Cd166作為肝癌診斷血清標志物的應用及其試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及臨床診斷技術領域，具體地說，涉及一種診斷肝癌的試劑盒以及應用。
【背景技術】
[0002]肝癌即肝臟惡性腫瘤，是外科疾病中的常見病和多發病，肝臟惡性腫瘤可分為原發性和繼發性兩大類。原發性肝臟惡性腫瘤起源于肝臟的上皮或間葉組織，前者稱為原發性肝癌，是我國高發的，危害極大的惡性腫瘤；后者稱為肉瘤，與原發性肝癌相比較較為少見。繼發性或稱轉移性肝癌系指全身多個器官起源的惡性腫瘤侵犯至肝臟。一般多見于胃、膽道、胰腺、結直腸、卵巢、子宮、肺、乳腺等器官惡性腫瘤的肝轉移。由于肝臟是人體最大的實質性器官，承擔人體的各類重要代謝功能，因此，肝臟一旦出現惡性腫瘤將導致危及生命的嚴重后果。又由于肝臟具有豐富的血流供應，與人體的重要結構如下腔靜脈、門靜脈、膽道系統等關系密切；肝臟惡性腫瘤發病隱匿，侵襲性生長快速，其治療甚為困難。因此，早期發現、早期診斷、早期治療。
[0003]目前肝癌的診斷主要依靠影像學檢查、肝穿刺組織學檢查等方法，然而這些檢測方法均具有一定的局限性。例如即使是很好的細針穿刺仍取材有限有較高的假陰性率，并且有使腫瘤擴散和針道種植的危險。癌癥的血清學檢測技術一直是研究的重點。然而，目前現有的針對癌癥(如HCC)檢測尚缺乏令人滿意的血清標志物，更缺乏可用于血清檢測或肝癌預后檢測的血清標志物。
[0004]血清CD166又稱為白細胞活化黏附因子(activated leukocyte cell adhes1nmolecule)，是淋巴細胞抗原⑶6的配基，主要在白細胞和胸腺上皮細胞上表達。
[0005]中國期刊《南方醫科大學》2013年刊出的論文“⑶133及⑶166在腦膜瘤中的表達及臨床意義”，作者通過一系列實驗研究得出以下結論:1、⑶133與⑶166在不同級別的腦膜瘤均有表達，⑶133及⑶166陽性細胞表達水平隨腦膜瘤病理級別增高而增高。并且在不同級別組腦膜瘤中⑶133陽性細胞(p=0.001)與⑶166陽性細胞(p=0.000) 1D值差異均有顯著性。2、⑶133及⑶166表達成正相關關系。經Spearman直線相關分析表明，⑶133陽性細胞與⑶166陽性細胞1D值呈顯著正相關(p=0.000)。3、切片染色可觀察到⑶133與⑶166共定位表達情況AD166可能為腦腫瘤干細胞標記物之一，與目前公認的腦腫瘤干細胞標記物⑶133可共同作為腫瘤干細胞的標記物。4、⑶166高表達組復發率較高，⑶166與腦膜瘤復發相關。
[0006]然而，目前關于⑶166作為肝癌診斷標志物還未見報道。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種CD166蛋白或其特異性抗體的用途。
[0008]本發明的再一的目的是，提供一種用于檢測肝癌的診斷試劑盒。
[0009]本發明的另一的目的是，提供所述的診斷試劑盒的用途。
[0010]本發明的第四個目的是，提供一種⑶166蛋白的用途。
[0011]為實現上述第一個目的，本發明采取的技術方案是:
CD166蛋白或其特異性抗體的用途，用于制備檢測肝癌的診斷試劑或試劑盒。
[0012]所述的檢測是血清檢測。
[0013]為實現上述第二個目的，本發明采取的技術方案是:
一種用于檢測肝癌的診斷試劑盒，所述的試劑盒包含測定血清中CD166蛋白含量的試劑。
[0014]所述的測定血清中⑶166蛋白含量的試劑為⑶166蛋白的特異性抗體。
[0015]為實現上述第三個目的，本發明采取的技術方案是:
如上所述的診斷試劑盒的用途，用于制備檢測肝癌的診斷試劑或試劑盒。
[0016]為實現上述第四個目的，本發明采取的技術方案是:
一種CD166蛋白的用途，它被用作檢測肝癌的標志物。
[0017]所述的檢測是血清檢測。
[0018]本文中，所檢測的血清中肝癌標志物⑶166蛋白在NCBI上的GenBank序列號是GENE.1D 214。本領域技術人員知道，凡是能捕獲和測定血清中上述⑶166蛋白的試劑(如CD166蛋白的特異性抗體)均能用于制備肝癌檢測的試劑或試劑盒。
[0019]本發明優點在于:本發明首次證實了 CD166蛋白可以作為肝癌診斷的標志物，可以通過檢測血清中的CD166蛋白濃度來診斷和預示肝癌疾病，取樣方便、易于檢測，且具有特異性和靈敏度高等優點。由于CD166是細胞表面分子，因此不僅可以用來診斷肝癌，而且有望成為治療肝癌的分子靶點。
【附圖說明】
[0020]附圖1:免疫印跡(Western Blotting)檢測2組正常人和8組肝癌患者血清中CD 166 的濃度(HI 是 Healthy individual, H 是 HCC)。
[0021]附圖2:不同疾病人群血清中⑶166的含量，箱式圖顯示正常人、腸癌、肝癌、乙型肝炎、丙型肝炎、肝硬化、胃癌、乳腺癌和肺癌患者血清中CD166的濃度。
[0022]附圖3:配對T檢驗結果顯示肝癌患者術前和術后血清中⑶166濃度的變化。
[0023]附圖4:卡方檢驗結果顯示⑶166的濃度和肝癌患者的臨床病理分期有關。
[0024]附圖5 =ROC曲線顯示⑶166和AFP診斷肝癌的特異性和靈敏度。
【具體實施方式】
[0025]下面結合附圖對本發明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0026]實施例1 I實驗材料
試劑盒買自上海麗臣生物科技有限公司，試劑盒全稱:human⑶166 ELISA KIT，貨號:LC9012,組成:微孔酶標板12孔*8條、標準品(4ng/ml )0.6ml、標準品稀釋液6ml、樣本稀釋液6ml、檢測抗體-HRP、洗滌緩沖液25ml、底物A、底物B、終止液、封板膜、說明書、自封袋。
[0027]2、實驗方法
血清樣本中CD166的檢測方法為:雙抗一步夾心法酶聯免疫吸附(ELISA)法。具體步驟:(I)實驗前準備洗滌緩沖液，ELISA板在室溫平衡20分鐘。(2)設置標準孔、樣品孔、空白孔(什么也不加)。標準孔分別加入不同濃度的標準品50ul ;樣品孔提前摸條件，血清樣品稀釋5倍(樣品孔加40ul樣本稀釋液，1ul待測血清樣本)。(3)標準孔和樣品孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體lOOul，37度恒溫箱60分鐘。(4)棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加洗滌液，洗滌5次。(5)標準孔、樣品孔和空白孔都加入底物A和B各50ul，37度避光孵育15分鐘。(6)所有孔加入終止液50ul，15分鐘內在450nm波長處測定各孔的吸光值。結果判定:首先標準孔和樣品孔的吸光值都要減去空白孔的吸光值；其次根據標準孔的吸光值和濃度，繪制標準品的線性回歸曲線；根據標準曲線和樣品孔的吸光值算出待測血清中CD166的濃度，再乘以稀釋倍數5倍，得出血清樣品CD166的最終濃度，單位是 ng/ml0
[0028]3、實驗結果
(I)圖1為免疫印跡(Western Blotting)檢測2組正常人和8組肝癌患者血清中⑶166的濃度的結果，其中HI是Healthy individual, H是HCC。結果表明8組肝癌患者血清(每組為8人份肝癌病人血清等量混合)中CD166的濃度明顯高于2組正常人(每組為8人份正常病人血清等量混合)。
[0029](2)分別在85例正常人、89例腸癌、51例肝癌、48例乙型肝炎、40例丙型肝炎、41例肝硬化、21例胃癌、25例乳腺癌和21例肺癌患者血清中使用試劑盒檢測CD166的濃度，結果如圖2所示，發現肝癌患者血清中⑶166的濃度顯著高于正常人、其他肝臟疾病和其他系統癌癥。
[0030](3)檢測肝癌患者(7例)肝癌切除術前后血清中⑶166濃度，結果圖圖3所示，發現術后患者血清⑶166含量下降明顯。
[0031](4)檢測不同肝癌分期患者血清中⑶166濃度，結果如圖4所示，行X列表卡方檢驗顯示⑶166的濃度和肝癌患者的分期有關系，分期越高⑶166的濃度越大。
[0032](5)甲胎蛋白(AFP)是經典的早期輔助診斷肝癌的血清學指標，AFP和⑶166的受試者工作曲線(ROC)如圖5所示，顯示⑶166的靈敏度和特異性都較好。
[0033]4.結果分析
正常人血清中幾乎檢測不到⑶166，但是肝癌患者血清中⑶166的表達明顯升高(圖1)。為了證明肝癌患者血清中⑶166的升高是特異性的，我們分別檢測了 85例正常人，CD 166平均濃度是216.8±577.lng/ml。89例腸癌平均濃度是636.2±488.5ng/ml,男/女0.82/1。51例肝癌平均濃度是7138.89±5434.68ng/ml,男/女18/1。48例乙型肝炎平均濃度是883.66±1139.32ng/ml，男/女1.4/1。40例丙型肝炎平均濃度是327.5±145.3ng/ml，男 / 女 1.35/1。41 例肝硬化平均濃度是 964.99±1275.136ng/ml，男 /女2.73/1。21例胃癌平均濃度是156.8±55.47ng/ml，男/女6/1。25例乳腺癌平均濃度是369.3±638.48ng/ml和21例肺癌平均濃度是332±94.59ng/ml，男/女1.63/1等病人血清中⑶166的濃度(圖2)，發現肝癌患者血清中⑶166的升高是比較特異的。同時我們也分析了同一個肝癌患者肝癌切除術前和術后血清中⑶166的表達情況，發現術后⑶166明顯下降(圖3)。最后，在上述正常人和肝癌患者血清中同時檢測AFP的濃度，并且和⑶166繪制了 ROC曲線，⑶166曲線下面積是0.9860，AFP曲線下面積是0.9142(圖5)，發現⑶166的特異性和靈敏度都非常好。
[0034]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1.CD166蛋白或其特異性抗體的用途，其特征在于，用于制備檢測肝癌的診斷試劑或試劑盒。2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的檢測是血清檢測。3.一種用于檢測肝癌的診斷試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含測定血清中⑶166蛋白含量的試劑。4.根據權利要求3所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述的測定血清中CD166蛋白含量的試劑為CD166蛋白的特異性抗體。5.權利要求3或4所述的診斷試劑盒的用途，其特征在于，用于制備檢測肝癌的診斷試劑或試劑盒。6.一種CD166蛋白的用途，其特征在于，它被用作檢測肝癌的標志物。7.根據權利要求6所述的用途，其特征在于，所述的檢測是血清檢測。
【專利摘要】本發明涉及CD166作為肝癌診斷血清標志物的應用及其試劑盒。本發明首次證實了CD166可以作為肝癌診斷的標志物，因此可以通過檢測血清中的CD166濃度來診斷和預示肝癌疾病，取樣方便、易于檢測，且具有特異性和靈敏度高等優點。由于CD166是細胞表面分子，因此不僅可以用來診斷肝癌，而且有望成為治療肝癌的分子靶點。
【IPC分類】G01N33/68, G01N33/574
【公開號】CN105628919
【申請號】CN201410594965
【發明人】孫奮勇, 王佳誼
【申請人】上海市第十人民醫院
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2014年10月30日
【公告號】WO2016065877A1