專利名稱：增強重組蛋白表達的方法
技術領域：
本發明涉及增強重組蛋白從RNA病毒載體的表達的方法，通過使用上述方法制備可用于藥物等的重組蛋白的方法，表達所述重組蛋白的RNA病毒載體，等等。
背景技術：
目前許多重組蛋白和肽被用作藥物組合物。人們認為生物藥 (biopharmaceuticals)的類型和數量會在將來增加，且將占所有藥物的較大一部分。已提出許多生物活性蛋白和肽可作為藥物組合物的候選。在這樣的情況下，通過增加蛋白和肽的表達水平而簡化其制備，可極大地提高它們的可利用性和適用性。對于基因治療等中使用的基因轉移RNA病毒載體也是如此。當使用基因轉移RNA 病毒載體將基因施用于基因療法、基因疫苗、單克隆抗體制備物等時，插入基因的表達水平與載體功能直接相聯系。因此，載體性能可通過增加表達水平來提高，這導致蛋白的可利用性和適用性的極大提高。由細菌產生的AB5毒素是由產毒素細菌產生并分泌至細菌細胞之外的蛋白質性外毒素。AB5毒素由一個具有毒性的活性亞基(A亞基)和五個具有細胞結合活性的結合亞基(B亞基)組成。霍亂毒素是AB5毒素。已報道了將非毒性霍亂毒素B亞基(CTB)作為分子佐劑應用于感染和慢性疾病，例如，用于流感病毒疫苗(Isaka M.等，Microbiol. Immunol. 52(2) :55_63，2008)，百日咳疫苗(Isaka M.等，Vaccine, 21 (11-12) :1165-73, 2003)，呼吸道合胞(respiratory syncytial) (RS)病毒疫苗(Singh S. R.等，Viral Immunol. 20(2) :261-75,2007 ；Oien N. L.等，Vaccine，Jun. 12 (8) :731_5，1994)，癌癥疫苗 (ffakabayashi A.等，J Immunol. 180(6) :4000-10,2008)和阿爾茨海默氏病疫苗(Maier M.等，Vaccine，23 04) :5149_59，2005)。然而，并無報道描述通過RNA病毒載體來表達重組蛋白或通過使用RNA病毒載體來增強重組蛋白的表達。現有技術文獻非專利文獻[非專利文獻 1] Isaka M.等，Microbiol Immunol. 2008 ；52 (2) :55-63[非專利文獻 2] Isaka M.等，Vaccine. 2003 ；21 (11-12) :1165-73[非專利文獻 3] Singh S. R.等，Viral Immunol. 2007 ；20 (2) :261-75[非專利文獻 4]0ien N. L.等，Vaccine. 1994Jun ； 12 (8) :731-5[非專利文獻 5] Wakabayashi A.等，J Immunol. 2008 ； 180 (6) :4000-10[非專利文獻 6]Maier Μ.等，Vaccine. 2005 ;23 (44) :5149-59

發明內容
發明所要解決的問題本發明正是鑒于上述狀況而提出的，本發明的一個目的是提供增強可用作藥物組合物的重組蛋白和肽從RNA病毒載體表達的方法，以簡化重組蛋白和肽的制備，并通過將上述技術應用于RNA病毒來源的基因轉移載體，在基因治療、基因接種、單克隆抗體制備等應用中提供可產生治療基因高表達的更有效的基因轉移載體。解決問題的手段本發明人發現當從RNA病毒表達蛋白或肽時，在不少情況下由于待表達的蛋白或肽的性質，所述蛋白或肽表達水平低下，且制備困難。具體而言，本發明人發現當從RNA病毒載體表達短肽、低溶解性蛋白等時表達效率極低。同時，AB毒素B亞基(AB5B)是超過IOKD的蛋白。其三維結構分析表明其形成五聚體 McCann J. A.等，Biochemistry. 36 (30) :9169-78,1997 ；Pickens J. C.等，Chem Biol. 11(9) :1205-1215, 2004)。屬于AB5B的霍亂毒素B (CTB)已用作佐劑。然而，并不知道當使用CTB時，蛋白表達水平是否改變。在將重組蛋白作為CTB融合蛋白表達的過程中， 本發明人發現當重組蛋白作為CTB融合蛋白使用仙臺病毒表達時，與當單獨表達該重組蛋白時相比，其表達水平顯著增加。為了更加具體地分析該現象，本發明人選擇了多種類型的重組蛋白作為實例，并評價了其與AB5B融合時表達水平的變化(增加或減少)。此外，為了衡量AB5B與其他載體蛋白(融合蛋白)之間的差異，選擇了假單胞菌外毒素A(PEDI)的受體結合域(Ia)和白介素-4(IL-4)，并比較了它們與AB5B的融合。所得的結果具有高度說服力。所有測試的大小為120個氨基酸或更少的肽，包括促腎上腺皮質激素釋放因子(CRF)，內皮縮血管肽-1 (ET-I)，神經肽Y(NPY)，胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)和淀粉狀蛋白β-42 (Α β 42:淀粉狀蛋白β )，當與ΑΒ5Β融合時，顯示顯著增加水平的表達(幾十倍或更多)。此外，將ΑΒ5Β與其他載體如PEDI和IL-4蛋白相比，顯示 ΑΒ5Β具有顯著更強的表達增強作用。ΑΒ5Β的作用比球狀蛋白質如IL-4更有效這一點是非常重要的。當從RNA病毒載體表達時，鏈長較短的蛋白僅以非常不良的表達效率表達。因此， 以充足的水平表達此類蛋白是困難的。然而，基于本發明，甚至對于鏈長短的蛋白也可通過將其作為ΑΒ5Β融合蛋白來表達而顯著增加其表達水平。 增加重組蛋白的表達水平對于制備該重組蛋白本身是有利的。當表達此種重組蛋白/肽時，在一些情況下可不經任何修飾而使用。然而，在其他情況下，優選將ΑΒ5Β去除。 在此類情況下，通過預先在ΑΒ5Β和目標重組蛋白/肽之間引入蛋白酶切割位點如腸激酶識別序列(DDDDK丨)，因子)(a識別序列(IEGR丨)，凝血酶識別序列(LVPR丨GS)或HRV 3C 蛋白酶識別序列(LEVLFQ丨GP)，AB5B可以被切去(cleave off)。或者，霍亂毒素(CTB)可通過使用Ni柱來親和純化，因為其對Ni柱顯示弱的親和力(Μ. T. Dertzbaugh和L. M. Cox, Protein Engineering, 11 :577-581,1998 ；美國專利 6008329 號)。此外，與AB5B的融合是在使用基因轉移RNA病毒載體進行基因治療、基因接種、單克隆抗體制備等中增強重組蛋白的體內、離體或體外表達的有效方式。增強的表達直接與載體功能相聯系，并因此可提高載體性能。具體而言，本發明涉及通過將重組蛋白與AB5B融合來增強重組蛋白從RNA病毒載體的表達的方法，通過使用上述方法制備可用于藥物的重組蛋白的方法，編碼AB5B融合蛋白的RNA病毒載體等。更具體而言，本發明涉及[1]編碼重組蛋白的RNA病毒載體，其中所述蛋白作為與AT5毒素B亞基的融合蛋白被編碼；[2][1]的載體，其中所述AB5毒素B亞基為霍亂毒素B (CTB)；[3] [1]或[2]的載體，其中所述重組蛋白是具有120個或更少氨基酸的肽；[4] [3]的載體，其中所述重組蛋白是具有50個或更少氨基酸的肽；[5] [1]至W]中任一項的載體，其中所述重組載體是神經肽或內分泌肽；[6] [1]至[5]中任一項的載體，其中所述重組蛋白是具有低溶解性的蛋白；[7] [1]至[6]中任一項的載體，其中所述RNA病毒載體是負鏈RNA病毒載體；[8]藥物組合物，包含[1]至[7]任一項的載體和藥學上可接受的擔載體；[9]弓丨入了 [1]至[7]中任一項的載體的細胞；[10]產生重組蛋白的方法，包括表達[1]至[7]中任一項的載體的步驟；[11]產生表達重組蛋白的能力增強的RNA病毒載體的方法，所述方法包括產生編碼融合蛋白的RNA病毒載體的步驟，所述融合蛋白中重組蛋白與AB5毒素B亞基融合；[12] [11]的方法，其中所述AB5毒素B亞基是霍亂毒素B (CTB)；[13] [11]或[12]的方法，其中所述重組蛋白是120個或更少氨基酸的肽；[14] [13]的方法，其中所述重組蛋白是50個或更少氨基酸的肽；[15] [11]至[14]中任一項的方法，其中所述重組蛋白是神經肽或內分泌肽；[16] [11]至[15]中任一項的方法，其中所述重組蛋白是低溶解性蛋白；[17] [11]至[16]中任一項的方法，其中所述RNA病毒載體是負鏈RNA病毒載體；[18]增加重組蛋白從RNA病毒載體的表達水平的方法，包括將重組蛋白作為與 AB5毒素B亞基的融合蛋白從RNA病毒載體表達的步驟；[19] [18]的方法，其中所述AB5毒素B亞基為霍亂毒素B (CTB)；[20] [18]或[19]的方法，其中所述重組蛋白是120個或更少氨基酸的肽；[21] [20]的方法，其中所述重組蛋白是50個或更少氨基酸的肽；[22] [18]至[21]任一項的方法，其中所述重組蛋白是神經肽或內分泌肽；[23] [18]至[22]任一項的方法，其中所述重組蛋白是低溶解性蛋白；[24] [18]至[23]任一項的方法，其中所述RNA病毒載體是負鏈RNA病毒載體；[25]包含[1]至[7]任一項的載體的病毒樣顆粒；等。而且，將在上述各項中的引用同一項的各項所述的發明2個或2個以上任意組合而得到的發明，在它們所引用的上位項所述的發明中已經意圖。此外，本說明書中記載的任意發明要素、技術要素及其任意組合，均是本說明書所意圖的。此外，在這些發明中，除本說明書所述的任意要素或其任意組合以外的發明，也是本說明書所意圖的。此外，對本說明書而言，在說明書中以優選的形式記載了某特定實施方式的情況下，不僅公開了其本身，還公開了本說明書中公開的包含該實施方式的更上位的發明中的、除該實施方式以外的發明。發明的效果本發明使得增加重組蛋白從RNA病毒載體的表達水平成為可能。在重組蛋白中， 特別是僅以低水平從RNA病毒載體表達的肽，如短肽蛋白和低溶解性蛋白，可通過使用本發明從所述RNA病毒載體以增加的表達水平有效地表達。此外，本發明的RNA病毒載體能夠用作基因轉移載體來實現有效的基因治療、基因接種、單克隆抗體制備等等。


[圖 1]顯示 SeV cDNA (pSeV18+CTB_mCRF/Δ F、pSeV18+CTB-mETl/Δ F、 pSeV18+CTB-mPYY/AF、pSeV18+CTB_mGLP2/Δ F、pSeV18+mCRF/Δ F、pSeV18+mETl/Δ F、 pSeV18+mPYY/ Δ F 和 pSeV18+mGLP2/ Δ F)結構的概略圖。將 CTB-mCRF、CTB_mETl、CTB_mPYY、 CTB-mGLP2、mCRF、mETl、mPYY、mGLP2基因中的每一個從pCI的NotI位點切出，然后插入 pkV18+NotI/AF 的 NotI 位點。[圖2]Ai342NotI片段的結構的示意圖。[圖3]Ai342NotI片段構建的示意圖。[圖4]CTB-Ai342NotI片段結構的示意圖。[圖5]顯示CTB-mCRF和mCRF在BHK21細胞的細胞裂解物和培養上清中表達量的圖。[圖6]顯示CTB-mETl和mETl在BHK21細胞的細胞裂解物和培養上清中表達量的圖。[圖7]顯示CTB-mPYY和mPYY在BHK21細胞的細胞裂解物和培養上清中表達量的圖。[圖8]顯示CTB-mGLP-2和mGLP_2在BHK21細胞的細胞裂解物和培養上清中表達
量的圖。[圖9]顯示BHK21細胞的細胞裂解物和培養上清中Aβ 42、IL_4_A β 42、 PEDI-A β 42、CTB-A β 42 的表達量的圖。[圖10]CTB-A β 15NotI片段構建的示意圖。[圖 11]CTB-A@ 15x2, CTB-Aβ 15x4, CTB-Aβ 15x8NotI 片段構建的示意圖。[圖 12]顯示攜帶 CTB-A β 42、CTB-A β 15、CTB-A β 15x2、CTB-A β 15x4、或 CTB-A β 15x8基因的SeV載體感染的BHK細胞的細胞裂解物和培養上清中的A β抗原量的 Western印跡照片。[圖 13]顯示攜帶 CTB-A β 42、CTB-A β 15、CTB-A β 1切2、CTB-A β 1切4、 CTB-A β 15x8基因的SeV載體感染的BHK細胞的細胞裂解物和培養上清中的針對GMl的結合活性的圖。[圖14]顯示肌肉內施用攜帶CTB-Aβ 42、CTB-A β 1切8、或GFP基因的載體的 C57BL/6N小鼠的抗A β抗體效價的圖。[圖15]顯示肌肉內、皮內、或鼻內施用攜帶CTB-Αβ15x8基因的SeV載體的 C57BL/6N小鼠的抗A β抗體效價的圖。[圖 16]顯示鼻內施用攜帶 CTB-A β 15、CTB-A β 15x2, CTB-A β 15x4、或 CTB-A β 15x8基因的SeV載體的C57BL/6N小鼠的抗A β抗體效價的圖。[圖17]顯示肌肉內施用攜帶CTB-Aβ 42基因的SeV載體、并用從大腸桿菌中純化的CTB-Αβ 42蛋白進行了加強免疫的C57BL/6N小鼠的抗Αβ抗體效價的圖。[圖18]顯示肌肉內施用攜帶CTB-Aβ 15x8基因的SeV載體、并用同一 SeV載體進行了加強免疫的C57BL/6N小鼠的抗A β抗體效價的圖。[圖19]顯示肌肉內施用了攜帶CTB-Aβ 42或CTB-A β 15x8基因的SeV載體、并用同一SeV載體進行了加強免疫的C57BL/6N小鼠的抗Aβ抗體效價的圖。小圖B中僅顯示了小圖A中的攜帶CTB-Aβ 42基因的kV載體的結果。[圖20]顯示鼻內施用了攜帶CTB-A β 15x8基因的SeV載體，并用同一 SeV載體進行了加強免疫的C57BL/6N小鼠的抗A β抗體效價的圖。[圖21]顯示肌肉內施用攜帶CTB-Aβ 15x8、CTB-A β 42或GFP基因的SeV載體， 并用CTB-Αβ 42蛋白進行了加強免疫的Tg2576小鼠的抗Αβ抗體效價的圖。[圖22]顯示肌肉內施用攜帶CTB-A015x8、CTB-A0 42或GFP基因的SeV載體， 并用CTB-Αβ 42蛋白進行了加強免疫的Tg2576小鼠的腦內Αβ量的圖。[圖2 顯示腦組織病理標本上的6Ε10免疫染色陽性區域的分布的照片對于對照的kV18+GFP/AF組(A)，在嗅球、海馬、和大腦新皮質散在性地確認了數量眾多的6E10染色陽性的A β沉積(棕色)，與此相對，對于SeV18+CTB-A β 15x8/ Δ F施用組(B)，A β沉積數明顯較少。[圖24]6Ε10免疫染色標本的圖像解析圖表。與對照的kV18+GFP/AF組(左欄) 相比，0 lhS/AF施用組(右欄)中，在腦的各部位中可見明顯的面積百分比減少傾向，特別是在海馬中差異巨大。發明的
具體實施例方式本發明涉及編碼重組蛋白的RNA病毒載體，其中所述重組蛋白作為與AB5毒素B 亞基(AB5B)蛋白的融合蛋白被編碼，還涉及產生所述載體的方法，包含此類載體的組合物，使用所述載體提高重組蛋白表達水平的方法等。本發明人揭示了目標蛋白的表達可通過使用編碼AB5B的核酸與RNA病毒載體的組合而顯著增強。具體而言，目標蛋白從RNA病毒載體的表達水平可通過將所述蛋白作為AB5B融合蛋白來表達而顯著增加。本發明中，RNA病毒是指具有RNA基因組、且在其生命周期中不具有DNA階段的病毒。本發明的RNA病毒不具有逆轉錄酶(S卩，RNA病毒不包括逆轉錄病毒)。S卩，病毒的增殖通過病毒基因組的RNA依賴性RNA聚合酶復制來實現，而不通過DNA介導。RNA病毒包括單鏈RNA病毒(包含正鏈RNA病毒和負鏈RNA病毒)和雙鏈RNA病毒。此外，包括具有包膜的病毒(有包膜病毒；enveloped viruses)和不具有包膜的病毒(無包膜病毒； non-enveloped viruses)，優選使用源自有包膜病毒的載體。本發明中，RNA病毒具體包括屬于以下的科的病毒。包括拉沙病毒等的沙粒病毒科(Arenaviridae)包括流感病毒等的正粘病毒科(Orthomyxoviridae ；包括甲型、乙型、丙型流感病毒和索戈托樣病毒等)包括SARS病毒等的冠狀病毒科(Coronaviridae)包括風疹病毒等的披膜病毒科(Togaviridae)包括腮腺炎病毒、麻疹病毒、仙臺病毒、RS病毒等的副粘病毒科 (Paramyxoviridae)包括小核糖核酸病毒、柯薩奇病毒、艾可病毒等的微小核糖核酸病毒科 (Picornaviridae)包括馬爾堡病毒、埃博拉出血熱病毒等的纖維病毒科(Filoviridae)包括黃熱病病毒、登革熱病毒、丙型肝炎病毒、庚型肝炎病毒等的黃病毒科 (Flaviviridae)
布尼亞病毒科(Bunyaviridae ；包括布尼亞病毒屬、漢坦病毒屬、內羅病毒屬和白蛉病毒屬等)包括狂犬病病毒等的彈狀病毒科(lihabdoviridae)呼腸孤病毒科(Reoviridae)。本發明中，病毒載體是指具有來源于病毒的基因組核酸，用于表達插入該基因組核酸中的基因的載體(運載體)。此外，本發明的病毒載體還包括感染性病毒粒子、病毒核心、病毒基因組與蛋白質的復合體、以及非感染性病毒粒子(非感染性病毒粒子或病毒樣粒子)等復合體，這些復合體具有在導入細胞中后表達其插入的基因的能力。例如，在RNA 病毒中，由病毒基因組及與之結合的病毒蛋白質構成的核糖核蛋白(病毒核心)能夠在被導入細胞中后在細胞內表達插入基因(W000/70055)。本發明的病毒載體也包括這樣的核糖核蛋白(RNP)。載體對細胞的導入可以使用適當的轉染試劑等來進行。將含有病毒基因組RNA或非感染性病毒顆粒(病毒樣顆粒(VLP))的RNP引入細胞的具體方法包括本領域技術人員已知的那些，如利用磷酸鈣(Chen，C. &0kayama, H. BioTechniques 6 :632-638,1988 ；Chen, C.禾口 Okayama，H. ，Mol. Cell. Biol. 7 :2745, 1987)，DEAE-右旋糖酐(Rosenthal，N. Methods Enzymo 1. 152 :704-709,1987)，多種基于脂質體的轉染試劑(Sambrook，J.等(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY))或電穿孑L (Ausubel, F.等(1994) In Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons, NY) , Vol. 1, Ch. 5 and 9)的方法。可將氯喹添加至轉染物以抑制在內體中的降解(Calos，Μ. P.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 :3015,1983)。轉染試劑包括例如 DOTMA(Roche)，Superfect Transfection Reagent(QIAGEN, Cat No. 301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Roche #1811169), TransIT-LTl(Mirus, Product No. MIR 2300), CalPhosTM Mammalian Transfection Kit(Clontech #K2051_1)和 CL0NfectinTM(Clontech#8020_l)。已知具包膜的病毒可在病毒粒體形成過程中納入宿主細胞來源的蛋白，且此類蛋白當引入細胞時可潛在地引起抗原性和細胞毒性(J. Biol. Chem. 272 16578-16584，1997)。因此使用不具包膜的RNP是有利的(W0 00/70055)。本發明優選的RNA病毒載體包括例如負鏈RNA病毒載體。負鏈RNA病毒載體是指來源于包含負鏈(編碼病毒蛋白質的反義鏈)的RNA作為基因組的病毒的病毒載體。負鏈 RNA也稱作陰性鏈RNA。本發明的負鏈RNA病毒具體包括單鏈負鏈RNA病毒(也稱非分節型(non-segmented)負鏈RNA病毒)。“單鏈陰性鏈RNA病毒”是指具有單鏈陰性鏈[即負鏈]RNA作為基因組的病毒。作為這樣的病毒，包括屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae ；包括副粘病毒屬、麻疹病毒屬、腮腺炎病毒屬和肺病毒屬等)、彈狀病毒科(Miabdoviridae ； 包括水皰病毒屬、狂犬病毒屬和短暫熱病毒屬等)、纖絲病毒科(Filoviridae)等科的病毒，其在分類學上屬于單分子負鏈RNA病毒目(Mononegavirales) (Virus第57卷第1期 pp29-36>2007 ；Annu.Rev. Genet. 32,123-162,1998 ；Fields virology fourth edition, Philadelphia, Lippincott-Raven,1305-1340,2001 ；Microbiol. Immunol.43,613-624, 1999 ；Field Virology, Third edition pp.1205-1241，1996)。本發明中，作為負鏈RNA病毒載體，特別可以列舉出副粘病毒載體。副粘病毒載體是來源于屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)的病毒的病毒載體。這樣的病毒可以列舉出例如屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒的仙臺病毒(Sendai virus)。這樣的病毒還包括例如新城疫病毒(Newcastle disease virus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、麻疹病 # (Measles virus) > Uf(RS) ^ (Respiratory syncytial virus) ^41 ^
(rinderpest virus)、瘟熱病毒(distemper virus)、猴副流感病毒(SV5)、人副流感病毒1， 2，3型、屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒(Influenza virus)、和屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)的水皰性口腔炎病毒(Vesicular stomatitis virus)及狂犬病病毒(Rabies virus)等。可在本發明中使用的病毒還包括例如仙臺病毒、人副流感病毒-1 (HPIV-I)、人副流感病毒-3 (HPIV-3)、海豹瘟熱病毒(PDV)、犬瘟熱病毒(⑶V)、海豚麻疹病毒(DMV)、小反芻動物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、亨德拉病毒 (Hendra)、尼帕病毒(Nipah)、人副流感病毒_2(HPIV_2)、猴副流感病毒5 、人副流感病毒-4a(HPIV-4a)、人副流感病毒_4b (HPIV_4b)、腮腺炎病毒(Mumps)和新城疫病毒(NDV) 等。更優選地，本發明的病毒包括選自仙臺病毒(SeV)、人副流感病毒-I(HPIV-I)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、海豹瘟熱病毒(PDV)、犬瘟熱病毒(CDV)、海豚麻疹病毒(DMV)、小反芻動物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、亨德拉病毒(Hendra)和尼帕病毒 (Nipah)中的病毒。本發明中使用的載體包括屬于副粘病毒亞科(包括呼吸道病毒屬、腮腺炎病毒屬和麻疹病毒屬)的病毒或其衍生物，例如屬于呼吸道病毒屬(genus Respirovirus)(也稱副粘病毒屬(genus paramyxovirus))的病毒或其衍生物。衍生物包括被遺傳修飾或化學修飾的病毒，但這些修飾不損害病毒的基因轉移能力。作為可適用于本發明的呼吸道病毒屬病毒，包括例如人副流感病毒1型(HPIV-I)、人副流感病毒3型(HPIV-3)、牛副流感病毒3 型(BPIV-3)、仙臺病毒(也稱小鼠副流感病毒1型)和猴副流感病毒10型(SPIV-IO)等。本發明的病毒載體可以來源于天然株、野生型株、突變株、實驗室傳代株和人工構建株等。此外，本發明的病毒載體可以具有傳染性，也可以不具有傳染性。這里，傳染性是指當病毒載體感染宿主細胞時，在該細胞中復制病毒、產生感染性病毒粒子的能力。病毒載體可以是具有與從自然界分離的病毒相同的結構的病毒載體，也可以是通過基因重組進行人工修飾而得到的病毒載體。例如，這樣的病毒載體可以是野生型病毒所具有的某些基因中存在突變、缺損的病毒。此外，還可以使用不完全病毒如DI粒子(J. Virol. 68 :8413-8417， 1994)等。例如，優選使用編碼病毒的包膜蛋白質或外殼蛋白質的基因中的至少1個中具有突變或缺損的病毒。這樣的病毒載體能夠復制其基因組，例如在感染細胞中，但不能形成感染性病毒粒子。這樣的復制能力缺損型病毒載體沒有將感染擴散的風險，因而安全性高。例如，可以使用缺失編碼包膜蛋白質(如F、H、HN、G、M、或Ml等)或突刺蛋白質的基因中的至少1個，或2個以上、3個以上或者4個以上的任意組合的負鏈RNA病毒載體(W000/70055 和 W000/70070 ；Li，H. -0.等，J. Virol. 74 (14) 6564-6569 (2000))。如果基因組 RNA 編碼基因組復制所必需的蛋白質(例如N、P、和L蛋白質)，則基因組能夠在感染細胞中擴增。為了制造缺損型病毒，例如可以將病毒基因組中的某些基因缺損，并外源性地對病毒產生細胞供給缺損的基因產物或能夠補償該基因產物的蛋白質(W000/70055和W000/70070 ；Li, H. -0.等，J.Virol. 74 (14) 6564-6569 (2000))。此外，不需完全補償缺損的病毒蛋白質、而以非感染性病毒粒子(VLP)的形式回收病毒載體的方法也是已知的(W000/70070)。此外，通過以RNP(例如由N、L、P蛋白質和基因組RNA構成的RNP)的形式回收病毒載體，能夠制造載體而無需補償包膜蛋白質。此外，在制作包膜病毒來源的病毒載體的情況下，可以制作包膜中包含與病毒本來具有的包膜蛋白質不同的蛋白質的病毒載體。例如，通過在制造病毒時使病毒產生細胞表達希望的外源性包膜蛋白質，能夠制造含該外源性包膜蛋白質的病毒。對于這樣的蛋白質沒有特殊限制，可以使用對哺乳動物細胞賦予感染能力的希望的粘附因子、配體、受體等蛋白質。具體地，可以列舉出例如水皰性口腔炎病毒(Vesicular stomatitis virus ；VSV) 的G蛋白(VSV-G)。VSV-G蛋白可以來源于任意的VSV株，例如可以使用^idiana血清型株 (J. Virology 39 :519-528(1981))來源的 VSV-G 蛋白，但不限于此。本發明的RNA病毒載體以與AB5毒素B亞基的融合蛋白的形式編碼重組蛋白。本發明中，AB5毒素是指一種許多病原性細菌共有的毒素，該毒素由1個拷貝的A亞基和5 個拷貝的 B 亞基組成(Merritt E, and Hol W, “ AB5toxins〃，Curr Opin Struct Biol 5(2) :165-71,1995 ；Lencer W, and Saslowsky D, “ Raft trafficking of AB5subunit bacterial toxins" ，Biochim Biophys Acta 1746(3) :314_21，2005)。所述 AB5 毒素包括例如空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)的腸毒素(enterotoxin)、霍亂毒素(霍亂弧菌)、不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxins)(例如LT和LT-II)(大腸桿菌)、百日咳毒素(pertussis toxin)(百日咳博德特氏菌)、志賀毒素(shiga toxin)(痢疾志賀氏菌) 以及其它的腸道出血性細菌產生的志賀樣毒素或Vero毒素(verotoxin)。一般認為，這些毒素的毒性由A亞基承擔，而B亞基形成五聚體，參與對細胞的粘附。本發明中特別優選的AB5毒素包括霍亂毒素和大腸桿菌不耐熱腸毒素，兩者在結構上和功能上均極為類似(Hovey BT等，J Mol Biol. ,285(3) 1169-78，1999 ；Ricci S.等， Infect Immun. 68 (2) :760-766,2000 ；Tinker J. K.等，Infectlmmun. 73 (6) :3627-3635, 2005)。作為霍亂毒素和大腸桿菌不耐熱腸毒素的具體的B亞基，可以列舉出包含登錄號 ΖΡ_01954889. 1，ZP_01976878. 1，NP_231099. 1，P13811. 1,ABV01319. 1，或 P32890，以及 SEQ ID NO :68、或者它們的成熟型蛋白質(除去N末端的21個氨基酸的；例如22 IM位氨基酸)的蛋白質等。作為編碼這樣的蛋白質的核苷酸序列，可以列舉出包含核苷酸序列NZ_ AAffEO 1000267. 1、NC_002505. 1、M17874. 1、EU113246. 1 和 M17873. 1，或者它們的成熟型蛋白質的序列(例如除去最5'端的63個核苷酸而得到的)的序列等。作為本發明優選的 AB5毒素B亞基，可以列舉出包含如上所述的氨基酸序列或由如上所述的核苷酸序列編碼的氨基酸序列者，或者與上述的氨基酸序列具有高相似性者。這樣的AB5毒素B亞基不僅可以包括天然序列，還可以包括突變。可以使用例如添加、缺失、取代、和/或插入了 1個或少數個氨基酸(例如數個、3個以內、5個以內、10個以內、15個以內、或20個以內的氨基酸)而得到的氨基酸序列的B亞基，只要與使用天然型的B亞基的情況相比，不會顯著地降低融合蛋白質的表達量。此外，也可以使用N末端和/ 或C末端具有1個 數個殘基(例如2、3、4、5、6、10、15或20個殘基)的氨基酸缺失或添加而得到的多肽、以及具有1個 數個殘基(例如2、3、4、5、6、10、15或20個殘基)的氨基酸取代而得到的多肽等。可以使用的變體包括例如天然蛋白質的片段、類似物、衍生物以及天然蛋白質與其它多肽(例如含有額外的異源信號肽或抗體片段的多肽)的融合蛋白質。 具體地，包含在野生型B亞基的氨基酸序列中取代、缺失、以及/或添加1個或多個氨基酸而得到的序列，且具有與野生型B亞基相當的增加融合重組蛋白表達的活性的多肽，可以作為本發明的AB5毒素B亞基使用。這樣的修飾型AB5毒素B亞基的優選保持形成五聚體的活性。在使用野生型蛋白質的片段的情況下，其通常包含野生型多肽(分泌蛋白質的情況下為成熟型的形式)的70%以上、優選80%以上、更優選90%以上(或95%以上)的連續區域。氨基酸序列的變體例如可以通過在編碼天然多肽的DNA中導入突變來制備 (Walker and Gaastra, eds.Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company, New York,1983) ；Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci.USA82 :488-492,1985 ； Kunkel 等，Methods Enzymo1. 154 :367-382,1987 ；Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N. Y. ),1989 ； U. S. Pat. No. 4，873，192)。關于如何進行氨基酸取代而不影響生物學活性的指導，包括例如 Dayhoff 等(1978)in Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl. Biomed. Res. Found.，Washington, D. C.))。AB5B包括例如大腸桿菌腸毒素LT的R192G突變體(Lemere 等，Neurobiol. Aging，23 :991-1000,2002 ；Seabrook 等，Neurobiol. Aging，25 :1141-1151, 2004 ；Seabrook 等，Vaccine, 22 :4075-7083, 2004)。對于進行修飾的氨基酸的數目沒有特殊限制，例如是天然多肽的成熟型的全部氨基酸的30%以內、優選25%以內、更優選20%以內、更優選15%以內、更優選10%以內、5% 以內、3%以內或以內，例如15個氨基酸以內、優選10個氨基酸以內、更優選8個氨基酸以內、更優選5個氨基酸以內、更優選3個氨基酸以內。在對氨基酸氨基酸進行取代時，通過取代成側鏈性質相似的氨基酸可以期待保持蛋白質的活性。這樣的取代在本發明中稱作保守取代。保守取代包括在同組內的氨基酸之間的取代，例如堿基性氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支鏈氨基酸(例如蘇氨酸、 纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。此外， 保守性取代還可以包括例如，BL0SUM62取代矩陣(S. Henikoff and J. G. Henikoff, Proc. Acad. Natl. Sci. USA 89 :10915-10919，1992)中給出正值(例如 +1 以上、+2 以上、+3 以上或+4以上)的氨基酸之間的取代。經修飾的蛋白質與野生型蛋白質的氨基酸序列之間顯示高同源性。高同源性的氨基酸序列包括具有例如70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、93%以上、95%以上或96%以上的同一性的氨基酸序列。氨基酸序列的同一性可以使用例如 BLASTP 程序(Altschul, S. F.等，J. Mol. Biol. 215 :403_410，1990)來確定。例如，可以在 NCBI (National Center for Biothchnology ^formation)的BLAST 的網頁上，使用默認參數來進行檢索(Altschul S. F.等，Nature Genet. 3 :266-272,1993 ；Madden, Τ. L.等，Meth. Enzymo1. 266 :131-141,1996 ；Altschul S. F.等，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402,1997 ； Zhang J. Madden T. L.，Genome Res. 7 :649-656,1997)。例如，通過 blast2sequences 程序(Tatiana A 等，FEMS Microbiol Lett. 174 :247-250,1999)進行 2 個序列的比較，制作 2個序列的比對，可以確定序列的同一性。空位按錯配對待。例如，計算天然型蛋白質(分泌后的成熟型的形式)的比對區域內的整個氨基酸序列上的同一性的值。具體地，通過計算出野生型蛋白質(對分泌蛋白質而言為成熟型)的全部氨基酸數中的相同氨基酸數的比例來確定序列同一性。此外，AB5毒素B亞基包括與編碼野生型蛋白質的基因的編碼區域的一部分或全部在嚴格條件下雜交的核酸所編碼的、具有與野生型蛋白質相當的活性(增加RNA病毒中表達的活性)的蛋白質。該蛋白質優選形成五聚體。在雜交中，例如，可以從包含野生型蛋白質基因的編碼序列或其互補序列的核酸、或作為雜交對象的核酸中的任何一方制備探針。鑒定可以通過檢測其是否與其他核酸雜交來實現。嚴格雜交的條件包括例如在含 5xSSC,7% (W/V) SDSUOO μ g/ml 變性鮭魚精子 DNA、5x Denhardt 液(lx Denhardt 溶液含 0. 2%聚乙烯基吡咯烷酮、0. 2%牛血清白蛋白以及0. 2% Ficoll)的溶液中，于50°C、優選 60°C、更優選65°C進行雜交，然后在與雜交相同的溫度下，于hSSC中、優選IxSSC中、更優選0. 5xSSC中、更優選0. IxSSC中振蕩洗滌2小時的條件。AB5毒素B亞基本來具有的信號肽(典型地是最初的21個氨基酸)可以完整地與重組蛋白質融合。或者也可以將其除去，例如在N末端添加真核細胞來源的蛋白質的信號肽，或者替換原有的信號肽(參照實施例)。具體地，可以使用免疫球蛋白kappa輕鏈、白細胞介素(IL)-2或組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)等希望的分泌蛋白質的信號序列，但所述信號肽序列不限于此。此外，融合蛋白質可以還包含標簽、接頭、和間隔序列。例如，目標重組蛋白與AB5 毒素B亞基可以直接連接在一起，也可以通過接頭(或間隔序列)連接在一起。對接頭/間隔序列的序列沒有特殊限制，但所述序列可以由例如1 15個氨基酸、優選1 8個氨基酸、例如2 6個氨基酸、例如約4個氨基酸組成，具體地說，所述序列包括但不限于KK (賴氨酸-賴氨酸)、GP (甘氨酸-脯氨酸),GPGP (甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸)、GGS (甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸)、GGGS、GGGGS、它們的重復、和它們的各種組合。一般而言，目標重組蛋白與AB5B的融合通常使得AB5B位于目標重組蛋白的N末端側，亦即目標重組蛋白位于AB5B的C末端側。待與AB5毒素B亞基融合的重組蛋白并無具體限制；然而，具體而言，其可能能夠顯著增加難以以充足的水平從RNA病毒載體表達的蛋白的表達。這樣的蛋白包括例如短肽鏈的蛋白。短多肽包括，例如由300個氨基酸或更少，優選250、220、210、200、180、160、140、 120、100、90、80、75、70、65、62、60、55、50、45、40、35、30、25 或 20 個氨基酸，或少于這些數目任一的數目的氨基酸(氨基酸數排除AB5毒素B亞基的部分)所組成的肽。待表達的重組蛋白由例如，7個氨基酸或更多，優選8、10或15個氨基酸或更多(例如20個或更多、25個或更多、30個或更多、40個或更多或41個或更多)氨基酸組成。更具體而言，本發明提供了編碼重組蛋白的RNA病毒載體，所述重組蛋白是由例如120個或更少個氨基酸，或50個或更少個氨基酸組成的肽，且作為與AB5毒素B亞基的融合蛋白被編碼。本文中“重組蛋白”指與AB5毒素B亞基融合的蛋白。S卩，AB5毒素B亞基并不包括在重組蛋白的長度中。舉例而言，重組蛋白的長度為融合蛋白排除AB5毒素B 亞基的部分的長度。還優選將具有低水溶性的蛋白/肽作為重組蛋白。具體而言，根據本發明可有效地增加由短肽鏈組成的、具有低溶解性的蛋白從RNA病毒載體的表達。“具有低水溶性的蛋白”意指當在20士5°C每五分鐘劇烈渦旋振蕩30秒時，在30分鐘之內溶解Img的蛋白所需的水或生理鹽水的體積為ImL或更多，優選在30分鐘之內溶解Img的蛋白所需的水或生理鹽水的體積為IOmL或更多，且更優選IOOmL或更多。在本發明中，待與AB5B融合的蛋白具體包括神經肽和內分泌肽。將重組蛋白作為AB5B融合蛋白表達的本發明的RNA病毒載體的特征在于，它們將重組蛋白從所述RNA病毒載體表達的表達水平增加至相同重組蛋白不經AB5B融合從相同 RNA病毒載體單獨表達的表達水平的例如1. 5倍或更多，優選兩倍或更多，2. 5倍或更多，3 倍或更多，3. 5倍或更多，4倍或更多，4. 5倍或更多，5倍或更多，6倍或更多，7倍或更多，8 倍或更多，9倍或更多，或10倍或更多。宿主細胞可適當地選擇，且其包括例如BHK21細胞 (ATCC CCL-10)。本發明為高表達難以從RNA病毒載體實現高表達的蛋白成為可能。目標蛋白包括難以從RNA病毒載體實現高表達的期望蛋白。此類蛋白包括例如具有如下特征的蛋白將從包含于RNA病毒載體中的編碼該蛋白的核酸表達該蛋白的表達水平與使用攜帶相同的該蛋白的編碼核酸作為插入物的表達質粒載體表達該蛋白的表達水平的比值(即，從RNA 病毒載體的表達水平/從質粒載體的表達水平)，與用例如編碼小鼠IL-4的核酸(SEQ ID NO 81和82)確定的比值進行比較時，相對比例為0. 8或更小，優選0. 75或更小，0. 7或更小，0. 65或更小，0. 6或更小，0. 55或更小，0. 5或更小，0. 45或更小，0. 4或更小，0. 35或更小，0. 3或更小，0. 25或更小或0. 2或更小。表達質粒載體包括例如具有CMV啟動子的，例如pcDNA 3. 1 (Invitrogen)。將載體在適當的條件下轉染(例如，將1 μ g質粒在24孔板中使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen))轉染。同時，將RNA病毒載體例如以MOI = 3 引入相同的宿主細胞。在基因轉染之后72小時收獲細胞。當目標重組蛋白是分泌蛋白時， 測定培養上清中蛋白的濃度。或者，測定表達的蛋白的量相對于細胞中蛋白的總量。針對小鼠IL-4和目標蛋白測定蛋白的濃度或量，并可對這兩個值進行比較。本發明的載體還可以在插入編碼與AB5毒素B亞基的融合蛋白的基因的位點以外的任何位點處攜帶其它外源基因。對于這樣的外源基因沒有限制，且包括例如用于監測載體的感染的標記基因，或者也可以是調節免疫性細胞因子、激素、受體、抗體，及其片段，或其它基因。重組RNA病毒載體可以利用公知方法來重構。具體地，載體可以通過下述步驟來制造(a)在構成包含病毒基因組RNA的RNP的病毒蛋白質的存在下，將以與AB5毒素B亞基的融合蛋白的形式編碼重組蛋白的RNA病毒的基因組RNA或編碼其互補鏈的RNA導入細胞或者使其在細胞中轉錄的步驟；和(b)回收生成的毒或包含該基因組RNA的RNP的步驟。 上述“構成RNP的病毒蛋白質”典型地是指與病毒基因組RNA —起形成RNP，并構成核殼的蛋白質。它們是基因組的復制和基因表達所必需的一組蛋白質，對負鏈RNA病毒而言，它們典型地是N(核殼，又稱核蛋白(NP))、P(磷)和L(大)蛋白質。其表記因病毒種類而異， 但相應的各組蛋白質是本領域技術人員所公知的(Anjeanette Robert等，Virology 247 1-6(1998))。病毒載體的產生可以使用希望的哺乳動物細胞、鳥類細胞等，具體地，這樣的細胞包括例如培養細胞，如猴腎來源的LLC-MK2細胞(ATCCCCL-7)、CV-I細胞(例如ATCC CCL-70)、和倉鼠腎來源的BHK細胞(例如ATCC CCL-10)等、以及人來源細胞等。此外， 為了大規模地獲得病毒載體，可通過用從上述宿主得到的病毒載體感染雞胚胎蛋來擴增載體。使用雞蛋制造病毒載體的方法已經建立起來(Nakanishi，et al. , ed. (1993)， “State-of-the-Art Technology Protocol in Neuroscience Research III, Molecular Neuron Physiology”，Koseisha，Osaka，pp. 153-172) 具體來說，將受精卵放入孵化器中， 在37-38°C的條件下，培養9-12天，使胎胚成長。將病毒載體接種到尿囊腔中，進一步將雞蛋培養數日(例如3天)使病毒載體繁殖，回收包含病毒的尿囊液。可用常規方法從尿液中 jfM^tit'M^^W (Tashiro, Μ. ,"Virus Experiment Protocol", Nagai, Ishihama, ed.， Medical View Co.，Ltd.，pp.68-731995)。粒子形成所必需的病毒蛋白質可以由轉錄后的病毒基因組RNA表達，也可以從基因組RNA以外的來源反式供給。例如，為了重構負鏈RNA病毒載體，可以通過將表達N、P 和L蛋白的質粒導入細胞等方法來供給N、P和L蛋白質。讓轉錄出的基因組RNA在這些病毒蛋白質的存在下復制，形成感染性病毒粒子。為了在細胞內表達病毒蛋白質和RNA基因組，將在適當的啟動子的下游連接編碼所述蛋白質或基因組的DNA而得到的載體導入宿主細胞。這樣的啟動子包括例如CMV啟動子(!7OeckingHand Hofstetter H. Gene 45: 101-105，1986)、逆轉錄病毒 LTR(Shinnik，Τ. Μ.，Lerner, R. A. &Sutcliffe, Nature, 293, 543-548，1981)、EFl-α 啟動子、CAG 啟動子(Niwa, H. etal. Gene. 108 :193-199,1991、特開平3-168087(公開未審查的日本專利申請)等。在制造缺損包膜蛋白質等的基因的缺損型病毒的情況下，可以通過在病毒產生細胞中表達所缺損的蛋白質和/或能夠補償其功能的其它病毒蛋白質等，來補償所產生的病毒的感染性(W000/70055、W000/70070、W003/025570 ；Li, H. -0.等， J.Virol. 74(14)6564-6569,2000) ο例如，也可以使用與病毒載體的基因組來源病毒不同的來源的負鏈RNA病毒的包膜蛋白質來將病毒進行假型化。作為這樣的包膜蛋白質，可以使用例如水泡性口腔炎病毒(Vesicular stomatitis virus ;VSV)的G蛋白質 (VSV-G) (J. Virology 39 :519-528 (1981)) (Hirata, Τ.等，2002，J. Virol. Methods, 104 125-133 ；Inoue, Μ.等，2003，J. Virol. 77 :6419-6429 ；Inoue Μ.等，J Gene Med. 2004 ；6 1069-1081)。要從基因組中缺損的基因包括例如，F、HN、H、G等刺突蛋白質基因、M等包膜襯里蛋白質基因、或它們的任意組合。刺突蛋白質基因的缺失可有效使得負鏈RNA病毒載體成為非傳染性，而M蛋白等包膜襯里蛋白質基因的缺失則可有效地使感染細胞不能形成粒子。例如，優選使用F基因缺陷型負鏈RNA病毒載體(Li，H. -0.等，J. Virol. 74，6564-6569， 2000)、M 基因缺陷型負鏈 RNA 病毒載體 anoue，Μ.等，J. Virol. 77,6419-6429, 2003)等。 此外，缺損F、HN(或H)以及M中的至少2個基因的任意組合的載體的安全性更能得到保障。例如，M和F基因雙缺失型的載體沒有傳染性且病毒粒子形成缺陷，同時保持高水平的感染性及基因表達能力。例如，作為F基因缺失型的重組病毒的制造的一個例子，將表達F基因缺損的負鏈RNA病毒基因組或其互補鏈的質粒與表達F蛋白質的表達載體、以及N、P、和L蛋白質的表達載體一起轉染宿主細胞。或者，使用F基因已整合入其染色體的宿主細胞，則能夠更有效率地制造病毒(W000/70070)。在這種情況下，優選使用Cre/loxP、FLP/FRT等序列特異性重組酶及其靶標序列，以使得F基因能夠被誘導表達(參照W000/70055、W000/70070 ； Hasan,M. K.等，J. General Virology 78 :2813_沘20，1997)。具體地，例如，將包膜蛋白質基因整合到具有重組酶靶標序列的載體，如Cre/loxP誘導型表達質粒pCALNdlw(Arai，T.等，J. Virology 72，plll5_1121，1998)中。表達的誘導通過例如以MOI 3 5感染腺病毒 AxCANCre 來進行(Saito 等，Nucl. Acids Res. 23 :3816-3821 (1995) ；Arai, T.等，J. Virol 72，1115-1121，1998)。此外，對于本發明的載體而言，載體中包含的任意病毒基因均可以在野生型基因的基礎上進行改變，例如為了降低病毒蛋白質的免疫原性、或者為了提高RNA的轉錄效率或復制效率。具體地，例如在負鏈RNA病毒載體中，可以考慮對復制因子基因N、P和L中的至少一個進行修飾，來提高轉錄或復制的功能。此外，作為包膜蛋白質之一的HN蛋白質具有血凝素(hemagglutinin)活性與神經氨酸酶(neuraminidase)活性。例如，減弱血凝素的活性能夠提高血液中的病毒的穩定性，而通過對神經氨酸酶的活性進行修飾，則能夠調節感染能力。此外，通過對F蛋白質進行改變，能夠調節膜融合能力。此外，例如，對可以充當細胞表面抗原分子的F蛋白質或HN蛋白質的抗原呈遞表位等進行解析，而該信息可以用來制作這些蛋白質的抗原性減弱的病毒載體。而且，可以在病毒基因中導入溫度敏感性突變，以抑制二次釋放粒子(或VLP，病毒樣粒子)的釋放(W02003/025570)。病毒蛋白質的突變的具體實例包括P蛋白質的86位的Glu (E86)的突變、SeV P蛋白質的511位的Leu (L511)到其它氨基酸的取代、或其它負鏈RNA病毒的P蛋白的同源位點的取代。具體例子包括86位的Lys取代、511位的Phe取代等。此外，對于L蛋白，例子包括L蛋白的1197位的Asn (Ni 197)和/或1795位的Lys (K1795)到其它氨基酸的取代、或其它負鏈RNA病毒的L蛋白中的同源位點的取代，具體的例子包括1197位的氨基酸到kr的取代和1795位的氨基酸到Glu的取代等。P基因和L基因的突變能夠顯著地提高持續感染性、次級病毒粒子釋放的抑制、或細胞毒性的抑制的效果。例如，可以導入下列突變對M基因，可導入G69E、T116A、和A183S突變，對HN基因，可導入A262T、G264、K461G 突變，但可導入的突變不限于此(具體情況參照W02003/025570)。 負鏈RNA病毒的制造可以例如利用以下的公知方法來實施(W097/16539 ； W097/16538 ；W000/70055 ；W000/70070 ；W001/18223 ；W003/025570 ；W02005/071092 ； W02006/137517 ；W02007/083644 ；W02008/007581 ；Hasan, Μ. K.等，J.Gen. Virol. 78 2813-2820，1997，Kato，Α·等，1997，EMBO J. 16 :578-587 ；Yu, D.等，Genes Cells 2 457-466，1997 ；Durbin, Α. P.等，Virology 235 :323-332,1997 ；ffhelan, S. P.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :8388-8392,1995 ；Schnell. Μ. J.等，EMBO J. 13 :4195-4203,1994 ； Radecke, F.等，EMBO J. 14 :5773-5784,1995 ；Lawson, N. D.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :4477-4481 ；Garcin, D.等，EMBO J. 14 :6087-6094,1995 ；Kato, Α.等，Genes Cells 1 569-579，1996 ；Baron, Μ. D.andBarrett, Τ.，J.Virol. 71 :1265-1271，1997 ；Bridgen,A. and Elliott, R. Μ.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :15400-15404,1996 ；Tokusumi, Τ.等，Virus Res. 8633-38,2002 ；Li, H. -0.等，J. Virol. 74 :6564-6569)，2000。通過這些方法，可以從 DNA重構包括副流感病毒、水皰性口腔炎病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、仙臺病毒等在內的負鏈RNA病毒。作為制造正⑴鏈RNA病毒的方法，可以列舉出以下的例子。1)冠狀病毒Enjuanes L, Sola I, Alonso S, Escors D, Zuniga S.Coronavirus reverse genetics and development of vectors forgeneexpression.Curr Top Microbiol Immunol. 287 161-97，2005.綜述。2)披膜病毒Yamanaka R,Zullo SA,Ramsey J,Onodera Μ,Tanaka R,Blaese Μ,Xanthopoulos KG.Induction of therapeutic antitumor antiangiogenesis by intratumoral injection of genetically engineered endostatin-producing Semliki Forest virus.Cancer Gene Ther.2001 Oct ；8 (10) :796-802.Datwyler DA,Eppenberger HM,Roller D, Bailey JE, Magyar JP.Efficient gene delivery into adult cardiomyocytes by recombinant Sindbis virus.J Mol Med. 1999Dec ；77(12) :859-64.3)微小核糖核酸病毒Lee SG, Kim DY, Hyun BH, Bae YS.Novel design architecture for genetic stability of recombinant poliovirus :the manipulation of G/C contents and their distribution patterns increases the genetic stability of inserts in a poliovirus-based RPS-Vax vector system.J Virol. 2002Feb ；76 (4) :1649-62.Mueller S, Wimmer E.Expression of foreign proteins by poliovirus polyprotein fusion analysis of genetic stability reveals rapid deletions and formation of cardioviruslike open reading frames.J Virol. 1998Jan ；72(1) :20-31.4)黃病毒Yun Si，Kim SY，Rice CM，Lee YM.Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus.J Virol. 2003Jun ；77 (11) :6450-65.Arroyo J, Guirakhoo F, Fenner S, Zhang ZX, Monath TP, Chambers TJ.Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow fever Virus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine (ChimeriVax-JE).J Virol. 2001Jan ；75 (2) :934-42.5)呼腸病毒Roner MR, Joklik WK.Reovirus reverse genetics Incorporation of the CAT gene into the reovirus genome.Proc Natl Acad Sci U S A. 2001Jul 3 ；98(14) :8036-41. Epub 2001 Jun 26.關于其它的RNA病毒的增殖方法和重組病毒的制造方法，可以參照ExperimentalVirology, Detailed Discussion,2nd Edition (Ed. Students' Association of The National Institute of Health ；Maruzen,1982)。本發明還涉及產生重組蛋白的方法，其包括從RNA病毒載體表達作為與AB5毒素B亞基的融合蛋白編碼的重組蛋白，并收集表達的蛋白。具體而言，將載體引入細胞，并從所述細胞中的載體表達所述融合蛋白。通過收集表達的融合蛋白，可將所述重組蛋白作為融合蛋白獲得。若需要，也可以通過將重組蛋白從融合蛋白切割而僅收集重組蛋白。如上所述，AB5B部分可通過在目標蛋白和AB5B之間引入序列特異性的蛋白酶剪切序列如腸激酶識別序列(DDDDK丨)，因子敘識別序列(IEGR丨)，凝血酶識別序列(LVPR丨GS)或 HRV 3C蛋白酶識別序列(LEVLFQ丨GP)而切去。對所述細胞并無限制，只要本發明載體可以引入它們即可。此類細胞包括培養的哺乳動物細胞(來源于小鼠、大鼠、猴和人的細胞)如LLC-MK2細胞(ATCC CCL-7)，CV-1細胞(例如，ATCC CCL-70)和BHK細胞(或例如， ATCC CCL-10)。或者，可以使用雞蛋來表達所述蛋白以制備大量的病毒載體(Nakanishi等編(1993) “State-of-the-Art Technology Protocol in Neuroscience Research III, Molecular Neuron Physiology", Koseisha, Osaka,pp.153-172)。本發明還涉及包含本發明的載體或引入了所述載體的細胞的組合物。本發明的組合物可用于需要重組蛋白高水平表達(因為其使得所述蛋白能夠高效地表達)的任何目的。具體而言，將本發明的組合物用于增強蛋白表達或實現增強的蛋白表達。在本發明的組合物的制造中，載體或細胞視需要可以與藥理學可接受的希望的擔載體(carrier)或介質(vehicle)組合。“藥學上可接受的擔載體或介質”包括能夠在其中懸浮載體或細胞的希望的溶液，例如磷酸緩沖生理鹽水(PBS)、氯化鈉溶液、Ringer’ s溶液、培養基等。在用雞蛋增殖載體等情況下，可以包含尿囊液。此外，包含所述載體的組合物可以包含去離子水、5% 葡萄糖水溶液等擔載體或介質。而且，除此之外還可以含有植物油、懸浮劑、表面活性劑、穩定劑、殺生物劑等。還可以添加防腐劑或其它添加劑。本發明的組合物可用作所需的試劑或藥物組合物。此外，本發明的組合物還可以組合生物聚合物等有機物、羥基磷灰石等無機物作為擔載體，具體包括膠原基質、聚乳酸聚合物或共聚物、聚乙二醇聚合物或共聚物及其化學衍生物等。本發明還提供了編碼AB5毒素B亞基用于增強蛋白表達的用途。本發明還提供了用于增強蛋白表達的試劑，其包含AB5毒素B亞基或編碼該亞基的核酸。本發明還提供了表達增強劑，其包含AB5毒素B亞基或編碼該亞基的核酸。將編碼AB5毒素B亞基的核酸與編碼目標蛋白的核酸合框連接以獲得編碼由這兩者組成的融合蛋白的核酸。所得的核酸可例如使用RNA病毒載體來表達以與單獨表達該蛋白相比顯著地增加該蛋白的表達水平。此外，本發明提供了增加重組蛋白表達水平的方法，其包括將重組蛋白作為與AB5 毒素B亞基的融合蛋白表達的步驟。此種AB5毒素B亞基可為例如霍亂毒素B (CTB)。同時， 如上所述，所述重組蛋白可為例如，120個氨基酸或更少的肽，或50個氨基酸或更少的肽。 所述重組蛋白可為神經肽或內分泌肽。在本文中，“重組蛋白”指與AB5毒素B亞基融合的蛋白。或者，所述重組蛋白可為例如，具有低溶解性的蛋白。所述重組蛋白是從例如RNA病毒載體表達的，優選地，例如，是從負鏈RNA病毒載體表達的。本發明還提供了 AB5毒素B亞基或其編碼核酸用于增加蛋白表達的用途。本發明還涉及用于增加蛋白表達的AB5毒素B亞基及其編碼核酸。本發明還涉及用于增強蛋白表達的組合物，其包含所述亞基或其編碼核酸。表達水平是否增加可例如通過從相同載體表達不含CTB融合的重組蛋白，并將其與重組蛋白的表達水平相比較來進行測試。此外，本發明涉及編碼重組蛋白與AB5毒素B亞基之間的融合蛋白的RNA病毒的基因組RNA，或其互補鏈(反基因組RNA)，或編碼兩者至少任一的DNA，在產生具有增加的重組蛋白表達的RNA病毒載體，引入該載體的細胞，或包含兩者之中任一的組合物中的用途。 本發明還涉及編碼RNA病毒的基因組RNA或其互補鏈(反基因組RNA)的DNA用于增加所述重組蛋白表達水平的用途，所述RNA病毒編碼重組蛋白與AB5毒素B亞基的之間融合蛋白。此外，本發明涉及實現重組蛋白增強表達的組合物，其包含編碼所述重組蛋白作為與AB5毒素B亞基的融合蛋白的RNA病毒載體。本發明還涉及編碼所述重組蛋白作為與 AB5毒素B亞基的融合蛋白的RNA病毒載體用于增強所述重組蛋白表達中的用途。本發明還提供了用于增強重組蛋白表達的試劑(表達增強劑)，其包含編碼所述重組蛋白作為與AB5 毒素B亞基的融合蛋白的RNA病毒載體。本發明還提供了編碼所述重組蛋白作為與AB5毒素B亞基的融合蛋白的RNA病毒載體在產生表達重組蛋白的能力增強的藥劑、試劑和/或藥物中的用途。包含本發明的載體的組合物或包含引入所述載體的細胞的組合物可在體外使用， 用于體內給藥，或用于通過細胞的離體給藥。在通過細胞給藥RNA病毒載體時，將其引入適當的培養細胞、從接種目標動物收獲的細胞等。為了用所述RNA病毒在體外感染細胞(例如，在試管或培養皿中)，感染在體外(或離體)進行，例如，在期望的生理水溶液如培養基、 生理鹽水、血液、血漿、血清或體液中進行，其中，感染復數(Μ0Ι ；平均每個細胞感染性病毒的數量)的范圍優選為1至1，000，更優選2至500，再更優選3至300，進一步更優選5至 100。本發明組合物的劑量取決于疾病、患者體重，年齡，性別，以及癥狀，給藥目的，待導入的組合物的劑量形式，給藥方法，待引入的基因等而變動；然而，本領域技術人員可確定給藥途徑。此外，給藥劑量可基于待給藥的動物類型，給藥的位置或頻率等進行選擇。待施用包含本發明載體的組合物的受試者優選包括哺乳動物(包括人和非人哺乳類)。具體而言，此類哺乳動物包括人，非人靈長類如猴，嚙齒類如小鼠和大鼠，兔，山羊，綿羊，豬，牛， 犬，貓以及所有其他哺乳動物。本發明的載體可優選用作病毒樣顆粒(VLP)，且還可以以與常規的病毒顆粒相同的方式使用。
實施例以下，在實施例的語境下對本發明進行更具體的說明，但本發明不受這些實施例的限制。而且，本文中引用的文獻全部并入作為本說明書的一部分。[實施例1]攜帶mCRF基因的SeV載體的構建。使用附有IgK分泌信號的人A β 42基因(SEQ ID Ν0:1)作為模板，通過PCR合成 mCRF片段(SEQ ID NO :3)，其中IgK分泌信號附接于小鼠CRF肽基因(登錄號匪205769)。 所用的引物示于SEQ ID N0:4至8。然后，使用CTB-Aβ 42NotI片段(實施例10 ;SEQ IDNO 14)作為模板，進行PCR以合成EcoRV-EIS片段(SEQ ID NO 9)。所用的引物示于SEQ ID NO 10 禾Π 11。接著，用 XhoI 和 EcoRV 消化mCRF 片段，并用 EcoRV 和 NotI 消化 EcoRV-EIS 片段。將所得的片段亞克隆入PCI載體(Promega)以構建mCRF基因NotI片段，其附有仙臺病毒轉錄信號(pCI-mCRF) (SEQ ID NO :12)。將F 基因缺陷 SeV 載體(WO 00/70070) (pSeV18+NotI/Δ F)的 cDNA 用 NotI 消化， 并將mCRF基因NotI片段(SEQ ID NO 12)插入NotI位點以構建攜帶所述mCRF基因的F 基因缺陷 SeV cDNA(pSeV18+mCRF/AF)(圖 1)。[實施例2]攜帶mCRF和CTB的融合基因的SeV載體的構建使用CTB-Αβ 42NotI片段(實施例10 ；SEQ ID NO 14)作為模板，進行PCR以合成CTB-mCRF片段(SEQ ID N0:16)。所用的引物示于SEQ IDNO :3、4、5、17和18。接著，用 XhoI和EcoRV消化CTB-mCRF片段，并用XhoI和EcoRV消化上述制備的pCI-mCRF。構建了附有仙臺病毒轉錄信號的CTB-mCRF基因NotI片段(SEQ ID NO 19)。將F 基因缺陷的 SeV 載體(WO 00/70070) (pSeV18+NotI/Δ F)的 cDNA 用 NotI 消化，并將CTB-mCRF基因NotI片段(SEQ ID NO 19)插入NotI位點以構建攜帶CTB-mCRF基因的 F 基因缺陷的 kv cDNA(pSeV18+CTB-mCRF/ Δ F)(圖 1)。[實施例3]攜帶mET-1基因的SeV載體的構建使用附有IgK分泌信號的人Αβ42基因(SEQ ID Ν0:1)作為模板，通過PCR 合成了 mETl片段(SEQ ID Ν0:21)，其中IgK分泌信號附于小鼠ETl肽基因(登錄號 ΝΡ_034234)。所用的引物示于SEQ ID NO :7、22、23和24。接著，使用CTB-Aβ 42NotI片段 (SEQ ID NO 14)作為模板，進行 PCR 以合成 EcoRV-PstI-EIS 片段(SEQ ID NO :25)。所用的引物示于SEQ ID N0:11和26。接著用XhoI和EcoRV消化mETl片段，并用EcoRV和NotI 消化EcoRV-Pstl-EIS片段。將所得的片段亞克隆入pCI載體以構建附接有仙臺病毒轉錄信號的 mETl 基因 NotI 片段(pCI-mETl) (SEQ ID NO :27)。將F 基因缺陷的 SeV 載體(WO 00/70070) (pSeV18+NotI/Δ F)的 cDNA 用 NotI 消化，并將mETl基因NotI片段(SEQ ID NO 27)插入NotI位點以構建攜帶mETl基因的F基因缺陷的 SeV cDNA(pSeV18+mETl/AF)(圖 1)。[實施例4]攜帶mET-1與CTB的融合基因的SeV載體的構建使用CTB-Αβ 42NotI片段(SEQ ID NO 14)作為模板，進行PCR以合成CTB-mETl片段(SEQ ID N0:29)。所用的引物示于 SEQ ID NO 17、22、23 和 30。接著，用 XhoI 和 EcoRV 消化CTB-mETl片段，并用B10I和EcoRV消化上述制備的pCI_mETl。構建了附有仙臺病毒轉錄信號的CTB-mETl基因NotI片段(SEQ ID NO 31)。用NotI 消化 F基因缺陷的 kV 載體(TO 00/70070) (pSeV18+NotI/Δ F)的 DNA，并將CTB-mETl基因NotI片段(SEQ ID NO 31)插入NotI位點以構建攜帶CTB-mETl基因的 F 基因缺陷的 SeV cDNA (pSeV18+CTB-mETl/ Δ F)(圖 1)。[實施例5]攜帶mPYY基因的SeV載體的構建使用附接有IgK分泌信號的人Αβ42基因(SEQ ID Ν0:1)作為模板，通過PCR 合成了 mETl片段(SEQ ID N0:33)，其中IgK分泌信號附于小鼠PYY肽基因(登錄號 NM_145435. 1)。所用的引物示于 SEQ ID NO :7、34、35、36 和 37。接著，用 XhoI 和 EcoRV 消化mPYY片段，并用EcoRV和NotI消化EcoRV-EIS片段(SEQ ID NO 9)。將所得的片段亞克隆入pCI載體以構建mPYY基因NotI片段，其附接有仙臺病毒轉錄信號(pCI_mETl) (SEQ IDNO 38)。將F 基因缺陷的 SeV 載體(W0 00/70070) (pSeV18+NotI/Δ F)的 cDNA 用 NotI 消化，并將mPYY基因NotI片段(SEQ ID NO 38)插入NotI位點以構建攜帶mPYY基因的F基因缺陷 SeV cDNA(pSeV18+mPYY/AF)(圖 1)。[實施例6]攜帶mPYY與CTB的融合基因的SeV載體的構建使用CTB-Αβ 42NotI 片段(SEQ ID NO 14)作為模板，進行 PCR 以合成 CTB-mPYY 片段(SEQ ID N0:40)。所用的引物示于SEQ ID NO 17、34、35、36和41。接著，用XhoI和 EcoRV 消化 CTB-mPYY 片段，并用 EcoRV 和 NotI 消化 EcoRV-EIS 片段(SEQ ID NO 9)。將所得的片段亞克隆入PCI載體以構建CTB-mPYY基因NotI片段，其附接有仙臺病毒轉錄信號 (SEQ IDNO 42)。用NotI 消化 F基因缺陷的 kV 載體(WO 00/70070) (pSeV18+NotI/Δ F)的 DNA，并將CTB-mPYY基因NotI片段(SEQ ID NO 42)插入NotI位點以構建攜帶CTB-mPYY基因的 F 基因缺陷的 SeV cDNA (pSeV18+CTB-mPYY/ Δ F)(圖 1)。[實施例7]攜帶mGLP-2基因的SeV載體的構建使用附接有igk分泌信號的人a β 42基因(seq ID ν0:1)作為模板，通過PCR合成了 mGLP-2片段(SEQ ID N0:44)，其中IgK分泌信號附接于小鼠GLP-2肽基因(登錄號 NM_175681. 2)。所用的引物示于 SEQ ID NO :7、45、46、47 和 48。接著，用 XhoI 和 EcoRV 消化 mGLP-2 片段，并用 EcoRV 和 NotI 消化 EcoRV-PstI-EIS 片段(SEQ ID NO :25)。將所得的片段亞克隆入pCI載體以構建mGLP-2基因NotI片段，其附著仙臺病毒轉錄信號(pCI_mETl) (SEQ ID NO 49)。將F 基因缺陷的 SeV 載體(WO 00/70070) (pSeV18+NotI/Δ F)的 cDNA 用 NotI 消化，并將mGLP-2基因NotI片段(SEQ ID NO 49)插入NotI位點以構建攜帶mGLP-2基因的 F 基因缺陷的 SeV cDNA (pSeV18+mGLP-2/ Δ F)(圖 1)。[實施例8]攜帶GLP-2與CTB的融合基因的SeV載體的構建使用CTB-Αβ 42NotI 片段(SEQ ID NO 14)作為模板，進行 PCR 以合成 CTB-mGLP_2 片段(SEQ ID N0:51)。所用的引物示于SEQ ID NO :17、45、46、47和52。接著，用XhoI和 EcoRV 消化 CTB-mGLP-2 片段，并用 EcoRV 和 NotI 消化 EcoRV-PstI-EIS 片段(SEQ ID NO 25)。將所得的片段亞克隆入pCI載體以構建CTB-mGLP-2基因NotI片段，其附接有仙臺病毒轉錄信號(SEQ ID NO 53)。用NotI 消化 F基因缺陷的 kV 載體(TO 00/70070) (pSeV18+NotI/Δ F)的 DNA，并將CTB-mGLP-2基因NotI片段(SEQ ID NO 53)插入NotI位點以構建攜帶CTB-mGLP-2基因的 F 基因缺陷的 SeV cDNA(pSeV18+CTB-mGLP-2/ Δ F)(圖 1)。[實施例9]攜帶Aβ 42基因的SeV載體的構建(I)A β 42基因的Not I片段的構建利用覆蓋人淀粉樣蛋白β肽序列(1-42) (SEQ ID NO 55)全長的多個引物進行 PCR，組裝成A β 42基因。在考慮人密碼子用法的基礎上對人A β 42的核苷酸序列進行了最優化。所得的序列具有這樣的結構，其中在N端側附接有IgK分泌信號，在C端側添加有仙臺病毒的轉錄信號(圖2，SEQ IDNO 56)。
構建方法如圖3所示。首先，將覆蓋IgK信號與Αβ42整個區域的6種長引物 Fl (SEQ ID NO :58)，F2(SEQ ID NO :59)，Rl(SEQ ID NO :60)，R2(SEQ ID NO :61)，R3(SEQ ID NO 62), R4(SEQ ID NO :63)混合起來。使用該混合物不加入模板而進行PCR。以所得PCR 產物作為模板進行第二輪PCR，使用導入了限制酶EcoRI的識別序列的2個引物Fl-I (SEQ ID NO 64)和R4-1(SEQ ID NO :65)。然后，將所得的PCR產物用限制酶EcoRI切割，亞克隆至PCI表達質粒(Promega公司)的EcoRI位點中，通過測序，選擇出正確具有正確序列的克隆。以選擇出的質粒作為模板，用添加了 NotI識別序列的引物Notl-Αβ _F(SEQ ID NO 66)和添加了仙臺病毒轉錄信號和NotI識別序列的引物NotI-polyA-R(SEQ ID NO :67) 進行PCR，所得的PCR產物用限制酶NotI消化，構建了目的Ai342NotI片段(圖2，SEQ ID NO 56)。(2)攜帶A β 42基因的仙臺病毒cDNA的構建將F 基因缺失型 kV 載體(W000/70070)的 cDNA (pkV18+NotI/Δ F)用 NotI 消化，在其NotI位點插入Ai3 42NotI片段，構建了攜帶Aβ 42基因的F基因缺失型 cDNA(pSeV18+A^ 42/AF)。[實施例10]攜帶Aβ 42與CTB的融合基因(CTB-A β 42)的SeV載體的構建(I)CTB-A β 42基因的NotI片段的構建CTB-A β 42的NotI片段具有下述結構包含分泌信號的霍亂毒素B亞基序列(SEQ ID NO 68)藉由GPGP氨基酸接頭連接到人淀粉樣蛋白β序列(1_42)的序列的N末端，而仙臺病毒的轉錄信號(圖4，SEQ ID NO 69)添加到其C末端。而且，為了增加表達效率，對于CTB和A β的堿基序列，按照人的密碼子用法進行了核苷酸序列的變更，但氨基酸序列不變。基因的構建通過使用覆蓋基因全長的長引物進行PCR來合成基因全長。具體地， 合成了 8種覆蓋CTB-Αβ區域的全長的長引物CTB-A0F-1(SEQ IDNO :71)，F_2 (SEQ ID NO 72)，F-3 (SEQ ID NO 73)，F-4 (SEQ ID NO 74)，R-I (SEQ ID NO 75)，R-2 (SEQ ID NO 76), R-3 (SEQ ID NO :77)，R-4 (SEQ ID NO :78)]。使用這8種引物的混合物進行PCR，從而得到了對應于從N端到Αβ 42的片段。為了合成含仙臺病毒轉錄信號的C端側的片段，以pCI 質粒(Promega公司)為模板、用 2種引物 CTB-A β Fl-2 (SEQ ID NO :79)和 CTB-A β R5-2 (SEQ ID NO 80)進行PCR。PCR得到了覆蓋CTB-A β全長的PCR片段。將該PCR片段通過TA克隆亞克隆至pGEM-T fesy質粒(Promega公司)中，確認核苷酸序列后，擴增質粒，將該質粒用限制酶NotI進行消化，制備了目的CTB-A β 42NotI片段(SEQ ID NO :69)。(2)攜帶CTB-A β 42基因的仙臺病毒cDNA的構建將F 基因缺失型 kV 載體(TO00/70070)的 cDNA (pkV18+NotI/Δ F)用 NotI 消化， 在其NotI位點插入CTB-A β 42NotI片段，構建了攜帶CTB-A β 42基因的F基因缺失型SeV cDNA(pSeV18+CTB-Aβ 42/Δ F)。[實施例11]攜帶Aβ 42與IL_4的融合基因的SeV載體的構建(I)A β 42與IL-4的融合基因的NotI片段的構建Αβ42基因與小鼠IL-4的融合采用基于部分重疊的組裝PCR方法進行。利用含有Aβ42ECORI片段(實施例9:圖3)的質粒制備Aβ42基因。同時，通過下列程序將小鼠IL-4基因(SEQ ID N0:81)制備為cDNA。從小鼠(BALB/cA)的脾臟抽提 mRNA，使用IL-4特異性引物進行逆轉錄，用PCR進行擴增，并亞克隆至克隆質粒。將所得的具有小鼠IL-4cDNA作為插入序列的質粒用于構建。具體地，以小鼠IL-4質粒為模板，用2種引物NotI-IL4-F(SEQ ID NO :83)和引物 IL4-R(SEQ ID NO :84)進行 PCR。同時，以 Αβ 42 質粒為模板，用引物 Αβ 42_F(SEQ ID NO: 85)和引物 NotI-A β 42-R(SEQ ID NO :86)進行 PCR，得到了 IL-4 與 A β 42 的 PCR 片段。引物IL4-R和A β 42-F被設計成一部分相互重疊。這樣，通過將IL-4與A β 42的PCR片段混合作為模板，并用引物NotI-IL4-F和引物NotI-A β 42-R進行PCR，使2個基因融合為一個融合基因。將所得的PCR片段亞克隆至克隆質粒中。確認核苷酸序列后，用限制酶NotI進行切割，從而構建了含有A β 42與IL-4的融合基因的目的NotI片段(SEQ IDNO :87)。(2)攜帶A β 42基因的仙臺病毒cDNA的構建將F 基因缺失型 SeV 載體(TO00/70070)的 cDNA (pSeV18+NotI/Δ F)用 NotI 消化， 在其NotI部位插入上述制作的mIL4-Ai3 42NotI片段，構建了攜帶A β 42基因的F基因缺失型 SeV cDNA (pSeV18+mIL4_A β 42/ Δ F)。[實施例12]仙臺病毒載體的重構與擴增病毒的重構和擴增按照Li等的報道(Li，H. -0.等，J. Virology 74. 6564-6569， 2000 ；W000/70070)及其改進方法(W02005/071092)進行。由于使用的載體為F基因缺失型，利用了通過Cre/loxP表達誘導系統表達F蛋白質的F蛋白輔助細胞。該系統利用了 pCALNdLw 質粒(Arai，T.等，J.Virol. 72 1115-1121 (1988))，該質粒是設計為通過 Cre DNA重組酶誘導表達基因產物。按照&iito等方法(Saito，I.等，Nucl. Acid. Res. 23， 3816-3821,1995 ；Arai, Τ.等，J. Virol. 72，1115-1121，1998)，用表達 Cre DNA 重組酶的重組腺病毒(AxCANCre)感染該質粒的轉化子，來表達插入基因。采用上述方法，制備了攜帶 CTB-mCRF、CTB-mETl、CTB-mPYY、CTB_mGLP2、mCRF、 mETl、mPYY、mGLP2、A3 42、σΓΒ-Αβ 42、或mIL4-A3 42 的各基因的 F基因缺失型載體(分別為 SeV18+CTB-mCRF/ Δ F, SeV18+CTB_mETl/ Δ F, SeV18+CTB_mPYY/ Δ F, SeV18+CTB_mGLP2/ Δ F,SeV18+mCRF/Δ F,SeV18+mETl/Δ F,SeV18+mPYY/Δ F,SeV18+mGLP2/Δ F,SeV18+Aβ 42/ Δ F, SeV18+CTB-Aβ 42/Δ F, SeV18+mIL4_A β 42/Δ F)。[實施例13]攜帶Aβ 42與PEDI的融合基因的SeV載體的構建(1)攜帶Αβ 42-PEDI融合基因的SeV載體cDNA的構建通過使用下列10種引物PCR擴增了 PEDI基因PEDI-IF (SEQ ID NO :89)、 PEDI-2R(SEQ ID NO :90)、PEDI-3F(SEQ ID NO :91)、PEDI_4R(SEQID NO :92)、PEDI-5F(SEQ ID NO :93)、PEDI-6R(SEQ ID NO :94)、PEDI-7F (SEQ ID NO :95)、PEDI_8R(SEQ ID NO :96)、 PEDI-9F(SEQ ID NO :97)和 PEDI_10R(SEQ ID NO :98)。通過下列程序將 PEDI 基因和 A β 42 融合在一起并插入載體。以攜帶Ai3 42SeV的載體作為模板、使用引物％VF6(SEQID NO 99)和S-PEDI-C(SEQ ID NO :100)進行PCR得到片段1。以同一模板使用引物PEDI-Ab-N(SEQ ID NO 101)和SEVR280 (SEQ ID NO :102)進行PCR得到片段3。以PEDI基因為模板、使用引物 PEDI-N(SEQ ID NO 103)和 PEDI—C(SEQ ID NO 104)進行 PCR 得到片段 2。使用這些片段作為模板，通過重疊PCR制備PEDI-A β 42NotI片段(SEQ ID N0:105)。將所得的片段插入pSeV18+/ Δ F的NotI位點，制備攜帶PEDI-A β 42融合基因的F缺失型SeV載體的cDNA。(2)攜帶PEDI-A β 42的F缺失型SeV載體的重構如實施例4所述，根據Li等的方法(Li，Η.-0.等，J. Virology 74. 6564-6569(2000), W000/70070)及其改進方法(W02005/071092),重構了攜帶 PEDI-A β 42 基因的 SeV 載體(SeV18+PEDI_A β 42/Δ F)。[實施例14]CTB融合對mCRF表達的作用SeV載體用于CTB_mCRF融合蛋白表達和SeV載體用于mCRF表達的表達能力的比較(1)將 BHK21 細胞用 SeV18+mCRF/ Δ F 和 SeV18+CTB_mCRF/ Δ F 感染，以評價 mCRF 和CTB-mCRF肽的表達水平。將BHK21細胞以IxlO6個播種于膠原包被的6孔板，用使用無血清培養基(VPSFM)稀釋成MOI為10的各SeV載體進行感染。1小時后向板中加入含10% FBS的GMEM。24小時后更換為無血清培養基(VPSFM)，48小時后回收培養上清和細胞，制備了細胞裂解物。未感染的細胞用作對照。(2)利用ELISA進行定量使用CRF ELISA 試劑盒(Yanaihara Institute Inc.)對 CRF 進行定量。表達水平的評價通過使用讀板器進行吸光度測定(0. D. 450)來進行。結果如圖5所示。結果顯示CTB-mCRF的表達水平顯著增加，而mCRF表達水平可忽略。[實施例15]CTB融合對mET_l表達的作用SeV載體用于CTB-mET-1融合蛋白表達和SeV載體用于mET-1表達的表達能力的比較(1)將 BHK21 細胞用 SeV18+mET_l/ Δ F 禾口 SeV18+CTB-mET_l/ Δ F 感染，以評價 mET-1和CTB-mET-1肽的表達水平。將BHK21細胞以IxlO6個播種于膠原包被的6孔板，用使用無血清培養基(VPSFM)稀釋成MOI為10的各SeV載體進行感染。1小時后向板中加入含10% FBS的GMEM。24小時后更換為無血清培養基(VPSFM)，48小時后回收培養上清和細胞，制備了細胞裂解物。未感染的細胞用作對照。(2) ELISA 定量ETl的定量如下進行通過在將樣品直接固化于96孔板并用1 % BSA/TBS-T緩沖液封閉所述板之后，用抗小鼠ETl抗體和過氧化物酶標記的抗兔IgG抗體進行檢測。表達水平的評價通過使用讀板器進行吸光度測定(0.D.450)來進行。結果如圖6所示。CTB-mET-1的表達水平顯著增加，而mET_l表達水平可忽略。[實施例16]CTB融合對mPYY表達的作用SeV載體用于CTB_mPYY融合蛋白表達和SeV載體用于mPYY表達的表達能力的比較(1)將 BHK21 細胞用 SeV18+mPYY/ Δ F 和 SeV18+CTB_mPYY/ Δ F 感染，以評價 mPYY 和CTB-mPYY肽的表達水平。將BHK21細胞以IxlO6個播種于膠原包被的6孔板，用使用無血清培養基(VPSFM)稀釋成MOI為10的各SeV載體進行感染。1小時后向板中加入含10% FBS的GMEM。24小時后更換為無血清培養基(VPSFM)，48小時后回收培養上清和細胞，制備了細胞裂解物。未感染的細胞用作對照。(2)利用ELISA進行定量使用大鼠PYY ELISA 試劑盒(Yanaihara Institute Inc.)對 mPYY 進行定量。表達水平的評價通過使用讀板器進行吸光度測定(0.D.450)來進行。
結果如圖7所示。CTB-mPYY的表達水平顯著增加，而mPYY的表達水平可忽略。[實施例17]CTB融合對mGLP_2表達的作用SeV載體用于CTB-mGLP_2融合蛋白表達和SeV載體用于mGLP-2表達的表達能力的比較(1)將 BHK21 細胞用 SeV18+mGLP_2/Δ F 和 SeV18+CTB-mGLP_2/Δ F 感染，以評價 mGLP-2和CTB-mGLP-2肽的表達水平。將BHK21細胞以IxlO6個播種于膠原包被的6孔板， 用使用無血清培養基(VPSFM)稀釋成MOI為10的各SeV載體進行感染。1小時后向板中加入含10% FBS的GMEMJ4小時后更換為無血清培養基(VPSFM)，48小時后回收培養上清和細胞，制備了細胞裂解物。未感染的細胞用作對照。(2)利用ELISA進行定量使用GLP-2ELISA 試劑盒(Yanaihara Institute he.)對 mGLP-2 進行定量。表達水平的評價通過使用讀板器進行吸光度測定(0.D.450)來進行。結果如圖8所示。CTB-mGLP-2的表達水平顯著增加，而mGLP_2的表達水平可忽略。[實施例18]CTB融合、PEDI融合、IL_4融合的效果的比較用于表達CTB-A β 42 融合蛋白的SeV載體、用于表達PEDI-A β 42融合蛋白的SeV載體和用于表達IL_4_Ai342 融合蛋白的SeV載體的表達能力的比較(1)將 BHK21 細胞用 SeV18+A β 42/Δ F、SeV18 + IL_4_A β 42/Δ F、 SeV18+PEDI-A β 42/ Δ F、和 &V18+CTB-A β 42/Δ F 感染，進行了 A β 42 抗原水平的評價。將 ΒΗΚ21細胞以IxlO6個/孔播種于膠原包被的6孔板，用使用無血清培養基(VPSFM)稀釋成 MOI 10的各SeV載體進行感染。1小時后向板中加入含10% FBS的GMEM，24小時后更換為無血清培養基(VPSFM)，48小時后回收培養上清和細胞，制備了細胞裂解物。(2)利用ELISA進行定量A β 42使用和光純藥工業的人A β 42 ELISA試劑盒來定量。表達水平的評價通過使用讀板器進行吸光度測定(O.D. 450)來進行。結果如圖9 所示。Aβ 42 基本上未表達，而 IL-4-Aβ 42、PEDI-Aβ 42、CTB-Aβ 42 表達增加。細胞內的表達水平分別是kkAβ 42的1395倍、171. 5倍、1沈08倍。[實施例19]CTB融合對A β 42表達的效果單獨表達A β 42的SeV載體和表達 CTB-A β 42融合蛋白的SeV載體的表達能力的比較將前一天播種的匯合的ΒΗΚ-21細胞(3χ105個細胞/孔播種，12-孔板)用攜帶單獨A β 42的SeV載體或攜帶CTB-A β 42的SeV載體以MOI 10進行感染，然后在VP-SFM培養基(lml/孔)中以37°C、5%C02進行培養。在第4天回收培養上清和細胞裂解物。將培養上清通過丙酮沉淀濃縮10倍，用IxSDS上樣緩沖液從其制備樣品。細胞裂解物使用150 μ 1/ 孔的Ix SDS上樣緩沖液進行了制備。將制備好的培養上清和細胞裂解物于98°C加熱10分鐘。然后，進行SDS-PAGE (使用15% Wako凝膠)/Western印跡(使用6E10抗體)，并以1、 0.5,0. 25,0. 125ng/泳道的A β 42肽作為對照進行了蛋白定量。單獨攜帶A β 42的SeV載體的Αβ的表達量在細胞裂解物中只有4. ^g/孔，在上清中只有7. hl0_3ng/孔。另一方面，攜帶A β 42-CTB融合基因的SeV載體的A β表達量在細胞裂解物中是2500ng/孔、在上清中是200ng/孔。即，分別在裂解物中大幅提高至568倍，在上清中大幅提高至27778倍。[實施例21]攜帶Aβ 15與CTB的融合基因(CTB-A β 15)、以及A β 15的串聯型與CTB的融合基因(CTB-A β 15x2, CTB-A β 1切4，或者CTB-A β 15x8)的SeV載體的構建(1) CTB-A β 15基因NotI片段的構建CTB-Aβ 15基因的NotI片段是以CTB-Aβ 42基因為基礎構建的(圖10)。以含有CTB-A β 42基因NotI片段的質粒作為模板，使用添加了 EcoRV限制位點的 2 種引物 Αβ 15-EcoR-R(SEQ ID NO :107)和 A β 15-EcoR-F (SEQID NO :108)進行反向 PCR， 將所得的PCR產物用限制酶EcoRV進行切割。然后，通過自連接得到含有CTB-Ai3 15片段的質粒。通過將該質粒用限制酶NotI進行切割，得到了目的CTB-Αβ 15基因的NotI片段 (SEQ ID NO 109)。(2) CTB-串聯型 A β 15 基因(CTB-A β 15x2, CTB-A β 15x4，或者 CTB-A β 15x8)的 NotI片段的制備CTB-串聯A β 15基因的NotI片段是利用2種基因構建的(圖11)。該方法除去含有CTB-A β 42的質粒的A β 42區域，并向質粒中導入限制酶位點。然后通過PCR向該位點中插入添加有限制酶位點的串聯Αβ 15片段。具體地，以含有來自CTB-Aβ 42的NotI片段(實施例10 ；SEQ ID NO 69)的質粒作為模板，使用添加有限制酶SmaI位點的2種引物CTB-SmaI-R(SEQ ID NO :111)和 CTB-SmaI-F (SEQ ID NO 112)進行反向PCR，將所得的PCR產物用SmaI進行切割，通過自連接得到了 Αβ 42缺損的質粒。然后，在該質粒的SmaI位點插入Αβ 15串聯片段。串聯Αβ 15片段是以含有Αβ 15的8串聯NotI片段(SEQ ID NO :113)的質粒為基礎通過下述方法制作的。以該質粒為模板，使用添加限制酶位點的2種引物 A β 15-SmaI-F(SEQ ID NO :115)和 A β 15_EcoRV-R(SEQ ID NO :116)進行 PCR,得至Ij A β 15 的重復數不同的PCR產物。對這些產物進行TA克隆。確認核苷酸序列后，用2種限制酶 SmaI、EC0RI進行切割，得到平滑末端的串聯Αβ15片段。將該片段插入Aβ 42缺損質粒的 SmaI位點。擴增得到的質粒，并用限制酶NotI進行切割，得到了目的CTB-A β 15x2NotI片段 (SEQ IDNO :117)，CTB-A β 15x4NotI 片段(SEQ ID NO :119)和 CTB-A β 15x8NotI 片段(SEQ ID NO :121)。(3)攜帶 CTB-A β 15、CTB-A β 15x2, CTB-A β 15x4 或 CTB-A β15χ8 基因仙臺病毒 cDNA的構建將F 基因缺失型載體(W000/70070)的 cDNA(pkV18+NotI/ΔF)用 NotI 消化，并在其 NotI 位點分別插入 CTB-A β 15、CTB-A β 15x2、CTB-A β 15x4, CTB-A β 15x8 片段， 構建了攜帶 CTB-A β 15、CTB-A β 15x2, CTB-A β 15x4、或 CTB-A β 15x8 基因的 F 基因缺失型 SeV cDNA (pSeV18+CTB-A β 15/ Δ F、pSeV18+CTB-A β 15x2/ Δ F、pSeV18+CTB-A β 15x4/ Δ F、 pSeV18+CTB-Aβ 15x8/Δ F)。[實施例22]A β肽表達能力的比較(I)Western 印跡通過Western印跡法評價了構建的載體的感染力和表達。將感染了 SeV載體的細胞的勻漿液和培養上清與等量的SDS-PAGE樣品緩沖液混合，于98°C加熱熱變性5分鐘。用15%的丙烯酰胺凝膠對混合物進行SDS-PAGE，然后采用半干轉印法轉印到PVDF膜上。用5%牛乳/TBS-T進行封閉后，將膜與抗Αβ抗體(6Ε10) 溫育，然后與作為第二抗體的HRP標記抗小鼠IgG溫育。使用化學發光底物SuperSignalWest Femto通過CCD照相機進行檢測。結果顯示，CTB-Aβ 42、CTB-A β 15、CTB-A β 15x2, CTB-A β 15x4, CTB-A β 15x8 在 BHK細胞內被表達并分泌到培養基中。還顯示CTB-Ai3 15x8的表達水平高于CTB-Aβ 42， CTB-A β 15x8向培養基中的分泌的量也明顯多于CTB-A β 42 (圖12)。(2)GM1-ELISA使用固定化有神經節苷脂GMl的平板評價了 CTB對GMl的結合。將神經節苷脂GMl (5 μ g/mL)固定化于96孔板(Nunc，MaxiSorp plate)的各孔， 用20% BlockingOne (NACALAI TESQUE)封閉后，向孔中加入感染了 SeV載體的細胞的培養上清(20倍 2000000倍稀釋)。與HRP標記的抗體6E10溫育后，使用TMB生色試劑進行檢測。結合量的評價通過使用讀板器進行吸光度測定(0.D.450)來進行。其結果顯示向培養基中分泌的CTB-A β 42、CTB-A β 15、CTB-A β 15x2, CTB-A β 1切4、和 CTB-A β 15x8 均與 GMl 結合。CTB-A β 15x8 的結合量為 CTB-A β 42 的 10 倍， CTB-A β 15的結合量為CTB-A β 15x8的100倍，這提示A β 15的重復數增加，則對GMl的結合能力降低(圖13)。[實施例23]構建的各種SeV載體在正常小鼠中誘導抗Αβ抗體的能力的評價(1)正常小鼠(肌肉內施用CTB-A β 42與CTB-A β 15x8的比較)對于C57BL/6N小鼠以各^lO7CIU/只的滴度肌肉內施用(右后肢)攜帶了 CTB-Ai3 42基因、CTB-Aβ 15x8基因、或GFP基因的SeV載體，以評價抗體效價。上述處置 14天后，從小鼠采集血液，以測定血漿中的抗Aβ抗體水平。將Αβ 1-42肽(5 μ g/mL)固定化于 96 孔板(Nunc, MaxiSorp plate)的各孔。用 20% BlockingOne (NACALAI TESQUE) 進行封閉后，加入小鼠血漿(300 300000倍稀釋)，與過氧化物酶標記的小鼠IgG抗體反應后，使用TMB生色試劑進行檢測。Αβ抗體效價的評價通過使用讀板器進行吸光度測定 (0.D.450)來進行。使用抗A β抗體(6Ε10)作為標準抗體。結果顯示，在CTB-A β 42基因施用組(n = 6)和CTB-A β 15x8基因施用組(η = 6) 中抗Αβ抗體效價提高，而作為對照的GFP基因施用組(n = 6)未見抗Αβ抗體效價的提高(圖14)。CTB-A β 15x8基因施用組的抗體效價為CTB-A β 42基因施用組的12. 23倍。(2)正常小鼠(肌肉內、皮內、鼻內施用)對于C57BL/6N小鼠，以5xl06CIU/只或hl(fCIU/只的滴度鼻內、皮內、和肌肉內 (右后肢)施用攜帶了 CTB-Αβ 15x8基因的SeV載體；作為對照組，以5xl07CIU/只的滴度肌肉內施用(右后肢)攜帶了 GFP基因的SeV載體，以評價抗體效價。上述處置14天后， 從小鼠采集血液，測定抗Αβ抗體的血漿水平。結果顯示，除對照組外，全部的施用組中抗Αβ抗體效價均提高。皮內施用組的抗體效價比其它施用組低。鼻內施用組的抗體效價比同滴度的肌肉內施用組高(圖15)。(3)正常小鼠(鼻內施用)對于C57BL/6N小鼠，以5xl07CIU/只的滴度鼻內施用攜帶了 CTB-Aβ 15、 CTB-A β 15x2, CTB-A β 1切4、或CTB-A β 15x8的SeV載體、以及作為對照的攜帶GFP基因的 SeV載體，進行了抗體效價的評價。結果顯示，所有施用組中與對照組相比抗體效價均顯著地提高。特別地，與 CTB-A β 15x8施用組相比，在CTB-A β 15、CTB-A β 15x4施用組中獲得了更高的抗A β抗體效價(圖16)。[實施例24]構建的各種SeV載體對正常小鼠中抗Αβ抗體誘導的加強效果的評價(1)正常小鼠(肌肉內施用)利用純化CTB_Ai3 42蛋白進行的加強免疫對于C57BL/6N小鼠，以各hl(fCIU/只的滴度肌肉內施用(右后肢)攜帶了 CTB-A β 42基因的SeV載體。14和觀天后，分別以20 μ g/PBS/只、100 μ g/PBS/只、或 100yg/IFA(弗氏不完全佐劑)/只肌肉內施用(右后肢)大腸桿菌生產的CTB-Aβ 42蛋白，以評價抗體效價。上述處置后每14天一次從小鼠采集血液，測定血漿中的抗Αβ抗體水平。其結果顯示，在用CTB-A β 42基因進行免疫、并用CTB-A β 42蛋白加強免疫的組中抗A β抗體的水平顯著地提高(圖17)。2次加強免疫后的A β抗體效價在20 μ g加強免疫組中為32 μ g/ml、IOOyg加強免疫組中為107yg/ml, [100yg+IFA]加強免疫組中為 25. 9μ g/ml。(2)正常小鼠(肌肉注射)利用SeV載體進行的加強免疫[1]對于C57BL/6N小鼠，以^lO7CIU/只的滴度肌肉內施用(右后肢)攜帶了 CTB-A β 42基因或CTB-A β 15x8基因的SeV載體，56天后以相同滴度肌肉內施用(右后肢) 相同SeV載體，以評價抗體效價。上述處置14、28天后，從小鼠采集血液，測定抗A β抗體的血漿水平。其結果顯示，在CTB_Ai3 15x8基因加強免疫組中抗Αβ抗體效價得到了顯著的提高(圖18)。同時，在CTB-Ai3 42基因加強免疫組中Αβ抗體效價的提高少于上述的 CTB-A β 15x8基因加強免疫組。(3)正常小鼠(肌肉注射)利用SeV載體進行加強免疫[2]對于C57BL/6N小鼠，以^clO6CIU/只或^dO7CIU/只的滴度肌肉內施用(右后肢) 攜帶了 CTB-A β 15x8基因或CTB-A β 42基因的kV載體，56天后以相同滴度肌肉內施用(右后肢)相同SeV載體，以評價抗體效價。上述處置14和28天后，從小鼠采集血液，測定抗A β抗體的血漿水平。其結果顯示，兩種載體均產生了加強免疫的效果，尤其是在CTB-Αβ 15x8基因加強免疫組中A β抗體效價的提高更顯著(圖19)。(4)正常小鼠(鼻內施用)利用SeV載體進行的加強免疫對于C57BL/6N小鼠，以^lO6CIU/只或^lO7CIU/只的滴度鼻內施用攜帶了 CTB-A β 15x8基因的SeV載體，56天后以相同滴度鼻內施用相同SeV載體，以評價抗體效價。上述處置14、28天后，從小鼠采集血液，測定抗A β抗體的血漿水平。其結果顯示，在CTB-Αβ 15x8基因加強免疫組中，以3/3的比例得到了顯著的Αβ 抗體效價的提高(圖20)。[實施例25]利用構建的各種SeV載體進行的在APP模型小鼠中的有效性評價 肌肉注射(1)抗Αβ抗體效價對于作為阿爾茨海默病模型小鼠的APP轉基因小鼠(Tg2576) (13個月齡)，以5x107CIU/ 只肌肉內施用(右后肢)SeV18+CTB-A β 18x5/ Δ F (也記作 CTB-A β 15x8)、或 SeV18+CTB-A β 42/ Δ F (也記作CTB-A β 42)、或作為對照的攜帶了 GFP基因的SeV載體 (SeV18+GFP/ Δ F ；以下也記作“GFP”)。14和28天后，對于CTB-A β 42基因施用組中的一半小鼠肌肉內施用(右后肢)大腸桿菌生產的CTB-Aβ 42蛋白。SeV載體施用起14、28、42、 56天后，測定了血漿中的抗Αβ抗體效價。其結果顯示，在CTB-Αβ 15x8基因施用組中觀察到了顯著的抗Αβ抗體效價的提高。在CTB-Ai342基因施用組中，一半的小鼠的抗Αβ抗體效價升高幾乎可以忽略。抗Αβ 抗體效價的提高也比CTB-Αβ 15x8基因施用組小。在CTB-Αβ 42蛋白加強免疫組中，加強免疫未增加抗A β抗體的效價(圖21)。(2)腦內 Αβ 水平ELISASeV載體施用開始56天后，從上述APP小鼠取腦組織，通過ELISA測定腦組織左半球中的Αβ水平。將腦組織在TBS中進行超聲波勻漿，35，OOOg離心1小時后，采集上清作為Αβ可溶性級分。將沉淀在10%甲酸中進行超聲波勻漿，然后用IM Tris進行中和。采集其作為Αβ不溶性級分。使用和光純藥工業的Ai3 42ELISA試劑盒和Ai3 40ELISA試劑盒， 測定了腦內Αβ的水平。其結果顯示，與GFP基因施用組中相比，在CTB-Aβ 15x8基因施用組中，不溶性級分中的Aβ水平降低至80%左右。在CTB-Aβ 42基因施用組中未見Aβ水平的降低。同時，在CTB-Aβ 42蛋白加強免疫組中Aβ水平僅有稍微降低。在CTB-Ai3 15x8 基因施用組中，與GFP基因施用組相比，可溶性級分中的Αβ水平降低至50%左右。在 CTB-Aβ 42基因施用組中Aβ水平未降低。在CTB-Aβ 42蛋白加強免疫組中，Aβ水平降低至 60 70% (圖 22)。(3) SeV18+CTB-A β 15x8/ Δ F 消除老年斑的效果將仙臺病毒載體肌肉內施用給小鼠。在施用后8周(15個月齡)的時間點上將各組中的小鼠解剖。為了組織病理學檢驗，將右腦半球浸漬于10%中性緩沖福爾馬林液中加以固定，石蠟包埋后，從距離腦正中裂約2mm的位置處的腦組織制備縱剖切片。用70%甲酸進行處理上述組織切片以便檢測A β蛋白和老年斑。用5% H2O2滅活內源性過氧化物酶活性。與抗A β抗體(6Ε10抗體、1000倍稀釋)進行反應后，加入過氧化物酶標記的第二抗體，進行DAB生色。此外，使用與顯微鏡相連接的3C⑶照相機獲取圖像。對每個樣品的 20-30張圖像文件進行合并(圖23)，使用圖像解析軟件NIH image，對于全部樣品采用相同的條件測定了嗅球、大腦新皮質和海馬各區域中Αβ蓄積部分所占的面積，計算出Αβ蓄積區域在各測定區中所占的比例。此外，對此測定中使用的老年斑的個數進行了比較。如圖 M所示，其結果顯示老年斑面積百分比有減少傾向，特別是在海馬中。(4)施用 SeV18+CTB_A β 15x8/ Δ F 的安全性評估如(3)中描述的那樣，獲得來源于處理組和對照組的施用后8周時(15個月齡) 的HE染色和抗rta-Ι抗體(小膠質)染色的石蠟切片樣品，評估了其中樞神經系統中的炎癥細胞浸潤和小膠質活化情況。其結果顯示，對于對照組和處理組，在腦的任何部位均完全檢測不到浸潤的炎癥細胞。這證實了本發明的載體不引起中樞神經系統中的炎癥。此外，在兩組動物的老年斑周圍觀察到了小膠質的活化，然而，在載體施用組的動物中，存在老年斑數目減少的傾向，與之平行地，也存在小膠質所占面積比率減少的傾向。工業實用性
本發明使得增加從RNA病毒載體的重組蛋白的表達水平成為可能。可通過使用本發明的基因轉移RNA病毒載體來實現有效的基因治療、基因接種、單克隆抗體制備等。
權利要求
1.一種編碼重組蛋白的RNA病毒載體，其中所述蛋白作為與A β 5毒素B亞基的融合蛋白被編碼。
2.權利要求1的載體，其中所述ΑΒ5毒素B亞基為霍亂毒素B(CTB)。
3.權利要求1或2的載體，其中所述重組蛋白是120個或更少氨基酸的肽。
4.權利要求3的載體，其中所述重組蛋白是50個氨基酸或更少的肽。
5.權利要求1至4中任一項的載體，其中所述重組載體是神經肽或內分泌肽。
6.權利要求1至5中任一項的載體，其中所述重組蛋白是具有低溶解性的蛋白。
7.權利要求1至6中任一項的載體，其中所述RNA病毒載體是負鏈RNA病毒載體。
8.—種藥物組合物，包含權利要求1至7中任一項的載體和藥學上可接受的擔載體。
9.一種導入了權利要求1至7中任一項的載體的細胞。
10.一種產生重組蛋白的方法，包括表達權利要求1至7中任一項的載體的步驟。
11.一種產生表達重組蛋白的能力增強的RNA病毒載體的方法，包括產生編碼融合蛋白的RNA病毒載體的步驟，所述融合蛋白中重組蛋白與ΑΒ5毒素B亞基融合。
12.權利要求11的方法，其中所述ΑΒ5毒素B亞基是霍亂毒素B(CTB)。
13.權利要求11或12的方法，其中所述重組蛋白是120個或更少氨基酸的肽。
14.權利要求13的方法，其中所述重組蛋白是50個或更少氨基酸的肽。
15.權利要求11至14中任一項的方法，其中所述重組蛋白是神經肽或內分泌肽。
16.權利要求11至15中任一項的方法，其中所述重組蛋白是具有低溶解性的蛋白。
17.權利要求11至16中任一項的方法，其中所述RNA病毒載體是負鏈RNA病毒載體。
18.一種增加重組蛋白從RNA病毒載體的表達水平的方法，包括將重組蛋白作為與ΑΒ5 毒素B亞基的融合蛋白從RNA病毒載體表達的步驟。
19.權利要求18的方法，其中所述ΑΒ5毒素B亞基為霍亂毒素B(CTB)。
20.權利要求18或19的方法，其中所述重組蛋白是120個或更少氨基酸的肽。
21.權利要求20的方法，其中所述重組蛋白是50個或更少氨基酸的肽。
22.權利要求18至21中任一項的方法，其中所述重組蛋白是神經肽或內分泌肽。
23.權利要求18至22中任一項的方法，其中所述重組蛋白是具有低溶解性的蛋白。
24.權利要求18至23中任一項的方法，其中所述RNA病毒載體是負鏈RNA病毒載體。
25.一種包含權利要求1至7中任一項的載體的病毒樣顆粒。
全文摘要
本發明提供了增強從RNA病毒載體的蛋白表達的方法和具有增強的蛋白表達能力的RNA病毒載體。本發明人通過將蛋白與AB5B蛋白融合從RNA病毒載體表達成功地顯著增加了蛋白表達水平。可通過使用本發明的基因轉移RNA病毒載體實現有效的基因治療、基因接種、單克隆抗體制備等。
文檔編號A61P43/00GK102272302SQ200980153258
公開日2011年12月7日 申請日期2009年10月30日 優先權日2008年10月31日
發明者井上誠, 佐伯晃一, 巖崎仁, 朱亞峰, 游軍, 田畑壽晃, 長谷川護 申請人:生物載體株式會社