專利名稱：一種afp重組蛋白和體外重組表達的方法
一種AFP重組蛋白和體外重組表達的方法[技術領域]
本發明涉及AFP重組蛋白和體外重組表達的方法，具體涉及一種人工信號肽-AFP-609aa-6his的重組蛋白和哺乳動物瞬時表達系統體外重組表達方法。[背景技術]
原發性肝細胞癌(primaryhepatocellular carcinoma，PHC,簡稱肝癌)是常見的惡性腫瘤之一，全球年發病病例大約為120萬人。目前，肝癌治療的總體療效仍很不理想，臨床上肝癌的治療方法主要有外科切除、 肝移植等。外科切除的病人的復發率很高，術后3年復發率為50%，5年復發率為70%。肝移植治療，尤其是活體肝移植雖然取得了一定的進展，但卻面臨著供體來源缺乏等問題。因此，臨床上迫切需要研究和發展新的治療肝癌的方法。近年來，隨著免疫學和分子生物學基礎理論研究的迅猛發展，以及人們對肝癌細胞生物學特性認識的加深，肝癌免疫治療成為新的腫瘤治療方法。目前已知的可能成為肝癌免疫治療的靶抗原有AFP、MAGE家族、HBV/HCV病毒抗原，以及一些癌基因(myc、fos、ras)坐寸ο
AFP是人體胎兒期血液中出現的一種特殊蛋白質。它在胎兒的肝細胞內合成。 AFP在成人血清中含量極微，但在肝細胞功能發生異常，特別在患有原發性肝細胞癌時，血清中又可出現AFP升高，所以臨床上常常借助AFP的檢查作為原發性肝細胞癌的輔助診斷。50% 80%的肝癌患者表達AFP，并且在血清中的濃度可能超過I mg/ml。在人體發育過程中，T細胞庫內針對AFP的特異性CTL克隆并未清除，適當條件和方法可以將之激活， Butterfield等將4條AFP表位肽包裹在不完全福氏佐劑里，對6例HLA A2.1陽性、表達 AFP的HCC病人進行皮內免疫，5例病人對其中的3條表位肽顯示了 AFP肽特異性T細胞擴增。基礎研究表明，DC是體內功能最強的專職抗原遞呈細胞，但由于肝癌患者體內DC大多數處于不成熟狀態，其功能存在障礙，誘導同種異體淋巴細胞增殖的能力降低。通過體外誘導DC成熟，并負載AFP來源的表位肽，激活特異性CTL殺傷肝癌細胞的能力。
哺乳動物表達系統在蛋白的起始信號、加工、分泌、糖基化方面具有獨特優勢，適合表達完整的大分子蛋白。由哺乳動物細胞翻譯后再加工修飾產生的外源蛋白質，在活性方面遠勝于原核表達系統及酵母、昆蟲細胞等真核表達系統，更接近于天然蛋白質。由于近幾年生物技術公司對哺乳動物表達系統的研發，相應的已經推出了較好的表達系統，大大提高了外源蛋白在哺乳系統里的表達量。隨著懸浮系統的日益成熟化，現在大規模瞬時表達外源蛋白已經成功，目前已經能達到mg至g級別。中國倉鼠卵巢細胞CHO作為表達宿主， 其優勢有以下幾點遺傳背景清楚，生理代謝穩定；與人的親緣關系接近，外源蛋白修飾準確；基因轉移和載體表達系統完善；耐受剪切力，便于大規模培養；被美國FDA確認為安全的基因工程受體細胞。[發明內容]
為了能夠大規模的制備高純度的AFP蛋白，本發明提供一種人工信號肽-AFP-609aa-6his的重組蛋白及其制備的方法。
為實現上述目的，設計一種人工信號肽-AFP-609aa_6his的重組蛋白，其特征在于其蛋白質序列如SEQ ID NO:1所示。
人工信號肽的堿基序列如SEQ ID NO 2所示。
本發明還包括一種用哺乳動物瞬時表達系統體外表達所述重組蛋白的方法，包括重組蛋白基因的合成，
其特征在于該方法包含以下步驟
a.利用基因合成技術，合成人工信號肽-AFP-609aa_6his序列
b.將人工信號肽-AFP-609aa_6his基因序列通過雙酶切克隆到pcDNA3. 1+載體中，構建pcDNA3.1+-AFP表達質粒，并進行質粒抽提，
C.將抽提得到的PCDNA3.1+-AFP質粒用PEI轉染進CHO-S懸浮細胞進行重組蛋白的表達，
d. 7天后分離純化得到的重組蛋白。
用N1-柱來分離純化。
用Hind III和EcoR I進行所述的雙酶切。
上述的重組蛋白能應用于肝癌治療藥物。
本發明主要包含四個方面的內容(1)利用基因合成技術，合成重組AFP DNA 序列，然后將序列克隆到pcDNA3. 1+載體中，構建pcDNA3.1+-AFP質粒，大規模制備 pcDNA3.1+-AFP質粒；(2)使用CHO懸浮表達系統表達重組AFP蛋白；(3)使用Ni — NTA 柱從懸浮 細胞上清液中分離純化重組AFP蛋白。(4)將純化后AFP蛋白刺激樹突狀細胞 (dendritic cells, DC),用活化后的DC細胞將T細胞激活，形成CTL殺傷H印G2細胞，用 MTT法檢測殺傷率。
本發明目的通過大規模瞬時懸浮CHO-S表達系統制備的人工合成AFP蛋白活性跟天然AFP蛋白相近，且得到的純度較高，內毒素含量低，無動物源性蛋白的污染，可以有望作為肝癌免疫治療的腫瘤抗原疫苗。[


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圖1是哺乳動物表達系統的質粒pcDNA3. 1+圖譜，
圖2是pcDNA3.1+-AFP的酶切鑒定瓊脂糖電泳圖，
圖3是SDS-PAGE分析純化后重組AFP蛋白圖，
圖4是Western-blot分析純化后重組AFP蛋白圖，
圖5是MTT法檢測經CTL處理的!fepG2細胞生長數據圖。
圖1中的圖譜的具體信息為
CMV 啟動子(CMV promoter) : bases 232-819
T7 啟動子 / 引物綁定位點(Τ7 promoter/priming site) : bases 863-882
多克隆位點(Mutiplecloning site) : bases 895-1010
反鏈的引物結合位點(pcDNA3.1/BGH reverse priming site): bases 1022-1039
BGH 多腺苷酸序列(BGH polyadenylation sequence) : bases 1028-1252
fl 復制起始位點(fl origin) : bases 1298—1726
sv40 早期啟動子和復制起始位點(SV40 early promoter and origin) : bases 1731-2074
新霉素抗性基因(開放讀碼框)Neomycinresistance gene (ORF) : bases 2136-2930
SV40 多腺苷酸信號(SV40 polyadenylation signal) : bases 3104-3234
PUC 復制起始位點(pUC origin) : bases 3617-4287 (互補鏈 complementary strand)
氛卡青霉素抗性基因Ampicillin resistance gene (bla) : bases 4432-5428 (互補鏈 complementary strand)
開放讀碼框(ORF): bases 4432-5292 (互補鏈 complementary strand)
核糖體結合位點(Ribosomebinding site) : bases 5300-5304 (互補鏈 complementary strand)
Bla 啟動子 Bla promoter (P3) : bases 5327-5333 (互補鏈 complementary strand)[具體實施方式
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為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，對本發明進行進一步詳細說明。本申請中的生產設備都是本領域的常用設備，應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
實施例1:
1.研究材料重組質粒PUC57-AFP為外包服務公司提供；DNA marker、限制性內切酶、T4連接酶等均購于Takara ；pcDNA3.1+、CHO-S和N1-NTA樹脂均為Invitrogen公司產品；CHO-S細胞培養基FreeStyle CHO均為Gibco的產品。PEI為Polysciences產品。
2.工作流程
(I)通過Hind III和EcoR I雙酶切pUC57_ AFP，將切下的AFP通過T4連接酶插入至同樣由Hind III和EcoR I雙酶切的pcDNA3.1+,構建成表達載體pcDNA3. 1+-AFP。
(2)制備感受態DH5 α，轉化pCDNA3.1+-AFP,平鋪在LB Amp+培養板，37°C孵箱過夜。挑3個單克隆，置5ml LB培養液中，37°C快搖過夜。小抽5ml培養物并且用小量抽提產物酶切鑒定，選取陽性克隆的培養物。選取一個陽性克隆進行500ml過夜擴增培養，然后把菌液倒進無菌離心管中，4°C離心，6000g離心15分鐘。按照大抽試劑盒標準操作流程進程質粒大抽，最后得到2. 5mg無菌，聞超螺旋，低內毒素，A260/280=l. 82的聞質量的質粒。 Hind III和EcoR I，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結果顯示片段準確。電泳結果在2000 bp 處有外源片段，表明了重組轉移質粒構建成功，如圖2所示。
(3)轉染前24h，接種IL密度為O. 8xl06/ml懸浮細胞CH0-S。轉染當天，細胞計數，確保細胞密度為2X106/ml可以進行轉染。準備DNA-PEI混合物，室溫靜置IOmin后，將混合物加入到細胞中，放入37°C、5% CO2孵箱培養。24h后，添加TN1。培養六天后，取出細胞懸液。
(4)細胞懸液進行離心，過濾。將上清液利用N1-NTA柱分離純化獲得相應的蛋白質，并通過SDS-PAGE以及Western blot分析純蛋白純度。結果在70kD處有條帶并且純度達到了 95%以上，表明了重組AFP蛋白表達成功如圖3和圖4所示。
(5)應用血細胞分離機采集健康供者外周血單個核細胞30ml。采用Ficoll密度梯度分離的方法分離單個核細胞(PBMC)。用生理鹽水洗滌細胞，洗滌后的PBMC懸浮于1640 無血清培養基中，置于六孔板中，每孔2 ml，細胞濃度為2xl06/ml。37°C、5% CO2孵箱培養 2h，保留貼壁細胞，收集非貼壁細胞，作為淋巴細胞，凍存。每孔加入含有IOOOu / ml的 rhGM-CSF、50ng / ml 的 IL_4、RPMI_1640 培養液 2 ml,37°C>5% CO2 孵箱培養。第五天加入純化后0，50，100，150 ug/ml的rAFP刺激DC，24小時后加入TNF_a刺激DC趨化成熟。 第七天收集細胞，然后用生理鹽水連續洗滌三次。
(6)收集DC細胞作為刺激細胞。復蘇凍存的非貼壁細胞作為反應細胞。將反應細胞與刺激細胞按20 1比例混合接種于24孔板，每孔I ml，37°C、5%C02培養5 d，收集的細胞即為效應細胞。收集對數生長期的H印G2細胞作為靶細胞，將效應細胞與靶細胞按20 1 比例混合接種于96孔板，終體積200ul。同時設單一靶細胞組，單一效應細胞，每組設3復孔。37°C、5% CO2 培養 24 h 后，加入 MTT (終濃度 O. 5 mg/ml)，37°C、5% CO2 培養 4h，1000 rpm / min離心5 min,吸棄200ul上清,補入150ul DMS0,振蕩10 min,充分溶解藍色沉淀后，用酶聯免疫檢測儀在490 nm處檢測A490值。根據吸光度值，計算細胞存活率。細胞存活率=[實驗組A均值一背景組A均值]/[空白組A均值一背景組A均值]XlOO %。其結果如圖5所示。·
權利要求
1.一種人工信號肽-AFP-609aa-6his的重組蛋白，其特征在于其蛋白質序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如權利要求1所述的重組蛋白，其特征在于人工信號肽的堿基序列如SEQID N02 所示。
3.一種用哺乳動物瞬時表達系統體外表達權利要求1所述重組蛋白的方法，包括重組蛋白基因的合成，其特征在于該方法包含以下步驟a.將重組蛋白基因通過雙酶切克隆到pcDNA3.1+載體中，構建pcDNA3.1+-AFP表達質粒，并進行質粒抽提，b.將抽提得到的pcDNA3.1+-AFP質粒用PEI轉染進CHO-S懸浮細胞進行重組蛋白的表達，c.7天后分離純化得到的重組蛋白。
4.如權利要求3所述的用哺乳動物瞬時表達系統體外表達權利要求1所述重組蛋白的方法，其特征在于用N1-NTA柱來分離純化。
5.如權利要求3所述的用哺乳動物瞬時表達系統體外表達權利要求1所述重組蛋白的方法，其特征在于用Hind III和EcoR I進行所述的雙酶切。
6.一種權利要求1所述的重組蛋白用于肝癌治療藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及AFP重組蛋白和體外重組表達的方法，具體涉及一種人工信號肽-AFP-609aa-6his的重組蛋白和哺乳動物瞬時表達系統體外重組表達方法，其蛋白質序列如SEQ ID NO:1所示，a.將重組蛋白基因通過雙酶切克隆到pcDNA3.1+載體中，構建pcDNA3.1+-AFP表達質粒，并進行質粒抽提；b.將抽提得到的pcDNA3.1+-AFP質粒用PEI轉染進CHO-S懸浮細胞進行重組蛋白的表達；c.7天后分離純化得到的重組蛋白。本發明通過大規模瞬時懸浮CHO-S表達系統制備的人工合成AFP蛋白活性跟天然AFP蛋白相近，且得到的純度較高，內毒素含量低，無動物源性蛋白的污染，可以有望作為肝癌免疫治療的腫瘤抗原疫苗。
文檔編號A61K39/00GK102993292SQ20121054566
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月14日 優先權日2012年12月14日
發明者陸玲玲, 蘇國新, 葉永清 申請人:上海柯萊遜生物技術有限公司