專利名稱：一種高效表達重組蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及動物細胞培養領域。更具體地，本發明涉及一種采用動物細胞流加培養方式高效表達重組蛋白的方法。
背景技術：
動物細胞大規模培養已經被廣泛應用于生產各類生物活性物質如單克隆抗體、病毒疫苗、免疫調節因子、生長因子、特定腫瘤抗原以及各種基因重組蛋白質藥物。動物細胞同微生物相比具有轉錄后修飾的能力，能夠高效地表達和生產各類高質量的蛋白質。動物細胞培養無論是貼壁細胞還是懸浮細胞，就操作方式而言，主要分為分批式(Batch)，流加式(Fed-batch)和灌流式(Perfusion)三種操作方式。簡單的分批培養 (Batch)中，隨著營養物的消耗和副產物積累，細胞停止生長并開始死亡，產物也停止表達， 生產效率很低。流加培養(Fed-batch)，即在培養過程中，根據細胞代謝需求，連續或間歇地向反應器內加入特定的流加培養基，補充新的營養物質，減少副產物，克服了批培養的弊端。流加培養同批培養相比，培養周期延長，能夠最終獲得更高的活細胞密度和產物濃度 (J. B.Griffith, Animal Cell Culture and Production of Biologicals, pp.401-410, Klumer Academic Publishers, R. Sasaki and K. Ikura(eds. ), (1991), Robbinson DK, Seamans TC, et al. optimization of a fed-batch process for production of a recombinant antibody. Annals NY Academy Sciences, (1994)，745 :185—296)。 3 會賣 流培養(Perfusion)是指把細胞和培養基一起加入反應器后，在細胞增長和產物形成過程中，不斷地將消耗過的培養基排出，同時又連續不斷地灌注新的培養基的方法。目前，流加式(Fed-batch)培養是動物細胞大規模培養生產分泌型重組蛋白藥物較為推崇的一種操作方式。此外，動物細胞大規模培養的有關研究內容還包括高密度和高表達細胞的培養環境及條件，促進單個細胞的基因合成和產物表達，改進培養系統的氧傳遞方式，以及減少剪切力和降低生產成本的培養條件等。其中，培養溫度是影響重組蛋白生產的重要因素之一， 優化培養溫度，可提高重組蛋白的產量，與其他方法相比，此方法操作簡便，有較好的實用價值。CN 200510011774.5(發明名稱為一種高效表達目的蛋白的方法)公開了一種高效表達目的蛋白的方法，該方法通過優化穩定表達目的蛋白的工程化CHO細胞株的培養溫度，并利用兩階段培養策略，使融合蛋白表達量得到顯著提高。但一些研究表明，僅通過優化培養溫度，并不能使重組蛋白的產量提高到理想水平(Yoon SK, Song JY, Lee GM. Effect of low culture temperature on specific productivity, transcription level, and heterogeneity of erythropoietin in Chinese hamster ovary cells. Biotechnol Bioeng. 2003,82(3) J89-98)，這是因為降低培養溫度可提高目的蛋白的比生成率，但同時導致細胞增殖抑制，降低了細胞的相對數量，從而影響了目的蛋白產量的提高。而且溫度不僅僅是影響重組蛋白表達的唯一因素。因此，結合優化培養溫度綜合考慮其它因素使重組蛋白高效表達是本領域技術人員一直期待解決的問題。

發明內容
為了解決上述問題，本發明的申請人公開了一種高效表達重組蛋白的方法，其中重組蛋白為抗IgE單抗，本方法采用動物細胞流加培養方式，包括如下步驟(1)細胞培養溫度36°C -38°C, pH值6. 5-6. 9，培養M-48小時，當動物細胞生長至適當密度時補加流加培養基，進行流加培養；(2)細胞培養溫度降至32. 50C -350C，pH值7. 0-7. 3，進行流加培養；(3)停止流加，細胞培養溫度升至36°C -38°C，pH值7. 0-7. 3，進行培養。本發明選擇動物細胞流加培養方式進行重組蛋白的表達，并在流加培養的不同階段控制不同范圍的細胞培養溫度和PH值，通過增加單位體積的細胞數量和單個細胞的蛋白表達量以期達到重組蛋白高效表達的目的。培養溫度是影響重組蛋白生產的重要因素之一。大多數動物細胞適宜的生長溫度在37°C左右。在36°c-38°c的培養溫度下，動物細胞增殖速度很快。當溫度逐漸下降， 細胞的增殖速度也逐漸減慢，但細胞表達重組蛋白的比生成率則顯著提高。因此，細胞在 360C _38°C下處于生長期，以細胞增殖為主；而在32. 5°C _35°C下，細胞增殖受到抑制，細胞處于維持期，此時以重組蛋白表達為主。pH值的變化是培養環境及條件的另一個重要因素。一定范圍的pH環境將有利于細胞的生長。大多數動物細胞的適宜PH為6. 8-7. 4，偏離這一范圍對細胞培養將產生有害的影響。但細胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環境中更利于細胞生長。對于同一種細胞.生長期和維持期最適PH也不盡相同。對大多數細胞來說，偏酸環境更利于生長.而偏堿環境更利于維持。本發明方法采用三段法。第一階段，即流加培養過程步驟(1)中，細胞培養環境溫度36°C -38pH值
6.5-6. 9。此時的細胞處于旺盛的生長期，選擇偏酸的培養環境還有利于減少副產物的產生，如乳酸累積。培養M-48小時，當細胞生長至適當密度時通過補加流加培養基，讓細胞繼續充分生長。第二階段，即流加培養過程步驟O)中，細胞培養環境溫度32. 5°C -35pH值 7.0-7.3。此時的細胞進入維持期，細胞以表達重組蛋白為主。此時選擇一定的流加稀釋率和流加時間，盡量使單個細胞的重組蛋白得到充分表達。第三階段，即流加培養過程步驟(3)中，細胞培養環境溫度36°C -38pH值
7.0-7. 3。此時的細胞接近生長末期，停止添加流加培養基，再培養一段時間使細胞在適宜的溫度下繼續生長，并完成蛋白表達的最后過程。經過以上步驟，于合適的時間收集上清，經檢測重組蛋白的產量得到顯著提高。本發明選擇流加培養方式培養動物細胞，通過生物反應器電加熱系統控制培養溫度，并通過向生物反應器中通入(X)2氣體使PH值下降或者加入NaHCO3溶液使pH值上升。 除了溫度和PH值以外的其他培養條件采用本領域的常規做法。本發明與CN 200510011774.5(發明名稱為一種高效表達目的蛋白的方法)公開的細胞兩階段培養方法相比較，在細胞大規模培養(50升及以上規模)生產重組蛋白方面， 本發明三段法的蛋白表達量高于對比文獻兩段法的蛋白表達量30%以上，對于重組蛋白藥物產業化更具有實際意義。本發明利用動物細胞的生長特點，通過改變溫度和pH值達到提高重組蛋白產量的目的。該方法的優點在于操作簡便，容易實施，在提高蛋白產量的同時不提高成本，適合于大規模的動物細胞培養，尤其是應用于生產各類生物活性物質如單克隆抗體、融合蛋白以及各種基因重組蛋白質。


圖1為本發明“三段法”表達抗IgE人源化單抗與對比文獻“兩段法”培養過程中的細胞生長比較圖。圖2為本發明“三段法”表達抗IgE人源化單抗與對比文獻“兩段法”培養過程中的蛋白產量比較圖。
具體實施例方式以下實施例僅僅對本發明進行進一步說明，不應理解為對本發明的限制。實施例ICHO細胞“三段法”表達融合蛋白1.材料穩定表達抗IgE人源化單抗的CHO細胞株(按照專利申請號200710101487. 2， 發明名稱《重組抗人IGE單克隆抗體及其制備方法和用途》的中國專利申請中的方法制Excel 1325-PF培養基(美國JRH公司生產)作為基礎培養基；Excell325-PF培養基中加入葡萄糖(濃度為60-90mmol/L)和谷氨酰胺(濃度為 5. 0-7. 8mmol/L)作為流加培養基。2.生物反應器Biostat D-50生物反應器(德國貝朗公司)。3. CHO細胞流加培養三段法(1)將穩定表達抗IgE人源化單抗的CHO細胞株在第1天接種后以 5.0X105cells/ml于生物反應器中。控制溫度在37°C左右，上下浮動不超過1°C，pH值控制在6. 5-6. 9之間。培養48小時，當CHO細胞密度達到2. 0-3. 5X 106cells/ml時添加流加培養基，控制流加稀釋率為0. 1-0. 3/天，流加時間72小時。(2)降低培養溫度，將溫度控制在32. 50C -35°C，同時控制pH值7. 0-7. 3。控制流加稀釋率為0. 1-0. 2/天，流加時間120小時。(3)升高細胞培養溫度至36°C -38°C，pH值7. 0-7. 3。停止添加流加培養基，再培養24小時。整個培養過程中反應器的攪拌轉速為50_60rpm，溶氧為40-50%空氣飽和度。4.本發明“三段法”與對比文獻“兩段法”進行比較(1) “兩段法”的CHO細胞培養方法第一階段將穩定表達抗IgE人源化單抗的CHO細胞株在第1天接種后以 5.0X105cells/ml于生物反應器中，控制溫度在36. 5°C -37. 8°C, pH值控制在6. 8-7. 4，反應器的攪拌轉速為50-60rpm，溶氧為40-50%空氣飽和度。培養48小時后開始添加流加培養基，根據培養環境控制流加稀釋率，流加時間72小時。第二階段將培養溫度降至25°C _32°C，繼續流加培養120小時，其他培養條件不變。停止添加流加培養基，再培養M小時。(2)本發明“三段法”與“兩段法”細胞密度的測定在用“三段法”與“兩段法”分別進行細胞培養的過程中，在第2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11和12天，常規采用血球計數法檢測細胞密度，結果見附圖1。(3)本發明“三段法”與“兩段法”蛋白表達量的測定在用“三段法”與“兩段法”分別進行細胞培養的過程中，在第2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11和12天，常規采用ELISA法，按照專利申請號200710101487. 2，發明名稱《重組抗人IGE單克隆抗體及其制備方法和用途》的中國專利申請中的方法，檢測抗IgE人源化單抗的表達量，結果見附圖2。(4)本發明“三段法”與“兩段法”的比較結果細胞密度的比較兩種細胞培養方法中，從第1天到第5天，細胞均處于旺盛的生長期；在第5天，細胞生長達到最高峰；此后，細胞生長處于維持期，細胞生長速度減慢，細胞密度曲線呈現一個平臺期，但“三段法”的細胞密度明顯高于“兩段法”的細胞密度；在第 12天，細胞密度達到最低點，見附圖1。蛋白表達量的比較兩種細胞培養方法中，從第1天到第5天，蛋白表達量處于緩慢增長期；從第5天到第9天，蛋白表達量增長迅速；從第10天開始，“兩段法”的蛋白表達量增長趨于平緩，而“三段法”的蛋白表達量增長依然顯著；在第12天，“三段法”的蛋白表達量達到1. 02g/L，而“兩段法”的蛋白表達量為0. 71g/L，“三段法”的蛋白表達量提高 43. 66%，見附圖2。根據上述結果，本發明提供的“三段法”由于在提高蛋白產量的同時不提高成本， 并且操作簡便、容易實施，更適合于大規模的動物細胞培養，尤其是可以應用于生產各類生物活性物質如單克隆抗體、融合蛋白以及各種基因重組蛋白質。
權利要求
1.一種高效表達重組蛋白的方法，其特征在于，所述重組蛋白為抗IgE單抗，所述方法采用動物細胞流加培養方式，包括如下步驟(1)細胞培養溫度36°C-38pH值6. 5-6. 9，培養M-48小時，當動物細胞生長至適當密度時補加流加培養基，進行流加培養；(2)細胞培養溫度降至32.5°C _35°C，pH值7. 0-7. 3，進行流加培養；(3)停止流加，細胞培養溫度升至36°C-38°C，pH值7. 0-7. 3，進行培養。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的細胞適當密度為 2. 0-3. 5X106cells/ml。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中，流加稀釋率為0.1-0. 3/天，流加培養時間72-96小時。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中，流加稀釋率為0.1-0. 2/天，流加培養時間120-144小時。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中，所述的培養時間為M-48小時。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的流加培養基為無血清培養基。
7.根據權利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述的動物細胞是CHO細胞。
全文摘要
本發明提供了一種高效表達抗IgE單抗重組蛋白的方法。該方法選擇動物細胞流加培養方式進行重組蛋白的表達，并在流加培養的不同階段控制不同范圍的細胞培養溫度和pH值，以期達到重組蛋白高效表達的目的。本發明操作簡便，容易實施，在提高蛋白產量的同時不提高成本，適合于大規模的動物細胞培養。
文檔編號C12P21/08GK102329847SQ201010225400
公開日2012年1月25日 申請日期2010年7月13日 優先權日2010年7月13日
發明者侯盛, 寇庚, 李晶, 王皓, 胡輝 申請人:上海張江生物技術有限公司