一種重組人ii型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白濃度測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體地涉及一種人血清中重組人腫瘤壞死因子受 體-抗體融合蛋白濃度測定方法。
【背景技術】
[0002] 腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor, TNF)，又叫惡病質因子 kachectin)， 按其結構分兩型；TNF- α和TNF- β，其中由活化的巨瞻細胞、單核細胞和T細胞產生 的能使腫瘤壞死的因子稱為TNF-a ;而把由活化的Τ細胞和ΝΚ細胞產生的淋己毒素 (lymphotoxin，LT)稱為TNF-目。目前研究較多的是TNF-a，它是一種由157個氨基酸組 成、相對分子質量為17kD的可溶性多膚，成熟型TNF-a的活性形式為Η聚體。
[0003] TNF- α具有廣泛的生物學活性，對免疫細胞有活化、促增殖和分化等作用，例如： 參與淋己細胞的遷移、活化、增殖與分化W及淋己組織的再生，對某些非腫瘤細胞和大多數 腫瘤細胞具有誘導調亡的作用，具有強大的抗腫瘤作用，是迄今發現的抗瘤作用最強的細 胞因子，對腫瘤細胞具有直接的抑制增殖和細胞壞死作用。TNF-a對其他細胞（包括必肌 細胞）的生長分化也有影響，同時還有抗病毒及細菌，激活T細胞，促進IL-1、比-2、IL-6的 產生及分泌，誘發炎癥反應，促進IL-2R、EGFR等的表達等功能，在宿主防御反應中起重要 作用。TNF-a具有雙重生物學效應，在濃度較低時，TNF-a主要作為白細胞和內皮細胞的 自分泌及旁分泌的調節物，參與抵抗細菌、病毒和寄生蟲的感染，促進組織修復及調節炎癥 反應，引起腫瘤細胞調亡等；在高濃度時，過量的TNF-a在體內的大量產生和釋放則會破 壞機體的免疫平衡，與其他炎癥因子一起產生多種病理損傷。TNF-a對眾多的組織器官產 生生物學效應，是細胞因子網絡中一個重要的多功能成員，是機體維持內部自穩、抵御各種 致病因子必不可少的免疫調節因子。
[0004] TNF-a參與機體的多種病理生理過程，包括發熱、炎癥、創傷愈合、免疫調節、病毒 復制、變態反應、膜島素抵抗和腫瘤殺傷等。當機體處于病理狀態時，TNF-a對清除受損細 胞、維持機體內環境平衡起著重要的作用，是維持機體內部穩定、抵御各種致病因子必不 可少的免疫調節因子。腫瘤壞死因子-α生產的失調被認為與許多人類疾病有關，包括阿 茲海默氏癥、癌癥、重性抑郁障礙和腸炎。在某些免疫性疾病如；中重度類風濕關節炎、強直 性脊柱炎、中重度尋常型銀屑病中，腫瘤壞死因子-α水平升高，引起炎癥反應。炎癥得不 到有效治療，疾病就會發展，最終會造成骨和關節的破壞，W及銀屑病皮損遷延不愈。
[0005] TNF- α的生物學活性主要是通過細胞膜上的特異受體傳遞信號而實現的。TNF- α 受體燈NFR)廣泛存在于肝、肺、腎、腸道及肌肉組織中。TNF-a與祀細胞膜上的TNFR結合 產生生物學效應，通過受體后效應將信息傳遞到胞核，使mRNA表達并進而合成蛋白質。
[0006] TNF-a受體燈NFR)有2種，即相對分子質量分別為55000的TNFR I(p55)和75000 的TNFRII (p75)，存在于多種正常及腫瘤細胞表面。兩類TNFR均為糖蛋白，氨基酸順序分 析顯示兩類受體胞外區域的氨基酸順序高度相似，但胞內區域則完全不同。TNFR與TNF- α 和TNF-目的結合具有高度親和力，其KD值均在pmol水平。由于各種細胞表達TNFR存在 差異，使得TNF-a對各種細胞的作用不同，由此表現出其功能及其程度的多樣性。一般來 說，受體數目越高越容易受到TNF-a的損傷。
[0007] TNF-a等細胞因子一方面與臟器細胞膜上的受體結合產生效應；另一方面，細胞 因子與循環中的可溶性受體結合，使循環中的細胞因子減少，但在組織中的表達卻增加， 其在局部中的過度生成導致臟器損害。
[0008] 重組人II型腫瘤壞死因子受體Fc抗體融合蛋白（riiTNFRII ;Fc)是一種采用基因 重組技術生產的融合蛋白，其一端為TNFRH胞外區，一端為人IgGl的Fc端。它通過與可 溶性、膜型TNF - a相結合，特異性阻斷TNF - a與細胞表面受體的相互作用，阻斷TNF - a 介導的炎癥反應，從而治療因 TNF-a失調所導致的類風濕關節炎、強直性脊柱炎及銀屑病 等自身免疫疾病。
[0009] 現有測定人血清中重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白濃度的方法，一 般為使用測定人II型腫瘤壞死因子受體的商業化試劑盒對人血清中重組人II型腫瘤壞死 因子受體-抗體融合蛋白，其使用的稀釋液均為化ISA實驗常用稀釋緩沖液，因此所配制出 來的標準曲線、質控樣品等均不含血清成分，與所測試樣品的基質相差甚遠，并不能保證測 試的準確性；更糟糕的是，有的樣品本身也需要使用稀釋液進行稀釋，如此下來則樣品間基 質組分都不一致，所測試結果可信度也就大打折扣。而在某些方法中，僅僅使用人血清質控 樣品及測試樣品的稀釋液，但由于血清中含高濃度的內源性II型腫瘤壞死因子受體，使得 實驗本底很高，方法的靈敏度往往達不到要求。
[0010] 因此，一種準確測定重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白濃度的測定方 法仍是目前所急需的。

【發明內容】

[0011] 本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種準確的測定人血清樣品中重 組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白濃度的方法。本發明的方法可克服方法驗證 及樣品檢測過程中做為樣品稀釋液的人血清中內源性可溶II型人腫瘤壞死因子受體對待 測重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白的背景干擾，提高方法的定量靈敏度。且 本方法所使用標準曲線、質控樣品及待測樣品均使用同樣的血清進行稀釋，保證基質組分 一致。具體地，發明公開了 ：
[0012] 1、一種重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白濃度的測定方法，其特征在 于，待測樣品為人血清，待測樣品的稀釋液為已去除內源性TNFRII的正常人血清。
[001引 2、根據上述1所述的方法，其特征在于，所述去除內源性TNFRII的正常人血清是 通過利用鏈霉親和素偶聯的磁珠及生物標記的抗TNFRII單克隆抗體純化正常人血清獲 得。
[0014] 3、根據上述2所述方法，其特征在于，包括如下步驟：
[001引 （1)使用生物素標記抗TNFRII單克隆抗體；
[0016] (2)使用鏈霉親和素偶聯的磁珠捕獲步驟（1)所得的生物素標記的抗TNFRH單克 隆抗體；
[0017] (3)使用步驟（2)所得的捕獲生物素標記抗TNFRn單克隆抗體的鏈霉親和素偶聯 的磁珠純化正常人血清，獲得去除內源性TNFRII的正常人血清；
[0018] (4)使用步驟（3)獲得的去除內源性TNFRn的正常人血清作為稀釋液稀釋待測樣 品，測定待測樣品中重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白濃度。
[0019] 4、根據上述3所述方法，其特征在于，步驟（4)所述重組人II型腫瘤壞死因子受 體-抗體融合蛋白濃度是通過具有高度特異性的雙特異性單克隆抗體夾必ELISA方法測 定。
[0020] 5、根據上述4所述方法，其特征在于，所述方法的標準品、質控樣品及待測樣品的 稀釋液均是權利要求3步驟（3)所獲得的去除內源性TNFRII的正常人血清。
[0021] 6、根據上述4所述的方法，其特征在于，所述重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗 體融合蛋白濃度測定還使用具備高信噪比的生物素-親和素信號系統進行測定。
[0022] 7、根據上述3所述方法，其特征在于，所述抗TNFRII單克隆抗體是MAB726抗體。
[0023] 8、根據上述7所述方法，其特征在于，所述MAB726抗體（重量）；鏈霉親和素偶聯 的磁珠（體積）比為Img ;4ml。
[0024] 9、一種驗證上述1-8任一所述方法的驗證方法，其特征在于，所述驗證包括