專利名稱：重建人t－PA分子及表達重建人t－PA蛋白的工程菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種重建的新型t-PA分子及其重建方法，以及用于高效表達這種重建人t-PA蛋白的工程菌株。
血栓類疾病是常見病、多發病，隨著我國人民生活水平的不斷提高，人們營養攝入的不平衡，高脂化、血栓類疾病已成為危害人類健康的最危險的殺手，其中冠心病、心肌梗塞、腦血栓病已成為我國及全世界死亡多的流行病，并且有年青化的趨勢，這些疾病的發生和發展均與不溶性纖維蛋白在血管壁沉積或血栓的形成有密切的關系。
血栓形成是指在機體心臟或血管內由血液的組成成份所形成的一種半固體凝塊。血栓可在血循環的任何部分形成。在血管內處于流動狀態的血液，會不斷有不溶性的纖維蛋白的析出，貼附在血管壁內，形成薄層。同時血液循環中的溶纖系統的各種因子則不斷將已析出的纖維蛋白溶解以排除其在血管中的沉積，使血凝與纖溶處于一種動態平衡，避免血管堵塞。在血液中的纖維蛋白酶原，可受各種激活因子作用而活化為纖溶酶。
纖溶酶原激活劑有鏈激酶(SK)、尿激酶(UK)和人組織型纖溶酶激活因子(t-PA)，由于SK和UK副作用大，缺乏溶纖特異性，造成溶纖酶原系統性激活，因此，在臨床應用于心肌梗塞、腦血栓等疾病急救時用量大，且在溶血栓的同時極易引起內出血和腦出血，這同樣是致命的。而t-PA來源于人組織，它能特異性地與血栓處的纖維蛋白結合，優先激活該處的纖溶酶原，因此使用起來效率高，專一性強，副作用小，安全性高，臨床上應用能在短時間內使通血率達75％以上，這是所有的其它溶栓劑所不能比擬的。盡管如此，由于全長天然t-PA具有與纖溶酶激活物抑制物(PAⅠ)相互作用的結構，其活性很容易被PAⅠ所抑制。鑒此，研究開發一種增加和保留優點，克服缺點的新的t-PA的變異分子或重建分子是非常必要的。
本發明的目的在于提供一種重建的人t-PA分子及其重建方法，以及用于表達這種重建的人t-PA蛋白的工程菌株。這種重建的人t-PA分子應具有較高的溶纖活性和較強的特異性，并能在工程菌株中高效表達。
基于上述目的，本發明采用基因工程、分子生物學等先進技術，重建了一種人t-PA分子，并在工程菌中高效表達，純化的這種重建t-PA蛋白分子，具有激活溶纖活性高、特異性強和穩定性高等特點。
為實現上述目的，本發明的所采用的具體技術方案如下一．t-PA基因重建過程根據對原型t-PA蛋白分子的結構與功能域分析估計，保留與特異性和激活有關的功能區域，去除無關的及與PA1抑制物結合的區域，設計了4條核苷酸引物，用RT-PCR法分別從臍帶血管內皮細胞總RNA模板中擴增獲得t-PA N端包括F-G區編碼和C端P區編碼的二個DNA片段(約0．3Kb和0．8Kb)分別克隆到puc-T載體中，轉化DH5α菌株，鑒定后擴增質粒，用內切酶切割、低熔點瓊脂糖電脈回收0．3和0．8Kbr DNA帶，把編碼N端氨基酸的0．3KbDNA定向克隆到原核表達載體pQE30的BamHⅠ-KpnⅠ位點，建成pQEtPAⅠ，把0．8Kb片段插入pQE30的KpnⅠ和HindⅢ之間，建成pQEtPA2，擴增pQEtPA1質粒DNA，用KpnⅠ和HindⅠ切割，定向插入0．8Kb的C端P編碼區，建成pQEtPAr，pQEtPAr即本發明的tPA重建分子。經內切酶分析鑒定后，作全序列分析證實，重建的tPA分子與設計完全相符，pQEtPAr轉化的JM109和M15產生的工程菌株均能表達出有激活溶纖酶原活性的tPA蛋白，分子量約41～42Kda，有良好的激活溶纖活性。
1． RT-PCR引物(1) 5’ -GAG CTC ATG AGA TCT TAC CAA GTG ATC TGC AGA-3’BglⅡ(2) 5’ -GTC GAC GGT ACC CGTGGC CCT GGT ATC TAT-3’KpnⅠ(3) 5’ -GTC GAC GGT ACC TGC GGC CTG AGA CAG GAC-3’KpnⅠ(4) 5’ -AGA TCT AGA AGC TTC TCG AG TCA CGG TCG CAT GTT GTC-3’HindⅢ2．RT-PCR法獲得tPA基因DNA片段引物(1)和(2)擴增0．3KbDNA，引物(3)和(4)為一對擴增0．8KbDNA。
RT-PCR反應混合物組成和條件為10×bulfer5μldNTPS(脫氧核苷三磷酸) 5μl(每種終濃度為250μM)正負鏈引物 各1μl(各50pM)模板RNA 2μl(約1μgRNA)RNasin1μl(約40u／μl)H2O(DEPC處理) 31μlMMLV逆轉錄酶 1μlAdvanTaqTMDNA聚合酶 1μl。
加逆轉錄酶和Taq DNA聚合酶前，混合其它成份，80℃保溫3分鐘，以消除RNA分子內部可能存在的二級結構，冷至室溫，然后加入MMLV逆轉錄酶，39℃進行逆轉錄反應1小時，再加入Taq DNA聚合酶及石蠟油覆蓋，94℃4分鐘，然后94℃1分鐘，52℃1分鐘，70℃30秒(擴增0．3Kb)或1分鐘(擴增0．8Kb)最后一輪70℃7分鐘，進行30個循環。取5μl RT-PCR產物為第二次擴增模板，PCR反應混合物除不加RNasin和MMLV逆轉錄酶外，其余成份與上述相同。第二次擴增進行30次循環，分別擴增出約0．3Kb和0．8Kb的tPA DNA片段，酚-氯仿提抽提，乙醇沉淀，溶于10μlTE中-20℃保存備用。
3．tPA重建分子的拼接和克隆1)．0．3Kb和0．8Kb片段的puc-T載體克隆a．DH5α受體菌感受態細胞制備用標準冷CaCl2法。
b．DNA連接反應10×T4DNA連接酶反應Buffer2μl，1μl puc-T DNA(約0．1μg)，1μl 0．3Kb或0．8KbDNA片段，1μl T4DNA連接酶(約2u)，15μl水．混合后16℃反應6小時。
c．轉化在50μl感受態DH5α細胞中加入10μl連接反應產物，冰中放30分鐘，41℃水浴放90秒鐘，然后放冰中5分鐘后直接涂布含Amp和IPTG、X-Gal的2YT平皿，37℃培養過夜。
c．重組質粒puctPA1和puctPA2鑒定用接種環挑選平皿中的白色菌落，接種10ml含Amp的2YT培養液，37振蕩培養過夜，取0．5ml加0．5ml無菌30％甘油作菌種保存(-20℃)，其余培養液離心收集菌體，用標準冷堿法提取質粒DNA，用BglⅡ和KpnⅠ(鑒定0．3Kb克隆)或KpnⅠ和HindⅢ(鑒定0．8Kb克隆)雙酶切，1．5％瓊脂糖膠電泳鑒定，經鑒定后獲得的0．3Kb克隆命名puctPA1，0．8Kb克隆命名為puctPA2。
2)0．3Kb和0．8Kb的tPADNA片段的拼接和表達載體pQE30克隆a．0 3Kb和0．8Kb片段克隆pQE30質粒DNA用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切(用于克隆0．3kb片段)和用KpnⅠ加HindⅢ雙酶切(用于克隆0．8Kb片段)，puctPA1 DNA用BglⅡ和KpnⅠ雙酶切，puctPA2 DNA用KpnⅠ和HindⅢ切割，用低熔點瓊脂糖膠電泳分離后，分別回收約0．3Kb片段和0．8Kb片段及切開的pQE30 DNA，經連接后轉化JM109菌株，重組質粒用雙酶切鑒定，分別獲得pQEtPA1和pQEtPA2重組質粒轉化的JM109菌株。
B．0．8Kb片段插入pQEtPA1質粒DNA用KpnⅠ和HindⅢ切開，用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切割puctPA2DNA獲得0．8Kb片段，連接轉化JM109菌株，經酶切鑒定，獲得重建的tPA克隆，命名為E．coli JM109pQEtPAr。該工程菌株已于2000年6月1日提交到中國典型培養物保藏中心、(CCTCC)，其保藏編號為CCTCC No M200018。
由本發明所得的工程菌種的生物學特性如下JM109pQEtPAr recAl supE44 endAl hsdR17 gyrA96 relA1 thi△(lac-proAB)F{traD36proAB+lacⅠqlacz△M15}pQEtPAr，一種支持帶有琥珀突變的載體生長的重組缺陷的抑制型菌株，對轉染的DNA有修飾作用而無限制作用，帶有pQEtPAr質粒，并能表達出有活性的重建tPA蛋白。
4．重建tPA分子克隆pQEtPAr的內酶切分析和DNA序列測定EcoRⅠ切割，兩條帶0 6Kb和3．9Kb；EcoRⅠ+HindⅢ切割，三條帶0．5Kb，0．6Kb和3．4Kb；KpnⅠ+HindⅢ切割，兩條帶0．8Kb和3．7Kb；pstⅠ+HindⅢ切割，兩條帶約1Kb和3．5kb；
用HindⅢ、KpnⅠ、pstⅠ任意一種酶單獨切割，都產生一條帶4．5Kb帶。
克隆的重建tPA基因全序列分析結果，含tPA編碼區共1074nt，編碼358個氨基酸，見后。
二、重建t-PA在JM109中的表達1．JM109 pQEtPAⅡ接種2YT(Amp)，37℃培養過夜，10％轉種，IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(1mmol/L)，37℃誘導培養5小時，或30℃誘導24小時，取誘導前后樣品，以只含載體pQE30的JM109作對照，SDS-PAGE檢查。
2．JM109 pQEtPAr接種2YT(Amp)，37℃培養過夜，10％轉種，加IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(1mmol／L)，37℃誘導培養7-8小時，取誘導前后樣品，只含載體pQE30的JM109作對照，SDS-PAGE檢查，表達出的重建tPA蛋白分子量約為41～42KD。
三、重建分子t-PA活性測定(纖維平板測活法)1．按文獻中國生物化學與分子生物學報，1998，14(2)156-159]方法略改動(平板中不加纖溶酶原改加到加樣孔中)制作纖維平板。
1．在平板上均勻打孔，分別加入待測樣品+纖溶酶原；t-PA標準品+纖溶酶原JM109 pQE30裂解液+纖溶酶原纖溶酶原JM109 pQE30裂解液于37℃放置10小時，測溶纖圈大小(圈的面積-加樣孔面積)與t-PA標準品比較，得出樣品單位數量大小。(注樣品為誘導表達后，收集菌體超聲波破細胞的上清。)重建t-PA分子的測序結果CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCT TAC CAA GTG ATC TGC AGA GAT GAA AAA→tPA編碼 pstⅠACG CAG ATG ATG ATA TAC CAG CAA CAT CAG TCA TGG CTG CGC CCT GTG CTC AGAAGC AAC CGG GTG GAA GAT TGG TGG TGC AAC AGT GGC AGG GCA CAG TGC CACTCA GTG CCT GTC AAA AGT TGC AGC GAG CCA AGG TGT TTC AAC GGG GGC ACCTGC CAG CAG GCC CTG TAC TTC TCA GAT TTC GTG TGC CAG TGC CCC GAA GGATTT GCT GGG AAG TGC TGT GAA ATA GAT ACC AGG GCC ACG GGT ACC TGC GGCKpn ⅠCTG AGA CAG GAC ACC CAG CCT CAG TTT CGC ATC AAA GGA GGG CTC TTC GCCGAC ATC GCC TCC CAC CCC TGG CAG GCT GCC ATC TTT GCC AAG CAC AGG AGGTCG CCC GGA GAG CGG TTC CTG TGV GGG GGC ATA CTC ATC AGC TCC TCC TGGATT CTC TCT GCC GCC CAC TGC TTC CAG GAG AGG TTT CCG CCC CAC CAC CTTACG GTG ATC TTG GTC AGA ACA TAC CGG GTG GTC CCT GGC GAG GAG GAGCAG AAA TTT GAA GTC GAA AAA TAC ATT GTC CAT AAG GAA TTC GAT GAT GACEcoR ⅠACT TAC GAC AAT TAC ATT GCG CTG CTG CAG CTG AAA TCG GAT TCG TCC CGCTGT GCC CAG GAG AGC CGC GTG GTC CGC ACT GTG TGC CTT CCC CCG GCG GACCTG CAG CTT CCG GAC TGG ACG GAG TGT GAG CTC TCC GGC TAC GGC AAG CATGAG GCC TTG TCT CCT TTC TAT TCG GAG CGG CTG AAG GAG GCT CAT GTC AGACTG TAC CCA TCC AGC CGC TGC ACA TCA CAA CAT TTA CTT AAC AGA ACA GTCACC GAC AAC ATG GTG TGT GCT GGA GAC ACT CGG AGC GGC GGG CCC CAG GCAAAC TTG CAC GAC GCC TGC CAG GGC GAT TCG GGA GGC CCC CTG GTG TGT CTGAAC GAT GGC CGC ATG ACT TTG GTG GGC ATC ATC AGC TGG GGC CGG GGC TGTGGA CAG AAG GAT GTC CCG GGT GTG TAC ACC AAG GTT ACC AAC TAC CTA GACTGG ATT CGT GAC AAC ATG CGA CCG TGA 。stop
權利要求
1．一種重建的人組織型纖溶酶激活因子t-PAr，其基因全序列為CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCT TAC CAA GTG ATC TGC AGA GAT GAA AAA→tPA 編碼 pst IACG CAG ATG ATG ATA TAC CAG CAA CAT CAG TCA TGG CTG CGC CCT GTG CTC AGAAGC AAC CGG GTG GAA GAT TGG TGG TGC AAC AGT GGC AGG GCA CAG TGC CACTCA GTG CCT GTC AAA AGT TGC AGC GAG CCA AGG TGT TTC AAC GGG GGC ACCTGC CAG CAG GCC CTG TAC TTC TCA GAT TTC GTG TGC CAG TGC CCC GAA GGATTT GCT GGG AAG TGC TGT GAA ATA GAT ACC AGG GCC ACG GGT ACC TGC GGCKpn ⅠCTG AGA CAG GAC ACC CAG CCT CAG TTT CGC ATC AAA GGA GGG CTC TTC GCCGAC ATC GCC TCC CAC CCC TGG CAG GCT GCC ATC TTT GCC AAG CAC AGG AGGTCG CCC GGA GAG CGG TTC CTG TGV GGG GGC ATA CTC ATC AGC TCC TCC TGGATT CTC TCT GCC GCC CAC TGC TTC CAG GAG AGG TTT CCG CCC CAC CAC CTTACG GTG ATC TTG GTC AGA ACA TAC CGG GTG GTC CCT GGC GAG GAG GAGCAG AAA TTT GAA GTC GAA AAA TAC ATT GTC CAT AAG GAA TTC GAT GAT GACEcoR ⅠACT TAC GAC AAT TAC ATT GCG CTG CTG CAG CTG AAA TCG GAT TCG TCC CGCTGT GCC CAG GAG AGC CGC GTG GTC CGC ACT GTG TGC CTT CCC CCG GCG GACCTG CAG CTT CCG GAC TGG ACG GAG TGT GAG CTC TCC GGC TAC GGC AAG CATGAG GCC TTG TCT CCT TTC TAT TCG GAG CGG CTG AAG GAG GCT CAT GTC AGACTG TAC CCA TCC AGC CGC TGC ACA TCA CAA CAT TTA CTT AAC AGA ACA GTCACC GAC AAC ATG GTG TGT GCT GGA GAC ACT CGG AGC GGC GGG CCC CAG GCAAAC TTG CAC GAC GCC TGC CAG GGC GAT TCG GGA GGC CCC CTG GTG TGT CTGAAC GAT GGC CGC ATG ACT TTG GTG GGC ATC ATC AGC TGG GGC CGG GGC TGTGGA CAG AAG GAT GTC CCG GGT GTG TAC ACC AAG GTT ACC AAC TAC CTA GACTGG ATT CGT GAC AAC ATG CGA CCG TGAstop 。
2．一種用于表達權利要求1所述的重建的人組織型纖溶酶激活因子t-PAr的工程菌株E．coli JMl09pQEtPAr，該工程菌株已提交到中國典型培養物保藏中心保藏，其保藏編號為CCTCC M200018。
3．權利要求1所述的重建的人組織型纖溶酶激活因子t-PAr的重建方法，其特征在于以臍帶血管內皮細胞總RNA為模板，設計了4條核苷酸引物(1) 5’ -GAG CTC ATG AGA TCT TAC CAA GTG ATC TGC AGA-3’BglⅡ(2) 5’ -GTC GAC GGT ACC CGTGGC CCT GGT ATC TAT-3’KpnⅠ(3) 5’ -GTC GAC GGT ACC TGC GGC CTG AGA CAG GAC-3’KpnⅠ(4) 5’ -AGA TCT AGA AGC TTC TCG AG TCA CGG TCG CAT GTT GTC-3’HindⅢ其中引物(1)和(2)為一組，引物(3)和(4)為一組，用RT-PCR法分別擴增模板獲得t-PAN端包括F-G區編碼和C端P區編碼的一個約0．3Kb DNA片段和一個約0．8Kb DNA片段，再分別克隆到puc-T載體中，轉化DH5α菌株，鑒定后擴增質粒，用內切酶切割、低熔點瓊脂糖電脈回收0．3和0．8Kbr DNA帶，把編碼N端氨基酸的0．3Kb DNA定向克隆到原核表達載體pQE30的BamH I-KpnⅠ位點，建成pQEtPAⅠ，把0．8Kb片段插入pQE30的KpnⅠ和HindⅢ之間，建成pQEtPA2，擴增pQEtPAl質粒DNA，用Kpn I和HindⅢ切割，定向插入0．8Kb的C端P編碼區，建成pQEtPAr，即為本發明重建的人組織型纖溶酶激活因子t-PAr分子。
全文摘要
本發明公開了一種重建的人t－PA分子及其重建方法,以及用于表達這種重建的人t－PA分子的工程菌株。這種重建的人t－PA分子具有較高的溶纖活性和較強的特異性,并能在工程菌株中高效表達,因此,在醫學上具有重要的應用價值。
文檔編號C12N15/12GK1281048SQ0011597
公開日2001年1月24日 申請日期2000年8月24日 優先權日2000年8月24日
發明者葉林柏, 郜金榮, 徐進平, 吳正輝 申請人:武漢大學