專利名稱：差異表達篩選方法
技術領域：
本發明涉及通過差異表達篩選基因的方法。
背景技術：
基因尋找(gene discovery)領域的一個中心目標是了解和闡明特定病狀與限定和/或引起該病狀的基因表達模式之間的關系。這樣，有可能鑒定出對疾病診斷或治療具有潛在的巨大醫學價值的基因。這些基因的產物可以直接用作治療劑，基因本身可以用于基因治療，或者可以發現調節這些基因的表達和作用以治療疾病的小分子效應物。研究集中在患病和健康組織之間表達模式的差異上，以闡明疾病的生理學機制。鑒定出的表達模式差異提供了一般認定的逆轉疾病表型的治療切入點。這些差異還提供了診斷標記，并確定進一步研究的蛋白質為影響所述疾病的因素。
基因表達的差異篩選是本領域一項眾所周知的技術，經常與扣除cDNA克隆法一起成功用于鑒定參與一系列細胞活動的基因。一般來說，或者使用測定mRNA表達水平的核酸型方法進行差異篩選，或者使用諸如雙向凝膠電泳的技術分離細胞含有的總蛋的蛋白質組方法進行差異篩選。
迄今為止已知的差異表達篩選方法(甚至那些基于DNA芯片技術的方法)的一個問題是目的基因產物的絕對水平和/或兩種特定狀態(例如，存在和不存在生長因子，或者在兩種不同的細胞類型中)之間的基因產物表達差異可能相當低。因此，盡管迄今為止使用標準差異表達篩選技術已經鑒定出一些非常重要的基因，但許多在細胞活動中可能起重要作用的基因仍然難以鑒別，因為其表達水平低，或者因為可觀察到的其表達水平變化可能相當小。
常規差異篩選方法存在的另一個問題是這些方法不能讓人們剖析正在研究的遺傳或生化途徑。鑒定出的基因表達的任何變化都是整體性的，而不是明確針對研究途徑的特定方面。因此，本領域需要一種易于在分子水平剖析生物途徑的方法。
發明概述因此，本發明的一個目標是提供一種基于差異表達的改進型篩選方法。
在本發明的第一個方面，提供一種用于鑒定參與細胞活動的遺傳因子的差異表達篩選方法，該方法包括對比在以下細胞中的基因表達(a)第一種目的細胞；和(b)第二種目的細胞，該細胞由于引入異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的生物分子；鑒定差異表達的遺傳因子。
術語“遺傳因子”是指包括基因、基因產物(如RNA分子和多肽)、順式作用調節元件(如啟動子元件和增強子元件)。該方法可鑒別所評價的這些分子類型中任一種的表達模式差異，并按照所研究的細胞活動置于生物演化關系(biological context)中。該方法還允許可鑒別研究的組成型遺傳因子差異，以便例如鑒定對特定生物活動的生物反應有影響的突變和多態性。
在一個實施方案中，所述第一種目的細胞還包括相對于生理水平來說水平改變的生物分子。然而，在一個替代的實施方案中，所述第一種目的細胞具有正常生理水平的生物分子。所述生物分子可能已在功能上表征，或者未充分表征。
通常，第二種目的細胞中的生物分子水平升高或降低。在一個優選的實施方案中，所述生物分子和由所述異源核酸編碼的多肽為同一分子。所述多肽可能已在功能上表征，或者未充分表征。
所述核酸最好控制多肽表達。所述異源核酸編碼的多肽最好參與細胞活動。所述“參與細胞活動”是指發現所述基因在細胞的遺傳或代謝途徑中具有與眾不同的作用。所述多肽可能涉及產生或維持特定疾病表型或生理條件的敏感性。專業技術讀者顯而易見的是，任何途徑中的任意點都可能是獨一無二的點，細胞在該點偏離正常生理反應而產生疾病表型。表現為疾病的作用經常是由突變事件造成，其中在相關生理途徑起作用的蛋白的基因編碼序列發生突變。
核酸最好使用病毒載體傳遞至細胞。在此情況下，異源核酸應當與病毒載體同線。專業技術讀者顯而易見的是，不同的病毒載體適于不同的細胞類型。按照本發明使用的病毒載體最好得自逆轉錄病毒、慢病毒如馬傳染性貧血病病毒(EIAV)或1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒和痘病毒如昆蟲痘病毒。
用于本發明目的的病毒載體優選特征為有效轉導靶細胞的能力以及使基因表達中任何微擾最小化的能力，所述干擾可能緣自使用的病毒載體本身，但與引入的異源目的核酸不是特異性相關(“表型沉默”)。病毒介導的基因轉移領域的技術人員應當知道，該領域在迅速發展，用于各種細胞類型的優選載體隨著領域的發展在變化。例如，在撰寫本發明時，優選的巨噬細胞轉導載體是腺病毒載體，因為該載體可能使轉導水平最高。該載體不能以表型沉默轉導，但有可能使用合適的控制因素將載體對細胞基因表達的影響排除在外。另一方面，能夠表型沉默轉導的得自慢病毒EIAV的載體在海馬神經元中產生最有效的轉導，因此成為選擇用于該用途的載體。載體的表型沉默經常是需要的，但必須與轉導效率相平衡。本文包括的實施例中描述的載體開發以所述細胞類型中的這兩個特征最優化為目標。對載體技術領域的技術人員顯而易見的是，本發明與載體類型無關，但通過優化選擇每種細胞類型的載體，可以增進本發明的實施。
一般而言，可以使用蛋白質組技術或使用基于核酸的基因組或cDNA技術測定第一種和第二種細胞中的基因表達。
在本發明第一方面的一個優選的實施方案中，提供一種用于鑒定參與細胞活動的遺傳因子的差異表達篩選方法，該方法包括對比在以下細胞中的基因表達(a)第一種目的細胞；和(b)與所述第一種細胞不同的第二種目的細胞，該細胞由于引入異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的生物分子；并鑒定差異表達的遺傳因子。
所述核酸最好控制多肽(例如上述參與細胞活動的多肽)的表達。
在第二個方面，本發明提供一種用于鑒定其表達受信號調控的遺傳因子的差異表達篩選方法，該方法包括在兩種不同信號水平下對比(a)在第一種目的細胞中的基因表達，其中所述信號處于第一種水平；和(b)在第二種目的細胞中的基因表達，該細胞由于引入控制多肽表達的異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的生物分子，該生物分子的活性對信號起反應，其中所述信號處于第二種水平；并鑒定差異表達的遺傳因子。
在本發明的第三個方面，使用已知或猜測參與細胞活動的多肽鑒定該活動的其它組分，方法是改變細胞中所述多肽的水平，以改善所鑒定其它組分水平的信噪比，使它們更易于通過差異表達技術進行鑒定。
因此，本發明還提供一種用于鑒定其表達在細胞活動中發生改變的遺傳因子的差異表達篩選方法，該方法包括對比(a)在第一種目的細胞中的基因表達；和(b)在第二種目的細胞中的基因表達，該細胞經修飾含有水平改變的影響細胞活動的多肽；并鑒定差異表達的遺傳因子。
所述多肽的水平改變優選是由于將控制所述多肽在細胞中表達的異源核酸引入細胞中造成。更優選所述異源核酸與病毒載體共線。
在本發明第三方面的一個優選的實施方案中，通過生物信號調節遺傳因子的表達，所述方法包括對比兩種不同信號水平的兩種細胞類型中的基因表達的步驟。
因此，本發明在此方面提供一種用于鑒定參與細胞活動的遺傳因子的差異表達篩選方法，該方法包括對比(a)在第一種目的細胞中的基因表達；和(b)在第二種目的細胞中的基因表達，該細胞由于引入控制多肽表達的異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的影響細胞活動的生物分子；并鑒定差異表達的遺傳因子，其中在至少兩種與細胞活動相關的不同環境條件下對比所述第一種和/或第二種目的細胞中的基因表達。優選在至少兩種與細胞活動相關的不同環境條件下同時對比所述第一種和第二種目的細胞中的基因表達。
在一個實施例中，細胞接觸的環境條件可以是不同水平的生物信號。可以在以下環境條件下對比兩種細胞類型中的基因表達沒有信號、存在第一種水平的信號和/或存在第二種水平的信號(例如，在含氧量正常[20％氧]和低氧[＜1％氧]之間的不同百分比的大氣氧含量)。使用至少兩種水平的生物信號允許對比環境條件改變以及異源核酸對這些細胞類型的作用，并鑒定其表達在生物信號水平和測試的環境條件之間以相同方式或以不同方式作用的遺傳因子。當然，不同類型的環境變化、細胞類型和異源核酸可以以相同的方式應用兩種以上水平的生物信號。
因此，本發明此方面的一個實施方案提供一種用于鑒定參與細胞活動的遺傳因子的差異表達篩選方法，該方法包括對比
(a)在第一種目的細胞中的基因表達；(b)在第一種目的細胞中的基因表達，其中該細胞接觸與細胞活動相關的生物信號，其中所述生物信號為第一種水平；(c)在第一種目的細胞中的基因表達，其中該細胞接觸與細胞活動相關的生物信號，其中所述生物信號為第二種水平；(d)在第二種目的細胞中的基因表達，該細胞由于引入控制多肽表達的異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的生物分子，該分子的活性對所述生物信號起反應，其中所述信號為沒有、第一種水平或第二種水平；并鑒定差異表達的遺傳因子。
在本發明此方面的一個替代的實施方案中，細胞接觸的環境條件可以為不同類型的環境變化(例如細胞接觸的不同生長因子的水平變化)。使用兩種環境變化允許對比每種環境變化和異源核酸對每種細胞類型的作用，并鑒定其表達在這些測試的環境變化之間以相同方式或不同方式作用的遺傳因子。每種細胞類型和每種異源核酸可以以相同的方式應用兩種以上的環境變化。
因此，本發明在此方面提供一種用于鑒定參與細胞活動的遺傳因子的差異表達篩選方法，該方法包括對比；(a)在第一種目的細胞中的基因表達；(b)在第一種目的細胞中的基因表達，其中該細胞接觸第一種類型的環境變化；(c)在第一種目的細胞中的基因表達，其中該細胞接觸第二種類型的環境變化；(d)第二種目的細胞在接觸或不接觸第一種和/或第二種類型環境變化的條件下的基因表達，所述第二種細胞由于引入控制多肽表達的異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的生物分子，該分子的活性對b)和c)項提及的一種或兩種環境變化起反應；并鑒定差異表達的遺傳因子。
在本發明以上的實施方案中，第一種細胞類型還可以含有由于引入控制多肽表達的異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的生物分子，該分子的活性對環境條件差異起反應。
第一種細胞中的生物分子可以與第二種細胞中水平改變的生物分子相同。在該實施方案中，第一種細胞和第二種細胞中的生物分子水平應當不同。
因此，本發明在此方面提供一種用于鑒定參與細胞活動的遺傳因子的差異表達篩選方法，該方法包括對比(a)在第一種目的細胞中的基因表達；(b)在第一種目的細胞中的基因表達，其中該細胞接觸與細胞活動相關的生物信號；(c)在第一種目的細胞中的基因表達，其中該細胞由于引入控制多肽表達的異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的生物分子，其活性對所述生物信號起反應，其中所述水平改變的生物分子為第一種水平，而其中所述生物信號或者存在或者不存在；(d)在第二種目的細胞中的基因表達；(e)在第二種目的細胞中的基因表達，其中該細胞接觸與細胞活動相關的生物信號；(f)在第二種目的細胞中的基因表達，其中該細胞由于引入控制多肽表達的異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的生物分子，其中所述水平改變的生物分子為第二種水平，而其中所述生物信號或者存在或者不存在；并鑒定差異表達的遺傳因子。
使用兩種表達水平的異源核酸允許對比每種水平和生物信號對每種細胞類型的作用，并鑒定其表達在這些測試的水平和生物信號之間以相同方式或不同方式作用的遺傳因子。每種細胞類型和每種生物信號可以以相同的方式應用兩種以上表達水平的異源核酸。
另一方面，第一種細胞中的生物分子可以與第二種細胞中水平改變的生物分子不同。在該實施方案中，第一種細胞和第二種細胞中的生物分子水平可以相同，或者可以不同。
因此，本發明在此方面提供一種用于鑒定參與細胞活動的遺傳因子的差異表達篩選方法，該方法包括對比；(a)在第一種目的細胞中的基因表達；(b)在第一種目的細胞中的基因表達，其中該細胞接觸與細胞活動相關的生物信號；(c)在第一種目的細胞中的基因表達，該細胞由于引入控制第一種多肽表達的異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的第一種生物分子，其活性對所述生物信號起反應，其中所述生物信號或者存在或者不存在；(d)在第二種目的細胞中的基因表達；(e)在第二種目的細胞中的基因表達，其中該細胞接觸與細胞活動相關的生物信號；(f)在第二種目的細胞中的基因表達，該細胞由于引入控制第二種多肽表達的異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的第二種生物分子，其中所述生物信號或者存在或者不存在；并鑒定差異表達的遺傳因子。
使用兩種類型的異源核酸允許對比每種異源核酸類型和生物信號對每種細胞類型的作用，并鑒定其表達在這些異源核酸類型和生物信號之間以相同方式或不同方式作用的遺傳因子。所測試的每種細胞類型和每種生物信號可以以相同的方式應用兩種以上類型的的異源核酸。本發明的該方面能夠尋找在特定環境變化下受不同生物分子差異調節的基因。這提高了組織和細胞特異性治療調節細胞反應的可能性。
在以上所有的實施方案中，對比其基因表達的第一種和第二種細胞可以為不同的細胞類型(例如，健康細胞和患病細胞)。使用兩種或多種細胞類型允許對比不同生物信號和異源核酸對這些細胞類型的作用，并鑒定其表達在這些測試的細胞類型和生物信號之間以相同方式或不同方式作用的遺傳因子。可以以相同方式評價兩種以上的細胞類型。
在本發明的一個優選的實施方案中，所述多肽影響疾病過程。因此，第一種細胞可以得自正常患者，而第二種細胞得自患病患者，反之亦可。或者，第一種細胞得自患病患者，而第二種細胞得自同一患病患者或患同樣疾病的患者。
因此，本發明再一個方面提供一種用于鑒定參與細胞活動的基因或基因產物的差異表達篩選方法，該方法包括(i)對比以下細胞中的基因表達(a)第一種目的細胞；和(b)第二種目的細胞；(ii)對比以下細胞中的基因表達(a)第一種目的細胞；和(b)第三種目的細胞，該細胞由于引入控制侯選基因或基因產物擴增或表達的異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的侯選基因或基因產物；和(iii)選擇那些導致第三種目的細胞中的第二種基因或基因產物的水平、拷貝數或表達相對于第一種目的細胞發生改變的侯選基因或基因產物，所述第二種目的細胞中的第二種基因或基因產物相對于第一種目的細胞也具有改變的水平、拷貝數或表達。
所述侯選基因產物優選為多肽或RNA分子。
在本發明以上方面的一個優選的實施方案中，提供一種用于鑒定參與疾病過程的基因產物的差異表達篩選方法，該方法包括(i)對比以下細胞中的基因表達(a)得自正常患者的第一種目的細胞；和(b)得自患病患者的第二種目的細胞；(ii)對比以下細胞中的基因表達
(a)第一種目的細胞；和(b)得自正常患者的第三種目的細胞，該細胞由于引入控制侯選基因或基因產物擴增或表達的異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的侯選基因或基因產物；和(iii)選擇那些導致第三種目的細胞中的第二種基因或基因產物的水平、拷貝數或表達相對于第一種目的細胞發生改變的侯選基因或基因產物，所述第二種目的細胞中的第二種基因或基因產物相對于第一種目的細胞也具有改變的水平、拷貝數或表達。
在本發明此方面的一個特別優選的實施方案中，基因產物的表達優選受到信號(例如和疾病過程相關的生物或其他環境信號)調節，該方法包括對比兩種不同信號水平下所述細胞類型中基因表達的步驟。
在上述的本發明實施方案中，通過使用核酸技術鑒定那些其水平在不同目的細胞類型改變的mRNA轉錄物，進行基因表達對比。
在上述的本發明實施方案中，通過使用蛋白分析技術鑒定那些其水平在不同目的細胞類型之間改變的多肽，進行基因表達對比。
按照本發明的再另一方面，提供一種增加差異表達篩選方法敏感性的方法，其中對比第一種和第二種目的細胞在兩種不同水平信號作用下的基因表達，該方法包括將異源核酸引入第一種細胞或第二種細胞中，以增加調節細胞對信號反應的生物分子的水平。發明詳述盡管本文提及的技術是本領域眾所周知的，但特別可參閱Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(1989)和Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)，第4版，John Wiley &Sons，Inc。
除非另有定義，否則本文使用的所有技術術語和科技術語都與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的含義相同。A.差異表達篩選技術基因編碼基因產物，主要為多肽，但也有RNA，這些產物參與的細胞活動不計其數。差異表達篩選技術是基于這樣一種構思通過對比兩組環境下的表達，可以鑒定出在這兩種條件下其表達發生改變的基因，反過來其功能又與這些條件之間的差異有關。例如，可通過對比接觸有絲分裂原如血小板衍生生長因子(PDGF)的細胞中的基因表達和未接觸PDGF的細胞中的基因表達，鑒定涉及PDGF反應途徑的基因。
因此，本文使用的術語“差異表達篩選”是指對比不同條件下兩種細胞之間的基因表達或相同或不同條件下兩種不同細胞之間的基因表達，目的是鑒定其表達水平在兩種細胞之間不同的基因或基因產物。
可使用各種技術檢測基因表達差異。第一種主要類型的技術是基于核酸檢測，本文稱為“基因組或cDNA技術”。Kozian和Kirschbaum(1999)中提供了有用的綜述。第二種主要類型的技術是基于細胞蛋白含量的檢測，本文稱為“蛋白質組技術”。基因組或cDNA技術本領域一個眾所周知的方法是扣除cDNA雜交。該技術包括將一種細胞(例如對照細胞)的mRNA群與由另一種細胞(例如接觸PDGF的細胞)的mRNA制備的cDNA群雜交。該步驟將把eDNA制備物中兩種細胞共有的序列全部去除。由其表達在接觸PDGF的細胞中上調的mRNA產生的cDNA將沒有對應的對照mRNA與其雜交，可以分離。通常，還將所述cDNA與同一細胞的mRNA雜交，以證實它們代表編碼序列。此方法詳述于WO90/11361，其中使用得自用化學物質N-(氨基羰基)-2-氯苯磺酰胺處理的植物根部細胞的mRNA產生cDNA文庫，然后將該文庫與未處理根細胞的mRNA雜交。該方法鑒定出大量其表達受所述化學物質上調的基因。
聚合酶鏈反應(PCR)已經導致了許多其它方法的發展。首先由Liang和Pardee(1992)描述了RT-PCR差異展示。該技術包括使用寡脫氧胸苷酸引物和隨機寡核苷酸10聚物對不同細胞群的反轉錄RNA進行PCR。經常使用放射性標記核苷酸進行PCR，以使產物在凝膠電泳和放射自顯影后可以顯色。Wilkinson等(1995)使用PCR差異展示鑒定出5種在草莓成熟過程中被上調的mRNA。Zhang等(1998)提供了差異展示RT-PCR(也叫做mRNA差異展示)的綜述，最近的使用“長距離”PCR的改進描述于Zhao等(1999)。
另一種技術稱作cDNA文庫篩選。Maser和Calvet(1995)提供了該技術以及以上提及的其它兩種差異表達篩選技術的綜述。
差異展示競爭性PCR是一種相當新的技術，已經成功用于研究在僅有少數基因改變表達水平的條件(例如MCF17細胞接觸雌二醇)下和更復雜條件(例如人NTERA2細胞的神經元差異)下的基因表達總體變化(Jorgensen等，1999)。
其它適于分析特定細胞類型轉錄組(transcriptome)的技術包括基因表達連續分析(SAGE；Velculescu等，Science(1995)270；484-487)，經抗生物素介導和限制介導的富集選擇性擴增(SABRE)(Lavery等，(1997)，PNAS USA 946831-6836頁)、差異展示(例如指標化差異展示反轉錄酶聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR；Mahadeva等(1998)J.Mol.Biol.284，1391-1398))、代表性差異分析(RDA)(Hubank(1999)Methodsin Enzymology 303325-349；參見Kozian和Kirschbaum(1999)的綜述和其中的參考文獻)、差異篩選cDNA文庫(參見Sagerstrom等(1997)Annu.Rev.Biochem.，66751-783；“Advanced Molecular Biology”，R.M.Twyman(1998)Bios Scientific Publisher，Oxford；“Nucleic AcidHybridization”，M.L.M.Anderson(1999)Bios Scientific Publisher，Oxford)、RNA印跡、RNA酶保護測定、S1核酸酶保護測定、RT-PCR、實時RT-PCR(Taq-man)、EST測序、整體平行特征測序(MPSS)和雜交測序(SBH)(參閱Drmanac R.等(1999)，Methods in Enzymology 303165-178)。這些技術中的大部分綜述于“Comparative gene-expressionanalysis”Trends Biotechnol.1999年2月；17(2)73-8。
可以許多方式對其表達在兩種細胞群中不同的基因產物進行實際鑒定。扣除方法固有鑒定其表達不同的基因產物，因為其表達相同的基因產物已由樣品中去除。其它方法包括僅對比一種細胞的表達產物和另一種細胞的表達產物，并任選借助于計算機程序觀察任何差異(用基于PCR的技術，每個樣品中的產物數量可限制在合理的大小)。例如使用基于PCR的技術，顯色對比不同泳道上出現的條帶，可鑒定只有一個泳道才有的條帶。這些條帶可由凝膠中切除，隨后進行分析。
DNA芯片技術的出現使得可以通過使用微陣列方便地進行對比(參閱Kozian和Kirschbaum，1999的綜述和參考文獻)。通常使用固定在基體(例如尼龍濾膜、玻璃片或硅片)上的cDNA(包括EST)、PCR產物、克隆的DNA和合成寡核苷酸制備陣列。為測定基因表達差異，將標記的cDNA或PCR產物與陣列雜交并對比雜交圖譜。使用熒光標記探針可以同時分析一個芯片上的兩種不同細胞群的mRNA，以不同的波長檢測結果。基于微陣列的差異表達篩選技術描述于US-A-5,800,992。蛋白質組技術蛋白質組學大規模研究蛋白的特性，以在蛋白水平上獲得對疾病過程、細胞活動及其聯系的整體、綜合看法。關于蛋白質組中使用技術的綜述描述于Blackstock和Weir(1999)-另見其中提供的參考文獻。本發明方法主要涉及表達蛋白質組學，表達蛋白質組學使用分辨蛋白質的電泳技術和成像分析研究細胞中蛋白表達的整體變化。鑒于核酸分析突出信息，蛋白質組學更多地涉及產物。兩種方法有時是互補的，因為蛋白質組技術可用于檢測由于蛋白穩定性改變所引起的多肽水平(不是mRNA水平)變化。
蛋白質組學領域使用的一種廣為人知的獨特技術是使用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測細胞的多肽含量，并對比其與另一種細胞的多肽含量。電泳的結果通常為用染料(如銀染或考馬斯亮藍)顯色的凝膠，或者由凝膠產生的放射自顯影，所有斑點對應于各種蛋白的印跡。還可以使用熒光染料。
因此，目標是鑒定在兩種凝膠/放射自顯影之間有差異的斑點，即其中一種沒有、強度減弱或強度增強。因此，在蛋白質組學中，對比基因表達僅包括對比一種細胞和另一種細胞的蛋白譜。可利用商業軟件包進行自動斑點檢測。
可將目的斑點由凝膠中切除，并使用諸如基體加速激光解吸電離飛行時間(matrix-assisted-laser-desorption-ionisation-time-of-flight)(MALDI-TOF)質譜分析法和電噴射質譜分析法的技術鑒定蛋白質(參閱“Proteomics to study genes and genomes”Akhilesh Pandey andMatthias Mann，(2000)，Nature 405837-846)。
可能需要進行一些預分離檢測，例如離心或自由流動電泳，以改善對低豐度蛋白的鑒定。還開發了對堿性蛋白、膜蛋白和其它低溶解性蛋白的特殊方法(Rabilloud等，1997)。
另外，蛋白和抗體陣列領域的新進展現在可以同時檢測大量的蛋白質。例如，在濾膜上的低密度蛋白陣列如通用蛋白陣列系統(Ge H，(2000)Nucleic Acids Res.28(2)，e3)使得可以用標準ELISA技術和掃描電荷耦合裝置(CCD)檢測儀使陣列抗原成像。還開發了免疫傳感器陣列，能夠同時檢測臨床分析物。現在，有可能使用蛋白陣列剖析體液蛋白表達，例如健康或患病個體的血清以及藥物治療前和治療后的患者的體液蛋白表達。
抗體陣列也促進了推定影響疾病或特定生理狀態的眾多蛋白的大范圍平行分析。近來已經報道了許多制備抗體陣列的方法(參閱Cahill，Trends in Biotechnology，2000 747-51)。
以上論述描述了技術人員可利用的在先技術方法，以在一般意義上對兩種或多種細胞群進行差異表達篩選。還描述了為檢測總體基因表達變化而引入異源基因(Busch and Bishop，J Immunol，-2561；Robinson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997 947170-7175)。然而，本發明與這些先有技術方法的區別之處在于本發明需要進一步的步驟，即由實驗者改變細胞中特定內源生物分子的水平，使得對細胞微擾(如信號轉導事件)起反應并受到生物分子影響的基因產物水平變得更容易檢測。換句話說，目的是放大和/或增加通常獲得的差異反應的信噪比，使其細胞水平低和/或其表達通常僅小量改變的基因產物的檢測可能性增加。
舉例來說，轉錄因子HIF-1α對胞內氧水平起反應。降低氧水平增加HIF-1α活性，并導致受控于低氧反應因子(HRE)的基因轉錄增加。如果例如通過用控制HIF-1α表達的病毒載體感染細胞人為將細胞中的HIF-1α水平增加，那么預期HIF-1α介導的轉錄反應增加。因此，其表達對低氧敏感并由HIF-1α誘導介導的基因表達改變，應當大于表達生理水平HIF-1α的正常細胞。B.生物分子生物分子可以為由于細胞合成代謝或分解代謝過程或以任何方式由胞外環境攝取而在細胞中可見的任何化合物。術語“生物分子”是指在生物學意義上具有活性的分子。生物分子最好在細胞中合成(即是細胞內源性的)或在多細胞生物情況下在生物體的任何細胞中合成。
因此生物分子的實例包括蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂質、類固醇、輔因子、擬態物、輔基(如血紅素)、無機分子、離子(如Ca2+)、肌醇磷脂、激素、生長因子、細胞因子、趨化因子、炎性因子、毒素、代謝物、藥物因子、漿質攜帶的營養物(包括葡萄糖、氨基酸、輔因子、無機鹽、蛋白和脂質)、外源或病理胞外組分、胞內或胞外病原體(包括細菌、病毒、真菌或支原體)。適當時還可以包括以上物質的前體、單體、寡聚和多聚形式以及分解產物。
多肽生物分子的實例包括酶、轉錄因子、激素、細胞結構組分和受體(包括膜結合受體)。
最好已知所述生物分子涉及令人感興趣的細胞活動。
在本發明的一個實施方案中，所述生物分子對細胞環境條件(本文也稱作信號)變化起反應。這種環境條件或信號的實例包括細胞微環境的改變、接觸激素、生長因子、細胞因子、趨化因子、炎性因子、毒素、代謝物、pH、藥物因子、低氧、缺氧、局部缺血、任何漿質攜帶營養物(包括葡萄糖、氨基酸、輔因子、無機鹽、蛋白和脂質)的不平衡、滲透壓、溫度(低溫或高溫)、機械應力、輻射(電離或非電離輻射)、細胞-胞外基體的相互作用、細胞-細胞的相互作用、外源或病理性胞外組分的累積、胞內和胞外病原體(包括細菌、病毒、真菌或支原體)以及遺傳微擾(均為后生或由突變或多態性介導)。由以上的羅列可清楚看出，信號可以是外部施加的信號如環境信號，例如氧化還原壓力、胞外配體與細胞表面受體的結合，該結合導致由信號轉導信號介導的細胞反應。另一方面，所述信號可以為內部施加的信號，例如由于細胞代謝水平下降而使激酶活性增加。
可以直接或間接地改變生物分子水平。直接改變可通過例如在培養基中溫育細胞使細胞吸收分子實現，所述培養基含有的分子水平與生理水平不同例如高于生理水平。其它方法包括載體介導的傳遞和微注射。在核酸和多肽的情況下，可通過將控制核酸或多肽表達的異源核酸引入到細胞中而使細胞中的生物分子水平升高。
本文的術語“異源核酸”是指其天然不存在的核酸，即對細胞進行修飾，使其含有除了其引入形式之外其它形式不存在的核酸。例如，所述核酸可以為染色體外核酸，例如在以下物質上編碼的核酸細菌質粒、噬菌體、轉座子、酵母附加體、插入元件、酵母染色體元件、病毒(包括例如桿狀病毒和SV40病毒(猿猴病毒)、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和反轉錄病毒)或其組合，如得自質粒和噬菌體遺傳因子的物質，包括粘粒和噬菌粒。所述核酸可以通過例如使用反轉錄病毒載體(包括小鼠或貓白血病病毒或慢病毒人免疫缺陷病毒和馬傳染性貧血病病毒)摻入到染色體中。還可以使用人、細菌和酵母人工染色體(分別為HAC、BAC和YAC)傳遞比其它載體可包含或表達的DNA片段大的DNA片段。還可以通過例如病毒轉導或同源重組(參見例如國際專利申請WO99/29837號)或用于產生轉基因動物胚胎或干細胞的微注射技術將所述核酸整合入基因組中。盡管如此，部分或全部異源核酸分子仍可以與對應的基因組序列相同，因為引入額外拷貝基因對于增加該基因的表達水平是一個便利的方法。
改變生物分子水平的間接方法為數眾多，包括使用以上描述的方法增加抑制或刺激性分子的水平。抑制性分子包括針對編碼生物分子的mRNA的反義核酸、核酶或EGS(外部向導序列)、針對生物分子的轉顯性失活突變體、轉錄因子、酶抑制劑和胞內抗體如scFv。刺激性分子的實例包括酶激活劑和轉錄激活劑。因此，可以以多種方式處理細胞，使得生物分子的水平最終發生改變。可通過表達反義RNA降低表達。
按照本發明，應當使生物分子的水平相對于生理水平發生改變。因此它們可以增強或者減弱。術語“相對于生理水平”是指在轉變這些水平之前，相對于在正常生理條件下通常存在于細胞類型中的生物分子的濃度或活性。因此，本發明通過慎重的方法，將生物分子的活性改變至在正常生理條件范圍下細胞中可見的水平之上或之下。“生理條件”包括通常體內存在的條件和一般體外使用的細胞培養條件。
作為實施例，所述活性或濃度可以比例如引入異源核酸之前于細胞中存在的正常生理活性或濃度增加或降低2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
本發明還允許鑒定參與細胞活動的遺傳因子。如上所述，術語“遺傳因子”是指包括基因、基因產物(如RNA分子和多肽)和順式作用調節元件(如啟動子元件和增強子元件)。相比于常規的差異篩選技術，本發明顯著易化了對參與細胞活動的基因和基因產物的鑒定，因為使用所述方法顯著提高了信號水平和/或信噪比。
特別值得注意的是，本發明能夠鑒定參與細胞活動的基因和基因產物并因此進一步研究這些基因和基因產物的作用。例如，如果已知一種特定的多肽在細胞活動中起作用，那么這就為開發修飾或調節多肽并由此影響細胞活動本身的藥物鋪平了道路。這種信息顯然與疾病的分析、診斷和治療、鑒定侯選切入點具有極大關聯，并為開發能夠預防或糾正任何細胞活動中任何導致不需要效應(例如疾病)的生理不平衡的藥物鋪平道路。
除了鑒定基因和基因產物之外，本發明還允許鑒定其它與影響特定細胞活動的基因相關的元件。這些元件的實例包括調節細胞活動中表達的基因轉錄的啟動子元件和增強子元件。鑒定這些元件對于研究細胞活動具有極大價值，并且例如為開發對特定細胞活動中產生的生物信號起反應的合成調節元件鋪平了道路。
本發明在此方面包括鑒定基因及其調節元件中的突變和多態性，這些突變和多態性影響所述基因對所研究的細胞活動的反應。這類信息對于評價和剖析在不同生物條件下于不同個體之間發現的表達模式差異具有極大價值。
本發明的差異表達篩選方法還允許根據需要通過改變所研究途徑的特定方面，在分子水平剖析生物途徑。這樣，本發明方法比本領域已知的常規差異表達篩選方法有優勢。這些先有技術方法對比不同生物條件下細胞群之間的基因表達模式，并因此獲得對兩種細胞群基因表達模式的總體判斷，即使使用的異源核酸與具體的生物途徑和反應無關。相反，本發明方法通過將異源核酸引入一個細胞群，改變影響所研究途徑的特定生物分子的水平，可以仔細分析生物途徑的精確分子組分。
本發明在此方面可以用對低氧起生物反應的特別實施例闡述，盡管專業技術讀者理解類似的細胞活動同樣可用此方法研究。對低氧的生物應答是復雜的，具有大量的參與分子組分。兩種重要的組分為蛋白HIF1α和EASP1。通過將編碼HIF1α的異源核酸引入一個細胞群，可以評價由HIF1α自身產生的基因表達模式差異。使用編碼EPAS1的異源核酸進行一個相似實驗，可以在此特別方面剖析對低氧的分子應答。通過鑒定受一個途徑(HIF1α)調節而不受另一個途徑(EASP1)調節的分子組分，可以使用例如對HIF1α途徑組分特異性的因子選擇性調節該細胞活動。本發明對低氧反應的應用能夠發現受HIF1α和EASP1差異性調節的新基因，并因此提升了組織和細胞特異性治療調節對低氧的細胞應答的可能性。
HIF1α激動劑或拮抗劑潛在地具有分別上調或下調低氧反應(諸如血管生成和紅細胞生成)的應用。例如，已知腎臟促紅細胞生成素的產生受HIF1α調節(Bunn等(1998)EPO研究氧依賴性調節的模型系統，J Exp Biol 2011197-1201)，因此HIF1α拮抗劑可通過下調EPO而引起貧血。本發明鑒定受HIF1α和EASP1差異性調節的基因和清楚識別這兩種密切相關的轉錄因子的不同作用的應用使得可以開發EPAS1激動劑或拮抗劑或者特異性差異調節基因的活性調節劑，以克服HIF1α調節的任何潛在臨床副作用，并因此能夠鑒定和開發用于診斷和治療低氧相關疾病的診斷和治療產品。
而在本發明的一個優選的實施方案中，通過引入異源核酸(通常為控制多肽表達的核酸)改變生物分子水平，所述異源核酸應當包含有效連接至控制序列的編碼序列，該控制序列能夠保證宿主細胞表達所述編碼序列，即載體是表達載體。術語“有效連接”是指所述組分處于允許其以其預定方式起作用的關系。“有效連接”至編碼序列的調節序列可以這樣的方式與編碼序列連接在與控制序列匹配的條件下實現編碼序列表達。
例如可以通過加入另外的轉錄調節元件修飾控制序列，以使控制序列控制的轉錄水平對轉錄調節物的反應更強。
適于有效連接至本發明蛋白編碼序列的控制序列包括啟動子/增強子和其它表達調節信號。可以選擇那些與其中的表達載體設計使用的宿主細胞相容的控制序列。術語“啟動子”是本領域眾所周知的，包括在大小和復雜性方面由最小啟動子至包括上游元件和增強子的啟動子的核酸區段。
啟動子通常從在哺乳動物細胞中有功能的啟動子中選擇，盡管在合適的時候可以使用在原核細胞和其它真核細胞中有功能的啟動子。因此，啟動子通常得自病毒或真核生物基因的啟動子序列。例如，可以是得自其中發生表達的細胞基因組的啟動子。真核生物啟動子可以是以遍在方式(例如α-肌動蛋白、β-肌動蛋白、微管蛋白啟動子)或以組織特異性方式(例如丙酮酸激酶基因啟動子)起作用的啟動子。可以使用特定細胞特有的組織特異性啟動子。還可以是對特定刺激物起反應的啟動子，例如結合甾類激素受體的啟動子。還可以使用病毒啟動子，例如莫洛尼鼠類白血病病毒長末端重復序列(MMLV LTR)啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子或人巨細胞病毒(CMV)IE啟動子。
誘導型啟動子可能有優勢，可在細胞生存期間調節異源核酸表達水平。可誘導是指使用所述啟動子獲得的表達水平可以調節。
另外，這些啟動子中的任何一個都可以通過加入另外的調節序列(例如增強子序列)進行修飾。還可以使用包含得自上述兩種或多種不同啟動子的序列元件的嵌合啟動子。
合適載體的實例包括質粒、人工染色體和病毒載體。病毒載體包括腺病毒載體、單純皰疹病毒載體和反轉錄病毒載體。可以使用各種本領域已知技術，如轉染、轉化、電穿孔、重組病毒載體(如反轉錄病毒、單純皰疹病毒和腺病毒)感染、直接注射核酸和biolistic轉化，將載體/多核苷酸引入到合適的宿主細胞中。特別優選使用重組病毒載體介導技術。病毒載體按照本發明將異源核酸引入到細胞中使用的病毒載體可得自任何合適病毒。已經鑒定了無數不同的病毒，存在的亞類包括反轉錄病毒、慢病毒(為反轉錄病毒的亞類)、腺病毒和單純皰疹病毒。反轉錄病毒實例包括鼠類白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、猿猴免疫缺陷病毒、人T細胞白血病病毒(HTLV)、馬傳染性貧血病病毒(EIAV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、Jembrana病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、山羊關節炎-腦炎病毒(CAEV)、長臂猿白血病病毒(GALV)、脾病灶形成病毒(SFFV)、小鼠乳瘤病毒(MMTV)、Rous肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠類白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠類骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠類肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠類白血病病毒(A-MLV)、禽類髓細胞組織增生病毒-29(MC29)和禽類成紅細胞增多病毒(AEV)。反轉錄病毒的詳細清單可見Coffin等，1997，“Retroviruses”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，主編JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus，758-763頁。
可在本領域獲得許多反轉錄病毒基因組結構的細節。作為實施例，有關HIV、EIAV和Mo-MLV的細節可見NCBI Genbank(基因組登錄號分別為AF033819、U01866和AF033811)。
反轉錄病毒的慢病毒亞型甚至可再分為“靈長類”和“非靈長類”病毒。靈長類慢病毒的實例包括獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的致病因子人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非靈長類慢病毒類包括原型“慢病毒”維斯那/梅迪病毒(VMV)以及相關性山羊關節炎-腦炎病毒(CAEV)、馬傳染性貧血病病毒(EIAV)和最新描述的貓免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和Jembrana病毒。
反轉錄病毒基因組基本結構是5′LTR和3′LTR，位于它們之間或之中的是能夠包裝基因組的包裝信號(psi)、引物結合位點、能夠整合入宿主細胞基因組的整合位點以及編碼包裝組分(為病毒顆粒組裝所需要的多肽)的gag、pol和env基因。更復雜的反轉錄病毒具有其它特征，例如HIV中的rev和RRE序列，它們能夠將整合原病毒的RNA轉錄物由細胞核有效輸送至感染靶細胞的細胞質中。HIV-1基因組具有的其它特征為編碼輔助蛋白的tat、vif、vpu、vpr和nef，輔助蛋白是病毒感染性必須的或調節病毒的感染性。慢病毒基因組具有的另一個特征是促進非分裂細胞感染的中心多嘌呤段/中心終止序列(cPPT/CTS)。
在原病毒中，這些基因和其它元件位于稱作長末端重復序列(LTR)的區域兩端的側翼。LTR負責原病毒整合和轉錄。因此，它們含有增強子一啟動子序列，并可以控制病毒基因表達。反轉錄病毒RNA依靠位于病毒基因組5′末端附近的psi序列包衣殼。
LTR本身是相同的序列，可以分為三種元件，叫做U3、R和U5。U3得自RNA 3′末端獨有的序列。R得自RNA兩個末端重復的序列，而U5得自RNA 5′末端獨有的序列。三種元件的大小在不同的反轉錄病毒中可顯著不同。病毒RNA兩端的R區為重復序列，而U5和U3分別代表RNA基因組5′末端和3′末端獨有的序列。
對于一個用于本發明篩選方法的典型反轉錄病毒載體，至少可以去除病毒復制必須的一個或多個gag、pol和env蛋白編碼區中的一部分。這產生了復制缺陷型反轉錄病毒載體。其它修飾，如去除U3區的啟動子/增強子元件或缺失輔助蛋白基因，也可以使載體復制缺陷。去除的部分甚至可以由目的核苷酸序列(NOI)代替，如編碼上述生物分子的核苷酸序列，以產生能夠將其基因組整合入宿主基因組的載體，但其中修飾的病毒基因組由于缺少結構蛋白而不能自身繁殖。
在整合入宿主基因組時，NOI或者由于載體LTR轉錄或者由于位于合適位置(例如LTR之間的合適位置和相對于NOI的合適位置)的啟動子序列轉錄而發生表達。應當注意的是，還可以用不同的啟動子替代LTR中存在的病毒啟動子。所述啟動子序列通常在哺乳動物細胞中有活性。控制一個或多個第一核苷酸序列表達的啟動子序列可以是例如組成型或調節型啟動子。所述啟動子可以是例如病毒啟動子，如天然病毒啟動子或CMV啟動子，或者可以是哺乳動物啟動子。特別優選使用在特定細胞類型或組織類型中具有優選活性或可調節的啟動子。因此，在一個實施方案中，可以使用組織特異性調節序列。哺乳動物細胞可調節啟動子系統的實例是四環素誘導型啟動子系統(Clontech，Palo Alto，CA)。
因此，通常通過以下方法將NOI轉移入目的位點將NOI整合入重組病毒載體；將修飾的病毒載體包裝為病毒體顆粒；并允許目的位點轉導-例如靶細胞或靶細胞群。
因此，用于本發明的反轉錄病毒載體的最小基因組包括(5′)R-U5-包裝信號(psi)和一種或多種第一核苷酸序列-U3-R(3′)。然而，用于產生宿主細胞/包裝細胞載體基因組的質粒載體還包括轉錄調節控制序列，這些轉錄調節控制序列有效連接至控制基因組在宿主細胞/包裝細胞中轉錄的載體基因組。這些調節序列可以為與轉錄的反轉錄病毒序列相關的天然序列，即5′U3區，或者它們可以為異源啟動子，例如另一種病毒啟動子，例如CMV啟動子。制備反轉錄病毒載體可通過使用生產細胞系、包裝細胞系或者瞬時轉染的合適細胞系生產復制缺陷型反轉錄病毒載體。
生產細胞系是表達能夠轉導的載體顆粒裝配所需的所有組分的細胞系。即它們表達形成載體顆粒所需的gag/pol和包膜蛋白，并產生包裝入載體顆粒的載體基因組轉錄物。通常，生產細胞與包裝細胞的不同之處僅在于它們還可以穩定表達載體RNA這一事實。通過能夠控制載體RNA表達的質粒轉染，或者整合入宿主細胞核DNA后通過能夠控制載體RNA合成的載體基因組轉導，可以將載體RNA引入包裝細胞中制備生產細胞。還可以通過控制載體RNA轉錄的質粒瞬時轉染，將包裝細胞轉變為一過性生產細胞。還可以由僅包含形成可轉導載體顆粒必須的三種組分中的兩種的細胞系制備生產細胞。例如，在MLV載體領域，TelCEB細胞系穩定表達MLV gag/pol和MLV載體基因組MFGnlsLacZ。通過引入控制包膜基因表達的質粒可以將TelCEB細胞系轉變為生產細胞系。在這方面，應當注意的是盡管gag/pol基因得自同一病毒，但env可以得自相同病毒，也可得自不同病毒。當由于利用不同病毒的包膜功能而形成感染性顆粒時，據認為載體顆粒已經假型化。例如，在慢病毒載體領域，通常制備由棒狀病毒、水泡性口炎病毒G蛋白假型化的載體。
還可以通過用表達轉導顆粒形成所需組分的質粒轉染合適細胞系瞬時制備載體顆粒。例如，可通過用控制gag/pol、載體基因組和包膜表達的質粒轉染人細胞系HEK 293T生產MLV、EIAV或HIV載體顆粒(Soneoka等，1995)。例如為增加滴度，還可以共轉染另一種質粒。
瞬時轉染方法正開發載體時可有利地用于檢測載體產生水平。在這一點上，瞬時轉染避免了產生穩定載體生產細胞系所需的時間長的缺點，還可以在載體或反轉錄包裝組分對細胞有毒時使用。通常用于產生反轉錄病毒載體的組分包括編碼gag/pol蛋白的質粒、編碼env蛋白的質粒和包含NOI的質粒。載體產生包括將這些組分中的一種或多種瞬時轉染入含其它需要組分的細胞中。如果載體編碼毒性基因或干擾宿主細胞復制的基因(例如細胞周期抑制劑或誘導凋亡的基因)，則可能難以產生穩定的載體生產細胞系，但瞬時轉染可用于在細胞死亡前產生載體。此外，用瞬時轉染產生的細胞系產生的載體滴度水平與由穩定載體生產細胞系獲得的水平相當。
現在，排列單獨編碼的顆粒形成組分編碼基因已成為反轉錄病毒載體領域的標準操作。例如，FLYA13 MLV包裝細胞系具有表達MLV gag/pol和env的單獨轉錄單元。該策略降低了可復制病毒的生產可能性，因為野生型病毒生產需要三個重組事件。因為同源性非常有益于重組，所以降低或消除載體和輔助病毒基因組之間的同源性還可以用于減少可復制輔助病毒產生的問題。
生產細胞/包裝細胞可以是任何合適的細胞類型。最通常使用的是哺乳動物生產細胞，但其它細胞如昆蟲細胞并沒有被排除在外。顯然，生產細胞必須能夠有效翻譯env和gag、pol mRNA。許多合適的生產包裝細胞系是本領域已知的。技術人員還能夠通過例如將編碼包裝組分的核苷酸構建物穩定引入細胞系中來制備合適的包裝細胞系。
非常理想的是，在實驗和實際應用時都使用高滴度病毒制備物。一種增加病毒的技術是濃縮病毒母液。通過離心可以很便利地達到此目的，但也可以使用其它方法如柱層析。
基于慢病毒的載體系統特別適用于本發明。這是因為它們能夠感染分裂細胞或非分裂細胞。可實現基因轉移的非分裂細胞實例包括神經元和造血干細胞。另外，可以構造慢病毒載體，以便它們在靶細胞中僅表達NOI。實際上它們是表型沉默。因此，引入轉基因的過程對宿主細胞產生的微擾最小。已經開發了基于HIV-1、EIAV和FIV的載體系統，并已經開發至據說最小的程度。HIV-1和EIAV的最小載體系統描述于WO 98/17815和WO 99/32646以及Kim等(1998)J.Virol，72，811-816和Mitrophanous等(1996)Gene Therapy，6，1808-1818。在這些最小系統中，載體組分被工程為在靶細胞中僅表達NOI，而且生產使用細胞的病毒蛋白表達降低至最小。對于HIV-1和EIAV兩個系統來說，為形成感染性顆粒必須表達的慢病毒基因僅僅是gag/pol和rev。與Rev反應元件(RRE)組合起作用的Rev必須達到形成高水平顆粒所需的Gag/Pol水平。一種甚至更進一步降低慢病毒蛋白要求的途徑是密碼子優化gag/pol。這使得Rev/RRE成為表達無關型。慢病毒gag/pol的密碼子優化過程描述于WO 99/41397、Kotsopoulou等，(2000)J.Virol.74，4839-4852。EIAV gag/pol的密碼子優化過程描述于英國專利申請0009760.0。
本文通過解釋給出了有關密碼子優化過程的更多信息。不同物種細胞的具體密碼子使用不同。這種密碼子偏倚反映出細胞類型中特定tRNA相對豐度的偏差。通過改變序列中的密碼子使得它們與對應的tRNA的相對豐度匹配，有可能增加表達。基于同樣理由，通過故意選擇已知對應的tRNA在特定細胞類型中罕有的密碼子，有可能降低表達。因此，可獲得另外的翻譯控制度。
許多病毒，包括HIV和其它慢病毒，使用大量罕有密碼子，通過將這些密碼子改變為哺乳動物通常使用的相應密碼子，可以增加包裝組分在哺乳動物生產細胞中的表達。哺乳動物細胞以及各種其它生物的密碼子使用表是本領域已知的。
密碼子優化具有許多其它優勢。利用其序列中的改變，生產細胞/包裝細胞中編碼病毒顆粒組裝所需的病毒顆粒包裝組分的核苷酸序列具有由其中除去的RNA不穩定序列(INS)。與此同時，仍保留包裝組分編碼序列，使得由所述序列編碼的病毒組分保持相同，或至少保持足夠相似，以確保包裝組分的功能未失效。密碼子優化還解決了Rev/RRE的輸出需要，使得優化序列與Rev無關。密碼子優化還降低了載體系統中不同構建物之間(例如gag-pol重疊區和env可讀框之間)的同源重組。因此，密碼子優化的總體作用是顯著增加病毒滴度和改善安全性。
在一個方案中，僅有與INS相關的密碼子進行密碼子優化。然而，在高度優選的實施方案中，序列整體進行密碼子優化，除了包含移碼部位的序列。gag-pol基因包含兩個分別編碼gag和pol蛋白的重疊讀框。兩種蛋白的表達依賴于翻譯過程中的移碼。這種移碼是由于翻譯過程中核糖體“滑動”造成。這種滑動據認為至少部分是由于核糖體失速(stalling)RNA二級結構引起。這種二級結構存在于gag/pol基因的移碼部位下游。對于HIV，重疊區由gag起始處下游的核苷酸1222(其中核苷酸1為gag ATG的A)延伸至gag末端(核苷酸1503)。因此，跨越移碼部位和兩個讀框重疊區的281bp片段最好不進行密碼子優化。保留此片段能夠更有效地表達gag-pol蛋白。對于EIAV，重疊區的起始處已經到了核苷酸1262(其中核苷酸1為gag ATG的A)。重疊區的末端在核苷酸1461。為了確保保留下移碼部位和gag-pol重疊區，保留野生型序列的核苷酸1156至1465。
可以對最優密碼子使用進行衍化，例如為了提供便利的限制位點，可以將保守氨基酸變化引入到gag-pol蛋白中。
在一個高度優選的實施方案中，密碼子優化基于高度表達的哺乳動物基因。可以改變第三個堿基，有時可以改變第二和第三個堿基。
由于遺傳密碼的簡并性，應當認識到，專業技術人員可以獲得眾多gag/pol序列。還存在許多據描述可用作產生密碼子優化的gag/pol序列起點的反轉錄病毒變異體。慢病毒基因組可變性相當大。例如存在許多仍有功能的HIV-1準物種。對EIAV也有同樣的情況。這些變異體可用于增強轉導過程的特定部分。HIV-1變異體的實例可見于http//hiv-web.lanl.gov。EIAV克隆的詳述可見于NCBI數據庫http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
任何反轉錄病毒均可以使用密碼子優化gag/pol序列的策略。這應適用于所有的慢病毒，包括EIAV、FIV、BIV、CAEV、Maedi/Visna、SIV、HIV-1和HIV-2。另外，此方法還可用于增加HTLV-1、HTLV-2、HFV、HSRV以及人內源性反轉錄病毒(HERV)、MLV和其它反轉錄病毒基因的表達。
可以幾種方式增強慢病毒載體的性能。最值得注意的是，對病毒基因組的修飾改善了轉導效率和NOI表達水平。這兩種類型的修飾可改善慢病毒載體用于本文所述用途的適用性。可通過加入稱作中心多嘌呤段/中心終止序列(cPPT/CTS)的元件改善轉導效率。該元件約200個核苷酸，天然地位于病毒基因組中心附近，并顯示改善HIV-1型載體的轉導(Follenzi等，(2000)Nat Genet.2000年6月；25(2)217-22；Sirven等，Blood，2000年12月15日；96(13)4103-10)。可利用旱獺肝炎病毒轉錄后調節元件(WHPRE)改善NOI表達。該元件為600bp，通過涉及增強聚腺苷酸化的機制增加mRNA半壽期來增強蛋白表達。其有益作用已在許多載體中得到證實，包括HIV-1型載體(Zuffeerey，J Virol.(1999)4月；73(4)2886-92；Ramezani等，Mol Ther.2000年11；2(5)458-69)。使用該元件的這種方法和其它方法描述于WO 99/14310號。
還可以使用得自痘病毒的載體(包括得自牛痘病毒、禽類痘病毒和昆蟲痘病毒的載體)在廣泛的靶細胞類型中表達NOI。其應用綜述于B Moss.1996(痘病毒科病毒及其復制，載于Virology，BN Fields等主編，83章，2637-2671頁，Lippincott-Raven Publishers；PA USA)。得自α-病毒和痘病毒的載體的應用綜述于MW Carroll等，2001(哺乳動物表達系統和免疫接種；載于Genetically Engineered Viruses，107-158頁，C Ring & E Blair主編，BIOS Scientific Publishers Ltd OxfordUK)。還可以將腺伴隨病毒載體用作基因轉移載體，其應用綜述于以下的出版物“用于基因轉移和基因治療的腺伴隨病毒載體”(Bueler，H AUTHOR AFFILIATIONInstitut fur Molekularbiologie，UniversitatZurich，Switzerland，來源Biol Chem 1999年6月；380(6)613-22)。C.目的細胞目的細胞可以為任何細胞，例如原核細胞、真菌細胞(例如酵母)、植物細胞或動物細胞(例如昆蟲細胞或哺乳動物細胞，包括人細胞)。在多細胞生物細胞時，細胞可以為靈長類細胞或無限增殖細胞系，可以包含組織樣品，或者它們可以為活體生物的組成部分。盡管細胞經常是指單個細胞，但一般意義上的細胞為細胞群組成部分。
在本發明方法中，需要對比至少兩種不同細胞之間的基因表達。通常兩種或多種細胞中的第一種細胞叫做參比細胞。在本發明的一個優選實施方案中，用于對比的細胞基本上在所有方面都相同。例如，它們可以都是相同細胞系的細胞，或者可以得自一個生物體的同一組織。然后，可以操作其中一種或兩種細胞，使它們包含如B節所述的相對于生理水平來說水平改變的生物分子。在一個實施方案中，第一種細胞未改變，而第二種細胞改變。特別優選這種情況，因為這應當改善信噪比。但在另一個實施方案中，兩種細胞都改變。
盡管如此，用作研究起點的細胞也不一定要大致相同。例如，在本發明的一個方面，可以使用患病生物(例如哺乳動物患者)的細胞研究參與疾病過程的基因。這可以與正常生物細胞或得自相同或不同患病個體的類似細胞進行對比。在使用正常生物細胞或患病生物細胞時，正常細胞一般相當于第一種目的細胞，而患病細胞相當于第二種目的細胞。因此，至少如以上B節所述，患病細胞發生改變，使得這些細胞包含水平改變的生物分子。
在本發明的另一個實施方案中，一種細胞是含突變基因的細胞，而另一種細胞含野生型形式的同一基因。
本發明包含的另一種可能性是細胞得自不同組織或得自發育或分化的不同階段。D.應用本發明提供許多利用差異表達篩選技術鑒定基因的改進方法。
在第一方面，提供一種鑒定參與細胞活動的基因的方法。大體上是操作一種細胞類型，使得細胞中參與細胞活動的生物分子水平發生改變。通常，這可以通過將控制多肽表達的異源核酸引至所述細胞中實現。所述多肽可以和生物分子相同，或者可以如上所述調節生物分子的水平。
一般來說，僅調節兩種相同細胞中的一種細胞的生物分子水平然后檢測基因轉錄不是本發明方法的目的，因為是檢測細胞中生物分子對基因表達的作用，而不是改變生物分子水平以增強或降低對目的事件的反應。
但是，在生物分子為細胞天然產生的基因產物(如多肽)時，通過引入異源核酸改變基因產物水平可同時用于微擾細胞活動和增強對這種微擾的反應，所以易于使用差異表達技術鑒定參與細胞活動的基因產物。作為實施例，HIF-1α過表達增強了低氧反應下游的元件，因為其增強了HIF-1α介導的轉錄的調節作用。
盡管如此，在本發明的較廣泛方面，存在兩種最大的可能性。第一種可能性是兩種細胞類型不同，并具有固有的差異基因表達模式。在此情況下，生物分子水平改變可用于增強這些差異。所述兩種細胞例如可得自不同組織，或者可得自不同的發育或分化階段。所述兩種細胞還可以因為一種細胞得自患病組織而另一種細胞得自正常組織而不同。在以上C節中給出了設想的其它配置。
第二種可能性是兩種細胞類型相同，但一種細胞以某種方式受刺激，而另一種細胞沒有(或一種細胞的受刺激程度高于另一種)。例如，一種細胞可以在生長因子存在下溫育，而另一種沒有。因此，在此實例中，生長因子不是生物分子，而是用來微擾細胞中基因表達的刺激物或信號，其作用可通過所述生物分子增強，而其又被由異源核酸表達的多肽改變水平。
因此，本發明在此方面提供以下方法通過使兩種不同的細胞群經受不同水平的信號或環境條件，鑒定其表達受信號或環境變化調節的基因，通過操作任一種或兩種細胞群，以改變其活性對信號或環境條件起反應的生物分子的水平，并鑒定其表達不同的基因產物。術語“其活性對信號或環境條件起反應”包括任何其在細胞中的濃度根據信號或環境條件而變化的生物分子，以及其特性(如酶活性或對另一種細胞組分的親和性)根據信號或環境條件而變化的生物分子。
因此，回到以上生長因子的實例，可以改變接觸生長因子的細胞，以表達增加水平的轉錄因子，該轉錄因子參與涉及該特定生長因子的信號轉導級聯。因此，轉錄因子之后的生長因子的作用增強(或者負面意義或者正面意義)，所以易于鑒定其表達受轉錄因子并最終受生長因子調節的差異表達基因。
如上所述，信號或環境條件或者為物理信號，例如氧化還原條件的變化、CO2水平、光、滲透壓、溫度[低溫或高溫]、機械壓力、輻射[電離或非電離]、暴露于低氧、缺氧、局部缺血，或者為化學信號，例如細胞微環境變化，接觸結合細胞表面受體并觸發信號轉導途徑的配體，包括激素、正常附著于其他細胞的細胞表面分子、擴散或轉運到細胞中的酶反應底物、生長因子、細胞因子、趨化因子、炎性因子、毒素、代謝物、pH、藥物因子、漿質攜帶營養物的不平衡、細胞-胞外基體的相互作用、細胞-細胞的相互作用、外源或病理性胞外組分的累積、胞內或胞外病原體(包括細菌、病毒、真菌和支原體)以及遺傳微擾。
第一種細胞可以以第一種水平經受信號，而第二種細胞以第二種水平接觸信號。在一個實例中，第一種水平可僅缺乏信號，而第二種水平可存在所述信號，或相反。信號水平可以調節，以便提供可分辨差異的基因表達。在一個替代實施方案中，第一種和第二種細胞都可以于第一種和第二種兩種信號水平進行對比。在第二種細胞中存在異源核酸將放大由信號改變引起的基因表達差異。
兩種信號水平最好都為生理相關水平。
在本發明的一個方面，可以使用已經獲得的有關參與疾病或其它生物過程的基因的知識，得到有關其表達在疾病或其它生物過程中改變的其它基因的進一步信息。為此，修飾一種細胞，以便改變已知參與疾病或其它生物過程的基因產物水平，這種改變或者通過例如引入編碼基因產物的異源核酸直接進行，或者如B節所述間接進行。然后檢測兩種細胞中的基因表達，對比結果以鑒定其表達改變的基因產物。
在本發明的這一方面，兩種細胞可以相同，只是已知參與疾病或其它目的生物過程的基因產物水平有變化。因此，兩種細胞可以都是和本身表現疾病或其它過程的細胞類型相同的正常細胞，或者它們可以都是患病細胞。或者，一種細胞可以是正常細胞，而另一種細胞是患病細胞。如果僅有一種細胞被修飾，那么最好是患病細胞被修飾。
在本發明的再一方面，差異表達篩選方法以兩步法用于鑒定參與疾病或其它進程的基因。首先，對比第一種目的細胞(例如正常患者細胞)和第二種目的細胞(例如患病患者的相應細胞)之間的基因表達。如上所述，第一種細胞和第二種細胞在某些方面是不同的，使得它們作用出不同的表達模式。這可能是因為細胞得自不同組織，或者是因為它們得自不同的個體(例如得自正常患者和患病患者)。所述細胞可能來源相似，但在某些方面進行了不同的處理。
然后鑒定其表達在第一種細胞和第二種細胞之間不同的基因產物。其次，在此篩選方法中使用基本與第一種細胞相同的第三種目的細胞，其中將侯選基因引入到第三種細胞使基因水平改變(通常上升)。對比該細胞的基因表達和第一種細胞的基因表達，鑒定在第一種細胞和含有水平改變的侯選基因的第三種細胞之間表達不同的基因產物。如果其表達在第二種細胞中改變的基因產物在第三種細胞中還具有改變的基因表達，那么選擇該侯選基因繼續研究。
最好在兩種或多種基因產物之間存在相關性，優選至少4種或5種基因產物，以使假陽性最小化。
現在，引用僅僅是說明性和非限制性的實施例描述本發明。在以下的實施例中，將以上描述的本發明方法稱為“Smartomics”，。
附圖簡述

圖1進行RNA印跡，以證實使用腺病毒基因轉移的HIF-1α和EPAS1在轉導巨噬細胞中過表達。如下所述進行RNA上樣1、2道用腺病毒AdApt ires-GFP轉導的巨噬細胞。3、4道用腺病毒AdApt HIF-1α-ires-GFP轉導的巨噬細胞。4、5道用腺病毒AdAptEPAS1-ires-GFP轉導的巨噬細胞。在泳道1、3、5中，以正常含氧量(20％O2)保持巨噬細胞。在泳道2、4、6中，以低含氧量(0.1％O2)保持巨噬細胞。RNA大小梯度的條帶位置以千堿基(kb)標在每個印跡的右側。雜交探針與基因HIF-1α(A)、EPAS1(B)和28s核糖體RNA(C)互補。
圖2使用Research Genetics GeneFilters分析兩種典型RNA樣品的散點圖。正常含氧量(Y軸)和低含氧量(X軸)中的非轉導巨噬細胞RNA與兩個Research Genetics GeneFilters GF200陣列雜交。分析以對陣列上每個基因的歸一化密度表示，每個基因具有兩個對應于正常氧含量和低氧含量信號的兩個值。將這些值作圖為散點圖，每個點代表陣列上的一個基因。RNA樣品之間以相似水平表達的基因位于x＝y線上。在此圖中清楚顯示了檢測的動態范圍。
圖3用Smartomics分析乳酸脫氫酶A的表達。在A圖中，顯示了對應于乳酸脫氫酶A(LDH-A)基因的點的微型圖象。對照水平設定在使該基因顯色最佳但在整個圖中為恒定設置的水平。6個圖象的每個條圖都對應于RNA樣品范圍內的離散陣列位置或實驗。位于各個點圖像下面的數字為該點對參比條件(gfp；20％O2)的歸一化密度比。陣列位置Research Genetics定義的點標識。克隆IMAGE鑒定。直方圖(B圖)顯示所示數值的平均值，誤差范圍為標準差。gfp用AdApt ires-GFP轉導的細胞。Hif-1α用AdApt Hif-1α-ires-GFP轉導的細胞。Epas1用AdApt Epas1-ires-GFP轉導的細胞。
圖4用Smartomics分析甘油醛3-磷酸脫氫酶的表達。在A圖中，顯示了對應于甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因的點的微型圖象。對照水平設定在使該基因顯色最佳但在整個圖中為恒定設置的水平。6個圖象的每個條圖都對應于RNA樣品范圍內的離散陣列位置或實驗。位于各個點圖像下面的數字為該點對參比條件(gfp；20％O2)的歸一化密度比。陣列位置Research Genetics定義的點標識。克隆IMAGE鑒定。直方圖(B圖)顯示所示數值的平均值，誤差范圍為標準差。gfp用AdApt ires-GFP轉導的細胞。Hif-1α用AdApt Hif-1α-ires-GFP轉導的細胞。Epas1用AdApt Epas1-ires-GFP轉導的細胞。
圖5用Smartomics分析血小板衍生生長因子β的表達。在A圖中，顯示了對應于血小板衍生生長因子β(PDGFβ)基因的點的微型圖象。對照水平設定在使該基因顯色最佳但在整個圖中為恒定設置的水平。6個圖象的每個條帶都對應于RNA樣品范圍內的離散陣列位置或實驗。位于各個點圖像下面的數字為該點對參比條件(gfp；20％O2)的歸一化密度比。陣列位置Research Genetics定義的點標識。克隆IMAGE鑒定。對于該基因，對應于同一基因存在不同的IMAGE克隆。直方圖(B圖)顯示所示數值的平均值，誤差范圍為標準差。gfp用AdApt ires-GFP轉導的細胞。Hif-1α用AdApt Hif-1α-ires-GFP轉導的細胞。Epas1用AdApt Epas1-ires-GFP轉導的細胞。
圖6用Smartomics分析單核細胞趨化蛋白-1的表達。在A圖中，顯示了對應于單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)基因的點的微型圖象。對照水平設定在使該基因顯色最佳但在整個圖中為恒定設置的水平。6個圖象的每個條帶都對應于RNA樣品范圍內的單獨實驗。位于各個點圖像下面的數字為該點對參比條件(gfp；20％O2)的歸一化密度比。陣列位置Research Genetics定義的點標識。克隆IMAGE鑒定。直方圖(B圖)顯示所示數值的平均值，誤差范圍為標準差。gfp用AdApt ires-GFP轉導的細胞。Hif-1α用AdApt Hif-1α-ires-GFP轉導的細胞。Epas1用AdApt Epas1-ires-GFP轉導的細胞。
圖7使用Smartomics發現新基因(Hs.16335)。在A圖中，顯示了對應于UniGene簇Hs.16335 EST的點的微型圖象。對照水平設定在使該基因顯色最佳但在整個圖中為恒定設置的水平。對于該基因，對照水平為最大。6個圖象的每個條帶都對應于RNA樣品范圍內的單獨實驗。位于各個點圖像下面的數字為該點對參比條件(gfp；20％O2)的歸一化密度比率。陣列位置Research Genetics定義的點標識。克隆IMAGE鑒定。直方圖(B圖)顯示所示數值的平均值，誤差范圍為標準差。gfp用AdApt ires-GFP轉導的細胞。Hif-1α用AdApt Hif-1α-ires-GFP轉導的細胞。Epas1用AdApt Epas1-ires-GFP轉導的細胞。
圖8用有效RNA印跡(Virtual Northern blot)雜交來證實Smartomics發現的Hs.16335。A)雜交探針＝Hs.16335。B)雜交探針＝β肌動蛋白。1-6泳道為圖3-7中使用的得自腺病毒轉導細胞的RNA樣品。泳道7-10為有(泳道9、10)或沒有(泳道7、8)預先激活的非轉導巨噬細胞。直方圖顯示得自磷成像儀的、與位于其上的RNA印跡相關的相對mRNA表達水平。數字為相對于gfp(20％O2)的相對表達比。
圖9pONY8Z的質粒圖譜。
圖10pONY8.1SM的質粒圖譜。
圖11pSMART CMV-HIF的質粒圖譜。
圖12pSMART CMV-空白型質粒圖譜。
實施例實施例1Smartomics用于在巨噬細胞中發現基因巨噬細胞與各種疾病狀態有關，包括癌癥、動脈粥樣硬化和炎性疾病(如關節炎)。在許多這樣的病癥中，巨噬細胞分泌惡化疾病狀態的因子。這些因子包括血管發生因子、趨化因子和炎性細胞因子。這些因子中有一些是已知的，但可能存在目前未知的其它因素，而它們可能是治療的重要靶點。在許多病癥中，巨噬細胞存在于低氧區域，就是這種生理狀態起啟動眾多基因的信號作用。已知這種背景，那么就有理由提出，在心血官疾病、癌癥和炎性疾病領域可以于低氧環境下誘導藥物開發的重要靶。
代表本領域當前水平的一個簡單方法是采用單核細胞/巨噬細胞群，將它們分為兩組，一組置于正常氧濃度下，另一組置于低氧條件下。然后可以將兩組的RNA或蛋白分子用于合適的差異分析。目標是鑒定在低氧條件下存在但在保持在正常氧濃度下的細胞中不存在的蛋白或cDNA分子。
如果本發明用于鑒定巨噬細胞中的低氧誘導基因和蛋白，應當試圖擴大低氧和正常氧之間的差異，以便增加信噪比。這可以通過以下方法實現將Hif1α基因傳遞至其中Hif1α基因過表達配置的巨噬細胞中，增強對低氧信號的反應。Hif1α是對低氧反應的調節過程的一部分。低氧誘導途徑中的Hif1α和其它蛋白與稱為低氧反應元件(HRE)的增強子元件相互作用，以開啟低氧誘導基因的轉錄。各種形式的HRE存在于許多已知在低氧條件下被開啟的基因的上游位置。Hif1α過表達導致許多低氧誘導基因大量過表達，并因此在差異篩選中增加了低氧特異性cDNA或蛋白的水平。這又增加了檢測那些可能為藥物開發靶的分子種類的可能性。因此，在此情況下，按照本發明使用的方法將對比在正常氧條件下未過表達Hif1α的巨噬細胞和在低氧條件下過表達Hif1α的巨噬細胞。
Hif1α的傳遞和表達可通過多種方式實現。
在此，我們描述組成表達轉錄因子HIF1α的腺病毒載體的構建。使用以下的PCR引物由Jurkat mRNA分離HIF1αcDNA，所述引物在5′突出端分別具有NheI和HpaI限制位點正向引物5′-CG -GACCGATTCACCATGGAG-3′反向引物5′-CG -GCTCAGTTAACTTGATCC-3′用NheI和HpaI限制酶消化PCR產物，并插入含人CMV啟動子和SV40聚腺苷酸序列的Introgene AdAptTM轉移載體的NheI-HpaI位點。該載體可以用PmlI線性化，然后和腺病毒血清型5基因組的右臂共轉染入E1表達細胞系PerC6(還可以用911或293細胞)。
使用PerC6無RCA系統產生AdCMVHIF1α腺病毒描述于www.introgene.com(Introgen，Leiden，the Netherlands)。用腺病毒有效轉導初級人巨噬細胞的方法描述于Griffiths等，2000。
以如下所述的多種可能方式比較轉導和未轉導巨噬細胞群的基因表達，以獲得在Hif1α控制下表達的基因讀數。另外，對比在低于0.5％氧濃度下溫育的轉導細胞和非轉導細胞。
制備總RNA樣品進行差異基因表達分析。這些樣品或者放射標記，或者熒光標記，并與固相支持物上的cDNA陣列雜交。低氧和/或各種HIF蛋白表達上調的基因定量地產生更強的雜交信號。陣列方案可以包括尼龍或玻璃支持物的任一種，這綜述于Bowtell，1999。涉及玻璃支持物方案的方法學細節詳述于Eisen和Brown，1999。在此，使用熒光標記探針，并使用激光共聚焦掃描儀檢測雜交。對于尼龍支持物方法，包括點印跡和雜交的標準分子生物學方法，詳述于Molecular CloningA Laboratory Manual，Sambrook，J等，Cold SpringHarbor Laboratory Press。在此，放射標對比的RNA樣品，并使用磷成像儀檢測雜交。
陣列可購自Research Genetics，Huntsville，AL，或使用扣除克隆產生的cDNA克隆自己制作(PCR選擇法，由Clontech，Palo Alto，CA擁有)。制作包括應用點陣機器人(MicroGrid，BioRobotics Ltd，Cambridge，UK)。實施例2使用Smartomics鑒定巨噬細胞中的低氧調節基因本發明用于鑒定巨噬細胞中低氧誘導的基因和蛋白。
Smartomics用于改善發現初級人巨噬細胞中受低氧作用激活或抑制的基因。如實施例1所述，Smartomics涉及通過實驗性引入低氧反應的關鍵調節物即低氧誘導型因子1α(HIF-1α)，增強對低氧的天然反應。或者單獨實現HIF-1α過表達，或者與細胞暴露于低氧組合實現HIF-1α過表達。這使得可以檢測用其他方法還不能檢測到的在單獨低氧作用下產生的基因表達改變。
盡管HIF-1α介導低氧反應廣為人知，但還已知或猜測其它轉錄因子參與其中。這些因子包括叫做內皮PAS結構域蛋白1(EPAS1)或HIF-2α的蛋白，HIF-2α與HIF-1α具有48％序列同一性(“內皮PAS結構域蛋白1(EPAS1)，一種在內皮細胞中選擇性表達的轉錄因子”，Tian H，McKnight SL，Russell DW.Genes Dev.1997年1月；11(1)72-82)。有證據提示，EPAS1對介導某些細胞類型的低氧反應特別重要，在人巨噬細胞中可清楚檢測出EPAS1，表明其在該細胞類型中起作用(“巨噬細胞—基因治療病理性低氧的新系統”，Gene Ther.2000年2月；7(3)255-62，Griffiths L，Binley K，Iqball S，Kan O，Maxwell P，Ratcliffe P，Lewis C，Harris A，Kingsman S，Naylor S.)。按照該文獻，本實施例還利用EPAS1過表達作為獨立于HIF-1α過表達的改善低氧反應型基因尋找的方法。還闡述了本發明的實施方案，其中可以鑒定對HIF-1α和EPAS1(或其它低氧反應介導物)反應的差異，目的是鑒定更適于特異性和有效治療疾病的治療靶分子。
如實施例1所述，可利用重組腺病毒將外源基因序列(即HIF-1α或EPAS1)引入初級巨噬細胞。如實施例1所述，可利用商用系統生產包含腺病毒轉移載體AdApt、腺病毒基因組質粒AdEasy和包裝細胞系Per-c6(Introgen，Leiden，The Netherlands)的腺病毒顆粒。按照標準的生產商說明書操作。
已經制備了AdApt轉移載體的三種衍生物，叫做AdApt ires-GFP、AdApt HIF-1α-ires-GFP和AdApt EPAS1-ires-GFP。在這些載體中，為便利起見，修飾AdApt，使由強巨細胞病毒(CMV)啟動子表達的插入基因(即HIF-1α或EPAS1)借助于內部核糖體結合位點(ires)連接至綠色熒光蛋白(gfp)標記物。因此，出現綠色熒光成為病毒在轉導的哺乳動物中表達HIF-1α或EPAS1的便利指示劑。
使用標準分子生物學方法構建AdApt衍生物，所述方法包括反轉錄酶PCR(RT-PCR)、通過限制酶消化在質粒之間轉移DNA片段、瓊脂糖凝膠DNA片段分離、“末端修復”具有突出端的雙鏈DNA片段以產生平端，以及DNA連接。由DNA測序確認亞克隆步驟。這些技術是本領域眾所周知的，但特別可參考Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual(1989)和Ausubel等，Short Protocols inMolecular Biology(1999)，第4版，John Wiley & Sons，Inc。
簡而言之，通過將腦心肌炎病毒(EMCV)ires和綠色熒光蛋白基因(GFP)緊接著CMV啟動子下游并與其同一方向先后插入到AdApt的末端修復的HpaI限制位點中，制備AdApt ires-GFP。EMCV ires和gfp序列都廣泛使用，并可由常用的質粒獲得。SEQ ID NO1列出了插入到AdApt質粒的連接的ires-GFP的確切核苷酸序列。
通過將人HIF-1α蛋白編碼序列插入到AdApt ires-GFP的CMV啟動子和ires-GFP元件之間，由AdApt ires-GFP獲得質粒AdAptHIF-1α-ires-GFP。為此，通過RT-PCR由人mRNA克隆人HIF-1αcDNA，通過與公開的HIF-1αcDNA核苷酸序列(Genbank登錄號U22431)對比驗證所述序列。HIF-1α序列以末端修復的片段連接入AdApt ires-GFP的末端修復的AgeI限制位點[還可以是緊接著CMV啟動子下游的親代載體AdApt的AgeI限制位點]。SEQ ID NO2顯示了含插入到AdApt ires-GFP中的編碼HIF-1α的確切DNA序列。
通過將人EPAS 1蛋白編碼序列插入到AdApt ires-GFP的CMV啟動子和ires-GFP元件之間，由AdApt ires-GFP獲得質粒AdAptEPAS1-ires-GFP。為此，通過反轉錄酶PCR(RT-PCR)由人mRNA克隆人EPAS1 cDNA，通過與公開的EPAS1 cDNA核苷酸序列(Genbank登錄號U81984)對比驗證所述序列。EPAS1序列以末端修復的片段連接入AdApt ires-GFP的末端修復的AgeI限制位點[還可以是緊接著CMV啟動子下游的親代載體AdApt的AgeI限制位點]。SEQ ID NO3顯示了含插入到AdApt ires-GFP中的編碼EPAS1的確切DNA序列。
在生產腺病毒顆粒之前，驗證腺病毒轉移載體AdApt HIF-1α-ires-GFP和AdApt EPAS1-ires-GFP在哺乳動物細胞中控制CMV啟動子表達具功能活性的HIF-1α或EPAS1蛋白的能力。這可如文獻所述通過瞬時轉染熒光素酶報導基因測定實現(Boast K，Binley K，IqballS，Price T，Spearman H，Kingsman S，Kingsman A，Naylor S.Hum GeneTher.1999年9月1日；10(13)2197-208，“用于治療局部缺血疾病的生理調節載體的特征”)。
使用前述的Introgene腺病毒系統，生產每個載體AdApt ires-GFP、AdApt HIF-1α-ires-GFP和AdApt EPAS1-ires-GFP的銫帶純腺病毒顆粒。按照Introgene的說明書，通過分光光度測定法定量腺病毒制備物，獲得每ml的病毒顆粒(VP)值。
為分離人巨噬細胞，由健康獻血人的外周血獲得單核細胞。將得自Bristol輸血中心(Bristol，UK)的100ml袋裝血沉棕黃層與等體積的RPMI1640培養基(Sigma)混合。混合物在50ml離心管中的10mlficol-paque(Pharmacia)頂部分層，以800xg離心25分鐘。取出交界層，用MACS緩沖液(磷酸緩沖鹽水pH7.2，0.5％牛血清白蛋白，2mmEDTA)清洗，并以80μl/10n7細胞重懸浮。向其中加入20μl CD14微珠(Miltenyi Biotec)，將離心管于4℃溫育15分鐘。此后，用MACS緩沖液以400×g進行1次清洗，將細胞重懸浮于3ml MACS緩沖液中，用位于midi-MACS磁體(Miltenyi Biotec)上的LS+MACS分離柱(Miltenyi Biotec)分離。用3×3ml MACS緩沖液清洗該柱。將該柱由磁體上取下，用注射器以5ml MACS緩沖液洗脫。用補加2％人AB血清(Sigma)的培養基(AIM V(Sigma))清洗細胞，以2×10n5細胞/ml重懸浮于同一培養液中，并置于特氟隆包被的大培養袋(Sud-LaborbedarfGmbH，82131 Gauting，Germany)中，轉移至組織培養箱(37℃，5％CO2)培養7-10天。在此過程中，單核細胞自然地分化為巨噬細胞。通過使用相差顯微鏡檢測細胞形態進行確認。通過于4℃放置30分鐘并排空內容物取出細胞。
用補加4％胎牛血清(Sigma)的DMEM(Gibco，Paisley，UK)清洗并重懸浮巨噬細胞。將4×106細胞置于各個10cm的Prineria(Falcon)組織培養皿中，每板的總體積為8ml，6×109腺病毒顆粒/ml。培養16小時后(在此過程中，巨噬細胞附著于板上并受到腺病毒顆粒感染)，去除培養基并代之以補加2％人AB血清的AIM V培養基。在實驗前再培養24小時，以使轉導的腺病毒進行基因表達。
使用綠色熒光作為基因轉移標記測定以上腺病毒顆粒的劑量，為大部分(超過80％)巨噬細胞群實現轉導所需的最小量。這可使用含LacZ報告基因的單獨腺病毒構建物證實。通過選擇最小劑量的病毒，使可能存在的病毒轉移的非特異性作用最小化。
對于低氧實驗，將相同的培養皿分處于兩個單獨的培養箱中一個為37℃、5％CO2、95％空氣(＝正常氧含量)，而另一個為37℃、5％CO2、94.9％氮氣、0.1％氧氣(＝低氧含量)。在這些條件下培養8小時后，由培養箱中取出培養皿，置于冷凍平臺上，用冷PBS清洗，使用RNazol B(Tel-Test，Inc；Biogenesis Ltd分銷)按照生產商的說明提取總RNA。
設計此實驗是為了獲得6個細胞群(簡稱“細胞類型”)，它們的差異僅在于用如下所示的腺病毒和/或低氧處理“細胞類型”腺病毒表達基因氧條件1 AdApt ires-GFP無 常 (20％氧氣)2 AdApt ires-GFP無 低氧(0.1％氧氣)3 AdApt HIF-1α-ires-GFPHIF-1α 正常(20％氧氣)4 AdApt HIF-1α-ires-GFPHIF-1α 低氧(0.1％氧氣)5 AdApt EPAS1-ires-GFP EPAS1正常(20％氧氣)6 AdApt EPAS1-ires-GFP EPAS1低氧(0.1％氧氣)可通過比較這些“細胞類型”之間的基因表達模式進行基因尋找。按照文獻使用的常規方法，應當比較細胞類型1和細胞類型2。通過實施本發明(Smartomics)，注意到其它幾種可能性。首先，可對比細胞類型3或5和細胞類型1。此時，對參與低氧反應的關鍵分子過表達的刺激可能超出天然的低氧反應，如細胞類型2所見。其次，在本發明的一個優選實施方案中，可對比細胞類型4或6和細胞類型1。在此情況下，通過過表達參與低氧反應的關鍵分子，使對低氧的天然反應增強或加強。應當注意的是，以上闡述的實驗設計使用對照腺病毒代替未處理的細胞。這樣做應當使病毒轉導的任何非特異性作用在整個分析過程中都同等發生，并將消失。
盡管由轉導巨噬細胞中的綠色熒光蛋白指示有效的腺病毒基因轉移，但使用RNA印跡證實了HIF-1α和EPAS1的過表達。通過RNA印跡(圖1)分析如上所述由細胞類型1-6中提取的RNA樣品。將RNA樣品(每泳道8μg總RNA樣品)在甲醛變性的1％瓊脂糖凝膠上電泳，然后轉移至尼龍膜(Hybond-N，Amersham，UK)，并先后和核苷酸序列與HIF-1α(圖1a)、EPAS1(圖1b)或28S核糖體RNA(圖1c)互補的33p-標記的DNA探針雜交。用于RNA印跡、嚴格條件下的探針雜交以及去除雜交探針的方法學是本領域眾所周知的。
在圖1a中，可以看到所有的泳道都含有對應于內源HIF-1αmRNA的約4kb模糊條帶。在含有AdApt HIF-1α-ires-GFP轉導細胞RNA的泳道3，4中，觀察到相似大小的較強條帶，表明HIF-1α成功過表達。
在圖1b中，可以看到所有的泳道都含有對應于內源EPAS1mRNA的非常模糊的約5kb條帶。在含有AdApt EPAS1-ires-GFP轉導細胞RNA的泳道5，6中，觀察到約4kb的較強條帶，表明EPAS1成功過表達。內源和過表達EPAS1大小的不同是由于內源基因存在長非翻譯區，該區并不重要。
在圖1c中，可以看到所有的泳道都檢測出28S核糖體RNA，表明凝膠上的RNA上樣量相同。
通過圖1a和1b的磷成像定量分析，顯然HIF-1α和EPAS1的過表達水平超出內源水平約80倍。低氧沒有再增強由腺病毒控制的這些基因的mRNA過表達。例如，在圖1a中，泳道4的條帶強度沒有超過泳道3。但是在蛋白和功能水平上，低氧加強了這些mRNA編碼蛋白的作用(Semenza GL.Annu.Rev.Cell Dev Biol.1999；15551-78，“低氧誘導因子1調節哺乳動物O2穩態”)。
使用Research Genetics Human GeneFilters Release 1(GF200)(Research Genetics，Huntsville，AL)獲得分離自6種“細胞類型”的RNA樣品的總體mRNA表達模式。該方法使用預先制備的與包含一系列特征水平的5,300種基因互補的DNA陣列，包括僅與未注解EST或未知功能cDNA序列匹配的序列。
所述陣列為尼龍組成，用得自特異性IMAGE聯合cDNA克隆的DNA點陣(http//image.llnl.gov/image/)。所述陣列與已經用同位素33p放射性標記的RNA樣品雜交，以檢測RNA樣品中各個基因的豐度。標記多個RNA樣品，平行與單獨拷貝的所述陣列雜交，比較RNA樣品之間的點雜交信號。
基于陣列的mRNA表達分析的關鍵問題是敏感性和可靠性。目前可利用其它兩種方法玻璃微陣列和DNA芯片，它們都使用熒光標記的RNA(Bowtell DD.Nat Genet.1999年1月；21(增刊1)25-32，“可通過微陣列獲得表達數據的選項—由開始到結束”)。盡管這些方法經常被認為比尼龍型方法敏感性增加，但這種觀點缺乏權威性的證據。相反，細心比較三種方法顯示，對于相似量的未擴增RNA，尼龍型放射性方法較好(Bretucci F，Bemard K，Loriod B，Chang YC，Granjeaud S，Birnbaum D，Nguyen C，Peck K，Jordan BR，Hum MolGenet.1999年9月；8(9)1715-22，“基于DNA陣列的表達檢測的敏感性問題和尼龍微陣列對小樣品的性能”)。微陣列和DNA芯片法需要更大量的RNA，而RNA經常難以由初級細胞獲得，或者易于產生錯誤的復雜擴增方法。
為證明用于所述Smartomics實施例的基于陣列的基因表達方法的敏感性，在我們的實驗室中用Research Genetics GeneFilters分析兩種代表性RNA樣品的散點圖，顯示約4對數的檢測范圍(圖2)。相比之下，可以論證地指出最復雜的基于陣列的方法DNA芯片具有3對數的檢測范圍(Affymetrix)。
因此，有理由假定，本文實施例闡述的由Smartomics提供的與敏感性問題有關的改進，能夠容易地通過使用替代的基于陣列的方法獲得。在任何情況下，任何潛在有利的陣列方法都可通過使用本文描述的Smartomics發明進一步改善。本發明的一個重要的用途是高通量方法，例如可使用陣列鑒定通常僅可用很敏感的低通量方法(例如RT-PCR或RNA印跡)檢測的表達改變。
放射性標記如上所述由6種“細胞類型”中提取的RNA，將其與單獨拷貝的Research Genetics Human GeneFilters GF200雜交(實驗1)。按照生產商提供的方法進行操作(http//www.resgen.com/products/GF200 ptotocol.php3)。使用MolecularDynamics Storm磷成像儀獲得雜交陣列的圖象。然后按照前述方法由陣列上剝離RNA。
為確保重復性，用相同的RNA樣品重復該步驟(實驗2)。然后使用Research Genetics Pathways 3.0軟件按照Pathways 3.0說明書的講解輸入和分析全部數據集。該分析的關鍵方面概述如下程序結構(project tree)設置使用“條件對”模式同時分析多個實驗。“條件”是指與得自相同“細胞類型”的相似RNA樣品雜交的幾個陣列。條件 “細胞類型” 腺病毒 氧實驗號1 1 AdApt ires-GFP 正常 11 1 AdApt ires-GFP 正常 22 2 AdApt ires-GFP 低氧 12 2 AdApt ires-GFP 低氧 23 3 AdApt HIF-1 α-ires-GFP 正常 13 3 AdApt HIF-1α-ires-GFP 正常 24 4 AdApt HIF-1α-ires-GFP 低氧 14 4 AdApt HIF-1α-ires-GFP 低氧 25 5 AdApt EPAS1-ires-GFP 正常 15 5 AdApt EPAS1-ires-GFP 正常 26 6 AdApt EPAS1-ires-GFP 低氧 16 6 AdApt EPAS 1-ires-GFP低氧 2歸一化設置按照Pathways 3.0說明書的解釋選擇“所有數據點”選項和默認設置的Y.Chen算法。作為兩個單獨的歸一化組處理兩個實驗，以校正相同實驗的不同陣列的雜交信號之間的總體差異。對比分析在條件2和條件1、條件3和條件1、條件4和條件1、條件5和條件1、條件6和條件1之間進行成對比較。
換句話說，使用條件1(即細胞類型1)作為參比條件進行成對對比。這相當于用對照腺病毒AdApt ires-GFP轉導細胞，并置于正常氧濃度(正常氧含量)下。以此方式對Research Genetics GF200陣列上存在的所有基因進行對比。通過對比條件，該分析判斷實驗1和實驗2二者的數據。過濾設定然后對以上列明的5個成對比較中的至少一個進行過濾，選擇表達比率高于2.0的基因。使用最小0.2最大1000的Intensity II濾器自動去除全部6種條件中信號強度低的基因。使用Students t-檢驗濾器(90％可信度)自動去除在實驗1和實驗2中不以可重復方式反應的基因。
結果以各個基因的表達模式輸出，顯示歸一化信號強度和表達比率。Pethways 3.0分析的關鍵優勢在于顯示各個點的高倍放大的微型圖象。這使得可以目測鑒定所檢測部位精確覆蓋了含雜交陣列點的區域，并且該點是真實的而不是背景假象。
即使取樣部位明顯為真實的陣列點，有時也會觀察到定量數據和對應的微型圖象之間的微小差異。例如，肉眼可能觀察到兩個點之間有小差異，而定量分析可能提示有較大差異。應當注意的是，微型圖象沒有歸一化來補償總體差異，并受限于圖象質量。灰度圖象固有地受限于其定量描述密度差異的能力。由Strom磷成像儀產生的數碼圖象單個像素包含的線性動態范圍為100,000，而打印的圖象僅可以256色灰度繪圖。三種代表性的已知低氧調節基因的結果就發現的真實低氧調節基因來說，證實HIF-1α或EPAS1過表達連同低氧接觸一起優于使用非轉導低氧細胞，顯示了本領域已知受低氧調節的基因的結果。
選擇了三種在Research Genetics GF200陣列上以雙點呈現的基因。因此，由于整個實驗是重復的，所有可以對這些基因進行總共4次重復對比。
本領域已知乳酸脫氫酶A(LDH-A)基因由低氧激活(Webster KA.Mol Cell Biochem.1987年9月；77(1)19-28，“在骨骼肌細胞中通過氧利用度調節糖酵解酶RNA轉錄速率”)。在圖3中，可以看出在單獨的低氧(gfp 0.1％O2)作用下，mRNA表達相比于正常氧含量(gfP20％O2)平均增加2.24倍。
通過過表達HIF-1α，LDH-A表達平均增加3.39倍，比天然反應明顯改善(圖3；HIF-1α20％O2)。通過使用Smartomics法的一個優選實施方案，同時在低氧下過表達HIF-1α，LDH-A的平均反應進一步提高至4.50倍(圖3；HIF-1α0.1％O2)。
在先有技術中已經確立HIF-1α負責介導LDH-A的低氧誘導激活(Iyer NV，Kotch LE，Agani F，Leung SW，Laughner E，Wenger RH，Gassmann M，Gearhart JD，Lawler AM，Yu A Y Semanza GL，Genes Dev.1998年1月15日；12(2)149-62，“由低氧誘導因子1α進行O2穩態的細胞和發育控制”)。但是從沒有設想或證明同時有或沒有低氧時使用病毒基因轉移技術以穩定方式過表達HIF-1α引起基因表達的次級變化，該變化明顯大于天然低氧反應。LDH-A對低氧的反應還可由EPAS1過表達改善(圖3；EPAS1)，盡管沒有HIF-1α過表達顯著。
同LDH-A一樣，本領域已知甘油醛3-磷酸脫氫酶(GADPH)基因由低氧激活(Webster KA.Mol Cell Biochem.1987年9月；77(1)19-28，“在骨骼肌細胞中通過氧利用度調節糖酵解酶RNA轉錄速率”)。在圖4中，可以看出在單獨低氧(gfp 0.1％O2)作用下，mRNA表達相比于正常氧含量平均增加1.52倍。
通過過表達HIF-1α，GAPDH表達平均增加3.33倍，比天然反應明顯改善(圖4；HIF-1α20％O2)。通過使用Smartomics法的完整實施方案，同時在低氧下過表達HIF-1α，GAPDH的平均反應進一步提高至4.57倍(圖4；HIF-1α0.1％O2)。
在已公開的文獻中，已經確立HIF-1α負責介導GAPDH的低氧誘導激活(Iyer NV，Kotch LE，Agani F，Leung SW，Laughner E，WengerRH，Gassmann M，Gearhart JD，Lawler AM，Yu A Y Semanza GL，GenesDev.1998年1月15日；12(2)149-62，“由低氧誘導因子1α進行O2穩態的細胞和發育控制”)。但本領域從沒有設想或證明同時有或沒有低氧時使用病毒基因轉移技術以穩定方式過表達HIF-1α引起基因表達的次級變化，該變化明顯大于天然低氧反應。
對于GAPDH，可以看出EPAS1過表達(圖4；EPAS1 20％O2和0.1％O2)的作用明顯小于HIF-1α過表達的作用。證實Smartomics法的一個鑒定對EPAS1或HIF-1α過表達選擇性或優選反應的基因的單獨實施方案。
本領域還已知血小板衍生生長因子β(PDGFβ)由低氧激活(Kourembanas S，Hannan RL，Faller DV.J Clin Invest，1990年8月；86(2)670-4，“氧含量調節人內皮細胞血小板衍生生長因子-B鏈基因表達”)。在圖5中，可以看出在單獨低氧作用(gfp 0.1％O2)下，mRNA表達比正常氧含量平均增加2.14倍。
通過過表達EPAS1，PDGFβ表達平均增加9.28倍(圖5；EPAS120％O2)，比天然反應有極大改善。在此情況下，低氧和EPAS1過表達組合沒有超過單獨的EPAS1過表達的反應，表明劑量-反應飽和作用(圖5；EPAS1 0.1％O2)。
由圖5可明顯看出，在PDGFβ對EPAS1和HIF-1α的反應中存在顯著的特異性，對GAPDH觀察到相反的方式。單獨的HIF-1α過表達對PDGFβ沒有明顯作用，而EPAS1過表達產生很大的作用。這解釋了Smartomics法的一個單獨實施方案，通過該實施方案鑒定對以相同方式起作用的不同基因過表達選擇性或優選反應的基因。
本領域已知單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)編碼基因通過降低mRNA表達以反向方式對低氧起反應(Negus RP，Turner L，Burke F，Balkwill FR，J Leukoc Biol.，1998年1月；63(6)758-65，“低氧下調MCP-1表達與腫瘤中巨噬細胞分布有關”)。在圖6中，可以看出在單獨低氧作用(gfp 0.1％O2)下，mRNA表達比正常氧含量平均變化0.47倍(即降低2.46倍)。
通過過表達HIF-1α，MCP-1表達平均變化0.243倍(即降低4.11倍)，比天然反應明顯改善(圖6；HIF-1α20％O2)。通過使用Smartomics法的一個優選實施方案，同時在低氧下過表達HIF-1α，MCP-1的平均反應變化進一步改善至0.112倍(即降低8.93倍)(圖6；HIF-1α0.1％O2)。通過過表達EPAS1甚至更顯著地改善了低氧誘導抑制的MCP-1表達(圖6；EPAS1 20％O2和0.1％O2)。這證明使用Smartomics改善了對受疾病信號抑制的基因的尋找。
以MCP-1作為例證，HIF-1α或EPAS1過表達加強低氧誘導基因抑制，這一發現在本領域完全沒有先例。HIF-1α和EPAS1蛋白的結構都含有反式激活結構域而沒有已知的轉錄阻抑結構域(Pugh CW，O′Rourke JF，Nagao M，Gleadle JM，Ratcliffe PJ，J Biol Chem.，1997年4月25日；272(17)11205-14，“低氧誘導因子-1的活化；鑒定α亞單位中的調節結構域”)。
以上闡述的結果涉及陣列基因表達分析，其中，在陣列上總共約5300個基因中鑒定出超過50個基因受低氧調節。通過關注本領域已知受低氧調節的基因并顯示Smartomics法如何可以明顯增強反應，提出一個觀點Smartomics提供了一個用于鑒定真實的新低氧調節基因的改進方法。在本研究中，如下所示，也可以直接顯示使用Smartomics法發現新基因。因為該分析包括了常規分析得到的表達改變(即沒有病毒過表達時對比低氧/正常氧含量)，清楚顯示了Smartomics發明的優勢。
表1列出了在此分析中鑒定的未注解基因或EST，這些基因或EST在病毒控制的過表達作用下激活，但還沒有被先有技術中進行的低氧/正常氧含量對比鑒定出。表1的最后5列顯示了相比于正常氧含量下Adapt-ires-GFP轉導細胞的表達比率。這5列的第一列為沒有Smartomics的反應，在此處顯示的所有情況下，水平都在顯著性以下。其它4列提供了使用本發明獲得的結果，由此可看出顯著的應答。特別是，在該表的最后幾行，鑒定出顯示對EPAS1過表達反應大的新基因。
表1Smartomics鑒定的新基因
列1是2001年2月16日UniGene數據庫使用的基因名稱。核苷酸和蛋白登錄號得自Genbank數據庫。最后5列顯示以對正常氧含量下Adapt ires-GFP轉導細胞的比率表示的表達水平。gfp H低氧下AdApt ires-GFP轉導細胞的表達。Hif N正常氧含量下AdAptHif-1α-ires-GFP轉導細胞的表達。Hif H低氧下AdApt Hif-1α-ires-GFP轉導細胞的表達。EPAS N正常氧含量下AdApt Epas1-ires-GFP轉導細胞的表達。EPAS H低氧下AdApt Epas1-ires-GFP轉導細胞的表達。
圖7顯示這些基因中一種對應于EST(GenBank登錄號N64734；IMAGE克隆293336)的基因的表達模式。在UniGene EST數據庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)中，該EST目前僅與兩個其它EST(登錄號為AI051607(IMAGE 1674154)和T87161(IMAGE 293336))成簇。UniGene簇號為Hs.16335，在該數據庫中完全沒有注解。序列分析顯示該稀有序列是不完整的，缺少關于蛋白編碼序列的信息。在人類基因組計劃基因注解的Ensembl數據庫(http//www.ensembl.org/)中，預測或證實cDNA序列的blast檢索沒有鑒定出該EST。因此，由公用信息顯然可知，對應于EST IMAGE293336的基因確實是新的未注解基因。
在圖7中，以最大對比度顯示微型陣列點圖象，使背景信號明顯。可以看到，在單獨低氧作用下(gfp 0.1％O2)，mRNA表達水平相比于正常氧含量平均增加1.4倍。但是，這是不顯著的，因為其得自各個實驗的巨大比率差異(2.41和0.46)。根據gfp 20％O2和gfp 0.1％O2的微型圖象，顯然在這些條件下的基因表達低于陣列型方法檢測閾。但是，在使用Smartomics發明并使用病毒基因轉移方法過表達EPAS1時，觀察到清晰的可檢測應答，誘導比率超過8倍(圖7；EPAS1 20％O2或0.1％O2)。圖7的表達模式還解釋了Smartomics的一個用于鑒定選擇性應答于HIF-1α或EPAS1的基因的單獨實施方案。
為證實圖7提供的結果，使用更敏感的方法研究對應于IMAGE克隆293336基因的表達，即有效RNA印跡。應當指出的是，該方法已經不適于最初發現得低氧誘導的IMAGE克隆293336，因為有效RNA印跡和類似的方法不能同時篩選大量的基因。該技術類似于常規的RNA印跡，只是對應于表達基因mRNA群的雙鏈cDNA用電泳分離，并印跡在尼龍膜上。這依賴于產生全長cDNA分子的cDNA合成方法，該方法可由商業渠道購買(SMART PCR eDNA SynthesisKit；Clontech Laboratories Inc，Palo Alto，CA，USA)。
按照SMART PCR cDNA Synthesis Kit說明書的描述實施有效RNA印跡方法。簡單地說，由6個用于陣列雜交的RNA樣品合成600ng cDNA。還加工了另外4個RNA樣品，它們得自在正常氧含量和低氧(6小時，0.1％O2)下培養的非轉導巨噬細胞，它們都用或不用100ng/ml脂多糖(大腸桿菌026B6 Sigma，UK)和1000u/ml人γ干擾素(Sigma，UK)預處理16小時。該組合因素引起巨噬細胞激活，這是巨噬細胞生理和病理作用的關鍵過程。所有的10個cDNA樣品都在瓊脂糖凝膠上分離，并按照Hybond N+說明將其堿轉移至Hybond N+膜(AmershamPharmacia，UK)上。按照本領域眾所周知的標準RNA印跡雜交與33P標記的克隆cDNA探針嚴格雜交。使用市售試劑盒(Prime-a-Gene，Promega，UK)放射標記cDNA探針。首先讓有效RNA印跡與UniGene簇Hs.16335的IMAGE克隆1674154的cDNA插入片段雜交(圖8a)。然后通過高溫/低鹽清洗剝離印跡，并用人β-肌動蛋白基因的蛋白編碼區再探測(圖8b)。
由圖8a可見，檢測到對應于Hs.16335的mRNA為約4.5kb的雙聯條帶。該基因受腺病毒控制的EPAS1過表達強烈誘導(泳道5，6)，與圖7的陣列數據一致。在該非陣列分析中的高誘導比率緣于有效RNA技術敏感性增加。與陣列數據不同，Hs.16335的表達在所有RNA樣品的檢測范圍內。重要之處在于，可見單獨的低氧產生約60倍的誘導比率(圖8a；泳道2，8)。因此，Hs.16335被鑒定為真實的低氧調節基因，盡管其在未用本發明(Smartomics)的陣列篩選檢測水平之下。
圖8a的檢測結果還解釋了Smartomics法的一個用于鑒定對EPAS1或HIF-1α過表達選擇性或優選反應的基因的單獨實施方案。HIF-1α過表達產生18.9倍的誘導比率(泳道3)，而EPAS1過表達產生141倍的大得多的誘導比率(泳道5)。
在圖8a的泳道9中，顯示LPS和THFα激活巨噬細胞使對應于Hs.16335的基因表達增加10.8倍。因此，該新基因可能與巨噬細胞的炎性功能相關。
在圖8b中，發現人β-肌動蛋白基因表達在整個實驗中都大致恒定，與圖8a中由于基因表達的特異性變化而產生的差異一致。
可根據有效RNA印跡上cDNA的大小進行cDNA末端快速擴增(RACE)，以克隆對應于Hs.16335的全長型基因。對該基因的測序和功能分析可能導致鑒定出新治療靶分子。該過程的至關重要之處是開始使用Smartomics發明。實施例3EIAV載體構建本實施例描述了在CMV啟動子下游具有4種獨特克隆位點的EIAV載體(pONY8.1SM)的產生。根據其包含的EIAV序列(約1.1kb)和其表達的EIAV蛋白(無)，pONY8.1SM是迄今為止最小的EIAV載體。該載體是基因轉移系統的一個實例，可用于按照本發明的差異表達篩選方法。但是，可以使用其它基于任何其它慢病毒、反轉錄病毒、皰疹病毒、腺病毒、α病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒或任何合適制品的DNA的基因轉移系統。構建EIAV型載體pONY8.1SM起點是pONY4.0Z(GB9727135.7和Mitophanous等，1999)。用ATTG替換EIAV gag區中的前兩個ATG三聯體，以消除EIAV基因組的gag表達，同時保持載體中的gag序列。發現gag序列對于保持產生高滴度載體很重要。
通過PCR進行ATG至ATTG的變化。使用引物ATTG1和PS2對EIAV前導序列/gag序列進行PCR擴增。其模板是質粒pONY3.1(GB9727135.7和Mitophanous等，1999)。該PCR片段在5′和3′末端分別包含NarI和XbaI位點。將該片段插入到用NarI和XbaI切割的pONY4Z中，產生pONY8.0Z。
ATTG1引物AGTTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAGAGGGGCGCAGACCCTACCTGTTGAACCTGGCTGATCGTAGGATCCCCGGGACAGCAGAGGAGAACTTACAGAAGTCTTCTGGAGGTGTTCCTGGCCAGAACACAGGAGGACAGGTAAGATTGGGAGACCCTTTGACATTGGAGCAAGGCGCTCAAGAA下劃線＝NarI位點PS2引物TAGTTCTAGAGATATTCTTCAGAG下劃線＝XbaI位點pONY8.1SM是含內部CMV啟動子的EIAV載體基因組，由該啟動子可表達任何目的基因。該載體通過缺失pONY8Z的一部分env序列制備。用SbfI切割pONY8Z(位置5885)。接著用SapI部分切割(在pONY8Z中有兩個SapI位點，參看圖9)。然后純化于位點8056切割的分子，平端并再連接，獲得pONY8.1Z。為產生pONY8.1SM，用SacII和SphI切割pONY8.1Z、平端并再連接。這去除了lacZ基因，并產生了4個用于插入任意基因或基因文庫的獨特位點BsmBI、SbfI、EcoRI和HindIII(圖10)。SbfI具有一個8堿基識別序列，使其用于插入未知基因。實施例4產生表達HIF1-α的EIAV載體本實施例描述了產生能夠由內部CMV啟動子表達HIF-1α的EIAV載體(pONY8.1SMHIF1)。人HIF-1α的登錄號為U22431。為制備pONY8.1SMHIF1，由分離自Jurkat細胞的mRNA產生的cDNA對HIF-1α進行PCR擴增。其引物為下述的HIFPM1和HIFPM2。它們含有用于克隆的SbfI位點，并使用Kozak序列增強翻譯。該途徑產生的PCR產物含有SbfI克隆位點，該位點位于HIF-1α可讀框的側翼。用SbfI切割該產物，并插入到SbfI切割的pONY8.1SM中。以該途徑產生的質粒叫做pONY8.1SMHIF1。
HIFPM1引物ATCGCCTGCAGG GAGGGCGCCGGCGGCGCGSbfI位點＝下劃線，Kozak序列＝粗斜體，ATG起始密碼子＝下劃線斜體HIFPM2引物ACTGCCTGCAGGTCAGTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAGSbfI位點＝下劃線該質粒用于和gag-pol和env表達質粒連接，產生如Mitrophanous等，1999所述的EIAV型載體顆粒。然后在基因受Hif1途徑直接或間接控制的情況下，使用這些顆粒轉導各種可能感興趣的細胞類型。
一個實例是初級人骨骼肌細胞。對比轉導和未轉導的細胞群。另外，對比低氧濃度下的轉導細胞和正常氧濃度下的未轉導細胞。
制備用于差異基因表達分析的RNA樣品。這些樣品或者放射標記，或者熒光標記，并與固相支持體上的cDNA陣列雜交。受低氧和/或各種HIF蛋白表達上調的基因產生數量上更強的雜交信號。陣列方案可包括綜述于Bowtell，1999的尼龍或玻璃支持物。涉及玻璃支持物方案的方法學細節詳述于Eisen和Brown，1999。在此使用熒光標記探針，并使用激光共聚焦掃描儀檢測雜交。對于尼龍支持物方案，所涉及的點印跡和雜交的標準分子生物學方法見MolecularCloningA Laboratory Manual，Sambrook，J等，Cold Spring HarborLaboratory Press詳述。在此，放射標記對比的RNA樣品，并使用磷成像儀檢測雜交。
陣列可購自Research Genetics，Huntsville，AL，或者可使用通過扣除克隆產生的cDNA克隆自己制備(PCR選擇法，由Clontech，PaloAlto，CA擁有)。制備包括使用點陣機器人(MicroGrid，BioRobotics Ltd，Cambridge，UK)。實施例5產生表達HIF1-α的密碼子優化的EIAV載體本實施例描述了產生EIAV衍生載體pSMART CMV-HIF，其中HIF-1α表達由位于載體內部的CMV啟動子驅動(圖11)。為本專利所述的差異篩選目的，可以使用相似的載體骨架獲得其它基因的表達。
構建pSMART CMV-HIF的起點是pONY4.0Z(WO 99/32646和Mitophanous等，Gene Ther.1999年11月；6(11)1808-18)。在第一步中，通過引入突變將質粒pONY4.0Z轉變為pONY8.0Z(參見以上的實施例3)，所述突變1)通過在tat的外顯子2產生一個83nt的缺失防止TAT表達；2)通過一個51nt的缺失防止S2 ORF表達；3)通過缺失rev外顯子1中的單個堿基防止REV表達；和4)通過在gag區的第一個和第二個ATG密碼子中插入T殘基，從而將序列由ATG變為ATTG，防止gag的N末端部分表達。相對于野生型EIAV序列(登錄號U01866)，這些缺失對應于以下缺失1)核苷酸5234-5316，首尾均包括在內；2)核苷酸5346-5396，首尾均包括在內；和3)核苷酸5538。插入的T殘基(4)在核苷酸526和核苷酸543之后。使用本領域技術人員容易實施的技術進行這些改變。獲得的載體pONY8.0Z不表達任何EIAV輔助蛋白或任何EIAV gag蛋白。
在第二步中，用增強的綠色熒光蛋白(eGFP)報告基因替換pONY8.0Z中存在的β-半乳糖苷酶報告基因，產生pONY8G。這可通過將對應于GFP基因的SacII-KpnI片段和pONY2.13GFP的側翼序列(WO 99/32646)轉移至用相同酶切割的pONY8.0Z中進行。
已經表明，叫做中央多嘌呤段的序列和中央終止序列(cPPT/CTS)的存在改善了基因通過HIV-1型載體傳遞至非分裂細胞的效率(Zennou等，Cell，2000年4月14日；101(2)173-85，Follenzi等，Nat Genet.2000年6月；25(2)217-22)。類似的EIAV順式作用元件位于多聚酶編碼區，并可作為功能元件如下通過使用PCR擴增由任何含有EIAV多聚酶編碼區(例如pONY3.1，WO 99/32646)的質粒獲得。PCR產物包括中央多嘌呤段和中央終止序列(CTS)。用于PCR反應的寡核苷酸引物是EIAV cPPT POSCAGGTTAT GTCGACGCTCTCATTACTTGTAACEIAV cPPT NEGCGAATGCGT GTCGACCATGTTCACCAGGGATTTTGXbaI的識別序列以粗體顯示，并將其插入到pONY8G骨架中。在插入如上所述制備的cPPT/CTS PCR產物之前，修飾pONY8G，以去除已經存在于pONY8G載體中的中央終止序列(CTS)。這可通過將含pONY8.0Z的CTS和RRE區的SalI至ScaI片段亞克隆入用SalI和EcoRV消化連接制備的pSP72中實現。然后通過用KpnI和PpuMI消化提取CTS區，突出端用T4 DNA聚合酶處理‘平端’，接著再連接末端。然后使用SalI和NheI提取修飾的EIAV載體片段，并連接入用同樣的酶消化連接制備的pONY8G中。此新EIAV載體叫做pONY8G del CTS。pONY8G del CTS具有兩個XbaI位點，位于CMV-GFP表達盒側翼，代表cPPT/CTS的PCR產物在用XbaI消化后可連接入部分消化后的任一個位點中。連接至這些位點產生具有或者正義或者反義的cPPT/CTS元件的質粒。其中cPPT/CTS在5′或3′-位置為正義(功能活性)的克隆分別叫做pONY8G 5′POS del CTS和pONY8G 3′POS del CTS。還按照與制備pONY8G 5′POS del CTS相似的策略制備了另一個叫做pONY8Z 5′POS del CTS的載體。因此，以相同的方式去除存在于pONY8.0Z中的CTS序列，以制備pONY8Zdel CTS，并將cPPT/CTS序列引入到恰好在pONY8Z del CTS的CMV啟動子上游的唯一XbaI位點中。
通過用HIF-1α的編碼區替換eGFP的編碼區，由pONY8G 5′POSdel CTS產生pSMART CMV-HIF載體質粒。這可通過用SacII和NotI消化pONY8G 5′POS del CTS(SacII和NotI位點位于eGFP基因側翼)并連接至由質粒AdApt HIF-1α-ires-GFP獲得的SacII-NotI片段實現。按以上實施例2所述構建質粒AdApt HIF-1α-ires-GFP。
還制備了pONY8G 5′POS del CTS的另一個衍生物，以便獲得在轉導實驗中用做‘陰性對照’的載體制備物。該載體叫做pSMARTCMV-空白型載體(圖12)，通過用BsmBI和NotI消化pONY8G 5′POSdel CTS(BsmBI和NotI位點位于eGFP基因側翼)然后再連接制備。根據由內部啟動子產生的轉錄物的序列分析，預期該載體轉導的細胞僅產生一個3氨基酸的肽。
使用磷酸鈣沉淀法，通過用載體質粒pONY3.1(表達EIAVgag/pol蛋白)和包膜表達質粒pRV67(編碼皰疹性口腔炎病毒蛋白G，VSV-G)中的任一種瞬時共轉染293-T人胚腎細胞，獲得上述的EIAV載體。
轉染前24小時將293T細胞以每皿3.6×106細胞接種在裝有10ml補加谷氨酰胺、非必需氨基酸和10％胎牛血清的DMEM的10cm培養皿中。在第二天下午進行轉染，將細胞過夜溫育，然后用補加丁酸鈉(5mM)的6ml新鮮培養基替換原培養基。7小時后收集培養基，并將6ml未補加的新鮮培養基加入到細胞中。通過低速離心澄清收集的培養基，然后通過0.4μm濾膜過濾。
然后于4℃通過過夜低速離心(6,000g，JLAl0.500轉子)濃縮載體顆粒，傾去上清液，留下管底部的沉淀。第二天早晨收獲剩余的組織培養液，澄清并過濾。然后將其置于先前收集的沉淀頂部，再進行過夜離心。此后傾析上清液，排掉多余的液體。然后將沉淀重懸浮在配制緩沖液中，達到起始上清液體積的1/1000。然后以等份儲存于-80℃。配制緩沖液(100ml)組織培養級水 28.65ml19.75mM Tris/HCl緩沖液pH7.019.75ml的0.1M溶液40mg/ml乳糖26.6ml的150mg/ml溶液37.5mM NaCl24.4ml的154mM溶液1mg/ml的人血清白蛋白a500μl的20％溶液
5μl/ml的硫酸魚精蛋白b100μl的5mg/ml溶液a人血清白蛋白(20％)(Albuteinv，Alpha therapeutics UK Ltd，Thetford，Norfolk)。
b硫酸魚精蛋白5mg/ml(Prosulf，CP Pharmaceuticals，Wrexham，UK)。
SED ID NO4中提供了pSMART CMV-HIF的序列。
SED ID NO5中提供了pSMART CMV-空白型的序列。實施例6使用Smartomics鑒定海馬神經元中的基因如以上實施例1和2所述，低氧是中風(腦局部缺血)的重要組成部分。現在利用本發明(Smartomics)改善了對初級大鼠海馬神經元中低氧作用激活或抑制的基因的尋找。這涉及通過實驗性引入低氧反應的關鍵調節物，即低氧誘導因子1α(HIF-1α)，增強對低氧的天然反應。HIF-1α過表達與細胞接觸低氧相組合使得可以檢測出在單獨的HIF-1α過表達或單獨的低氧作用下尚不能檢測的基因表達變化。
按照標準方法由胚胎大鼠建立初級大鼠海馬神經元培養物(Dunnett SB，Bjorkland A(主編)1992，Neural Transplantation，APractical Approach，IRL Press)。簡而言之，在妊娠第18天用0.7ml異熒烷麻醉記錄懷孕時間的Wistar大鼠，并通過頸部脫位處死。取出子宮中的幼鼠并去頭。解剖海馬并在含DNAse(0.05％)和葡萄糖(2mM)的Hanks緩沖鹽溶液(HBSS)中儲存在冰上，然后在胰蛋白酶(0.1％)和DNAse(0.05％)中溫育5分鐘。溫育后，通過加入大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI，0.1％)使胰蛋白酶失活，輕柔地研制溶液。通過離心(3,000rpm，5分鐘)沉淀細胞并去除胰蛋白酶。然后用含SBTI和DNAse(0.05％)的HBSS清洗細胞兩次，再沉淀，然后最終懸浮于含胎牛血清(10％)、谷氨酰胺(2mM)和慶大霉素(0.1mg/ml)的Dulbecco改良型Eagle培養基(DMEM)中。將細胞(3×106細胞/皿)平板接種在包被聚-D-賴氨酸(50μg/ml)和纖連蛋白附著促進肽(10μg/ml)的60mm皿上。將培養物放置在含5％CO2的37℃濕潤培養箱中，平板接種后12小時，用補加B27和谷氨酰胺(2mM)的神經基礎培養基(Brewer GJ，(1995)“無血清B27/神經基礎培養基支持紋狀體、黑質、隔膜、大腦皮質、小腦和齒狀回的神經元差異生長”，Journal of NeuroscienceResearch 42674-83)替換50％的平板接種培養基。每兩天用補加的神經基礎培養基供給培養物，并在第3天體外轉導。
在含聚凝胺(2μg/ml)的補加神經基礎培養基中以0.5體積的典型培養基體積進行轉導。轉導開始后5小時，將培養基體積增加2倍，12小時后更換。按照以上詳述的方法平行產生病毒pSMART CMV-HIF(攜帶HIF-1α基因；參見實施例5)、pSMART CMV-空白型(用作對照的空基因組；參見實施例5)和pONY8Z 5′POS del CTS(含β-半乳糖苷酶基因)。使用pONY8Z 5′POS del CTS計算D17細胞和海馬神經元中的病毒滴度。通過對三種病毒制備物進行定量RT-PCR(Taqman)對比RNA包裝信號，這種對比可以建立相對于pONY8Z5′POS del CTS的pSMART CMV-HIF和pSMART CMV-空白型病毒的生物滴度。所有的轉導都使用對兩種病毒大約相等的感染復數(MOI)進行，用于每個實驗的MOI至少為10。
轉導后36小時，將相同的培養皿分放入兩個單獨的培養箱中，一個為37℃、5％CO2、95％空氣(＝正常氧含量)，而另一個為37℃、5％CO2、94.9％氮氣、0.1％氧(＝低氧)。在這些條件下培養6小時后，由培養箱中取出培養皿，防止于冰冷的平臺上，用冷PBS清洗，使用RNazol B(Tel-Test，Inc；由Biogenesis Ltd經銷)按照廠商的說明提取總RNA。
實驗提供4個樣品，其差異僅在于它們用慢病毒和/或低氧處理，如下所示樣品慢病毒表達基因氧條件1 pSMART CMV-空白型 無 正常氧含量2 pSMART CMV-空白型 無 低氧3 pSMART CMV-HIF HIF-1α 正常氧含量4 pSMART CMV-HIF HIF-1α 低氧可以通過對比這些樣品之間的基因表達模式實現基因尋找。按照本領域公開的常規方法，人們應對比細胞類型1和細胞類型2。通過實施本發明(Smartomics)，看出其它幾種可能性。首先，可以對比細胞類型1和3。在此，對涉及低氧反應的關鍵分子過表達的刺激可以超出對低氧的天然反應，如細胞類型2所見。其次，可以對比細胞類型1和4。在此情況下，對低氧的天然反應通過過表達涉及低氧反應的關鍵分子而被放大或加強。
使用Research Genetics Rat GeneFilter GF300(Research Genetics，Huntsville，AL)獲得分離自4個樣品的RNA的總體mRNA表達模式。該方法使用預先制備的DNA尼龍陣列，所述DNA得自含基因的3′末端的I.M.A.G.E./LLNL cDNA克隆。所述陣列包括5,000個以上的基因，含有一系列的特征水平，包括代表未注解的EST的序列或未知功能的cDNA序列。
放射標記由上述4個樣品中提取的RNA，并與單獨拷貝的Research Genetics Rat GeneFilter GF300雜交。對生產商提供的方法(http//www.resgen.com/products/GF200_protocol.php3)進行以下修改后進行操作將RNAsin加入到標記反應物中，在標記后通過與45mMEDTA/18mM NaOH于65℃溫育30分鐘使mRNA/cDNA雜交體變性。
使用Molecular Dynamics Storm磷成像儀獲得雜交陣列的圖象。然后按照前述方法由陣列中剝離RNA。為確保重現性，用相同的RNA樣品重復該方法。然后輸入兩組數據，并使用Research GeneticsPathways 3.0軟件按照Pathways 3.0說明書的解釋進行分析。以下概述該分析的關鍵方面程序結構設置“條件對”模式用于同時分析多個實驗。在此情況下一個條件等于一個樣品(例如樣品3，在正常氧含量下過表達HIF-1α)。歸一化設置按照Pathways 3.0說明書的解釋選擇數據點歸一化。該技術通過將所有的樣品強度除以陣列上所有克隆(對照點除外)的平均樣品強度產生歸一化強度。兩個實驗作為單獨的歸一化組處理，使得同一實驗不同陣列之間的雜交信號總體差異得到校正。對比分析條件1(即樣品1)對應于用對照慢病毒轉導并置于正常氧濃度(正常氧含量)下的細胞。該條件在與條件2、3和4(即樣品2、3和4)的成對對比中用作參比條件。
以此方式對Research Genetics GF300陣列上存在的所有基因進行對比。通過對比這些條件，該分析判斷兩個實驗的數據。4個代表性的已知HIF-1α/低氧調節基因的結果就發現的真實低氧調節基因來說，證實在低氧細胞中過表達HIF-1α優于使用非轉導低氧細胞或在正常氧含量細胞中過表達HIF-1α，本領域已知受低氧和HIF-1α調節的基因的結果示于以下。比率表示為歸一化強度的平均比率。
表2.已知的HIF-1α/低氧調節基因的反應
列于表2的全部4個基因都是本領域已知的低氧調節基因，并已經RNA印跡分析證實在HIF1-α敲除時下調(Iyer等，(1998)，低氧誘導因子1α對O2穩態的細胞和發育控制，Genes Dev 12149-162)。在烯醇化酶1α的情況下，通過陣列雜交未檢測到正常氧含量下對低氧或Hif-1α過表達的反應。僅在Hif-1α于低氧下過表達時檢測到表達水平比正常氧含量增加。在葡萄糖轉運蛋白的情況下，低氧下Hif-1α過表達使檢測的低氧反應增加。在甘油醛-3-磷酸脫氫酶和乳酸脫氫酶A的情況下，檢測到低氧反應，但正常氧含量下Hif-1α過表達增加反應，低氧下Hif-1α過表達甚至更是如此。過濾設置然后進行數據過濾，以減少數據組，并選擇以上詳述的三對對比中至少一對的表達比率在2.0以上的基因。使用最小0.2的IntensityII濾器將在所有4種條件下信號強度都低的基因自動去除。使用Students t檢驗濾器(90％可信度)將在兩個實驗中都以重復方式不反應的基因自動去除。
結果以各個基因的表達模式輸出，顯示歸一化信號強度和表達比率。Pathways 3.0分析的一個重要優勢在于顯示的原始圖象的各個點的高放大倍數微型圖象。這使得可以目測鑒別確實覆蓋包含雜交陣列點區的檢測部位。已知基因和新基因的注解就發現的新低氧調節基因來說，證實在低氧細胞中過表達HIF-1α優于使用非轉導低氧細胞或在正常氧含量細胞中過表達HIF-1α，本領域已知受低氧調節但不受HIF-1α調節的基因和未注解基因的結果示于以下。比率表示為歸一化強度的平均比率。
表3.新HIF-1α調節基因的反應
a代表性的金屬硫蛋白EST在陣列上點樣兩次，所以數據是兩個點的平均值。
由文獻可知金屬硫蛋白-I受低氧調節(Murphy等(1999)，低氧激活金屬硫蛋白基因表達涉及金屬效應元件和金屬轉錄因子-1，CancerRes 59(6)1315-22)，但不知道受HIF-1α調節。表3的數據顯示，對低氧下HIF-1α過表達的反應遠超過對單獨低氧的反應和對正常氧含量下HIF-1α過表達的反應。該EST(表達序列標簽)是完全沒有注解的DNA序列。同樣，表3的數據顯示，對低氧下HIF-1α過表達的反應遠超過對單獨低氧的反應和對正常氧含量下HIF-1α過表達的反應。
該數據顯示，上述方法使已知基因的其它功能注解和功能未知的完全未注解新基因的功能注解成為可能。實施例7使用Smartomis鑒定細胞因子調節的基因嗜酸性粒細胞與諸如哮喘的變應性疾病有關，哮喘的特征為在患病組織有大量的嗜酸性粒細胞。IL-5是涉及嗜酸性粒細胞分化和存活的關鍵細胞因子。IL-5刺激嗜酸性粒細胞生成作用，并由骨髓釋放，還延長了外周血嗜酸性粒細胞的存活。因此，IL-5在哮喘的發生機理中可能扮演起因的角色。
在IL-5刺激作用下激活的基因作為哮喘治療的潛在標靶引人矚目。
代表本領域發展水平的簡單方法涉及采用嗜酸性粒細胞群，將其分為兩組，一組置于存在IL5的條件下，而另一組置于沒有IL5的條件下。然后將兩組的RNA或蛋白用于合適的差異分析中。目標是鑒定在IL5存在的條件(IL5+)下存在但在無IL5培養基保持細胞(IL5-)中不存在的蛋白或cDNA。
用于在嗜酸性粒細胞中鑒定IL5誘導基因和蛋白的本發明試圖放大IL5+和IL5-之間的差異，以便增加信噪比。這可以通過將IL5受體基因傳遞至處于過表達形態的嗜酸性粒細胞中來增加對IL5信號的反應實現。
IL5α受體以兩種同種型存在，一種為起IL5激動劑作用的膜結合形式，一種為起IL5拮抗劑作用的溶解形式。因為細胞通常表達兩種同種型，所以似乎它們以保持二者之間平衡的方式調節其反應。一種或另一種的表達應當以一種不可能僅改變外源IL5濃度的方式‘強行影響’嗜酸性粒細胞的反應。
預期膜結合形式的IL5α受體過表達應使細胞對細胞因子反應過強。在差異篩選中，該形式受體的過表達將導致IL-5特異性cDNA或蛋白水平增加。檢測藥物開發靶的可能性因此而增加。本發明應用于該情況時包括對比在IL5配體不存在時沒有過表達膜結合形式的IL5α受體的嗜酸性粒細胞和接觸IL5并過表達膜結合形式的IL5α受體的嗜酸性粒細胞。
同樣，預期起IL-5拮抗劑作用的溶解形式受體過表達將減弱嗜酸性粒細胞對IL-5刺激的反應。對比在IL5配體不存在時過表達溶解形式的IL5α受體的嗜酸性粒細胞和接觸IL5(但不過表達溶解IL5α受體)的嗜酸性粒細胞的表達模式。這些方法中的任一種都可用于辨別在IL5作用下表達、其產物是治療諸如哮喘的變應性疾病的潛在標靶的基因。
可以使用任何表達IL5受體的細胞系，例如AML14.3D10、TF1.8或HL-60。可通過各種方式實現膜結合形式和溶解形式的IL5α受體的傳遞和表達。例如，可以用以上實施例和以下實施例8描述的表達構建物轉染或轉導嗜酸性粒細胞。
以如下所述的眾多方式對比轉導和未轉導嗜酸性粒細胞群的基因表達，以獲得在IL5作用下表達的基因讀數。對比IL5不存在時用表達溶解性IL5α受體的構建物轉染的細胞和IL5存在時的未轉染細胞。對比IL5存在時用表達膜結合IL5α受體的構建物轉染的細胞和IL5不存在時的未轉染細胞。
制備總RNA樣品用于差異基因表達分析。這些樣品或者放射標記或者熒光標記，并與固相支持物上的cDNA陣列雜交。IL5上調的基因產生數量上更強的雜交信號。陣列方案可以包括尼龍或玻璃支持物的任一種，綜述于Bowtell，1999。涉及玻璃支持物方案的方法學細節詳述于Eisen和Brown，1999。在此情況下使用熒光標記探針，并使用激光共聚焦掃描儀檢測雜交。對于尼龍支持物方法，包括點印跡和雜交的標準分子生物學方法詳述于Molecular CloningALaboratory Manual，Sambrook，J等，Cold Spring Harbor LaboratoryPress。在此情況下，放射標記對比的RNA樣品，并使用磷成像儀檢測雜交。
陣列可購自Research Genetics，Huntsville，AL，或使用通過扣除克隆產生的cDNA克隆自己制作(PCR選擇法，由Clontech，Palo Alto，CA擁有)。制作包括應用點陣機器人(MicroGrid，BioRobotics Ltd，Cambridge，UK)。
可以將分離自細胞的RNA反轉錄為cDNA，并由此篩選cDNA。或者，如上所述，可以使用蛋白質組學方法(例如雙向凝膠電泳)鑒定差異表達產物。可以參考B1ackstock和Weir(1999)和其中提到的參考文獻，其中論述了各種各樣的蛋白質組學技術。
還可以使用以上方法測定對IL5起反應的其它細胞(例如嗜堿性粒細胞和骨髓前體細胞)的差異表達模式。還可以使用通常對IL5無反應的其它細胞，只要IL5的β鏈與α鏈共表達。對此，應當注意的是，IL-5、IL-3和GM-CSF受體共用相同的β鏈。實施例8過表達人IL5αR同種型本實施例描述了兩種EIAV載體(pONY8.1SMIL5Rm和pONY8.1SMIL5Rs)的產生，這兩種載體能夠由內部CMV啟動子表達IL5α膜受體(pONY8.1SMIL5Rm)或IL5α溶解性受體(pONY8.1SMIL5Rs)。人IL5αR的登錄號為A26251。。
為制備pONY8.1SMIL5Rm，由分離自人外周血嗜酸性粒細胞的mRNA產生的cDNA對IL5αR進行PCR擴增。PCR引物為下述的IL5R1和IL5R2。它們包含SbfI克隆位點，并使用Kozak序列增強翻譯。該方式產生的PCR產物包含位于IL5αR可讀框側翼的SbfI克隆位點。用SbfI切割所述PCR引物，并插入到用SbfI切割的pONY8.1SM中。重要的是檢查IL5αR以正確的方向插入。該方式產生的質粒叫做pONY8.1SMIL5Rm。
該構建物表達野生型IL5αR。修飾IL5αR可讀框，以制備表達溶解形式的IL5αR的pONY8.1SMIL5Rs。
這可通過PCR擴增進行，以去除所述受體的C末端(表位標記的溶解性人IL-5受體，親和交聯標記、IL-5結合和生物活性，BrownPM，Tagari P，Rowan KR，Yu VL，O′Neill GP，Middaugh CR，Sanyal G，Ford-Hutchinson AW，Nicholson DW)。前332個氨基酸保留，同時去除包含跨膜區和胞內區的后88個氨基酸。PCR引物為下述的IL5R1和IL5R3。它們包含SbfI克隆位點，并使用Kozak序列增強翻譯。該方式產生的PCR產物包含位于IL5αR可讀框側翼的SbfI克隆位點。用SbfI切割所述PCR引物，并插入到用SbfI切割的pONY8.1SM中。重要的是檢查IL5αR以正確的方向插入。該方式產生的質粒叫做pONY8.1SMIL5Rs。IL5R1引物ATCGCCTGCAGG ATGATCATCGTGGCGCATGTATTACSbfI位點＝下劃線Kozak序列＝粗斜體ATG起始密碼子＝下劃線斜體IL5R2引物ACTGCCTGCAGGTCAAAACACAGAATCCTCCAGGGTCSbfI位點＝下劃線IL5R3引物ACTGCCTGCAGGTCATCCCACATAAATAGGTTGGCTCSbfI位點＝下劃線其它實施例·在多巴胺能細胞系中過表達抗凋亡基因(即Bcl-2、Bcl-x)產生抗諸如MPTP的神經毒素的神經保護。因為最有代表性的多巴胺能神經元(初級細胞)為培養的有絲分裂期后細胞，所以可以使用慢病毒載體將所述基因引入這些神經元中并過表達，然后篩選發生差異表達的細胞標靶。
·還可以通過在神經元中過表達(凋亡)死亡受體如Fas，并提供限制量的配體(FasL)，鑒定抗凋亡標靶。這些細胞將通過誘導其神經保護基因試圖存活。
·可以在細胞系中過表達類似的生長因子(NGF、GDNF等)及其受體，使所述細胞對生長因子的存活作用敏感。
·在幾種不同的神經系統傷害模型中，刺激性傷害神經系統之后表達諸如HSP70的熱激蛋白(HSP)及其過量產生產生保護作用。HSP涉及腦部局部缺血、神經變性疾病、癲癇和創傷。HSP是通常結合熱激因子(HSF)的分子伴侶，其在神經系統損傷后于細胞溶膠中解離、磷酸化并三聚化，然后進入細胞核中，它們在其中結合熱激基因啟動子中的熱激元件(HSE)，導致其轉錄激活。因此，HSP在神經元、神經膠質或內皮細胞中的過表達可以和Hif1相似的方式進行差異篩選。
·APP(淀粉樣前體蛋白)為Aβ肽前體的一種跨膜蛋白，于Alzheimer病的神經斑中發現。已鑒定出引起某些家族(早期發生)形式疾病的突變。
·早老蛋白1和2對加工APP和某些其它膜蛋白很重要的跨膜蛋白。已經在某些家族形式疾病中分離出幾種突變。
·α-synuclein一種與神經元突觸結合的細胞質蛋白。已經在一些Parkinson病家系、部分Lewy體(Parkinson病的胞內病灶特征，還見于Alzheimer病和Lewy體癡呆)中發現了突變。
·Tau一種微管結合蛋白。已經在與染色體17連鎖的Parkinson綜合征前顳性癡呆和Pick病中發現突變。
·Parkin未知功能的蛋白，與遍在蛋白在N端具有一定同源性，在C端具有環指基序。在青少年型Parkinson病中鑒定出缺失。
·遍在蛋白(UCH-L1)形成部分Lewy體的巰基蛋白酶。已經在德國Parkinson病家系中鑒定出突變。
以上說明書中提及的所有出版物都通過引用結合到本文中。在不背離本發明范圍和精神的情況下對本發明所述方法和系統進行各種修改和變化對本領域技術人員來說是顯而易見的。盡管結合特別優選的實施方案描述了本發明，但顯然要求保護的本發明不應當不恰當地限于這些具體的實施方案。實際上，用于實施本發明的所述模式的各種修改對分子生物學或相關領域技術人員是顯而易見的，屬于以下權利要求的范圍。
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序列表SEQ ID NO1ires-GFP DNA片段的核苷酸序列CTAGAGTGTGATTTTAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCACTAGAGGAATTCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGTGTTTGTCTATATGTGATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTAGTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGAATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAGCTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGCCGCGACTSEQ 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權利要求
1.一種用于鑒定參與細胞活動的遺傳因子的差異表達篩選方法，該方法包括對比(a)在第一種目的細胞中的基因表達；和(b)在第二種目的細胞中的基因表達，該細胞由于引入控制多肽表達的異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的參與細胞活動的生物分子；以及鑒定差異表達的遺傳因子，其中在至少兩種與所述細胞活動有關的不同環境條件下對比所述第一種和/或第二種目的細胞中的基因表達。
2.按照權利要求1的方法，其中在至少兩種與所述細胞活動有關的不同環境條件下對比所述第一種和第二種目的細胞中的基因表達。
3.按照權利要求1或權利要求2的方法，該方法包括對比(a)在第一種目的細胞中的基因表達；(b)在接觸了第一種類型環境變化的第一種目的細胞中的基因表達；(c)在接觸了第二種類型環境變化的第一種目的細胞中的基因表達；(d)在接觸了或者沒有接觸所述第一種和/或第二種類型環境變化的條件下在第二種目的細胞中的基因表達，該細胞由于引入控制多肽表達的異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的生物分子，該分子的活性對b)和c)項所述的環境變化中的一種或兩種產生反應；以及鑒定差異表達的遺傳因子。
4.按照權利要求1或權利要求2的方法，其中所述不同的環境條件是不同水平的生物信號。
5.按照權利要求4的方法，該方法包括對比(a)在第一種目的細胞中的基因表達；(b)在接觸了與細胞活動相關的生物信號的第一種目的細胞中的基因表達，其中所述生物信號為第一種水平；(c)在觸了與細胞活動相關的生物信號的第一種目的細胞中的基因表達，其中所述生物信號為第二種水平；和(d)在第二種目的細胞中的基因表達，該細胞由于引入控制多肽表達的異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的生物分子，該分子的活性對所述生物信號產生反應，其中沒有所述信號或者所述信號為第一種水平或第二種水平；以及鑒定差異表達的遺傳因子。
6.按照權利要求4的方法，該方法包括對比(a)在第一種目的細胞中的基因表達；(b)在第一種目的細胞中的基因表達，其中該細胞接觸了與所述細胞活動相關的生物信號；(c)在第一種目的細胞中的基因表達，該細胞由于引入控制多肽表達的異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的生物分子，該分子的活性對所述生物信號產生反應，其中所述水平改變的生物分子為第一種水平，而其中所述生物信號存在或者不存在；(d)在第二種目的細胞中的基因表達；(e)在第二種目的細胞中的基因表達，其中該細胞接觸了與所述細胞活動相關的生物信號；(f)在第二種目的細胞中的基因表達，該細胞由于引入控制所述多肽表達的異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的生物分子，其中所述水平改變的生物分子為第二種水平，而其中所述生物信號存在或者不存在；以及鑒定差異表達的遺傳因子。
7.按照權利要求4的方法，該方法包括對比(a)在第一種目的細胞中的基因表達；(b)在第一種目的細胞中的基因表達，其中該細胞接觸了與所述細胞活動相關的生物信號；(c)在第一種目的細胞中的基因表達，該細胞由于引入控制第一種多肽表達的異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的第一種生物分子，該分子的活性對所述生物信號產生反應，其中所述生物信號存在或者不存在；(d)在第二種目的細胞中的基因表達；(e)在第二種目的細胞中的基因表達，其中該細胞接觸了與所述細胞活動相關的生物信號；(f)在第二種目的細胞中的基因表達，該細胞由于引入控制第二種多肽表達的異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的第二種生物分子，其中所述生物信號存在或者不存在；以及鑒定差異表達的遺傳因子。
8.一種用于鑒定其表達受信號調控的基因或基因產物的差異表達篩選方法，該方法包括在兩種不同的信號水平上對比(a)在第一種目的細胞中的基因表達，其中所述信號為第一種水平；和(b)在第二種目的細胞中的基因表達，該細胞由于引入異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的生物分子，該分子活性對所述信號產生反應，其中所述信號為第二種水平；以及鑒定差異表達的基因或基因產物。
9.按照任一項前述權利要求的方法，其中所述第一種和第二種細胞為不同的細胞類型。
10.按照任一項前述權利要求的方法，其中所述生物分子水平相對于生理水平提高。
11.按照權利要求1-9任一項的方法，其中所述生物分子水平相對于生理水平降低。
12.按照任一項前述權利要求的方法，其中所述生物分子和所述多肽相同。
13.按照任一項前述權利要求的方法，其中所述異源核酸通過病毒載體引入到所述細胞中。
14.按照權利要求13的方法，其中所述病毒載體為逆轉錄病毒、慢病毒(如馬傳染性貧血病病毒(EIAV)或1型人類免疫缺陷病毒(HIV-1))、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒和痘病毒(如昆蟲痘病毒)。
15.按照任一項前述權利要求的方法，其中通過蛋白質組學技術測定基因表達。
16.按照權利要求1-14任一項的方法，其中使用基因組或cDNA技術測定基因表達。
17.按照任一項前述權利要求的方法，其中所述第一種目的細胞具有正常生理水平的所述生物分子。
18.按照任一項前述權利要求的方法，其中所述多肽參與所述細胞活動。
19.按照任一項前述權利要求的方法，其中所述第一種細胞得自正常患者，而所述第二種細胞得自患病患者。
20.按照權利要求1-18任一項的方法，其中所述第一種細胞得自患病患者，而所述第二種細胞得自相同患病患者。
21.按照權利要求1-7和9-20任一項的方法，其中所述遺傳因子為基因、基因產物或調節元件。
22.一種用于鑒定參與疾病過程的基因產物的差異表達篩選方法，該方法包括(i)對比以下細胞的基因表達(a)第一種目的細胞；和(b)第二種目的細胞；(ii)對比以下細胞的基因表達(a)所述第一種目的細胞；和(b)第三種目的細胞，該細胞由于將控制侯選基因產物表達的異源核酸引入到所述第一種細胞中而包含相對于生理水平來說水平改變的所述侯選基因產物；以及(iii)選擇使所述第三種目的細胞中的第二種基因產物的表達水平相對于所述第一種目的細胞發生改變的侯選基因產物，所述第二種目的細胞中的第二種基因產物相對于所述第一種目的細胞的表達水平也發生了改變。
23.按照權利要求22的方法，其中所述侯選基因產物為多肽。
24.按照權利要求22或23的方法，其中通過使用核酸技術鑒定其水平在所述第一種目的細胞和第二種目的細胞之間以及所述第一種目的細胞和第三種目的細胞之間發生改變的mRNA轉錄物，從而進行基因表達對比。
25.按照權利要求22或23的方法，其中通過使用蛋白分析技術鑒定其水平在所述第一種目的細胞和第二種目的細胞之間以及所述第一種目的細胞和第三種目的細胞之間發生改變的多肽，從而進行基因表達對比。
26.按照權利要求22-25任一項的方法，其中所述基因產物受信號調節，而在所述信號的兩種不同水平上對比所述細胞中的基因表達。
27.一種增強差異表達篩選方法敏感性的方法，其中對比第一種和第二種目的細胞在兩種不同信號水平作用下的基因表達，該方法包括將異源核酸引入所述第一種或第二種細胞中，以升高調節所述細胞對所述信號反應的生物分子的水平。
28.按照任一項前述權利要求的方法，其中所述異源核酸編碼選自以下的生物分子HIF1α、EPAS1、膜結合形式的IL5α受體、溶解形式的IL5α受體、Bcl-2、Bcl-x、FasL、NGF、GDNF、熱激蛋白(HSP)、APP、早老蛋白1、早老蛋白2、α-synuclein、Tau、Parkin和遍在蛋白。
29.按照權利要求7的方法，其中所述第一種多肽為HIF1-α，而所述第二種多肽為EPAS1。
全文摘要
本發明提供一種用于鑒定參與細胞活動的遺傳因子的差異表達篩選方法，該方法包括對比(a)在第一種目的細胞中的基因表達；和(b)在第二種目的細胞中的基因表達，該細胞由于引入控制多肽表達的異源核酸而包含相對于生理水平來說水平改變的影響細胞活動的生物分子；并鑒定差異表達的遺傳因子，其中在至少兩種與細胞活動相關的不同環境條件下對比在所述第一種和/或第二種目的細胞中的基因表達。
文檔編號C12N15/09GK1425075SQ01808359
公開日2003年6月18日 申請日期2001年2月22日 優先權日2000年2月22日
發明者A·J·金斯曼 申請人:牛津生物醫學(英國)有限公司