專利名稱：連接效應分子與蛋白質的方法
連接效應分子與蛋白質的方法本發明涉及連接效應分子與蛋白質的方法，且更具體地說，提供 了一個或多個效應分子與蛋白質中一個或多個半胱氨酸的位點特異性 連接的改進的方法。帶有連接的效應分子的蛋白質用于許多不同目的，既包括診斷應 用，又包括治療應用。例如，抗體可變區的高度特異性和親和力使得它們成為理想的診斷和治療劑，特別是用于調節蛋白質蛋白質相互 作用。在Fv、 Fab、 Fab'、 F(ab)2和其它抗體片段中編碼的靶向功能 可以與一個或多個效應分子，諸如細胞毒性藥物、毒素或聚合物分子 結合以便增加功效。例如，由于這些片段缺乏Fc區，所以它們在動物 中具有短的循環半衰期，而這一情況可以通過結合某些類型的聚合物， 諸如聚乙二醇(PEG)得以改善。已經證實增加結合的PEG的大小使循環 半衰期從數分鐘增加到多個小時并且已經證實了使用5kDa - 100kDa 的PEG修飾Fab' (Chapman等，1999， Nature Biotechnology, 17， 780-783; Leong等，2001， Cytokine, 16， 106-119; Chapman, 2002， Advanced Drug Delivery Reviews, 54， 531-545)。聚乙二醇化的抗 體片段，諸如CDP870目前正在進行臨床試驗，其中結合的PEG的作用 使得循環半衰期對治療而言達到了可接受的水平。人工引入的蛋白質中的反應基團與蛋白質連接。這類基團包括胺類(賴 氨酸)、硫醇類(半胱氨酸、甲硫氨酸)、酚類(酪氨酸)、羧酸類(天冬氨酸、谷氨酸)或其它氨基酸側鏈。效應分子的連接位點可以是隨機的 或位點特異性的，不過，通常優選位點特異性連接。來自含硫的氨基酸半胱氨酸的巰基殘基為常用的可以用于選擇 性偶聯效應分子與蛋白質的反應基團。例如，效應分子與抗體的位點 特異性連接最常見的是通過連接半胱氨酸殘基實現的，因為這類殘基
在抗體片段中相對不常見。抗體鉸鏈區為位點特異性連接的普通區， 因為它們包含半胱氨酸殘基并且遠離可能參與抗原結合的抗體的其它區。合適的鉸鏈區天然存在于片段中或可以使用重組DNA技術生成(例 如，參見US 5， 677， 425; WO 98/25971; Leong等，2001 Cytokine, 16， 106-119; Chapman等，1999 Nature Biotechnology, 17， 780-783)。 或者可以將位點特異性半胱氨酸改造進入抗體片段，以例如，形成表 面暴露的半胱氨酸(US 5,219, 996)。如果效應分子通過半胱氨酸進行位點特異性連接，那么蛋白質中 的乾巰基通常被小的發酵相關肽產物，諸如谷胱甘肽封端或有意地被 蛋白質(例如抗體片段)提取和純化過程中的化學添加劑，諸如5,5'-二硫代雙(2-硝基苯曱酸)(DTNB)封端。需要除去這些封端劑以便在連 接效應分子前活化靶巰基。在許多情況中，需要選擇性活化一個或多個靶半胱氨酸，以便在不還原蛋白質中其它半胱氨酸的情況下進行效 應分子連接。例如，抗體Fat/片段在重鏈與輕鏈恒定區(CHl與CJ之間具有天然鏈間二硫鍵，且由此以便選擇性還原抗體中的另外處，例 如鉸鏈區的耙半胱氨酸，還原必須在一定謹慎條件下進行，使得CL: CH1 間二硫鍵保持完整并且避免效應分子與鏈間半胱氨酸連接。因此，"適 度，，還原條件常用于除去巰基封端劑并且在與效應分子反應前活化靶 巰基。這種適度還原通常通過孵育抗體片段與基于巰基的還原劑，諸 如P -巰基乙醇(P -ME) 、 P -巰基乙胺(P -MA)或二硫蘇糖醇(DTT)實現 (例如，參見EP 0948544)。在還原并且與效應分子(在這些條件下)反 應后，大比例的抗體片段不具有任何連接的效應分子并且必須從具有 正確數量的連接的效應分子的抗體片段中純化出它們。這種低效率的 效應分子連接在重要的是實現最高生產效率的修飾治療抗體片段的大 規模生產過程中可能是一個缺陷。本發明提供了選擇性連接一個或多個效應分子與蛋白質中一個 或多個半胱氨酸的改進的方法。在本發明的方法中，與現有技術的方 法相比，較大比例的蛋白質得以正確修飾，從而顯著提高了效應分子 的連接效率。
因此，本發明提供了連接一個或多個效應分子與蛋白質中一個或多個半胱氨酸的方法，包括a) 通過對不能形成分子內二硫鍵的單巰基還原劑或多巰基還原 劑滲濾蛋白質來活化蛋白質中的一個或多個半胱氨酸；和b) 使處理的蛋白質與效應分子反應。本文所用的術語"蛋白質"包括含有可以用于效應分子連接的一 個或多個半胱氨酸的蛋白質，多肽及其片段。例如，可以修飾蛋白質 以便產生其變體和片段，只要必要時，所需的生物特性(例如結合靶位 點的能力)得以保留。例如，可以通過使用各種遺傳工程或蛋白質工程 技術修飾蛋白質以便將半胱氨酸引入蛋白質，從而用作效應分子的連 接位點。因此，用于效應分子連接的半胱氨酸可以天然存在于蛋白質 中和/或可以通過重組DM技術進行改造進入蛋白質中。因此，根據蛋 白質的預期應用和所需效應分子的數量的不同，得到具體地控制可用 于連接效應分子的半胱氨酸的數量和位置。合適的蛋白質的實例包括，但不限于酶；激素；抗體；受體； 生長因子；血清蛋白，諸如白蛋白、脂蛋白和血纖蛋白原；纖維蛋白 溶酶，諸如組織纖溶酶原激活物(t-PA)、鏈激酶和尿激酶；生物反應 調節物，諸如白細胞介素、干擾素和集落刺激因子；紅細胞生成素； 和肽激素，諸如黃體生成素、生長激素、胃泌素、促卵胞激素、TSH、 ACTH、 IGF結合蛋白；可溶性受體，諸如IL-1R、 TNFR、 IL-17R等。優選本發明方法中效應分子所連接的蛋白質為抗體或其片段。本 文所用的術語"抗體"是指完整抗體及其功能活性片段或衍生物，其 可以為，但不限于多克隆、單克隆、人源化或嵌合抗體、單鏈抗體、 Fv、 Fab片段、Fab'和F(ab')2片段以及任何上述的表位結合片段。合 適的抗體片段的另外的實例還包括WO 2005003169 、 WO 2005003170 和WO 2005003171中所述的那些抗體片段。優選用于本發明的蛋白質 為Fab'片段。因此，抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部 分，即含有特異性結合抗原的抗原結合部位的分子。本發明的免疫球 蛋白分子可以屬于任何類別(例如IgG、 IgE、 IgM、 IgD或IgA)或免疫 球蛋白分子的亞類并且可以獲自任何物種，包括例如小鼠、大鼠、 鯊魚、兔、豬、倉鼠、駱駝、美洲駝羊、山羊或人。人源化抗體為具有一個或多個來自非人物種的互補決定區(CDR)和來自人免疫球蛋白分子的構架區的抗體分子(例如，參見US 5， 585， 089)。嵌合抗體為那些由免疫球蛋白基因編碼的抗體，所述的免疫球蛋 白基因已經被遺傳改造，使得輕鏈和重鏈基因由屬于不同物種的免疫 球蛋白基因區段組成。優選重鏈和輕鏈恒定區為人的而可變區來源于 另一物種。可以通過本領域中公知的任何方法制備單克隆抗體，諸如雜交瘤 技術(Kohler & Milstein， 1975， 256， 495-497)、三源雜交瘤技術、人B-細胞雜交瘤技術(Kozbor等，/邁邁"/7o7og7 1983， 4， 72)和EBV-雜交瘤技術(Cole等，"Monoclonal Antibodies和 Cancer Therapy", pp. 77-96， Alan R. Uss， Inc., 1985)。還可以通過任何其它合適的方法獲得抗體，諸如那些描述在 Babcook， J.等，/Voc. yVa〃. Jcad. Sc/. 〃W, 1996， 93 (15)， 7843-7848、 W0 92/02551、 WO 2004/051268和W0 2004/106377中的 方法。可以使用任何合適的酶切割和/或消化技術，例如通過使用胃蛋 白酶處理從任何完整的抗體，尤其是完整的單克隆抗體中獲得抗體片 段。或者或此外，可以通過使用重組DM技術，包括操作和重新表達 編碼抗體可變和/或恒定區的DNA來制備抗體片段。可以使用標準分子 生物學技術來修飾、添加或缺失所需的氨基酸或結構域。對可變或恒 定區的任何改變仍然包括在本文所用的術語"可變"和"恒定"區中。(例如，參見Boss等，US 4， 816， 397; Cabilly等，US 6,331,415; Shrader等，W0 92/02551; Ward等，1989， Nature, 341, 544; Orlandi 等，1989， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86， 3833; Riechmann等，1988， Nature, 322, 323; Bird等，1988, Science, 242， 423; Queen等， US 5,585,089; Adair， WO91/09967; Mountain和Adair, 1992， Biotechnol. Genet. Eng. Rev， 10， 1-142; Ve纖等，1998， Journal of Immunological Methods, 216， 165-181)。用于本發明的抗體和抗體片段可以具有天然或修飾的鉸鏈區，其 包含可以用作效應分子連接位點的一個或多個半胱氨酸。天然鉸鏈區 為通常與抗體分子的CH1結構域結合的鉸鏈區。修飾的鉸鏈區為在長 度和/或組成方面不同于天然鉸鏈區的任何鉸鏈區。這類鉸鏈區可以包 括來自其它物種的鉸鏈區，所述的其它物種諸如人、小鼠、大鼠、兔、 鯊魚、豬、倉鼠、駱駝、美洲駝羊或山羊的鉸鏈區。其它修飾的鉸鏈 區可以包含來源于不同類別或來自CH1結構域類別的亞類抗體的完整 鉸鏈區。因此，例如，Yl類別的CJ結構域可以與y4類別的鉸鏈區 連接。或者，修飾的鉸鏈區可以包含部分天然鉸鏈區或重復單元，其 中重復中的各單元來源于天然鉸鏈區。在另一個備選方案中，可以通 過將一個或多個半胱氨酸或其它殘基轉化成天然殘基，諸如絲氨酸或 丙氨酸，或通過將適當定位的殘基轉化成半胱氨酸殘基來改變天然鉸 鏈區。通過這類方式，鉸鏈區中半胱氨酸的數量可以得到增加或減少。 其它修飾的鉸鏈區可以為完全合成的并且可以被設計成具有所需特 性，諸如長度、半胱氨酸組成和撓性。例如，在US 5， 677， 425、WO 9915549、WO 9825971和W0 2005003171 中已經描述了許多修飾的鉸鏈區，并且將這些文獻引入本文作為參考。 在一個實例中，用于本發明的蛋白質為具有天然或修飾的鉸鏈區的 Fab'片段。或者或此外，例如，可以將用于效應分子連接的位點特異性半胱 氨酸改造進入抗體或其片段，以便生成表面暴露的半胱氨酸(例如，參 見US 5， 219, 996和WO 2006034488)。因此，通過使用合適的改造技 術，可以改變抗體或其片段中的半胱氨酸數量以便為效應分子連接提供特定數量的位點。因此，在本發明的一個實施方案中，蛋白質為抗體FaV片段且 效應分子所連接的各半胱氨酸均位于鉸鏈區中。在另 一個實施方案中，蛋白質為抗體Fab'或Fab片段且效應分子所連接的至少一個半胱氨酸 為改造的半胱氨酸，優選表面暴露的半胱氨酸。在一個實施方案中， 兩個或兩個以上效應分子與抗體FaV片段連接并且所述分子中的至 少一個與鉸鏈區中的半胱氨酸連接。如果本發明的蛋白質為抗體或其片段，那么該抗體一般能夠選擇 性結合抗原。所述的抗原可以為任何細胞伴隨抗原，例如，諸如細菌 細胞、酵母細胞、T-細胞、內皮細胞或腫瘤細胞這類細胞上的細胞表 面抗原，或所述的抗原可以為可溶性抗原。抗原還可以為任何醫學相 關抗原，諸如那些在疾病或感染過程中被增量調節的抗原，例如受體 和/或其相應的配體。細胞表面抗原的具體實例包括黏著分子，例如 整聯蛋白，諸如P1整聯蛋白，例如VLA-4; E-選擇蛋白、P選擇蛋白 或L-選擇蛋白;CD2、 CD3、 CD4、 CD5、 CD7、 CD8、 CDlla、 CDllb、 CD18、 CD19、 CD20、 CD23、 CD25、 CD33、 CD38、 C歸、0D45、 CDW52、 CD69; 癌胚抗原(CEA);人乳脂小球蛋白(HMFG1和2); MHC I類和MHC II類 抗原；和VEGF，且如果合適，還有其受體。可溶性抗原包括白細胞 介素，諸如IL-1、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-8、 IL-12、 IL-16或IL-17;病毒抗原，例如呼吸道合胞病毒或巨細胞病毒抗原； 免疫球蛋白，諸如IgE;干擾素，諸如干擾素a、干擾素P或干擾素y; 腫瘤壞死因子-a、腫瘤壞死因子-P;集落刺激因子，諸如G-CSF或 GM-CSF;和血小板衍生生長因子，諸如PDGF-a和PDGF-p，且如果合 適，還有其受體。在本發明的方法中，至少一個效應分子通過位于蛋白質中的半胱 氨酸殘基的巰基共價連接。該共價鍵一般為二硫鍵、硫醚鍵，或特別 是硫-碳鍵。可以使用適當活化的效應分子，例如巰基選擇性衍生物， 諸如馬來酰亞胺、吡啶基二硫代、乙烯基砜、硪乙酰基、溴乙酰基和 半胱氨酸衍生物。本文所用的術語"效應分子"包括，例如，抗腫瘤藥、藥物、毒 素(諸如細菌或植物來源的酶促活性毒素及其片段，例如蓖麻毒素及其
片段)；生物活性蛋白，例如酶；其它抗體或抗體片段；合成或天然存 在的聚合物、核酸及其片段，例如DNA、 RNA及其片段；放射性核素， 特別是放射性碘、放射性同位素、螯合金屬、納米顆粒和報道基團， 諸如熒光化合物或可以通過NMR或ESR光鐠法檢測的化合物。應該認 識到效應分子可以包含單一效應分子或兩個或兩個以上如此連接以便 形成可以使用本發明的方法與蛋白質連接的單一部分的這類分子。具體的抗腫瘤藥包括細胞毒性和細胞生長抑制劑，例如烷基化 劑，諸如氮芥(例如苯丁酸氮芥、美法侖、雙氯乙基甲胺、環磷酰胺或 尿嘧啶氮芥)及其衍生物；三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺、白 消安或順鉑；抗代謝物，諸如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、5-氟脫氧尿苷、 阿糖胞苷、巰嘌呤、硫鳥嘌呤、氟代乙酸或氟代檸檬酸；抗生素，諸如博來霉素(例如硫酸博來霉素)、多柔比星、柔紅霉素、絲裂霉素(例 如絲裂霉素C)、放線菌素類(例如放線菌素D)、普卡霉素、刺孢霉素 及其4汙生物或esperamicin及其4汙生物；有絲分裂抑制劑，諸如依托泊 苷、長春新堿或長春堿及其衍生物；生物堿類，諸如橢圓玫瑰樹堿； 多元醇類，諸如紫杉萜酯-I或紫杉萜酯-II;激素，諸如雄激素(例如 屈他雄酮或睪內酪)、黃體酮(例如醋酸甲地孕酮或醋酸甲羥孕酮)、雌 激素(例如二曱基己烯雌酚雙磷酸酯、聚磷酸雌二醇或磷酸雌二醇氮芥) 或抗雌激素藥(例如他莫昔芬)；蒽醌類，諸如米托蒽醌；脲類，諸如 羥基脲；肼類，諸如丙卡巴肼；或咪唑類，諸如丙卡巴肼。螯合金屬包括具有2 - 8個(包括端點)配位數的二-或三價金屬 的螯合物。這類金屬的具體實例包括锝(Tc)、錸(Re)、鈷(Co)、銅(Cu)、 金(Au)、銀(Ag)、鉛(Pb)、鉍(Bi)、銦(In)、鎵(Ga)、釔(Y)、鋱(Tb)、 釓(Gd)和鈧(Sc)。 一般而言，所述的金屬優選為放射性核素。具體的 放射性核素包括^Tc、 186Re、 mRe、 58Co、 6°Co、 67Cu、 195Au、 199Au、 mAg、 203Pb、 2°6Bi、 2°7Bi、 mIn、 67Ga、 68Ga、 88Y、 9°Y、 "°Tb、 153Gd和47Sc。例如，螯合的金屬可以為與任何合適的聚腺苷酸螯合劑螯合的上 述類型的金屬之一，所述的聚腺苷酸螯合劑例如為非環狀或環狀多胺類、聚醚類(例如冠醚類及其衍生物)；聚酰胺類；卟啉類；和碳環衍生物。一般而言，螯合劑的類型將取決于使用中的金屬。然而，本發明 的結合物中一組特別有用的螯合劑為非環狀或環狀多胺類，尤其是多氨基羧酸類，例如二亞乙基三胺五乙酸及其衍生物；和大環胺類，例 如環三-氮雜和四-氮雜衍生物(例如國際專利說明書WO 92/22583中所 述)；和聚酰胺類，尤其是去鐵草酰胺及其衍生物。其它效應分子包括蛋白質、肽和酶。所關注的酶包括，但不限于 蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、異構酶、轉移酶。所關注的蛋白質、 多肽和肽包括，但不限于免疫球蛋白；白蛋白；毒素，諸如相思豆 毒素、蓖麻毒素A、假單胞菌內毒素或白喉毒素；蛋白質，諸如胰島 素、肺瘤壞死因子、oc-干擾素、p-干擾素、神經生長因子、血小板 衍生生長因子或組織纖溶酶原激活物；血栓形成劑或抗血管生成劑， 例如制管張素或內皮抑制素；或生物反應調節物，諸如淋巴因子、白 細胞介素-l (IL-1)、白細胞介素-2 (IL-2)、白細胞介素-6 (IL-6)、 粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子 (G-CSF)、神經生長因子(NGF)或其它生長因子和免疫球蛋白。其它效應分子可以包括例如在i貪斷中有用的可檢測物質。可檢測 物質的實例包括各種酶、輔基、熒光物質、發光物質、生物發光物質、 放射性核素、正電子發射金屬(用于正電子成像術)和非放射性順磁金 屬離子。對于可以與用作診斷劑的抗體結合的金屬離子一般參見美國 專利US 4， 741， 900。合適的酶包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、P -半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基包括鏈霉抗生物素、抗生物 素蛋白和生物素；合適的熒光物質包括傘形酮、熒光素、羅丹明紅、 羅丹明綠、B-藻紅蛋白、R-藻紅蛋白、別藻藍蛋白、德克薩斯紅、太 平洋藍(Pacific blue)、馬里那藍(Marina blue)、俄勒岡綠(Oregon green)和Alexa Fluor系列350， 405， 430， 488， 500， 514， 532, 546， 555， 568， 594， 610， 633， 647， 660， 680， 700和750;合適的發 光物質包括魯米諾；合適的生物發光物質包括螢光素酶、螢光素和水 母發光蛋白；且合適的放射性核素包括1251、 mI、川ln和"Tc。
用作效應分子的合成或天然存在的聚合物包括，例如，任選取代 的直鏈或支鏈聚亞烷基、聚亞烯基或聚氧化亞烷基聚合物或支鏈或非 支鏈多糖類，例如同-或雜-多糖，諸如乳糖、直鏈淀粉、葡聚糖、淀 粉或糖原。可以存在于上述合成聚合物上的具體可選取代基包括一個或多 個羥基、曱基或曱氧基。合成聚合物的具體實例包括任選取代的直鏈 或支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其是任 選取代的聚(乙二醇)，諸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。本文所用的"衍生物"意欲包括反應衍生物，例如巰基-選擇性反應基，諸如ot-囟代羧酸或酯，例如碘乙酰胺；二酰亞胺，例如馬來酰 亞胺，乙烯基砜或二硫化馬來酰亞胺等。反應基可以直接與聚合物連 接或通過連接基部分與聚合物連接。可以理解該基團的殘基在某些情 況中構成作為蛋白質與聚合物之間連接基的產物的組成部分。可以為直鏈或支鏈的聚合物的大小可以根據需要改變，但一般的 平均分子量范圍為500Da - 100， OOODa,優選5， 000 - 40, OOODa，且更 優選10， 000 - 40， 000Da和20, 000 - 40, 000Da。聚合物的大小可以特 別基于產物的預期應用來選擇，例如定位于某些組織，諸如腫瘤的能 力或延長的循環半衰期(就綜述而言，參見Chapman, 2002， Advanced Drug Delivery Reviews, 54， 531-545)。因此，例如，如果打算使 產物脫離循環并且滲入組織，例如用于治療腫瘤，那么使用小分子量 聚合物，例如具有約5，000Da分子量的聚合物可能是有利的。就產物 保留在循環中的應用而言，使用較高分子量的聚合物，例如具有 25， OOODa - 40， OOODa分子量的聚合物可能是有利的。特別優選的聚合物包括聚亞烷基聚合物，諸如聚(乙二醇)或尤其 是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物；且尤其是具有約10， OOODa-約 40， OOODa范圍分子量的聚(乙二醇)或其衍生物。本發明的聚合物可以通過商購獲得(例如購自NipponOil和Fats; Nektar Therapeut ics)或可以使用常規化學操作步驟由可商購的原料 制備。
在本發明的優選的方面中，與蛋白質連接的效應分子中的至少一個為聚合物分子，優選PEG或其衍生物。 一般就連接聚(乙二醇)(PEG) 部分而言，參照"Poly (ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992， J.Milton Harris (ed)， Plenum Press, New York; "Poly (ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997， J. Mi 1 ton Harris和S. Zalipsky (編輯)，American Chemical Society ， Washington DC 和 "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998， M. Aslam和A. Dent, Grove Publishers， NewYork。 在本發明的一個實例中，與蛋白質連接的各效應分子為PEG,該 蛋白質為抗體片段并且各PEG分子通過馬來酰亞胺基與抗體片段中的 一個或多個巰基共價連接。在一個優選的實施方案中，所述的蛋白質 為抗體Fab'片段且PEG分子通過馬來酰亞胺基與鉸鏈區中的單個半胱 氨酸連接。PEG可以為直鏈或支鏈的。為了連接支鏈的PEG分子，賴 氨酸殘基優選與馬來酰亞胺基共價連接。與賴氨酸殘基上的每個胺基 團優選連接曱氧基聚(乙二醇)聚合物。在一個實例中，每個聚合物的 分子量約為20， 000Da且整個聚合物分子的總分子量因此約為 40， 000Da。可以使用本文所述的方法同時或通過重復該方法依次〗吏兩個或 多個效應分子與蛋白質中的半胱氨酸連接。優選如果使兩個或多個效 應分子與蛋白質連接，那么應同時連接它們。本發明的方法還可以擴展至本文所迷的方法之前和/或之后的一 個或多個步驟，其中使用任何合適的方法，例如通過其它可利用的氨 基酸側鏈，諸如氨基和亞氨基使另外的效應分子與蛋白質連接。可以 使用標準化學或重組DNA操作步驟使其它這類效應分子與蛋白質連 接，其中所述蛋白質與所述效應分子直接或通過偶聯劑連接。用于使 這類效應分子與抗體結合的技術為本領域眾所周知的(參見 Hellstrom等，Controlled Drug Delivery, 2nd Ed. ， Robinson等， eds.， 1987， pp. 623-53; Thorpe等，1982 , Immunol, Rev.，62: 119-58和Dubowchik等，1999， Pharmacology and Therapeutics， 83， 67-123)。具體的化學操作步驟包括例如那些描述在國際專利說 明書WO 93/0623KWO 92/22583、WO 90/09195、WO 89/01476、WO 9915549 和WO 03031581中的操作步驟。或者，如果效應分子為蛋白質或多肽， 那么可以使用重組DNA操作步驟，例如歐洲專利說明書第392745號中 所述的操作步驟實現連接。在本發明的方法中，在連接效應分子之前的步驟(a)中活化一個 或多個半胱氨酸。本文所用的術語"活化"是指產生步驟(b)中效應分 子所連接的每個半胱氨酸中的游離巰基的過程。在一個實例中，"活 化"是指除去與半胱氨酸結合的加合物，諸如谷胱甘肽。在另一個實 例中，"活化，，是指還原不同多肽鏈中的兩個半胱氨酸之間的二硫鍵， 例如還原F(ab02的一個或多個鉸鏈半胱氨酸之間的二石危鍵，以便活 化形成的FaV片段的鉸鏈半胱氨酸。在一個實施方案中，通過除去與 半胱氨酸結合的加合物來活化Fab'片段的鉸鏈半胱氨酸。在另一個實 施方案中，通過還原F(ab')2中兩個這樣的鉸鏈半胱氨酸之間的二硫 鍵來活化Fab'片段的鉸鏈半胱氨酸。優選在所述方法的步驟(a)中活化的每個半胱氨酸不在同一多肽內具有另一個半胱氨酸的二硫鍵上。例如，如果蛋白質為抗體或其片 段，那么在步驟(a)中活化的半胱氨酸優選不為重鏈的鏈間半胱氨酸、 CH1或輕鏈的鏈間半胱氨酸、G或重鏈或輕鏈的鏈間半胱氨酸。因此， 本發明提供了一種方法，由此效應分子可以有效和選擇性地與特定的 半胱氨酸殘基連接并且可以保留蛋白質內的其它所需的二硫鍵。在本發明的一個實施方案中，其中蛋白質為抗體FaV片段，該 方法的產物為抗體Fab'片段，其中效應分子與鉸鏈區中的單個半胱氨 酸連接并且重鏈與輕鏈(CJ與CJ之間的鏈間二硫鍵得以保留。在另一個實施方案中，使用本發明的方法使兩種或兩種以上蛋白 質通過一個或多個效應分子連接。如果合適，可以使用合適的連接基 使可以為相同或不同的蛋白質通過一個或多個效應分子連接。在一個 實例中，可以通過包含共價連接的效應分子的鏈間橋連接二價抗體。 在一個這樣的實例中，使用本發明的方法使兩個Fab'片段通過合適的 連接基與PEG分子連接，以便產生多價抗體。在一個這樣的實例中， 如WO 99/64460中所迷使兩個Fab'片段與聚乙二醇化的二馬來酰亞胺 橋交聯以便產生DFM-PEG。通過對不能形成分子內二硫鍵的單巰基還原劑或多巰基還原劑 滲濾蛋白質來選擇性地活化本發明方法的步驟(a)中的半胱氨酸。滲濾 為本領域中眾所周知的技術并且常用于改變蛋白質樣品中的緩沖液。 滲濾池為可商購的，例如Amicon攪拌池和Pall Centramate系統。通過保留蛋白質并且能夠進行緩沖液更換的膜滲濾一般在緩沖液中的蛋 白質樣品。隨著時間的流逝，用新的緩沖液替代包含蛋白質的原始緩 沖液。在本發明中，術語"對不能形成分子內二硫鍵的單巰基還原劑 或多巰基還原劑滲濾，，是指蛋白質對含有合適的還原劑的溶劑，適宜 的是緩沖液的滲濾。該方法的步驟(a)—般在緩沖水溶液中進行，其實例包括，但不 限于磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液。蛋白質可以在與滲濾緩沖液相同的緩 沖液中或它們可以是不同的。優選緩沖液的pH在2. 0-10. 0，更優選 4.0-7.0的范圍內。在一個優選的實施方案中，緩沖液的pH在6.0 -7.0。該緩沖液可以任選地含有螯合劑，諸如EDTA、 EGTA、 CDTA或 DTPA。優選該緩沖液含有1 - 5mM，優選2mM的EDTA。或者或此外，該 緩沖液可以為螯合緩沖液，諸如檸檬酸、草酸、葉酸、N，N-二甘氨酸、 兩性離子緩沖劑、tris或ADA。適用于本發明的還原劑為不能形成分子內二疏鍵的單巰基還原 劑和多巰基還原劑。用于本發明的單巰基還原劑為本領域中廣為皆知的，其實例包 括，但不限于p-巰基乙胺、巰基乙醇、半胱氨酸和谷胱甘肽。優選用于本發明的單巰基還原劑為P-巰基乙胺。其它合適的還原劑包括不能形成分子內二硫鍵的多巰基還原劑。 本文所用的術語"不能形成分子內二硫鍵的多巰基還原劑"是指包含 不能在巰基之間形成分子內二硫鍵的兩個或多個巰基的還原劑。這類
還原劑的實例如下所示:<formula>formula see original document page 16</formula>用于本發明的不適宜的還原劑為能夠形成分子內二硫鍵的多巰 基還原劑，例如可以在其兩個巰基之間形成分子內二硫鍵的二硫蘇糖 醇。對本領域技術人員而言顯而易見的是，可以通過確定在步驟(a) 中使用還原劑處理蛋白質后產生的游離巰基的數量或通過，例如經大 小排阻色譜法確定步驟(b)中連接的效應分子的數量來鑒定適宜的還 原劑。用于確定游離巰基的方法為本領域中眾所周知的，例如，參見 Lyons等，1990， Protein Engineering, 3， 703。
還可以由本領域技術人員根據經驗確定還原劑的合適的濃度。優選以0. 3 - 5raM，更優選0. 3 - 4mM，甚至更優選0. 3 - 3mM，更優選0. 3 -2mM的濃度使用還原劑。優選濃度為1， 1.5， 2， 2.5, 3， 3.5， 4， 4.5或5mM。優選還原劑的濃度較低，以便實現對靶半胱氨酸的選擇性 活化。因此，在一個實施方案中，還原劑的濃度不超過5mM。在一個 實施方案中，還原劑的濃度不超過4mM。在一個實施方案中，還原劑 的濃度不超過3mM。在一個實施方案中，還原劑的濃度不超過2mM。在 一個實施方案中，還原劑的濃度不超過lmM。在本發明的一個實施方案中，在步驟(a)中的滲濾開始之前，蛋 白質樣品中不存在還原劑并且通過滲濾使蛋白質與還原劑接觸。因此， 在一個實施方案中，將還原劑僅摻入滲濾緩沖液中并且在該方法的步 驟(a)之前，在蛋白質樣品中不存在還原劑。在另一個實施方案中，在步驟(a)中的滲濾之前，也將還原劑加 入到蛋白質中。優選在開始滲濾前即刻將還原劑加入到蛋白質中。加同。在每種情況下，所用的各還原劑優選為不能形成分子內二石克鍵的 單巰基還原劑或多巰基還原劑。因此，在一個實施方案中，加入到蛋 白質樣品中的還原劑與滲濾緩沖液中的還原劑不同。優選加入到蛋白 質中的還原劑與滲濾緩沖液中的還原劑相同，即不能形成分子內二硫 鍵的單巰基還原劑或多巰基還原劑。優選蛋白質樣品中和滲濾緩沖液 中的還原劑為13 -巰基乙胺。優選滲濾前蛋白質樣品中還原劑的起始濃 度為滲濾緩沖液中還原劑濃度的0. 5 - 1. 5倍，更優選0. 75 - 1. 25倍， 甚至更優選0. 9- 1. 1倍。在一個實施方案中，滲濾開始時蛋白質樣品 中還原劑的濃度與滲濾緩沖液中還原劑的濃度大致相同，優選是相同 的。應該認識到本領域技術人員可以通過改變所用的還原劑、還原劑 的濃度、蛋白質的濃度、反應的pH、溫度、滲濾的時間期限和流速來 優化本發明方法的步驟(a)中蛋白質中半胱氨酸的活化。因此，本領域技術人員可以根據經驗確定合適的滲濾流速。合適
的流速包括1-15個滲濾體積/小時。還可以使用較低的流速，例如 0. 2-0. 9個滲濾體積/小時。在一個實施方案中，流速為0. 5個滲濾 體積/小時。滲濾可以在任何合適的溫度，例如約5'C -約70°C,例如在室溫 下進行。使該方法的步驟(a)進行足以活化步驟(b)中效應分子所連接的 各半胱氨酸的時間。本領域技術人員可以根據經驗確定合適的時間期 限。 一般而言，滲濾進行1-20小時的期限。在一個實施方案中，滲 濾進行1 - 10小時的期限， 一般為4， 5， 6， 7， 8， 9或10小時。在 一個實施方案中，滲濾進行6. 5小時的期限。本領域技術人員還可以基于蛋白質類型的不同，根據經驗確定用 于本發明方法的蛋白質的合適的濃度。例如，如果蛋白質為抗體Fab' 片段，那么合適的濃度包括1 - 200mg/1 ，優選2 - 30mg/1,優選20mg/1 。任選地，在對還原劑滲濾后，可以降低還原劑的水平或使用本領 域中公知的任何適宜的方法在該方法的步驟(a)與(b)之間除去還原 劑。在一個實施方案中，通過對不含任何還原劑的緩沖液滲濾蛋白質， 例如通過對這種新的緩沖液繼續進行步驟(a)的滲濾來降低還原劑的 濃度。在另一個實施方案中，通過對包含低濃度還原劑的緩沖液滲濾 來降低還原劑的水平。在另一個實施方案中，通過凝膠過濾來降低還 原劑的水平或從蛋白質樣品中除去還原劑。在該方法的步驟(b)中，使一個或多個效應分子與該方法的步驟 接。 ； '、、一 ， 、"，、'該方法的步驟(b)—般可以在溶劑，例如緩沖水溶液，諸如磷酸 鹽、檸檬酸鹽或乙酸鹽中進行。 一般而言，其為通過凝膠過濾滲濾或 轉移至蛋白質樣品中的緩沖液。該反應 一般可以在任何合適的溫度下， 例如約5。C -約70°C，例如在室溫下進行。該緩沖液可以任選地包含 螯合劑，諸如EDTA、 EGTA、 CDTA或DTPA。優選該緩沖液包含EDTA1 -5mM，優選2mM的EDTA。或者或此外，該緩沖液可以為螯合緩沖液，
諸如檸檬酸、草酸、葉酸、N，N-二甘氨酸、兩性離子緩沖劑、tris或 ADA。 一般以與蛋白質濃度至少等摩爾的濃度使用該效應分子，即至少 為1:1。 一般而言，以與蛋白質濃度相比過量的濃度使用該效應分子。 一般而言，該效應分子為1.1-100倍摩爾過量，優選l. 1， 1.5， 2， 3， 5， 10或50倍摩爾過量。合適的效應分子濃度的其它實例包括1.2， 1.25， 1. 3和1. 4倍摩爾過量。或者，如果2種或2種以上蛋白質與一個或多個效應分子連接，那么該效應分子不可以過量，例如效應分 子與蛋白質之比可以為0. 1 - 1，優選0.5。本領域技術人員可以根據 經驗確定反應期限并且一般為1-20小對。在一個實施方案中，該反 應進行14-16小時的期限。如果必要，可以通過常規手段，例如通過色譜技術，諸如離子交 換、大小排阻或疏水作用色譜法從任何原料或該方法過程中生成的其 它產物中分離包含所需數量的效應分子的所需產物。因此，在一個實 施方案中，本發明的方法進一步包括步驟(c)，其中純化帶有所需數量 的連接的效應分子的蛋白質。實施例現在僅通過實施例描述本發明，其中參照 附

圖1 :還原時間對Fab'聚乙二醇化效率的作用。 附圖2:還原條件對聚乙二醇化效率的作用比較。 附圖3:還原劑類型對聚乙二醇化效率的作用比較。 附圖4:還原劑濃度對聚乙二醇化效率的作用。 附圖5: pH對聚乙二醇化效率的作用。在所有附圖中的術語"Fat/-PEG"均代表帶有一個與單一鉸鏈區 半胱氨酸連接的40， 000 PEG的Fab'。在所有附圖中的術語"多-PEG，，均代表高分子量聚乙二醇化材料， 其中1個以上PEG分子與抗體Fab'片段連接。實施例1 通過在帶有10000 MWCO膜的8050 Amicon攪拌池中對2mM 2-巰 基乙胺、0. 1M磷酸鹽、2mM EDTA pH6滲濾還原在0. 1M磷酸鹽、2mM EDTA pH6中包含10mg/ml單鉸鏈巰基的20ml Fal/。在開始滲濾前即刻將 2-巰基乙胺加入到FaV溶液中至終濃度為2mM。在滲濾過程中，每隔30分鐘除去一次lml保留液的等分部分并 且通過在使用0. 1M磷酸鹽、2raM EDTA pH6平衡的PD10柱上進行嚴格 凝膠過濾從所述的等分部分中除去還原劑。使還原的Fab'在環境溫度 下在具有~3倍摩爾過量的40kPEG-馬來酰亞胺(Nektar)的相同緩沖 液中聚乙二醇化16小時。通過大小排阻HPLC測定FaV的聚乙二醇化 (聚乙二醇化百分比)。附圖1表示在滲濾5小時后，反應隨著時間的流逝進行到~80% Fat/單聚乙二醇化的平衡。實施例2在環境溫度下，通過在帶有10000 MWCO膜的8010 Amicon攪拌 池中對均在0. 1M磷酸鹽、2mMEDTA pH6中的lmM2-巰基乙胺或lmM 2-巰基乙醇或1mM還原態谷胱甘肽或lmM二硫蘇糖醇滲濾16小時還原在 0. 1M磷酸鹽、2mM EDTA pH6中包含10mg/ml單鉸鏈巰基的8ml Fab' 樣品。然后通過在環境溫度下使FaV對0. 1M磷酸鹽、2mM EDTA pH6 繼續滲濾4小時除去還原劑。使還原的Fab'在環境溫度下在具有5倍 摩爾過量的40kPEG-馬來酰亞胺(Nektar)的相同緩沖液中聚乙二醇化 16小時。平行進行的是，在環境溫度下，通過與5mM2-巰基乙胺或5mM2-巰基乙醇或5mM還原態谷胱甘肽或5mM二硫蘇糖醇一起孵育30分鐘還 原在0. 1M磷酸鹽、2mMEDTApH6中包含10mg/ml單鉸鏈巰基的0. 5ml Fab'樣品。通過在使用0. 1M磷酸鹽、2mM EDTA pH6平衡的PD10柱上 進行嚴格凝膠過濾除去還原劑。在環境溫度下使用5倍摩爾過量的40k PEG-馬來酰亞胺(NektarM吏還原的Fab'聚乙二醇化16小時。通過大小排阻HPLC以及還原和非還原SDS-PAGE測定Fab'的聚
乙二醇化。SDS-PAGE分析證實在Fat/ -PEG (單聚乙二醇化)中保留了鏈 間二硫鍵。附圖2表示與導致大比例Fab'保持未聚乙二醇化的孵育相比， 滲濾還原推進了朝著更多單聚乙二醇化Fab'的平衡。使用2-巰基乙胺 滲濾使單聚乙二醇化的Fab'的百分比從55%增加到85%。類似地，使 用谷胱甘肽或2-巰基乙醇滲濾使單聚乙二醇化的Fab'的百分比分別 從25°/。增加到58%和從22%增加到42%。附圖2還表示如果還原劑為能 夠形成分子間二硫鍵的二硫醇，例如二硫蘇糖醇，那么它會將在單聚 乙二醇化后的平衡推進至鏈間半胱氨酸上不理想的廣泛多聚乙二醇 化。實施例3在環境溫度下，通過在帶有10000 MWCO膜的8010 Amicon攪拌 池中對均在0. 1M磷酸鹽、2mMEDTA pH6中的lmM:2-巰基乙胺或lmM 2-巰基乙醇或lmM還原態谷胱甘肽或lmM L-半胱氨酸滲濾16小時還原 在0. 1M磷酸鹽、2mM EDTA pH6中包含1 Omg/ml單鉸鏈巰基的8ml Fab' 樣品。然后通過在環境溫度下使FaV對O.IM磷酸鹽、2mM EDTA pH6 繼續滲濾4小時除去還原劑。在環境溫度下使用5倍摩爾過量的40k PEG-馬來酰亞胺(Nektar)使還原的Fab'聚乙二醇化16小時。通過大小排阻HPLC以及還原和非還原SDS-PAGE測定Fab'的聚 乙二醇化。附圖3表示P-巰基乙胺和半胱氨酸特別有效地還原Fab'而達到 高水平的單聚乙二醇化。實施例4在環境溫度下，通過在帶有10000 MWCO膜的8010 Amicon攪拌 池中對在0. 1M磷酸鹽、2mMEDTApH6中的0. 3raM或lmM或3mM或5mM 2-巰基乙胺滲濾16小時還原在0. 1M磷酸鹽、2mM EDTA pH6中包含 10mg/ml單鉸鏈巰基的6ml Fab'樣品。然后通過在環境溫度下將Fab's 對0. 1M磷酸鹽、2mM EDTA pH6繼續滲濾4小時除去還原劑。在環境 溫度下使用3倍摩爾過量的40k PEG-馬來酰亞胺(Nektar)使還原的 Fab'聚乙二醇化16小時。通過大小排阻HPLC以及還原和非還原 SDS-PAGE測定Fab'的聚乙二醇化。附圖4表示還原效率取決于還原劑的濃度。發現在這些條件下 lmM對這種Fat/為最佳。應該認識到可以通過改變所用的還原劑、還 原劑的濃度、蛋白質的濃度、反應的pH、溫度、通過蛋白質的還原劑 的量和通過蛋白質的還原劑的流速來優化任何蛋白質的還原。實施例5在環境溫度下，通過在帶有10000 MWC0膜的8010 Amicon攪拌 池中對在0. 1M檸檬酸鹽、2mM EDTA pH4， 5， 6或7中的lmM 2-巰基 乙胺滲濾16小時還原在0. 1M檸檬酸鹽、2mM EDTA pH4， 5， 6或7中 的6. 5ml Fab'樣品。通過在使用0. 1M檸檬酸鹽、2mM EDTA pH4， 5， 6 或7平衡的PD10柱上進行嚴格凝膠過濾除去還原劑。在環境溫度下使 用4倍摩爾過量的40k PEG-馬來酰亞胺(Nektar)使還原的Fab'聚乙二 醇化5小時。通過大小排阻HPLC測定Fab'的聚乙二醇化。附圖5表示pH對產生的Fab'-PEG的量的作用。實施例6在環境溫度下，通過使用10000 MWCO膜在l5-20升的體積中對 在0. 1M磷酸鹽、2mM EDTA pH 6. 8中的lmM 2-巰基乙胺以1個滲濾體 積/小時的流速滲濾6. 5小時還原在0. 1M磷酸鹽、2mM EDTA， pH 6. 8 中的20mg/ml(士2mg/ml)抗體Fat/。在滲濾開始前即刻將2-巰基乙胺 加入到Fab'溶液中至終濃度為lmM。在滲濾后，通過以8個滲濾體積/ 小時對20mM乙酸鈉pH 4. 5繼續滲濾1 - 1. 5小時除去還原劑。在環境 溫度下將還原的Fat/與1. 25摩爾過量的40k PEG-馬來酰亞胺(Nektar) 一起孵育16-20小時。
通過大小排阻HPLC測定Fab'的聚乙二醇化。達到85%的聚乙二醇化。經證實該滲濾方法以大規模是有效的，從而導致高效率的聚乙二醇化。
權利要求
1.連接一個或多個效應分子與蛋白質中一個或多個半胱氨酸的方法，包括a)通過對不能形成分子內二硫鍵的單巰基還原劑或多巰基還原劑滲濾蛋白質活化蛋白質中的一個或多個半胱氨酸；和b)使處理的蛋白質與效應分子反應。
2. 權利要求1所述的方法，其中不能形成分子內二硫鍵的單巰 基還原劑或多巰基還原劑在步驟(a)前存在于蛋白質樣品中。
3. 權利要求2所述的方法，其中蛋白質樣品中還原劑的濃度為滲 濾緩沖液中還原劑濃度的0. 5-1.5倍。
4. 權利要求3所述的方法，其中蛋白質樣品中還原劑的起始濃度 與滲濾緩沖液中的還原劑濃度相同。
5. 權利要求l-5中任意一項所述的方法，其中還原劑的濃度為lmM。
6. 權利要求1-5中任意一項所述的方法，其中在步驟(a)-步驟 (b)之間從蛋白質樣品中除去還原劑。
7. 權利要求6所迷的方法，其中通過凝膠過濾除去還原劑。
8. 權利要求6所述的方法，其中通過滲濾除去還原劑。
9. 權利要求1-8中任意一項所述的方法，其中所述還原劑選自P -巰基乙胺、P-巰基乙醇、谷胱甘肽或半胱氨酸。
10. 權利要求1-9中任意一項所述的方法，進一步包括步驟(c), 其中純化帶有所需數量的效應分子的蛋白質。
11. 權利要求1-10中任意一項所述的方法，其中所述蛋白質為抗 體或其片段。
12. 權利要求ll所述的方法，其中所述蛋白質為抗體Fab'片段。
13. 權利要求11或權利要求12所述的方法，其中效應分子所連 接的至少一個半胱氨酸存在于抗體鉸鏈區中。
14. 權利要求11-13中任意一項所述的方法，其中效應分子所連 接的半胱氨酸各自存在于抗體鉸鏈區中。
15. 權利要求1-14中任意一項所述的方法，其中所述效應分子為PEG。
16. 權利要求15所述的方法，其中所述效應分子為40， 000 PEG-馬來酰亞胺。
全文摘要
本發明提供了連接一個或多個效應分子與蛋白質中一個或多個半胱氨酸的方法，包括a)通過對不能形成分子內二硫鍵的單巰基還原劑或多巰基還原劑滲濾蛋白質來活化蛋白質中的一個或多個半胱氨酸；和b)使處理的蛋白質與效應分子反應。
文檔編號A61K39/395GK101212984SQ200680023411
公開日2008年7月2日 申請日期2006年6月29日 優先權日2005年7月6日
發明者S·P·海伍德 申請人:Ucb醫藥有限公司