專利名稱：一種分子量內標的制備方法及用該方法制備的分子量內標的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別是涉及一種分子量內標及其制備方法。
背景技術：
人類基因組計劃開始以來，基因掃描和基因分型技術發展迅速。在致病基因篩查，疾病基因連鎖和關聯分型，腫瘤等疾病早期診斷、法醫學個體識別等方面都廣泛應用。基因分型技術重要的手段就是利用DNA測序儀或遺傳分析儀分析基因片段的分子量。這類儀器分析分子量時需要一個分子量標準來對樣品進行計算，也就是分子量內標，又稱為分子量內對照(Internal Lane Standard)。
跟傳統的分子量標準(marker)相比，分子量內標屬于內對照，而傳統的分子量標準屬于外對照，內對照與待測樣品在同一泳道電泳，二者運動規律完全一致，因此校對結果更加準確。另外，分子量內標的精確度更高，傳統分子量標準的電泳介質往往是瓊脂糖凝膠和分辨率較低的聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)，分辨率在幾十個bp左右，而分子量內標的電泳介質是測序的PAGE或毛細管電泳膠，分辨能力可以達到1個bp，因此，這就要求分子量內標的自身分子量非常準確，不能有1個堿基的差別。另外，由于需要將待測樣品與分子量標準區分開，分子量內標需要進行熒光標記，才能被儀器識別，并且標記的熒光分子在分析不同標記的樣本時需要不同的標記，而傳統的分子量標準不帶有熒光標記，無法用做內對照。
由于熒光標記的分子量要求分子量精確到1個核苷酸，還需要帶有熒光標記，其制作方法也和傳統分子量標準差別很大。常規的制備分子量標準方法難以得到大量、準確的熒光標記分子量內標。

發明內容
本發明針對上述領域中的不足，提供一種經濟快捷制備分子量內標的方法，同時還提供了由該方法制得的一種全新的分子量內標產品。
一種分子量內標的制備方法，以pUC18質粒為模板，固定上游引物5′GCGAAACCCGACAGGACTA 3′，選取相應距離設計下游引物，擴增得到多個核苷酸片段。
所述下游引物分別為70R5′ACAGGAGAGCGCACGAGG 3′；
80R5′CAGGGTCGGAACAGGAGAG 3′；100R5′GACAGGTATCCGGTAAGCGG 3′；120R5′TTCCCGAAGGGAGAAAGGC 3′；140R5′GCTATGAGAAAGCGCCACG 3′；160R5′CTGAGATACCTACAGCGTGAGC 3′；180R5′AGCGAACGACCTACACCGA 3′；200R5′GTGCACACAGCCCAGCTTG 3′；240R5′TACCGGATAAGGCGCAGC 3′；280R5′GATAAGTCGTGTCTTACCGGGT 3′；320R5′CGCTCTGCTAATCCTGTTACCA 3′；360R5′GCCACCACTTCAAGAACTCTGT 3′；400R5′CAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGT 3′；450R5′ATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCC 3′；490R5′ACAAAAAAACCACCGCTACCA 3′；500R5′CTGCTTGCAAACAAAAAAACC 3′；分別擴增得到70bp，80bp，100bp，120bp，140bp，160bp，180bp，200bp，240bp，280bp，320bp，360bp，400bp，450bp，490bp，500bp片段。
所述擴增反應條件為94℃2min；30cycles94℃20sec，58℃40sec，72℃40sec；70℃10min。
所述上游引物帶有熒光標記物。
所述熒光標記物為ROX，FAM，HEX，JOE，TMR，TET，VIC，LIZ或Cy5。
上述方法制備得到的分子量內標。
本發明通過一個廣泛使用的質粒載體(pUC18)作為DNA模板。用Primer Premier 5.0軟件分析pUC18質粒全序列，(見附錄SEQ ID NO1)發現在其927bp處至1425bp處，ATGC含量均一，沒有特殊二級結構，選取該500bp左右的區域，在上游(5’)設計一條固定引物5′GCGAAACCCGACAGGACTA 3′，在下游設計一系列引物，使擴增產物為一系列核苷酸片段。本發明通過固定上游引物，依次向下設計下游引物的方法得到一系列長度不等的片段。這樣可以降低成本，節約時間，提高工作效率。
上游引物5′GCGAAACCCGACAGGACTA 3′，退火溫度58℃。以上游引物為起點，在其下游相應距離找下游引物的終點，下游引物的長度和序列要保證有較好的特異性同時退火溫度跟上游引物接近，GC含量在20-40％之間，沒有復雜二級結果，與上游引物不能形成二聚體。本發明選擇核苷酸片段的長度分別為70、80、100、120、140、160、180、200、240、280、320、360、400、450、490、500bp，最終確定下游引物序列如下引物名稱引物序列(5′-3′)70R 5′ACAGGAGAGCGCACGAGG 3′80R 5′CAGGGTCGGAACAGGAGAG 3′100R5′GACAGGTATCCGGTAAGCGG 3′120R5′TTCCCGAAGGGAGAAAGGC 3′140R5′GCTATGAGAAAGCGCCACG 3′160R5′CTGAGATACCTACAGCGTGAGC 3′180R5′AGCGAACGACCTACACCGA 3′200R5′GTGCACACAGCCCAGCTTG 3′240R5′TACCGGATAAGGCGCAGC 3′280R5′GATAAGTCGTGTCTTACCGGGT 3′320R5′CGCTCTGCTAATCCTGTTACCA 3′360R5′GCCACCACTTCAAGAACTCTGT 3′400R5′CAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGT 3′450R5′ATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCC 3′490R5′ACAAAAAAACCACCGCTACCA 3′500R5′CTGCTTGCAAACAAAAAAACC 3′通過摸索，最終確定擴增反應條件為94℃2min；30cycles94℃20sec，58℃40sec，72℃40sec；70℃10min。在這一條件下各個片段都能有較高的擴增效率和好的特異性。
由于上游引物一致，下游引物的長度和退火溫度與上游相近，所以全部片段擴增條件都基本一致，可以在同一基因擴增儀上用同一反應程序同時擴增，使得操作更加簡便，節約時間，提高了工作效率，適于大規模制備。
本發明制備分子量內標的過程中上游引物的熒光標記物可以是ROX，也可以時是FAM(羧基熒光素)，HEX(六氯-6-甲基熒光素)，JOE(4，5二氯-6-羧基熒光素)，TMR(4-甲基-6-羧基-羅丹明)或TET，VIC，LIZ，Cy5等熒光標記物，并用這一方法制備分子量內標。由于熒光標記引物合成造價較高，保存時間有限，所以可以只合成上游的固定端引物，這樣可以大大降低引物合成成本和生產成本。
本發明制備得到一種帶有熒光標記的核酸分子量內標，由長度為70、80、100、120、140、160、180、200、240、280、320、360、400、450、490、500bp的16個雙鏈DNA片段組成，每個片段有一條DNA鏈帶有熒光標記物，經過電泳分離后，激光激發產生激發光能夠被熒光檢測儀(如日立FMBIO熒光檢測儀、ABI 3100遺傳分析儀等)檢測到，用來分析同一泳道中目的DNA片段的大小。這種分子量內標可以用來計算和校對長度為70bp到500bp之間的核酸片段的分子量。由于產物帶有熒光素標記，需要在pH大于8.0的緩沖體系中低溫冷凍保存，并且不能夠反復凍融。低pH環境和反復凍融會導致熒光標記物脫落，從而引起檢測信號降低，靈敏度變差。
利用該方法制作的分子量內標是雙鏈DNA分子，其中只有一條帶有熒光標記物，在進行變性凝膠電泳前需要變性成為單鏈分子。一般方法是加入去離子甲酰胺，95℃加熱3-5分鐘變性，迅速置于冰上冷卻3分鐘。
本發明制備的內標可以用于變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細管電泳。


圖1帶有ROX熒光標記的分子量內標電泳圖譜圖2采用本發明作為分子量內標與Goldeneye 16A等位基因階梯共同電泳后檢測分型結果圖3采用Promega公司的ILS600作為分子量內標與Goldeneye 16A等位基因階梯共同電泳后檢測分型結果具體實施方式
實施例1 制備分子量內標1.1設計上游引物并合成ROX標記的上游引物。
選用的DNA模板是pUC18質粒(Takara公司，貨號D3218)。選擇927bp處5′GCGAAACCCGACAGGACTA 3′為上游引物，退火溫度58℃。ABI 394核酸合成儀合成引物，并在引物的5’用ROX標記，HPLC法純化引物。
1.2根據片段長度來設計下游引物。
選擇一系列長度不等片段70、80、100、120、140、160、180、200、240、280、320、360、400、450、490、500共16個片段。還可以是927-1425bp之間長度不等的多個核苷酸片段。ABI 394核酸合成儀合成引物，PAGE純化。下游引物選擇序列如下引物名稱 引物序列(5′-3′)70R 5′ACAGGAGAGCGCACGAGG 3′
80R 5′CAGGGTCGGAACAGGAGAG 3′100R5′GACAGGTATCCGGTAAGCGG 3′120R5′TTCCCGAAGGGAGAAAGGC 3′140R5′GCTATGAGAAAGCGCCACG 3′160R5′CTGAGATACCTACAGCGTGAGC 3′180R5′AGCGAACGACCTACACCGA 3′200R5′GTGCACACAGCCCAGCTTG 3′240R5′TACCGGATAAGGCGCAGC 3′280R5′GATAAGTCGTGTCTTACCGGGT 3′320R5′CGCTCTGCTAATCCTGTTACCA 3′360R5′GCCACCACTTCAAGAACTCTGT 3′400R5′CAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGT 3′450R5′ATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCC 3′490R5′ACAAAAAAACCACCGCTACCA 3′500R5′CTGCTTGCAAACAAAAAAACC 3′1.3摸索擴增反應條件，用該條件擴增得到產物并檢測，擴增反應在Bio-Rad iCycler基因擴增儀上進行。
分別合成上述上游引物及下游引物(ABI 394核酸合成儀完成)，將引物用TE稀釋至10μM，摸索反應體系中引物濃度、模板DNA濃度和Taq酶用量，最終確定反應體系配制方法如下表

退火溫度通過設置溫度梯度，從54、56、58、60℃分別擴增，檢測反應效率和反應特異性，最終確定反應條件是94℃2min；30cycles94℃20sec，58℃40sec，72℃40sec；70℃10min。在這一條件下各個片段都能有較高的擴增效率和好的特異性。
1.4調整產物量，使各個條帶峰值均衡，結果見圖1。
通過調整各個條帶的含量使其達到等摩爾比例，峰值比較均一，ABI 3100遺傳分析儀進行檢測。檢測方法如下1)取0.5μl與9.5μl Hi-Di甲酰胺混合，95℃變性3分鐘，立即置于冰上；2)ABI3100遺傳分析儀檢測(參數設置進樣電壓1千伏，進樣時間15秒，電泳電壓15千伏，電泳時間1400秒)3)各片段峰高大于500RFU，各片段之間高度差異小于10％。
1.5產物純化和冷凍保存。上述經過檢測峰值均衡的DNA片段混合物中含有蛋白和鹽離子，會導致DNA片段降解，不利于長期保存，因此需要將其純化去除雜質。利用天根生化公司的離心柱型DNA純化試劑盒完成，操作方法如下1)將各反應產物混到一起；估計產物的體積，向其中加入10倍體積的結合液，溫和的充分混勻。
2)將上一步所得溶液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室溫放置2分鐘，13000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。
3)向吸附柱中加入700μl的漂洗液，13000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。
4)向吸附柱中加入500μl的漂洗液，13000rpm離心30-60秒，倒掉廢液。
5)將吸附柱重新放回收集管中，13000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫和58℃溫箱數分鐘，徹底晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。
6)取出吸附柱，放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量65-70℃水浴預熱的洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘。13000rpm離心1分鐘，收集溶液。溶液中即含有作為分子量內標的16個DNA片段。
實施例2.用ROX標記的分子量內標分析基因片段并檢驗準確度利用其進行分子量校正分別由FAM，HEX，TMR標記的長度在100-480bp之間的等位基因階梯(基點認知技術(北京)有限公司的Goldeneye 16A身份鑒定試劑盒組分之一)，共包含210個等位基因片段，計算每個片段的平均大小和方差。對照實驗采用美國Promega公司的產品ILS 600(貨號DG2611)分析該等位基因階梯。ILS 600由ROX標記的22條60-600bp的雙鏈DNA組成，其中大小為60-200bp的片段之間相隔20bp，200-500bp的片段之間相隔25bp，500-600bp的片段之間相隔50bp。
電泳檢測在ABI 3100遺傳分析儀上完成，電泳電壓15kV，收集時間1400秒。樣品分別在12個泳道中同時電泳，結束后用gene mapper 3.2軟件分析每個泳道中每個等位基因片段的分子量，然后計算每個片段的分子量標準差。
根據Promega公司提供的產品檢驗標準可知，用內標分析等位基因ladder的片斷大小，重復上樣12次，分析ladder中每個位點的每個基因型的12個數值，取平均數并計算標準偏差(SD)，SD值應小于0.1個堿基，但Penta D，Penta E，FGA和D18S51位點的SD值可在0.1至0.2個堿基之間。用GeneScan軟件和Local Southern Method方法所計算的內標線性方程中，R2的值應大于0.9999。
分析結果表明，用本發明分析等位基因階梯的12次結果，每個片段長度的標準差都小于0.10(0.03-0.07之間)，R2的值為0.999999(3號泳道分析圖譜見圖2)。用ILS 600分析的結果與之相似，每個樣品的標準差小于0.10(0.03-0.07之間)，R2的值為0.999999(3號泳道分析圖譜見圖3)。可見，本發明所制備的內標已經達到了Promega公司的產品檢驗指標，可以用于分子量校對。
附錄SEQ ID NO1(pUC18質粒的全序列)1TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG51 GAGACGGTCA CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG101 TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG151 CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC ACCATATGCG GTGTGAAATA201 CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC ATTCGCCATT251 CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT301 TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA351 ACGCCAGGGT TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA401 GCTTGCATGC CTGCAGGTCG ACTCTAGAGG ATCCCCGGGT ACCGAGCTCG451 AATTCGTAAT CATGGTCATA GCTGTTTCCT GTGTGAAATT GTTATCCGCT501 CACAATTCCA CACAACATAC GAGCCGGAAG CATAAAGTGT AAAGCCTGGG551 GTGCCTAATG AGTGAGCTAA CTCACATTAA TTGCGTTGCG CTCACTGCCC601 GCTTTCCAGT CGGGAAACCT GTCGTGCCAG CTGCATTAAT GAATCGGCCA651 ACGCGCGGGG AGAGGCGGTT TGCGTATTGG GCGCTCTTCC GCTTCCTCGC701 TCACTGACTC GCTGCGCTCG GTCGTTCGGC TGCGGCGAGC GGTATCAGCT751 CACTCAAAGG CGGTAATACG GTTATCCACA GAATCAGGGG ATAACGCAGG801 AAAGAACATG TGAGCAAAAG GCCAGCAAAA GGCCAGGAAC CGTAAAAAGG851 CCGCGTTGCT GGCGTTTTTC CATAGGCTCC GCCCCCCTGA CGAGCATCAC901 AAAAATCGAC GCTCAAGTCA GAGGTGGCGA AACCCGACAG GACTATAAAG951 ATACCAGGCG TTTCCCCCTG GAAGCTCCCT CGTGCGCTCT CCTGTTCCGA1001 CCCTGCCGCT TACCGGATAC CTGTCCGCCT TTCTCCCTTC GGGAAGCGTG1051 GCGCTTTCTC ATAGCTCACG CTGTAGGTAT CTCAGTTCGG TGTAGGTCGT1101 TCGCTCCAAG CTGGGCTGTG TGCACGAACC CCCCGTTCAG CCCGACCGCT1151 GCGCCTTATC CGGTAACTAT CGTCTTGAGT CCAACCCGGT AAGACACGAC1201 TTATCGCCAC TGGCAGCAGC CACTGGTAAC AGGATTAGCA GAGCGAGGTA1251 TGTAGGCGGT GCTACAGAGT TCTTGAAGTG GTGGCCTAAC TACGGCTACA1301 CTAGAAGAAC AGTATTTGGT ATCTGCGCTC TGCTGAAGCC AGTTACCTTC1351 GGAAAAAGAG TTGGTAGCTC TTGATCCGGC AAACAAACCA CCGCTGGTAG1401 CGGTGGTTTT TTTGTTTGCA AGCAGCAGAT TACGCGCAGA AAAAAAGGAT1451 CTCAAGAAGA TCCTTTGATC TTTTCTACGG GGTCTGACGC TCAGTGGAAC1501 GAAAACTCAC GTTAAGGGAT TTTGGTCATG AGATTATCAA AAAGGATCTT1551 CACCTAGATC CTTTTAAATT AAAAATGAAG TTTTAAATCA ATCTAAAGTA1601 TATATGAGTA AACTTGGTCT GACAGTTACC AATGCTTAAT CAGTGAGGCA1651 CCTATCTCAG CGATCTGTCT ATTTCGTTCA TCCATAGTTG CCTGACTCCC1701 CGTCGTGTAG ATAACTACGA TACGGGAGGG CTTACCATCT GGCCCCAGTG1751 CTGCAATGAT ACCGCGAGAC CCACGCTCAC CGGCTCCAGA TTTATCAGCA1801 ATAAACCAGC CAGCCGGAAG GGCCGAGCGC AGAAGTGGTC CTGCAACTTT1851 ATCCGCCTCC ATCCAGTCTA TTAATTGTTG CCGGGAAGCT AGAGTAAGTA1901 GTTCGCCAGT TAATAGTTTG CGCAACGTTG TTGCCATTGC TACAGGCATC1951 GTGGTGTCAC GCTCGTCGTT TGGTATGGCT TCATTCAGCT CCGGTTCCCA2001 ACGATCAAGG CGAGTTACAT GATCCCCCAT GTTGTGCAAA AAAGCGGTTA2051 GCTCCTTCGG TCCTCCGATC GTTGTCAGAA GTAAGTTGGC CGCAGTGTTA2101 TCACTCATGG TTATGGCAGC ACTGCATAAT TCTCTTACTG TCATGCCATC
2151 CGTAAGATGC TTTTCTGTGA CTGGTGAGTA CTCAACCAAG TCATTCTGAG2201 AATAGTGTAT GCGGCGACCG AGTTGCTCTT GCCCGGCGTC AATACGGGAT2251 AATACCGCGC CACATAGCAG AACTTTAAAA GTGCTCATCA TTGGAAAACG2301 TTCTTCGGGG CGAAAACTCT CAAGGATCTT ACCGCTGTTG AGATCCAGTT2351 CGATGTAACC CACTCGTGCA CCCAACTGAT CTTCAGCATC TTTTACTTTC2401 ACCAGCGTTT CTGGGTGAGC AAAAACAGGA AGGCAAAATG CCGCAAAAAA2451 GGGAATAAGG GCGACACGGA AATGTTGAAT ACTCATACTC TTCCTTTTTC2501 AATATTATTG AAGCATTTAT CAGGGTTATT GTCTCATGAG CGGATACATA2551 TTTGAATGTA TTTAGAAAAA TAAACAAATA GGGGTTCCGC GCACATTTCC2601 CCGAAAAGTG CCACCTGACG TCTAAGAAAC CATTATTATC ATGACATTAA2651 CCTATAAAAA TAGGCGTATC ACGAGGCCCT TTCGTC
權利要求
1.一種分子量內標的制備方法，以pUC18質粒為模板，固定上游引物5′GCGAAACCCGACAGGACTA 3′，選取相應距離設計下游引物，擴增得到多個核苷酸片段。
2.根據權利要求1所述的分子量內標的制備方法，所述下游引物分別為70R5′ACAGGAGAGCGCACGAGG 3′；80R5′CAGGGTCGGAACAGGAGAG 3′；100R5′GACAGGTATCCGGTAAGCGG 3′；120R5′TTCCCGAAGGGAGAAAGGC 3′；140R5′GCTATGAGAAAGCGCCACG 3′；160R5′CTGAGATACCTACAGCGTGAGC 3′；180R5′AGCGAACGACCTACACCGA 3′；200R5′GTGCACACAGCCCAGCTTG 3′；240R5′TACCGGATAAGGCGCAGC 3′；280R5′GATAAGTCGTGTCTTACCGGGT 3′；320R5′CGCTCTGCTAATCCTGTTACCA 3′；360R5′GCCACCACTTCAAGAACTCTGT 3′；400R5′CAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGT 3′；450R5′ATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCC 3′；490R5′ACAAAAAAACCACCGCTACCA 3′；500R5′CTGCTTGCAAACAAAAAAACC 3′；分別擴增得至70bp，80bp，100bp，120bp，140bp，160bp，180bp，200bp，240bp，280bp，320bp，360bp，400bp，450bp，490bp，500bp片段。
3.根據權利要求2所述的分子量內標的制備方法，所述擴增反應條件為94℃2min；30cycles94℃20sec，58℃40sec，72℃40sec；70℃10min。
4.根據權利要求1所述的分子量內標的制備方法，所述上游引物帶有熒光標記物。
5.根據權利要求4所述的分子量內標的制備方法，所述熒光標記物為ROX，FAM，HEX，JOE，TMR，LIZ或Cy5。
6.權利要求1至5任一所述的分子量內標的制備方法制備得到的分子量內標。
全文摘要
本發明涉及“一種分子量內標的制備方法及用該方法制備的分子量內標”。一種分子量內標的制備方法，以pUC18質粒為模板，固定上游引物5′GCGAAACCCGACAGGACTA 3′，選取相應距離設計下游引物，擴增得到多個核苷酸片段。本發明通過固定上游引物，依次向下設計下游引物的方法得到一系列長度不等的片段。由于熒光標記引物合成造價較高，保存時間有限，所以可以只合成上游的固定端引物，這樣可以大大降低引物合成成本和生產成本。同時由于上游引物一致，下游引物的長度和退火溫度與上游相近，所以全部片段擴增條件都基本一致，可以在同一基因擴增儀上用同一反應程序同時擴增，使得操作更加簡便，節約時間，提高了工作效率，適于大規模制備。
文檔編號C12N15/11GK101050474SQ20071006471
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月23日 優先權日2007年3月23日
發明者高陽, 陳初光, 馬斌, 王曙光 申請人:鼎生科技(北京)有限公司, 基點認知技術(北京)有限公司