專利名稱：一種抑制骨橋蛋白表達的小分子rna藥物及其表達系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域中一種抑制骨橋蛋白(OPN)表達的方法。
背景技術：
OPN是一分子量為44KD的分泌型糖基化磷蛋白，主要通過與其受體整合素和CD44相互作用，參與多器官多組織的生理病理過程，具有多種功能。研究表明OPN的表達和動脈粥樣硬化、骨質疏松癥、風濕性關節炎、糖尿病及多種腫瘤的發生發展密切相關。
惡性腫瘤已成為引起人類死亡的主要原因，其死亡率僅次于心血管疾病，而腫瘤的轉移是惡性腫瘤死亡率高、預后差的主要原因。很多研究表明細胞中OPN的高表達與惡性腫瘤細胞的轉移潛能密切相關，OPN在腫瘤細胞的黏附、移行、浸潤、血管新生以及腫瘤的微環境中起著關鍵作用。臨床上OPN高表達的腫瘤患者一般復發和轉移率高，預后較差。因此抑制腫瘤細胞中OPN的表達，有可能降低腫瘤細胞的轉移潛能，從而提高腫瘤患者的生存率。
RNAi(RNA interference，RNA干擾)是近幾年發展起來的一種轉錄后基因沉默技術，與反義技術相比其抑制基因表達更有效、特異且持久。RNAi現象由Fire等在線蟲中首次發現并報道，隨后在果蠅、植物和動物細胞中都證實了這種現象的存在。隨后Tuchl等發現體外合成的21bp的siRNA可以在哺乳動物細胞中特異有效的抑制基因表達，不久Brummelkamp等將含有19-29bp的shDNA的表達載體轉染到哺乳動物細胞中，成功轉錄出shRNA并能特異抑制目標基因的表達，之后RNAi技術在抗腫瘤、抗病毒和基因功能研究的領域中都得到了廣泛的應用。
目前在實驗室一般使用合成的dsRNA或shRNA表達載體來實現目標基因的沉默，合成RNA成本高，容易降解，不能長期有效的抑制目標基因的表達；而一些早期開發的RNAi載體如pSilencer和pSUPER等都缺少指示標記和抗性篩選基因，給其使用帶來很多不便。因此我們構建的RNAi載體可以有效的解決這些問題，另外雖也有文獻報道使用RNAi技術在小鼠結腸癌細胞中抑制OPN表達，但我們設計的是針對人的OPN基因的不同抑制位點，并且抑制效果很好。

發明內容
本發明的目的是提供一種抑制骨橋蛋白(OPN)表達的方法。
本發明提供的抑制骨橋蛋白(OPN)表達的方法是使用RNAi技術。
本發明提供了兩條shRNA序列shRNA1CGACTCTGATGATGTAGATGACACTTTCAAGAGAAGTGTCATCTACATCATCAGAGTCGShRNA2GCGAGGAGTTGAATGGTGCATACAATTCAAGAGATTGTATGCACCATTCAACTCCTCGC包含上述兩條shRNA的質粒及其細胞系均屬于本發明的保護范圍。具體的質粒為pcDNA3.0+GFP+U6/OPN-RNAi-1和pcDNA3.0+GFP+U6/OPN-RNAi-2。
質粒的通用結構如圖1所示。
質粒的構建方法為設計三條引物U6-F、U6-R+shRNA1和U6-R+shRNA2，U6-F引物含有BamH I的酶切位點及保護堿基，U6-R+shRNA1和2分別含有shDNA1和shDNA2序列，并且含有Xba I酶切位點和保護堿基。用人的基因組DNA為模板，分別用引物U6-F和U6-R+shRNA1及U6-R+shRNA2進行擴增，得到U6+shRNA的PCR產物，用BamH I和Xba I酶切之后連接到pcDNA3.0的BamH I和Xba I酶切位點之間。EGFP(增強綠色熒光蛋白)插入到pcDNA3.0的Kpn I和BamH I酶切位點之間。
本發明提供了兩種shRNA序列，并在pcDNA3.0的基礎上進行了改造，使之可表達EGFP，可作為更好的轉染標記，不共轉染更方便和經濟。
本發明篩選的含有OPN-shRNA的穩定細胞系為研究OPN在腫瘤轉移過程中的作用機制提供了極好的研究材料，也屬于本發明的保護范圍，并將在惡性腫瘤的治療研究中起到重要作用。


圖1質粒pcDNA3.0+EGFP+U6/OPN-RNAi-1和OPN-RNAi-2的通用圖譜。
圖2穩定細胞系中OPN表達水平檢測圖。
具體實施例方式
實施例1針對OPN基因RNAi載體的構建一、RNA干擾片段的選擇首先從GeneBankTM得到OPN的mRNA序列，根據文獻提供的經驗利用Ambion網站設計siRNA軟件選取了兩條siRNA片段，核苷酸序列如下siRNA1CGACTCTGATGATGTAGATGACACTsiRNA2GCGAGGAGTTGAATGGTGCATACAA根據這兩條siRNA片段和U6啟動子序列設計以下三條引物U6-F’CATGGATCCTCGGGCAGGAAGAGGGCCTAU6-R+shRNA15’-CATTCTAGAAAAAACGACTCTGATGATGTAGATGACACT AGTGTCATCTACATCATCAGAGTCGCGGAATTCCGCGTCCTTTCCACAAG3’U6-R+shRNA25’-CATTCTAGAAAAAAGCGAGGAGTTGAATGGTGCATACAA TTGTATGCACCATTCAACTCCTCGCCGGAATTCCGCGTCCTTTCCACAAG-3’帶有下劃線的為酶切位點，下劃線之前的為保護堿基，方框中為siRNA之間的Loop結構，前后反向互補序列形成shRNA結構。
二、U6+shRNA片段和EGFP的擴增用人的基因組DNA為模板，分別用U6和U6-R+shRNA1或shRNA2進行擴增，得到的產物即為U6啟動子+shRNA片段；用PWEN100為模板，根據EGFP的序列設計引物進行PCR，得到的PCR產物即為EGFP。
三、RNAi載體的構建將載體pcDNA3.0和EGFP分別用Kpn I和BamH I進行雙酶切，酶切后切膠回收目的片段，將載體和EGFP的酶切片段連接。按照常規方法制備大腸桿菌感受態，將連接好的產物進行轉化，涂板后37℃培養過夜，挑出單菌落搖菌培養，提取質粒并用Kpn I和BamH I雙酶切鑒定，陽性克隆進一步用T7引物測序鑒定，擴增并純化陽性克隆，即得到pcDNA3.0+EGFP質粒。
將載體pcDNA3.0+EGFP和U6+shRNA分別用BamH I和Xba I進行雙酶切，回收、連接、轉化及鑒定同上，陽性克隆進一步用U6-F引物測序，擴增并純化陽性克隆，即得到pcDNA3.0+EGFP+U6+shRNA的RNAi載體。
實施例2RNAi載體的轉染和穩定細胞系的篩選以5×104/孔的密度在24孔板上鋪SK-Hep-1細胞，24小時后進行轉染操作。將帶有OPN基因序列的RNAi載體和帶有無關序列的負對照載體各500ng轉染細胞，轉染試劑使用Lipofectamine(Invitrogen)，具體操作步驟見Invitrogen公司脂質體轉染試劑使用說明。轉染48小時后以1∶20的比例傳代轉染細胞，加500ug/ml的G418進行穩定細胞系的篩選，10-14天后在熒光顯微鏡下標記表達綠色熒光蛋白的細胞集落，轉移至孔板繼續擴大培養，凍存能穩定表達綠色熒光蛋白的穩定細胞系，以備繼續研究之用。
實施例3目標基因OPN在穩定細胞系中表達的比較分析提取穩定細胞系及SK-Hep-1的RNA，提取RNA使用試劑RNA提取試劑Trizol(Invitrogen)，具體操作步驟見Invitrogen公司Trizol試劑使用說明。用2ug的RNA進行RT-PCR；RT使用M-MLV逆轉錄酶(Promega)，用隨機引物進行RT，具體見Promega公司的M-MLV逆轉錄酶說明書。PCR時所用OPN引物為根據OPN的Exon序列設計而得，用HPBDG作為內源對照，引物序列如下OPN-FAGCCTTCTCAGCCAAACG OPN-RGACTTACTTGGAAGGGTCTGTGHPBDG-FTCTGGTAACGGCAATGCGGHPBDG-RGCAGATGGCTCCGATGGTG用55℃退火，擴增27個循環，PCR完成之后用1.5％的瓊脂糖凝膠進行電泳，拍照分析，結果見圖2，由圖可知，在含pcDNA3.0+EGFP+U6/OPN-RNAi-1和2的穩定細胞系中，OPN的表達水平都有明顯的下調，而在含負對照載體的穩定細胞系中，OPN的表達水平無變化。
由此可見，本發明中的OPN-RNAi序列和根據pcDNA3.0所改造使用的載體，在體外細胞實驗中能夠有效的抑制目標基因的表達，并可以用于轉染后目標基因下調的穩定細胞系的篩選。因此該RNAi序列可以用來有效的抑制OPN的表達，可以作為一種抑制OPN表達的小分子RNA藥物，故可用于治療與OPN表達密切相關的一些疾病，如動脈粥樣硬化、骨質疏松癥、風濕性關節炎、糖尿病及多種腫瘤等；本發明建立的抑制OPN表達的穩定細胞系及其負對照穩定細胞系也可用來做為研究OPN在肝癌轉移過程中作用機制的模型；本發明改造的RNAi載體也可用于制備研究其它基因功能的試劑或是其它疾病的治療藥物。
權利要求
1.一種抑制骨橋蛋白OPN表達的核苷酸序列，其特征在于其包含有siRNA1或siRNA2序列。
2.按權利要求1所述的一種抑制骨橋蛋白OPN表達的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列是siRNA1或siRNA2。
3.一種抑制骨橋蛋白OPN表達的shRNA，其特征在于其序列如shRNA1或shRNA2所示。
4.一種包含權利要求3所述shRNA的載體。
5.按權利要求4所述的載體，其特征在于所述載體為pcDNA3.0+GFP+U6/OPN-RNAi-1和pcDNA3.0+GFP+U6/OPN-RNAi-2。
6.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，其含有權利要求4或5所述的載體。
全文摘要
本發明公開了一種能抑制骨橋蛋白OPN表達的小分子RNA藥物及其表達系統。本發明提供的抑制OPN表達的方法是RNAi技術，具體提供了兩條能特異抑制OPN表達的shRNA序列，并提供了包含上述兩條shRNA的質粒pcDNA3.0+EGFP+U6/OPN－RNAi－1和OPN－RNAi－2及其構建方法。本發明可用于治療一些與OPN表達密切相關的疾病，如動脈粥樣硬化、骨質疏松癥、風濕性關節炎、糖尿病及多種高轉移性的腫瘤等。本發明改造的RNAi載體也可用于制備研究其它基因功能的試劑或是其它疾病的治療藥物。
文檔編號C12N15/63GK1896235SQ20061003260
公開日2007年1月17日 申請日期2006年1月9日 優先權日2006年1月9日
發明者莊詩美, 程家森, 楊金娥, 張宴 申請人:中山大學