專利名稱：一種臨床質譜診斷試劑的標準物質的試劑盒和方法
技術領域：
本發明涉及一種新的生物樣品中蛋白質分析方法的標準物質及試劑盒。一種通過能與 蛋白質結合的基質去捕獲生物標志，并用有定量控制的質譜分析來檢溯生物標志。在此 提及的此項發明涉及蛋白質檢測領域，為一種新的非侵入性的體外質譜檢測方法。本發明 可以應用到已經脫離人體的體液中的生物標志組合的標準物質檢測方法或標準物質試劑盒開發。背衆技術隨著人類基因組計劃的實施和完成，科學家們提出了后基因組(post-gen咖e)計劃的 概念，研究要點轉移到功能基因組學上，而生物功能主要體現物質是蛋白質。1994年， 澳大利亞Macquarie大學的Wilkins和Williams肖'先提出蛋白質組(proteorae)的概念， 指的是"一種基因組所表達的全部蛋白質"，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部 蛋白質。對于蛋白質組的研究是功能基因組學研究的核心，稱為蛋白質組學(proteomics)。 蛋白質組學被認為是后基R組研究中最主要的部分。與基因組相比，蛋白質組的組成更復 雜，功能更活躍，應用前景更廣泛。蛋白質組學從細胞整體水平進行蛋白質屬性的研究， 如表達水平、翻譯后修飾及相互作用等，并由此獲得對于疾病過程、細胞生理生化特征和 調控M絡的廣泛完整的認識。所以，蛋白質組學技術正在逐步成為生物學、醫學及制藥學 等的重要研究手段。不論是細胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細胞所表達的蛋白質功 能。閔此，鑒定人體內表達的蛋白質的區別，可用于體外疾病樣本診斷及篩査，并最終用 于藥物開發和疾病治療。而要進行蛋白質表達和功能的差異化分析，要求能夠達到分辨細 胞內分子的復雜混合物的程度。但細胞內許多物質往往以微量存在，目前用于分析蛋白的 方法在上述各方面都有局限，用這些常規手段難以進行化學結構及蛋白質序列鑒定分析。 用質譜聯合可克撒這一技術缺點。血液，由于易采集性和對機體的生理狀況的易記錄性，成為研究生物標記物的最好的 來源之一。蛋白指紋圖譜(質譜)技術(MALDI-T0F-MS、 SELDI-TOF-MS)是近幾年發展起 來的實驗室診斷新技術，它且具有操作較簡便、多樣本檢測、檢測快速、靈敏性和特異性
高等優點，是實驗紫診斷技術革命性的進展。蛋白指紋圖譜技術在醫學領域的應用，主要 用于多種疾病，特別是腫瘤的早期診斷。蛋白指紋圖譜技術是一項發展前景非常好的診斷 技術，具有廣闊的臨床應用前景。使用蛋白指紋圖譜技術已經成為研究比較蛋白質組學和 發現生物標記物可選用的方法，尤其在多肽及低分子量蛋白質質譜分析的研究中非常有 用。但是，我們在進行蛋白質質譜分析時發現沒有一個臨床質譜診斷試劑的標準物質的試 劑盒。血液樣本離體后如不及對分離血清(漿)，對結果影響很大，因而及時分離血清(漿) 成為實驗的首要保障。接下來便是血清(漿)樣本的質量和保存的穩定性問題了，這對一 些外院或外地送檢的樣本顯得尤其重要。然而，很少有人就血清樣本的收集過程對研究蛋 白質組的影響做過深入的研究，為此，以下用基于蛋白指紋圖譜技術的方法，對標本的處 理和血液不同儲存條件等因素導致血液中蛋白質質譜的影響做了系統的分析。國家高技術 研究發展計劃(863計劃)在2006年已將人類重要生物標志物圖譜的實驗確證和分析技 術研究列為國家目標導向類專題課題。研究血清(漿)樣品分離、多肽圖譜快速掃描和疾 病特征峰測序等系列用于惡性腫瘤血清標志物圖譜發現的質譜診斷關鍵技術，創建具有自 主知識產權的健康人群和3-4種我國常見惡性腫瘤人群"血清質譜多肽屈譜"的任務即 將拉開戰幕。

發明內容
本發明的目的是建立一種在生物樣品中檢測標準物質的方法。'該方法為疾病的早期檢 測提供了新的途徑，并為進一步發現新的生物標志提供了基礎。本發明涉及一種通過生物標志結合的基質表面，并用定量性質譜分析來同時檢測多種 生物標志狀態。本發明中的生物標志是利用一臺質譜儀來發現的。該設備的質量精確度約為+/-0. 1%。 基質是任何能與生物標志選擇性或特異性結合的物質。舉例說明，WCX陰離子，SAX 陽離子，C8/C18疏水作用基質吸附劑，分離生物化學中的這些方法和由這些方法產生的 吸附劑具有診斷反面的用途(即陰離子吸附劑捕獲陽離子蛋白質，配位共價金屬螯合劑上 滯留說明多肽分析物內存在組氨酸殘基)。底基洗去未吸附的物質。任何適宜的洗液均可 使用。生物標志首先能夠被具有能與生物標志物結合基質吸附表面捕獲，非吸附物能從基質 上洗脫，吸附到底基的生物標志物在質譜儀中被檢測。生物標志通過離子發生源，如激
光，被離子化，產生的離子被一個離子感受集合器收集，然后質量分析器分柝那些通過的 離子。之后，檢測器將檢測的離子信息轉換為質荷比。定量性控制及質譜激光能量調控-每次測試前，用質譜的標準化質控血清，將標準化質控血清中用于定量的標準峰4091. 1Da 或6634.0 Da強度調至50先質譜信號強度的最大值。生物標志的檢測明顯地將與信號強度 的檢測有關。這樣，生物標志的數量與質量都可以被檢測出來。飛行質譜對待分析物的分析生成飛行時間譜。該飛行時間譜的最終分析并不表示離子 化能量攻擊一個樣本產生的單獨的脈沖信號，而是一系列脈沖的信號之和。這樣降低了千 擾，并增加了動態范圍。該飛行時間數據受數據處理軟件的影響。軟件中數據處理主要包 括轉換飛行時間與質荷比而產生質譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過濾高頻噪音而 減輕高頻噪音。通過對生物標志的吸附和檢測而產生的數據可利用計算機的數據分析程序進行分析。 該計算機程序分析這些數據以顯示檢測出的生物標志的數量，并顯示信號的強度和確定被 檢測的每個生物標志的分子量。數據分析還能包括一系列的確定生物標志的信號強度和矯 正數據對預定統計分布狀態的偏離。例如，通過計算與某些參數相關的每個峰值的髙度， 可規范觀測到的峰。該參數可能是由儀器和類似能量吸收分子等化學成分產生的不重要的 T擾，這可以設置調零。計算機可以將計算結果數據轉換成各種形式來表現。其標準譜可以表示，但在一種形 式中只有峰高和質量信息可以在譜帶中保留，產生一個較清晰的圖，并使具有幾乎相同分 子量的生物標志物更易顯現。在另一種形式中，兩個或更多的譜比較，便于突顯獨特的生 物標志物和那些高于或低于校準樣本的生物標志物。分析一般包括展示從待分析物得到的信號的圖譜中峰的鑒定。峰可以通過視圖進行選 擇，軟件是可用的，它可自動檢測峰。 一般情況下，該軟件通過鑒定信號具有信噪比高于 一個選擇閾值并標記出在峰信號的質心處的峰的質量這樣的方式操作。在一個有效的程序 中，比較許多譜錢以認定出現在質譜中某一選定范圍內同樣的一些峰。該軟件的一個版本 聚集所有出現在確定的質量范圍內的各條光譜的峰，對所有在質量(質荷比)中值附近的 峰指定一個質量(質荷比)簇。發明中使用的生物標志是基質所捕。這些生物標記是進一步通過質譜(mass spectrometry)測定其不同分子量來知道它們特定的身份。對生物標志的檢測需要將一個樣本放基質的一個吸附點上，接著進行清洗-電噴1^電 離質譜(electrospray ionizsation mass spectrometry, ESI-MS) ;fe在毛細管的出口處 施加一高電壓，所產生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著裕劑 蒸發，液滴表面的電荷強度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致 使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相。基質輔助激光解析/電離飛行時間質譜 (matrix-assisted laser desorption/ionization time of fight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)的基本原理是向吸附點上加入SINAPINIC酸等并讓其干燥，將分析物分散 在分子中并形成晶體，當用激光照射晶體時，由于基質分子經輻射所吸收的能量，導致能 量蓄積并迅速產熱，從而使基質晶體升華，致使連同分析物一起進入氣相。而后，用質譜 測定法對基質進行分析，而一個顯示了蛋白質分子的遺留物圖將生成，這張圖是在蛋白質 分子的質量-電荷比的基礎上，以彼此分開的峰圖的形式顯示出來的。然而，如果有必要，這些生物標志也可通過，比如，確定多肽的氨基酸序列來進行鑒 別。在蛋白質化學及蛋白質組學研究中，為了增加蛋白質鑒定的可信度，獲得一段蛋白 質肽片段內部序列信息通常是非常重要的。對于蛋白質及多肽的序列測定，傳統的方 法是采用Edman降解方法，而該方法最大的不足之處在于費時太長(一個殘基需花費 30-40分鐘)。近年來，隨著質譜技術的飛速發展，尤其是多級質譜(MS/MS)以及源后 裂解(PSD)等技術的發展，應用質譜測序已成為一種流行的方法。例如， 一個生物標志能用許多酶描繪出來，例如V8蛋白酶(V8 protease)或胰蛋白 酶，而且消化片段(digestion fragments)的分子量可被用來在數據庫中搜索序列，這 些序列與由多種酶生成的消化片斷的分子量相吻合。或者，如果此生物標志不是己知數鋸 庫中的蛋白質分子，在生物標志的N極氨基酸序列(N-terminal Amino Acid Sequence) 的基礎上，可使用降解探針，而后，這些探針會被用來描繪由探測到了生物標志的樣本所 生成的基閑組或cDNA庫。最后，蛋白質生物標志可用蛋白質梯狀排序法(protein ladder sequencing)進行排序。通過將分子碎成碎片并將碎片用酶解作用或其他可按順序從碎片 末端除去一個單個氨基酸分子的方法進行處理后，可生成蛋白質梯度(protein ladders)。 然后，用質譜對此梯度進行分析。階梯狀碎片(ladder fragments)在質量上的差異可鑒 別出從分子末端被除去的氨基酸。閑此，本發明可以用于生物標志鑒定的金標準。特異性是指某一物質或某種疾病的專一屬性，它是代表某種物質或某種疾病的特征。 通過某些特征可以識別某種物質或某種疾病，從而把它和其他物質或疾病區分開來。對專 有特征的識別往往依賴于特殊的檢測方法，例如要了解某種疾病是否存在有特異性抗原就 要用有關特異性抗體來檢測。自蛋白質組學研究有新發展以來，這種傳統意義上特異性檢 測和界定方法有了很大的突破。如一個蛋白質不同片段變異是不同類型腫癯的標志。
本發明利用WCX陰離子基質及利用C8/C18疏水基質芯片/磁珠為例對正常人血清(漿) 進行蛋白質對比分析。定量性控制及質譜激光能量調控每次測試前，用質譜的標準化質 控血清(漿)，將標準化質控血清(漿)中用于定量的標準峰4091. 1Da或6634.0 Da強度 調至50%質譜信號強度的最大值。一種臨床質譜診斷試劑的標準物質的試劑盒和方法的具體操作步驟 以下是用本發明提供的一個操作方案及試劑盒實例。1. 樣品處理及標準化質控血清(漿)制備 將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中，視需要離心澄清樣品。質潛的標準化質控血清(漿)制備定義符合如下標準供血者10人，5男5女，血 型為O型年齡為18-30歲；民族漢。生化指標正常，包括總膽同醇、甘油二酯、空 腹血糖、乙肝表面抗原、肝功檢查、腎功檢查；無遺傳病家族史；無重大傳染病史。女 性不能懷孕，男性為不吸煙者。2. 基質與標準化質控血清(漿)制備、樣品上樣抽取O型血的健康受試者(男女各半)的新鮮血液(a) 4'C下待血液凝圃后馬上離 心，4'C離心5min。 (b) 4。C下馬上離心，4'C離心5min分離血漿。標準物質標準化質 控血清(漿)樣品分裝lOOpl—小管，于一8(TC儲存；或取混合血清(漿)1:2稀釋于U9 緩沖液(9MUrea， 2%CHAPS， 50mM Tris-HCL， pH9.0) —小管，25'C儲存。即成為標準化 質控血清(漿)試劑盒。將質譜的標準化質控血清及樣品點樣在有支持物的基質中的一個 位點上。支持物可用金屬片、玻璃片、陶瓷片、陶瓷珠、磁性珠、多聚體、液相色譜柱子 或S印harose beads等。基質是用于標記、結合血清(漿)的。標記至液相色譜柱子上的 基質可用液相色譜質譜聯用儀(LC-MS)的標準方法丄分析。將質譜的標準化質控0血清 (漿)用于質譜儀試劑盒的定量方法。3. 洗滌用結合緩沖液洗滌。在樣品完全千燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位 點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復以上步驟。以下可 有不同步驟(1) 用水徹底洗滌整個陣列點，自然千燥基質及滯留的生物標志，加0.5pL吸 能分子(以50%乙腈，0. 5%三氟乙酸的制備的飽和標準瀋液)(2) 或用0.05% 1%二氟乙酸徹底洗滌整個陣列點(當用陶瓷珠、磁性珠、多 聚體或S印harose beads為支持物時)，將生物標志洗脫至質譜專用金屬片 (有3x3 nra圓孔)上，自然干燥金屬片，加0. 5 pL吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸制備的飽和標準溶液)。 吸能分子可用Si卿inic acid或alpha-Cyano-4-hydroxycinn柳ic acid等。 3.質譜的定量控制及測試用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀，用氮激光儀(337 nm)和80 cm或120 cm飛行 管分析陣列，或用電噴霧電離已洗脫的生物標志后用液相色譜質譜聯用儀(LC-MS)標準 方法去分析滯留于各位點的生物標志或蛋白質。用計算機分析數據進行數據重疊展示。定量性質譜調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清(漿)，將標準化質控血清中 用于定量的標準峰4091. IDa或6634. 0 Da等強度調至50%信號強度的最大值。本發明將蛋白質分成了幾大類，即WCX陰離子、SAX陽離子、C8/C18疏水作用等蛋白。 這樣，可用質譜儀直接進行分析及定量。本發明可用于體外細胞和非侵入性的體外質譜檢測方法的定量控制，如離體體液的試 劑盒用于臨床疾病的質譜檢測方法。可以檢測多個蛋白質生物標志群及正常人群血清(漿) 質譜多肽圖譜(圖l正常人群血清(漿)質譜多肽圖譜)。所捕獲的生物標志群可來源于已經脫離人體或動物體的血液，體液，分泌物，細胞溶 解物，組織溶解物和器官溶解物。本發明中的試劑盒及方法與其他非侵入性的體外檢測方法比較，具有以下的特點a)準確質譜直接分析有很強的精確性， 一般誤差率只有0. 1 Da。因為蛋白質是由氨基酸組 成的，而氨基酸的平均質量是己知的，如果知道了抗原或生物標志的總分子量，那么抗原 的變異(指氨基酸變化)就很容易被推測出來。(2) 方便本方法將蛋白質分成了幾大類，即陰離子、陽離子、親水、疏水或配位共價金屬螯合 劑作用蛋白(圖l正常人群血清(漿)質譜多肽圖譜)。這樣，可用質譜儀直接進行分析。(3) 快捷用本發明提供的蛋白指紋法進行疾病診斷時，無需對蛋白質進行測序。本發明采用了 計算機"條碼格式"，信號強度沿著線性軸以暗度強度值顯示。此強度可以用掃描儀記錄 并用分析軟件自動分析對比強弱，從而有助于臨床復雜的診斷，如可用此"蛋白指紋"或 條碼格式進行醫學分析(

圖1)。本發明提供的一個試劑盒方法用于質譜檢測定量控制。從而有助于臨床復雜的檢測。 說明書附l正常人群[ftl.清(漿)質譜多肽圖譜。同一樣本同時在蛋白芯片上做8點重復試驗, 所有峰值的CV值均〈10%，顯示了較好的重復性。圖2血清(漿)存放在4'C條件下不同時間對蛋白質譜的影響 圖3血清(漿)反復凍溶對蛋白質譜的影響 圖4用U9稀釋血清(漿)后不同保存時間對蛋白質譜的影響 圖5溶血對蛋白質譜的影響具體實施方式
本發明將結合具體實施例作進一步說明，這些實例僅用于說明目的，而不用于限制本 發明范圍。實施例1貭譜的標準化質控血清(漿)制備(1)實驗方法 一、材料標本來源質譜的標準化質控血清(漿)制備定義符合如下標準，供血者男女各半， 血型為0型；年齡為18-30歲；民族，漢。生化指標正常，包括總膽固醇、甘油三酯、 空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功檢査、腎功檢查；無遺傳病家族史；無重大傳染病史。 女性無懷孕，男性無吸煙史者。抽取IO位O型血的健康受試者(男女各半)的新鮮血液，4t:下待血液凝固后馬上離心，10,000 rpm， 4'C離心5min;樣品的處理和儲存。取混合血 清(漿)lOpl，用20nlU9緩沖液(9M Urea， 2%CHAPS， 50mM Tris-HCL, pH9.0)稀釋， 而后，將以上標本冰浴振蕩30min。將上述變性后標本加入360^1相應的結合緩沖液， 待用。所有樣本均進行雙份檢測以減少實驗誤差。簡要操作步驟將200jal結合緩沖液(50 raM NaAC, pH 4.0)加至己裝好WCX陰離子 芯片的Bioprocessor中，置振蕩器(MSI Minishaker) 400-600 r卿，震
緩沖液。重復上述操作兩次。在芯片處理器每孔中加入lOOpl處理好的標本，置振蕩器 400-600 rpm， 4'C震蕩lh。甩出標本。每孔加入200pl的結合緩沖液，室溫置振蕩器 400-600 rpm,震蕩5min,甩去孔中液體，再次加入結合緩沖液200|n，重復操作一次。 立刻拆開芯片處理器，取出芯片，待丁后，在每個加樣孔上加SPA 0.5 千燥后再重 復加SPA 0. 5 nl —次。或用0. 05% 1%二氟乙酸徹底洗滌整個WCX陰離子磁珠陣列點， 將生物標志洗脫至質譜專用金屬片(有3x3圓圓孔)上，自然T燥金厲片，加0.5^吸 能分子(以50%乙腈，0.5%二氟乙酸制備的飽和標準溶液)。然后用質譜分析閱讀。定量 性控制及質譜激光能量調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清(漿)，將標準化質 控血清(漿)中用于定量的標準峰4091. 1Da或6634.0 Da強度調至50%質譜信號強度的 最大值。數據收集在每次實驗數據收集前，用All-in-one蛋白校正儀器，使蛋白質分子量誤 差<0.1%。數據分析應用t檢驗軟件分析處理所有峰譜，形成蛋白指紋圖譜。所有的圖譜都進 行了標準化，統一到它們自己全部的離子總數(峰血積的總和)。將標準化質控血清中用 于定量的標準峰4091. 1Da或6634. 0 Da強度調至50%信號強度的最大值，并且用最顯著 的峰進行了校正，而后又進行了 "減少基線"，定義蛋白峰(s/n>5，最小的峰強度〉1.6)。 分析了所有700 30000Da之間的蛋白峰，并且仔細檢查了每個相應的峰，計算出峰的平 均數，標準誤差(SD)和變異系數(CV%)。用t檢驗比較配對樣本(溶血與否)的蛋白峰， 計算P值。峰值CV〉309i或者p<0. 01為有顯著性差異。利用C8及C18疏水基質磁珠/芯片的實驗結果與上述WCX陰離子基質磁珠/芯片的實驗結果一致。實施例2分析血清(漿)蛋白質組具有良好的可重復性將上述混合血清(漿)點樣在同一條芯片的8個點上做重復性檢測，分析了血清(漿) 中的多肽及低分子量蛋白質組。如圖l所示，在被定義分析的79個主要峰中，其峰值強 度的變異系數(CV)均在10%以下，說明用這種方法來分析蛋白質組有良好的重復性。實施例3血清(漿)儲存條件不同對蛋白質組的結果影響我們把血清(漿)放置4。C不同的時間0， 2， 4， 6， 8, 12， 24， 72小時，發現在112小時之內，血淸(漿)蛋白質組基本未發生變化，血清(漿)中被定義的79個峰中沒 有一個峰CV>30%。，僅有2個峰值(占2. 5%)CV〉20% 。至4小時，有2個峰(占2. 5%) CV>30% 和5個峰(占6. 4%) CV>20% ; 12小時后，分別有5個峰值(占6. 4%) CV〉3(m和10個峰 值(占12. 7%) CV濕。時間延長至72小時，有10個峰值(占12. 7%) CV雇和19個 峰值(占24. 1%) CV〉20% (圖2)。實施例4反復凍溶對血清(漿)蛋白質組的結果影響將混合血清(漿)樣本一8(TC冰凍2小時以上，然后室溫(25°C)融化放置，反復l, 2， 3， 4次，在每次融化后檢測蛋白質譜峰，發現1次凍融后，在80個定義了的主要蜂 中，沒有1個峰值CV〉309G或者只有1個峰值(占1. 2%) CV>20%。 2次凍融后，有4個峰 值(占5. 0%) CV〉30免和8個(占10. 0%) CV〉20%。經4次反復凍融，發現8個峰值(占 10.0%) CV〉3(m和14個(占17.5%) CV>20% (圖3)。實施例5用U9稀釋血清(漿)后不同保存時間對血清蛋白質組的影響 將混合lili清(漿)和U9緩沖液以1: 2稀釋后室溫(25°C)保存1天，2天至7天， 觀察對血清(漿)蛋白質組結果的影響。發現至24小時在定義的79個主要峰中沒有1個 峰值CV>30%,僅有1個峰(占1. 3%) CV>20%;至48小時，有5個峰值(占6. 4%)和9個 峰(占11. 4%) CV>20%;至第7天，24. 1%的峰值(^>30%和57.0%的峰值(^>20% (圖4)。實施例6溶血對血清(槳)蛋白質組結果的影響隨機選擇了一份血樣分離血清(漿)后又進行機械性溶血得到一份溶血的樣本，同時 進行了蛋白質組學的試驗。發現36.0%的峰經配對1檢驗有顯著性差異(P<0.05)。(圖5)實施例7 —8(TC放置對血清(漿)蛋白質組的結果的影響比較了新鮮血清(漿)和放置于一80'C長達24個月以上的血清蛋白質組的變化，發 現變化很小，沒有1個峰值CV〉309()或者僅有1個峰值CV〉20%。結論在對疾病的生物標志物的發現中，血液應用最為廣泛，但是血液離體后放置在玻璃試 管的過程中，隨著血細胞持續不斷的新陳代謝，細胞膜完整性的改變導致了代謝產物的不
斷釋放，以及血凝塊降解產物的釋放必然會對結果有所影響。丙此我們在進行蛋白質質譜 分析時，采血之后必須立即盡快離心得到血清(漿)。然而即便如此，臨床血清(漿)樣 本也經常由于運送等問題不能被及時檢測。本研究主要是對血清(漿)樣本的儲存穩定性 等作了系統分析，旨在更好地做好蛋白質質譜分析的質量控制。U9緩沖液(9MUrea， 2%CHAPS， 50rnM Tris-HCL， pH9.0)是一種蛋白質裂解液。發現 血清與U9緩沖液以1: 2稀釋后在室溫(25°C)、 24小時內保存具有良好的穩定性，這為 實驗提供了很好的運送及保存方法和便利。溶血導致血細胞的機械性損傷。這在采血和血樣運輸過程中經常會發生。溶血會導致 血液細胞內的物質外逸干擾血清(漿)蛋白質組，引起質譜的分析結果的改變。發現36. 0% 的被定義了的峰p〈0.01，這表明，發生溶血的樣本不能用于蛋白質組的比較，亦不能用 于生物標記物的發現。總之，發現血樣本的質量，儲存情況的變化對蛋白質質譜分析有著 不同的影響。溶血樣本以及在4'C或者25'C放置12小時以上的樣本對于多肽及低分子量 血清(漿)蛋白質組的結果有著很大影響。相比之下，凍溶l次以及4"C或25t:進行短期 儲存，甚至在一8(TC長期儲存或者用U9緩沖液稀釋室溫保存1天以內結果較穩定。本研 究為如何吏好地保證血清(漿)蛋白質質譜分析中血樣本質量以及運輸、保存提供了一個 客觀的依據。利用C8及C18疏水基質磁珠/芯片的實驗結果與上述WCX陰離子基質磁珠/ 芯片的實驗結果一致。建議血液標本的處理、運送、操作及儲存的蛋白質質譜分析的標準條件是4'C下處 理血液標本，2小時內盡快分離血清(漿)及細胞。用U9緩沖液稀釋血清后，可以24小 時內在宰溫下運送或對血清(漿)及芯片結合過程進行操作。血清(漿)可長期儲存在一 8(TC，但限凍溶1次。對溶血標本，應重新取血。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為 參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本 發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定約范圍。
權利要求
1.一種臨床質譜診斷試劑的標準物質的試劑盒和蛋白質分析方法，用標準化質控血清(漿)控制下的定量性質譜分析來檢測。該方法通過以下步驟實現(1)樣品處理及質譜標準化質控血清(漿)制備；(2)基質與血清(漿)結合試劑盒制備、樣品上樣；(3)洗滌；(4)質譜的定量控制及質譜檢測；其中所述步驟(1)將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中。用O型血，男女相等，混合制備質譜的標準化質控血清(漿)；所述步驟(2)將質譜的標準化質控血清(漿)及樣品點樣在有支持物的基質中的一個位點上。支持物可用金屬片、玻璃片、陶瓷片、陶瓷珠、磁性珠、多聚體、液相色譜柱子或Sepharose beads等。基質是任何能與血清選擇性或特異性結合的物質；所述步驟(3)用結合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復以上步驟。用水徹底洗滌整個陣列點，自然干燥基質及滯留的生物標志；或用三氟乙酸徹底洗滌整個陣列點(當用陶瓷珠、磁性珠、多聚體、液相色譜柱子或Sepharosebeads為支持物時)，將生物標志洗脫至質譜專用金屬片或位點上。所述步驟(4)加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制備的飽和標準溶液)用質譜儀去分析滯留與各位點的生物標志或用電噴霧電離已洗脫的生物標志后用質譜儀去分析。本發明用WCX陰離子基質磁珠及用C8/C18疏水基質磁珠對血液進行蛋白質對比分析，用計算機分析血液中質荷比數據。定量性控制及質譜激光能量調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清(漿)，將標準化質控血清(漿)中用于定量的標準峰4091.1Da或6634.0Da強度調至50％質譜信號強度的最大值。
2. 權利要求1所述的基質是用于捕獲多種蛋白質的，所述的分析方法，可以檢測多 個蛋白質生物標志群及正常人群血清(漿)質譜多肽圖譜。
3. 權利要求l所述的蛋白質分析方法，所用的基質包括WCX陰離子、SAX陽離子、親 水、C8/C18疏水或配位共價金屬螯合劑作用吸附劑。
4. 權利要求1所述的分析方法，所捕獲的生物標志群來源于已經脫離人鉢或動H體 的血液，體液，分泌物，細胞溶解物，組織溶解物和器官溶解物。
5. 權利要求1中基質的支持物可以是金屬片、玻璃片、陶瓷片、陶瓷珠、磁性珠、 多聚體、液相色譜柱子或S印harose beads。
6. —種權利要求1所述標準化質控血清(漿)的用途，其特征在于，用于制備質譜 檢測標準物質的試劑盒。
7. —種權利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，它包括 一容器以及裝于容 器中的權利要求6所述的標準物質。標準物質為標準化質控血清(漿)樣品分裝10(Hil 一小管，于—80TC儲存或取混合血清(漿)l:2稀釋于一小管U9緩沖液(9MUrea， 2%CHAPS, 50mM Tris-HCL, pH9.0), 25。C儲存。
8. 如權利要求7所述的試劑盒，其特征于，所述的標準物質:為O型血的血清或血漿。
全文摘要
本發明涉及一種臨床質譜診斷試劑的標準物質的試劑盒和方法。標準物質試劑盒為標準化質控血清(漿)樣品分裝于小管，在-80℃儲存或取混合血清(漿)1∶2稀釋于U9緩沖液在25℃儲存。用標準化質控O型血清(漿)控制下的定量性質譜分析來檢測。本方法精確、方便且快捷。
文檔編號G01N30/00GK101165482SQ20061014051
公開日2008年4月23日 申請日期2006年10月16日 優先權日2006年10月16日
發明者洋 許 申請人:洋 許