一種利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法
【專利摘要】本發明涉及一種利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法，包括定向肽庫的設計、定向肽庫的合成構建、目標蛋白的體外表達純化、定向肽庫與目標蛋白的反應、定向肽庫的肽段洗脫分離、定向肽庫的肽段線性化、線性化肽段的鑒定測序步驟，所述定向肽庫由線性肽或環狀肽組成。運用該方法可篩選鑒定出各種激酶、抗體、蛋白酶以及任何可能與蛋白質結合的分子的結合肽段的一致序列。
【專利說明】一種利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及用于研究化合物與蛋白質相互作用的定向肽庫以及定向肽庫芯片技術，具體涉及到用簡并線性或環狀肽庫來研究單個化合物與蛋白質相互作用的一致序列，以及用高通量的方法系統性地研究各種蛋白質信號基團之間的特異性作用。
【背景技術】
[0002]許多生物學過程通過蛋白質與其他化合物的相互作用來進行，包括酶和底物的結合(比如激酶，蛋白酶，磷酸酶與它們的底物的結合)，抗原抗體反應，受體與配體的相互作用，以及蛋白特定結構域的相互作用例如SH2結構域與含有磷酸酪氨酸的靶蛋白的相互作用。分析某種物質結合的特異性，比如酶結合的特異性，通常的方法是鑒定其作結合的一系列自然底物所含有的序列特征，通過比較不同的底物的序列，確定該酶所識別結合的一致序列。例如，蛋白激酶的特異性在于在體內和體外識別的底物磷酸化位點。多種研究表明，底物磷酸化位點附近的氨基酸殘基決定了體內蛋白激酶是否能對其進行識別。一旦通過實驗證明了某種序列特征，根據此一致序列所設計合成的一系列將每個氨基酸殘基逐個突變的肽段進行實驗，分析磷酸化反應的Km和Vmax的變化。
[0003]然而，用這種經典的方法來鑒定蛋白結合的特異性有嚴重的局限性。其過程花費的人力物力巨大，假定的結合序列上每一個氨基酸殘基都要做突變。而且，如果突變不能覆蓋所有其他氨基酸的可能性，理論上則沒有達到最優化的實驗組合。比如，要確定一個9?
12個氨基酸組成的肽段上的激酶活性位點，按傳統的嘗試將達到大約2010的組合方式，即1.024X 1013的可能性。另外，傳統的方法往往由于底物的不確定性而無法實施。比如，細胞外的信號激活了多種激酶，造成了多種底物的磷酸化，哪種激酶磷酸化哪種底物很難確定。一個更難解決的難題是在鑒定某種蛋白尤其是酶的底物結合特異性時，它們的體內底物往往是低豐度的，體內的方法往往很難做檢測。
[0004]尋找特殊蛋白的抑制劑也為臨床的應用提供了便利。例如淋巴細胞的激活和人類疾病密切相關，包括移植反應，自身免疫疾病和感染。T細胞的激活需要一些酪氨酸激酶的激活。尋找這些激酶的抑制劑在臨床上有極大意義。肽段作為小分子能夠作為藥物進入細胞并發揮作用，然而目前還沒有很好的酪氨酸激酶抑制劑，天然存在的結合底物往往不是最佳的結合底物，如何設計出最佳的結合序列作為藥物的應用是難點。
[0005]綜上，鑒定某個蛋白的相互作用結合特異性序列很有意義，也迫切需要更簡便的方法。本發明利用定向的簡并線性或環狀肽庫，來篩選特定蛋白所結合的一致序列。環狀肽庫是對線性肽庫的改進。線性肽庫中的肽段由天然的a-氨基酸組成，缺點在于，這種暴露的線性肽段不能很好地模擬相對較大的蛋白的靶結合序列的空間構像。此外，由天然氨基酸構成的線性肽段在體內很容易被蛋白酶所降解。因此，用于鑒定化合物之間結合序列的新型的肽庫和改進的方法的研制很有必要。

【發明內容】
[0006]為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法。
[0007]為解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下:
[0008]一種利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法，包括定向肽庫的設計、定向肽庫的合成構建、目標蛋白的體外細胞表達、定向肽庫與目標蛋白的反應、定向肽庫的肽段洗脫分離、定向肽庫的肽段線性化、線性化肽段的鑒定測序步驟，其特征在于:所述定向肽庫由線性肽或環狀肽組成，所述線性肽是由(Xaa)n-Zaa-(Xaa)mK示的氨基酸組成的多肽，所述環狀肽是由環-((Xaa)n-Zaa-(Xaa)m-R-R')所示的氨基酸組成的多肽；其中，Xaa代表任何天然或非天然的a-氨基酸，Zaa代表非簡并的天然或非天然的a_氨基酸，t匕如，針對激酶的底物磷酸化位點特異性序列的肽庫，其非簡并的氨基酸可以是酪氨酸，絲氨酸或者蘇氨酸。R-V是環狀肽的連接處，當需要線性化肽段時可將該連接處切開。η和m代表O?10個氨基酸數目。環狀肽由線性肽經過肽鍵環化而成，線性肽庫也可以用來進行該技術的操作，但環狀肽為優化的方法。
[0009]本發明的定向肽庫是指由某些位置的氨基酸序列固定的肽段和其他位置具有各種組合的環狀肽段形成的庫或者是由線性肽段組成的庫。肽庫的簡并性決定了其多樣性，比如在只有兩個位置簡并的肽庫中，包含了 400個唯一肽段(202)，然而，在8個位置簡并的庫中，大約包括2.5父101°個唯一肽(208)。
[0010]本發明的進一步的技術方案，采用BOP/HOBt化學反應偶聯法合成可溶性的線性肽或可溶性的環狀肽或在固定支持相上直接合成線性肽或環狀肽，采用Na-FMOC封閉法保護線性肽或環狀肽的氨基酸，環狀肽在R-R,處連接成環，在環狀肽庫的簡并位置，加入等量的不同種的已用Na-FMOC封閉的氨基酸于反應體系中。
[0011]優選的，所述固定支持相為纖維素膜，使用超精密針頭在每張大小為8X 12cm的SPOT膜上點樣1600個肽段，每個點樣的肽段產量約為5nmol。也可將合成的帶生物素的多妝庫點在芯片上。
[0012]優選的，所述肽段合成的長度為5?25個氨基酸，優選7?15個氨基酸長度，9?11個氨基酸的長度為最佳。羧基端加上其他氨基酸修飾可以促進肽的溶解度，例如多聚賴氨酸的尾巴。為了測序的準確性，可在氨基酸末端加上其他氨基酸，例如在N端可加上Met-Ala雙肽。根據需要可以進行修飾的改進，例如在篩選肽段作為抑制劑時，可以在肽段上連入穿膜肽，提高肽段的跨膜特性。
[0013]本發明的進一步的技術方案，目標蛋白的體外表達純化的方法是用細菌或真核細胞來表達便于純化的融合蛋白，以GST為優。用昆蟲細胞表達GST-目標融合蛋白，昆蟲細胞用裂解液裂解，所述裂解液包括20mM Tris pH8.0，150mMNaCl，10%甘油，2mM EDTA，lmM苯甲基磺酰氟化物PMSF，0.15U/mL抑肽酶，20mM亮肽酶素，ImM 二巰基蘇糖醇DTT和1%乙基苯基聚乙二醇，隨后用谷胱甘肽親和柱純化目標蛋白，如GST-SLK1，GST-cyclin B_Cdc2和GST-cyclin A-⑶K2，目標是降低激酶和肽的分離難度或者避免蛋白酶不純的問題。
[0014]本發明的進一步的技術方案，就蛋白激酶的底物而言，所述定向肽庫與目標蛋白的反應體系為:將純化的目標蛋白加入300 μ L含有Img線性肽或環狀肽混合物的溶液中，所需各種因子的濃度為 IOOmM ΑΤΡ，包含約 6 X IO5Cpm 的[y-32P]ATP, ImM DTT，IOmM MgCl2和 50mM ρΗ7.0 的 Tris，室溫孵育 IOmin0[0015]本發明的進一步的技術方案，所述定向肽庫的肽段洗脫分離的步驟是:肽段混合物以pH5.5-6.0的高鹽溶液(如50mM MES，IM NaCl，pH5.5)上柱子，在這種條件下，磷酸化后的肽段結合金屬離子柱，而非磷酸化的肽段直接流過柱子，然后柱子用PH6.0的低鹽溶液(如pH6.0的50mM MES)洗去非磷酸化肽段的非特異結合以及多余的鹽離子，最后，以pH8.0的洗脫溶液(如500mM NH4CO3, pH8.0)洗脫結合的磷酸化肽段。
[0016]如果目標蛋白不是激酶，可將純化蛋白固定在經磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)平衡后的瓊脂糖珠子上，形成柱子，再與300 μ L含有Img的多肽庫以親合作用的方法富集與純化蛋白結合的多肽。
[0017]本發明的進一步的技術方案，所述定向肽庫的肽段線性化是由溴化氫打斷肽鍵或由蛋白酶切割。
[0018]本發明的進一步的技術方案，所述線性化肽段的鑒定采用Edman降解法或質譜法自動化測序。
[0019]測序之后，對于每個簡并位置的氨基酸，用下列的公式計算得到相對豐度:
[0020]
【權利要求】
1.一種利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法，包括定向肽庫的設計、定向肽庫的合成構建、目標蛋白的體外表達純化、定向肽庫與目標蛋白的反應、定向肽庫的肽段洗脫分離、定向肽庫的肽段線性化、線性化肽段的鑒定測序步驟，其特征在于:所述定向肽庫由線性肽或環狀肽組成，所述線性肽是由(Xaa)n-Zaa-(Xaa)m所示的氨基酸組成的多肽，所述環狀肽是由環-((Xaa)n-Zaa-(Xaa)m-R-R')所示的氨基酸組成的多肽；其中，Xaa代表任何天然或非天然的a-氨基酸，Zaa代表非簡并的天然或非天然的a_氨基酸，R-Ri是環狀肽的連接處，η和m代表O?10個氨基酸數目。
2.根據權利要求1所述的利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法，其特征在于:采用BOP/HOBt化學反應偶聯法合成可溶性的線性肽或可溶性的環狀肽或在固定支持相上直接合成線性肽或環狀肽，采用Na-FMOC封閉法保護線性肽或環狀肽的氨基酸，環狀肽在R-R,處連接成環，在環狀肽庫的簡并位置，加入等量的不同種的已用Na-FMOC封閉的氨基酸于反應體系中。
3.根據權利要求2所述的利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法，其特征在于:所述固定支持相為纖維素膜。
4.根據權利要求1所述的利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法，其特征在于:所述線性肽或環狀肽的肽段長度為5?25個氨基酸。
5.根據權利要求1所述的利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法，其特征在于:目標蛋白的體外表達純化的步驟為:用昆蟲細胞表達GST-目標融合蛋白，昆蟲細胞用裂解液裂解，所述裂解液包括20mM Tris pH8.0,150mM NaCl，10%甘油，2mM EDTA, ImM苯甲基磺酰氟化物PMSF，0.15U/mL抑肽酶，20mM亮肽酶素，ImM 二巰基蘇糖醇DTT和1%乙基苯基聚乙二醇，隨后用谷胱甘肽親和柱純化目標蛋白。
6.根據權利要求1所述的利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法，其特征在于:所述定向妝庫與目標蛋白的反應體系為:將純化的目標蛋白加入300 μ L含有Img線性肽或環狀肽混合物的溶液中，所需各種因子的濃度為IOOmM ATP,包含約6 X IO5Cpm的[Y -32pJATP, ImM DTT，IOmM MgCl2 和 50mM ρΗ7.0 的 Tris,室溫孵育 IOmin0
7.根據權利要求1所述的利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法，其特征在于:所述定向肽庫的肽段洗脫分離的步驟是:肽段混合物以ΡΗ5.5-6.0的高鹽溶液上金屬離子柱，然后柱子用ΡΗ6.0的低鹽溶液洗去非磷酸化肽段的非特異結合以及多余的鹽離子，最后，以ΡΗ8.0的洗脫溶液洗脫結合的磷酸化肽段。
8.根據權利要求1所述的利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法，其特征在于:所述定向肽庫的肽段線性化是由溴化氫打斷肽鍵或由蛋白酶切割。
9.根據權利要求1所述的利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法，其特征在于:所述線性化肽段的鑒定采用Edman降解法或質譜法自動化測序。
【文檔編號】G01N33/68GK103513039SQ201310290034
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年7月10日 優先權日:2013年7月10日
【發明者】松陽洲 申請人:廣州美格生物科技有限公司