專利名稱：：免疫組質譜檢測個體化腫瘤生物標志及療效試劑盒和方法
技術領域：
：本發明涉及一種新的生物樣品中蛋白質分析方法，一種通過能與抗體結合的基質去捕獲生物標志，并用有定量控制的質譜分析來檢測生物標志。在此提及的此項發明涉及疾病檢測領域，為一種新的非侵入性的體外檢測方法。更確切地講，此發明涉及到生物標志(biomarkers)，而這些抗原或生物標志能被以更高的特異性和靈敏度的抗體組及定量控制的質譜將多種疾病一次性區分出來。免疫組質譜技術特別對評估傳統腫瘤標記物陰性的惡性腫瘤及腫瘤治療療效監測具有重要意義。本發明可以應用到已經脫離人體體液中個體化腫瘤病人的生物標志及監測腫瘤療效的檢測方法或試劑盒開發。
背景技術：
：隨著人類基丙組計劃的實施和完成，科學家們提出了后基肉組(past-genome)計劃的概念，研究要點轉移到功能基因組學上，而生物功能主要體現物質是蛋白質。1994年，澳大利亞Macquarie大學的Wilkins和Williams首先提出蛋白質組(proteome)的概念，指的是"一種基閑組所表達的全部蛋白質"，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質。對于蛋白質組的研究是功能基因組學研究的核心，稱為蛋白質組學(pr,)teomic、s)。蛋白質組學被認為是后基閑組研究中最主要的部分。與基岡組相比，蛋白質組的組成更復雜，功能更活躍，應用前景更廣泛。蛋白質組學從細胞整體水平進行蛋白質屬性的研究，如表達水平、翻譯后修飾及相互作用等，并由此獲得對于疾病過程、細胞生理生化特征和調控網絡的廣泛完整的認識。所以，蛋白質組學技術正在逐步成為生物學、醫學及制藥學等的重要研究手段。目前蛋白質組學技術在實驗診斷與臨床醫學中己經得到越來越多的應用。在蛋白質組學中以下三項技術的進步對于實驗診斷與臨床醫學研究進展將具有決定性的影響。蛋白質的分離技術在蛋白質組學中應用分離技術有兩個目的。第一、通過將蛋白質的混合物分離成單一蛋白質或蛋白質小組以簡化復雜的蛋白質混合物；第二、通過標記的方法可以比較兩個蛋白質的混合物樣品中蛋白質的不同表現。其中主要的技術有雙向電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)、高效液相層析(high-performanceliquidchromatography，HPLC)、毛細管電泳(capillaryelectrophoresis,CE)、親和層析(affinitychoromatography)、蛋白芯片(proteinmicroarray)、磁性微球(magneticbeads)禾ff免疫組等。特別是蛋白芯片和磁性微球兩項新的蛋白指紋圖譜技術克服了以往技術的缺點，具有高靈敏度、高通量、結果重復性好(CV<510%)、可機械化操作和方法靈活等特點。待測樣品來源廣泛，不需作特殊前處理，可以直接點樣檢測，如血清、尿液及組織液等；檢測快速，一般一例標本的檢測時間僅需約5分鐘，從標本制備到出結果全過程僅約1小時。蛋白芯片和磁性微球兩項新的蛋白指紋圖譜技術有可能在體液中潛在腫瘤標志(tumormarker)檢測方面創造革命性突破。生物質譜(biologicalmassspectrometry)技術生物質譜是化學領域中非常重要的一種分析方法。它通過測定分子質量和相應的離子電荷實現對樣品中分子的分析。19世紀末科學家已經奠定了這種方法的基礎，1912年科學家第一次利用它獲得對分子的分析結果。在質譜分析領域，已經出現了幾項諾貝爾獎成果，其中包括氫同位素氘的發現(1934年諾貝爾化學獎成果)和碳60的發現(1996年諾貝爾化學獎成果)。不過，最初科學家只能將它用于分析小分子和中型分子，由于生物大分子比水這樣的小分子大成千上萬倍，因而將這種方法應用于生物大分子難度很大。美國科學家約翰芬恩與日本科學家田中耕一在傳統的質譜分析法基礎上發明了一種新方法對生物大分子的質譜分析法。首先將成團的生物大分子拆成單個的生物大分子，并將其電離，使之懸浮在真空中，然后讓它們在電場的作用下運動。不同質量的分子通過指定距離的時間不同，質量小的分子速度快些，質量大的分子速度慢些，通過測量不同分子通過指定距離的時間，就可計算出分子的質量。蛋白質組學常用的生物質譜有五種1.電噴霧電離質譜(electrosprayionizsationmassspectrometry,1':SI-MS)是在毛細管的出口處施加一高電壓，所產生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發，液滴表面的電荷強度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相。電噴霧離f化的特點是產生高電荷離子而不是碎片離子，使質量電荷比(masstochargeratio,m/z)降低到多數質量分析儀器都可以檢測的范圍，因而大大擴展了分子量的分析范圍，離子的真實分子質量也可以根據質荷比及電荷數算出。2.基質輔助激光解析/電離飛行時間質譜(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeoffightmassspectroTietry，MALDI-TOF-MS)的基本原理是將分析物分散在基質分子中并形成晶體，當用激光照射晶體時，由于基質分子經輻射所吸收的能量，導致能量蓄積并迅速產熱，從而使基質晶體升華，致使連同分析物一起進入氣相。MALDI-T0F-MS所產生的質譜圖多為單電荷離子，岡而質譜圖中的離F與多肽和蛋白質的質量有一一對應關系。MALDI-TOF-MS與蛋白芯片分離技術聯合應用即為表面增強激光角率吸/電離飛行時間質譜(surfaceenhancedlaserdesorption/ionizationtimeoffightmassspectrometry,SELDI-TOF-MS)。3.快原子轟擊質譜(fastatombomebardmentmassspectrometry'FABMS)是-一禾中軟電離技術，應用快速惰性原子射擊存在于底物中的樣品，使樣品離子濺出進入分析器。這種軟電離技術適于極性強、熱不穩定的化合物的分析，特別適用于多肽和蛋白質等的分析研究。4.同位素質譜是一種開發和應用比較早的技術，被廣泛地應用于各個領域，但它在醫學領域的應用只是近幾年的事。由于某些病原菌具有分解特定化合物的能力，該化合物又易于用同位素標示，人們就想到用同位素質譜的方法檢測其代謝物中同位素的含量以達到檢測該病原菌的A的，同時也為同位素質譜在醫學領域的應用開辟了一條思路。5.免疫組質譜(immunomicmassspectrometry,IMS)是質譜與抗體分離技術聯合應用。免疫組質譜檢測(immunomicmass'spectrometryana]ysis,IMSA)的定義為一組.多種(類)抗體與質譜聯合來精確地鑒別變異或修飾生物標志群的方法。在一個抗體組基質上同時捕獲多個生物標志，并對捕獲的變異的或修飾的生物標志進行質譜精確分析。可以同時檢測多個生物標志群。免疫組質譜檢測的主要優點為節省生物標志的排序鑒定及鑒別變異或修飾的生物標志。蛋白質數據庫技術蛋白質組學的發展離不開蛋白質數據庫的發展及檢索方法的改進，同時由F蛋白質組學的發展，使得蛋白質數據庫日益豐富。數據庫的專一性和綜合性越來越強，而且通過生物信息學的應用，可以對多個不同的數據庫進行銜接。蛋白質組學常用的數據庫按研究內容可以分為兩類，結構蛋白質數據庫和系統蛋白質數據庫。結構蛋白質數據庫包括蛋白質結構及蛋白質功能等數據庫，這類蛋白質數據庫主要提供蛋白質的序列、功能、主要結構等信息以幫助鑒定蛋白質，如NCBInr,Ge叩印t,SwissProt,OwlanddbEST等數據庫。系統蛋白質數據庫包括雙項凝膠電泳及蛋白指紋圖譜庫等，這類蛋白質數據庫主要提供生命體各個系統或器官的總體蛋白質系統動態變化幫助對某個系統內或疾病中的全景的蛋白質水平進行觀察。不論是細胞的正常功能還是病理特性都在-一定程度上取決于細胞所表達的蛋白質功能。因此，鑒定人體內表達的蛋白質的區別，可用于體外疾病樣本診斷及篩查，并最終用于藥物開發和疾病治療。而要進行蛋白質表達和功能的差異化分析，要求能夠達到分辨細胞內分子的復雜混合物的程度。但細胞內許多物質往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規手段難以進行化學結構及蛋白質序列鑒定分析。免疫組質譜檢測可克服這一技術缺點。本發明用免疫組質譜檢測可同時檢測出多種(三種以上)的生物標志的方法。如，血庫篩查要求特異性地檢測出常見病毒微生物疾病的已知標記。但是，制備特異性結合標記并且能在復雜的混合物中鑒別出標記的試劑需要大量時間，這阻礙了此類體外i會斷試劑盒方法的發展。目前，還沒有一種方法能夠將四種以上疾病標志物同時檢出。ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay)試劑盒等利用抗體可以用于檢測一種疾病標志物。利用抗體及三色免疫熒光，最多可以做到檢測三種疾病標志物，但三種以.l:.疾病標志物就無法同時檢測。利用抗體組與質譜儀聯合應用，即可以解決同時鑒別三種以上的病毒或微生物抗原標志物。舉例講，將抗HBV(HBsAg)抗體，抗HCV抗體，抗HIVp24antigen(RibasSGetal.Performanceofaquantitativehumanimmunodeficiencyvirustype1p24antigenassayonvariousHIV-lsubtypesforthefollow-upofhumanimmunodeficiencytype1seropositiveindividuals.JVirolMethods2003;113:29-34)及抗梅毒抗體(anti-treponemal17kDaprotein)(GeorgeRetal.Ananalysisofthevalueofsomeantigen-antibodyinteractionsusedasdiagnosticindicatorsinatreponemalWesternblot(TWB)testforsyphilis.JClinLabImmunol1998:50:27-44)等抗體聯合標記至ProteinA或G的支持物(磁性珠子、芯片等)上。由于每種特異體抗體捕獲生物抗原的分子量是不同的，故ProteinA/(;-抗體與質譜儀聯合應用時，質譜儀就非常容易地將這四種抗原同時分開了。由此推理，如果同時選擇四種以上的抗體，而這四種以上抗體所結合的抗原分子量是不同的，則本發明可同時區分四種以上不同種類的疾病。本發明可以檢測窗口期的獻血者，這比單純的ELISA抗體試劑盒更安全(LauDT，etal.ArapidimmunochromatographicassayforhepatitisBvirusscreening.JViralH印at2003:10:331-334)。另外，本發明的方法可同時檢測出多種變異的生物標志。免疫組質譜檢測的應用是一種高靈敏度、高準確性的檢測方法，它能從一個不同成分的混合體系中檢査和區分不同組分、不同分子量(差別在1或2個氨基酸之間)的生物標志(蛋白質)。將來，它可能成為臨床上許多疾病檢測的新模式，作為臨床檢査的常規方法。舉例，血清纖維蛋白肽A及變異的纖維蛋白肽A，應用以往方法不能確定哪種肽類片段與發病有關，現在可以用免疫組質譜檢測，將其中這種組分和它們的分子量清晰區分開來，并找到與該病發病有關的特殊組分，這是分子醫學的革命。本發明的方法可同時檢測出多種修飾生物標志。修飾的生物標記群指的修飾蛋白質為甲基化、乙酰化、羥基化、磷酸化修飾等。在人類腫瘤的發生發展過程中，過去對腫瘤臨床檢測一直停留在細胞水平上，丙此臨床醫生長期盼望的真正意義上的早期診斷(如實體瘤在尚未形成包塊以前，白血病在骨髓細胞檢查不能確診以前)是不可能實現的。
發明內容本發明的目的是建立一種在生物樣品中檢測正常人與某科或多種疾病在離體血液中生物標志的方法。此發明涉及到生物標志(biomarkers)，而這些生物標志能被用來以更高的特異性和靈敏度將某種或多種疾病患者同時區分出來。該方法為疾病的早期檢測提供了新的途徑，并為進一步發現新的變異的或修飾的生物標志提供了基礎。免疫組質譜檢測(lmmunomicmassspectrometryanalysis,IMSA)的定義為一組多種(類)抗體與質譜聯合來精確地鑒別變異的或修飾生物標志群的方法。免疫組質譜技術特別對評估傳統腫瘤標記物陰性的惡性腫瘤及腫瘤治療療效監測具有重要意義。本發明涉及一種通過標記特異性抗體組至能與抗體結合的基質表面，并用定量性質譜分析來同時檢測某種疾病的多種生物標志或多種疾病狀態。生物標志群可以是不變異的、變異的、修飾的。變異的的生物標志群是指變異蛋白質為增加或減少一個或多個氨基酸。修飾的生物標記群是指修飾蛋白質為甲基化、乙酰化、羥基化、磷酸化修飾等。本發明中的生物標志是利用一臺質譜儀來發現的。該設備的質量精確度約為+/-0.1%。基質是任何能與抗體選擇性或特異性結合的物質。舉例說明，ProteinA和G基質吸附抗體Fc段的功能。具有吸收劑功能的ProteinA和G底基與抗體結合，抗體結合血清中生物標志。經過一段足夠的時間使生物標志能與抗體-ProteinA和G結合。底基洗去未吸附的物質。任何適宜的洗液均可使用。生物標志首先能夠被具有能與生物標志物結合的抗體-基質吸附表面捕獲，非吸附物能從基質上洗脫，吸附到底基的生物標志物在質譜儀中被檢測。生物標志通過離子發生源，如激光，被離子化，產生的離子被一個離子感受集合器收集，然后質量分析器分析那些通過的離子。之后，檢測器將檢測的離子信息轉換為質荷比。定量性控制及質譜激光能量調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清，將標準化質控血清中用于定量的標準峰4091.1Da或6634.0Da強度調至50%質譜信號強度的最大值。生物標志的檢測朋顯地將與信號強度的檢測有關。這樣，生物標志的數量與質量都可以被檢測出來。飛行質譜對待分析物的分析生成飛行時間譜。該飛行時間譜的最終分析并不表示離子化能量攻擊一個樣本產生的單獨的脈沖信號，而是一系列脈沖的信號之和。這樣降低了干擾，并增加了動態范圍。該飛行時間數據受數據處理軟件的影響。軟件中數據處理主要包括轉換飛行時間與質荷比而產生質譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過濾高頻噪音而減輕高頻噪音。通過對生物標志的吸附和檢測而產生的數據可利用計算機的數據分析程序進行分析。該計算機程序分析這些數據以顯示檢測出的生物標志的數量，并顯示信號的強度和確定被檢測的每個生物標志的分子量。數據分析還能包括一系列的確定生物標志的信號強度和矯正數據對預定統計分布狀態的偏離。例如，通過計算與某些參數相關的每個峰值的高度，可規范觀測到的峰。該參數可能是由儀器和類似能量吸收分子等化學成分產生的不重要的干擾，這可以設置調零。計算機可以將計算結果數據轉換成各種形式來表現。其標準譜可以表示，但在一種形式中只有峰高和質量信息可以在譜帶中保留，產生一個較清晰的圖，并使具有幾乎相同分子量的生物標志物更易顯現。在另一種形式中，兩個或更多的譜比較，便于突顯獨特的生物標志物和那些高于或低于校準樣本的生物標志物。分析一般包括展示從待分析物得到的信號的圖譜中峰的鑒定。峰可以通過視圖進行選擇，軟件是可用的，它可自動檢測峰。一般情況下，該軟件通過鑒定信號具有信噪比高于一個選擇閾值并標記出在峰信號的質心處的峰的質量這樣的方式操作。在一個有效的程序中，比較許多譜線以認定出現在質譜中某一選定范圍內同樣的一些峰。該軟件的一個版本聚集所有出現在確定的質量范圍內的各條光譜的峰，對所有在質量(質荷比)中值附近的峰指定一個質量(質荷比)簇。免疫組質譜檢測質譜與抗體分離技術聯合應用即為免疫組質譜(Immimomicmassspectrometry,IMS)。免疫組質譜檢測(I,unomicmassspectrometryanalysis,IMSA)為一組多種(類)抗體與質譜聯合來精確地鑒別變異或修飾生物標志群的方法。在一個抗體組基質上同時捕獲多個生物標志，并對捕獲的變異的或修飾的生物標志進行質譜精確分析。可以同時檢測多個生物標志群(biomarkers)。目前F丄ISA等技術主要依靠間接的化學或放射測定法，丙而無法直接鑒定抗原的變異，而用免疫組質譜技術能測定抗原變異片段的分子量。另外，還可以將多種疾病的特異性抗原的抗體同時標在一個基質點上。即用質譜同時可檢測多種疾病特異性抗原的分子量(如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒)，及進行窗口期檢査，而ELISA技術及免疫熒光技術無法做到。免疫組質譜分析發現對傳統腫瘤標記物CA153、CA125、AFP和CEA等表達陰性的腫瘤檢測陽性，故免疫組質譜技術特別對評估傳統腫瘤標記物陰性的個體化惡性腫瘤有更大的意義，由于每種特異性抗體所捕獲生物抗原的分子量是不同的，故免疫組與質譜聯合應用時，質譜儀就非常容易地將這四種抗原同時分開了。用三種以上抗體組與質譜聯合，可同時檢測出多種(三種以上)的生物標志及一種或一種以上變異的或修飾的生物標志。這樣產生了一種新型可用質譜儀直接進行分析多種(三種以上)生物標志及一種或一種以上變異或修飾生物標志的方法。三色免疫熒光法可以同時分析二種生物標志，但無法達到三種以上的生物標志的分析或像免疫組質譜檢測來精確地、高效地確定一種變異的或修飾的被分析物(抗原或生物標志)。這些生物標志組合可以用于同時鑒別正常人及不同種類疾病的檢測方法。本發明發現分子量為1465土15Da、8938土15Da、11683土15Da、8707土15Da生物標志的變化對腫瘤治療療效監測具有重要意義。通過這組峰的鑒別，本實驗中腫瘤治療后有效病人的血清生物標志組合為陰性。目前用于臨床疾病治療療效監測的方法和評估預后的指標多為宏觀和粗略的。如根據腫瘤包塊大小變化，陰影消失與否；血象和生化指標的改變；根據骨髓中原始幼稚細胞的百分比作為判斷白血病緩解與否的指標；有時還采用的是回顧性分析指標。因此，難以反映疾病本身本質變化規律，在一定程度h缺乏客觀性。根據疾病生物標志類型分型和含量的改變，更符合客觀實際，更有助于臨床治療。發明中使用的生物標志是被抗體所捕。這些生物標記是進一步通過質譜(massspectrometry)測定其不同分子量來知道它們特定的身份。對生物標志的檢測需要將一個樣本放基質的一個吸附點上，接著進行清洗。電噴霧電離質譜(electrosprayionizsationmassspectrometry,ESI-MS)是在毛細管的出口處施加一高電壓，所產生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發，液滴表面的電荷強度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相。基質輔助激光解析/電離飛行時間質譜(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeoffightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)的基本原理是向吸附點上加入SINAPINIC酸等并讓其干燥，將分析物分散在分子中并形成晶體，當用激光照射晶體時，由于基質分子經輻射所吸收的能量，導致能量蓄積并迅速產熱，從而使基質晶體升華，致使連同分析物一起進入氣相。而后，用質譜測定法對基質進行分析，而一個顯示了蛋白質分子的遺留物圖將生成，這張圖是在蛋白質分子的質量-電荷比的基礎上，以彼此分開的峰圖的形式顯示出來的。因為本項發明中的生物標志是通過質譜和抗體基質來標識的，閑而它們可通過質譜測定法進行檢測而直接知道它們特定的身份。這種方法比抗體為基礎的ELISA及免疫熒光法更準確。然而，如果有必要，這些生物標志也可通過，比如，確定多肽的氨基酸序列來進行鑒別。在蛋白質化學及蛋白質組學研究中，為了增加蛋白質鑒定的可信度，獲得一段蛋白質肽片段內部序列信息通常是非常重要的。對于蛋白質及多肽的序列測定，傳統的方法是采用Edman降解方法，而該方法最大的不足之處在于費時太長(一個殘基需花費30-40分鐘)。近年來，隨著質譜技術的飛速發展，尤其是多級質譜(MS/MS)以及源后裂解(PSD)等技術的發展，應用質譜測序已成為一種流行的方法。例如，一個生物標志能用許多酶描繪出來，例如V8蛋白酶(V8protease)或胰蛋白酶，而且消化片段(digestionfragments)的分子量可被用來在數據庫中搜索序列，這些序列與由多種酶生成的消化片斷的分子量相吻合。或者，如果此生物標志不是已知數據庫中的蛋白質分子，在生物標志的N極氨基酸序列(N-terminalAminoAcidSequence)的基礎上，可使用降解探針，而后，這些探針會被用來描繪由探測到了生物標志的樣本所生成的基因組或cDNA庫。最后，蛋白質生物標志可用蛋白質梯狀排序法(proteinladdersequencing)進行排序。通過將分子碎成碎片并將碎片用酶解作用或其他可按順序從碎片末端除去一個單個氨基酸分子的方法進行處理后，可生成蛋白質梯度(proteinladders)。然后，用質譜對此梯度進行分析。階梯狀碎片(ladderfragments)在質量上的差異可鑒別出從分子末端被除去的氨基酸。因此，本發明可以用于生物標志鑒定的金標準。特異性是指某一物質或某種疾病的專一屬性，它是代表某種物質或某種疾病的特征。通過某些特征可以識別某種物質或某種疾病，從而把它和其他物質或疾病區分開來。對專有特征的識別往往依賴于特殊的檢測方法，例如要了解某種疾病是否存在有特異性抗原就要用有關特異性抗體來檢測。自蛋白質組學研究有新發展以來，這種傳統意義上特異性檢測和界定方法有了很大的突破。如一個蛋白質不同片段變異是不同類型腫瘤的標志。根據基丙到蛋白質表達的復雜過程，一種特異性基岡的產物一蛋白質必定有相關多組分蛋白質的表達。通過對這些不同組分的檢測形成一個綜合模式圖(蛋白指紋質譜圖)，將這種圖譜(如某種腫瘤)與其他圖譜(如正常人或其他疾病)相比較，進而識別這種特異蛋白(如腫瘤抗原或其片段)，從而將正常人與患某種疾病病人區分開來。免疫組質譜檢測個體化腫瘤生物標志及療效試劑盒和方法的具體操作步驟以下是用本發明提供的一個操作方案及試劑盒實例。1.樣品處理及標準化質控血清制備將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中，視需要離心澄清樣品。質譜的標準化質控血清制備定義符合如下標準供血者10人，5男5女，血型為0型；年齡為18-30歲；民族漢。生化指標正常，包括總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功檢査、腎功檢査；無遺傳病家族史；無重大傳染病史。女性不能懷孕，男性為不吸煙者。2.基質與多種抗體結合制備、樣品上樣將質譜的標準化質控血清及樣品點樣在有支持物的基質中的一個位點上。樣品來于血液，體液，分泌物，細胞溶解液，組織溶解物和器官溶解物。支持物可用金屬片、玻璃片、陶瓷片、陶瓷珠、磁性珠、多聚體、液相色譜柱子或毛細管電泳柱子等。基質是用于標記、結合多種抗體的。抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。無限量地增加抗體組來達到無限量地檢測多個或多種生物標志物或抗原標記(只須生物標志的分子量差異在質譜檢測誤差率內)。將合成的變異的或修飾的生物標志免疫小鼠，待免疫反應出現后，從外周血中分離B細胞。用ELISA法篩選出效價最高的單抗株，大量制備，并從培養上清中提取所需抗體。此抗體可用于制備檢測變異或修飾生物標志的所需試劑盒。基質與多種抗體結合制備試劑盒的方法可用任何能與抗體結合的方法及任何能與抗體選擇性或特異性結合的物質，舉例用蛋白A和G(ProteinAandG)標記的S印harosebeadst基質與抗體Fc段結合；用Carbodiimide方法(CarbodiimideMethod)將.帶有carboxylate-groups標記的磁性珠上基質與抗體的氨基端(amino-groups)結合(GmnDL,etal.PreparationofsensitiveandstableerythrocytesbythecarbodiimidemethodforthedetectionofprimaryandsecondaryIgMandIgGantibody.J[mmunolMethods.1972;1(4):381-389.);用str印tavidin標記的基質與biotin標記的抗體結合用MEPHyperCel標記的陶瓷珠與抗體結合(throughhighcapacityandhighselectivityinteractionandthecooperativeinfluenceofathioethergroup);等等方法。多種抗體標記至液相色譜柱子或毛細管電泳上的基質可用液相色譜質譜聯用儀(LC-MS)的標準方法去分析。可以將質譜的標準化質控血清用于質譜儀試劑盒的定量方法。3.洗滌用結合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復以上步驟。以下可有不同步驟(1)用水徹底洗滌整個陣列點，自然千燥基質及滯留的生物標志，加0.5)aL吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸的制備的飽和標準溶液)；(2)或用0.05%1%三氟乙酸徹底洗滌整個陣列點(:當用陶瓷珠、磁性珠、多聚體為支持物時)，將生物標志洗脫至質譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片，加0.5吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸制備的飽和標準溶液)；(3)或用電噴霧電離質譜(液相色譜柱子或毛細管電泳柱子為支持物時)。吸能分子可用Sinapinicacid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamicacid等。3.質譜的定量控制及測試用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀，用氮激光儀(337nm〕和80cm或120cm飛行管分析陣列，或用電噴霧電離己洗脫的生物標志后用液相色譜質譜聯用儀(L(:-MS)標準方法去分析滯留于各位點的生物標志或蛋白質。串聯四極桿質譜或線性離子阱質譜來鑒定修飾的與變異的的生物標志及多肽denovo的測序。用計算機分折數據進行數據重疊展示。定量性質譜調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清，將標準化質控血清在WCX磁珠中用于定量的標準峰4091.1Da或6634.0Da等強度調至50%信號強度的最大值。本發明可用于體外細胞和非侵入性的臨床疾病體外檢測方法，如離體體液的試劑盒用于臨床疾病的檢測方法。本發明發現分子量為1465土15Da、8938土15Da、11633土15Da、8707土15Da生物標志的變化區分正常人、腫瘤生物標志群變異表達具有重要意義。通過這組峰的鑒別，本實驗中82例胃癌病人(其中CEA陰性37例)、98例肝癌病人(其中AFP陰性53例)、86例乳腺癌病人(其中CA153陰性43例)、38例卵巢癌病人(其中CA125陰性27例)、36例膀胱癌病人、92例結直腸癌病人(其中CEA陰性37例)的血清生物標志組合陽性。該方法的靈敏度為100%，有個體化生物標志組合特征，可檢測傳統腫瘤標記物CA125、CA153、AFP和CEA陰性的腫瘤。腫瘤的傳統腫瘤標記物CA125、CA153、AFP和CEA的靈敏度為21%至60%。免疫組質譜分析發現對CA125、CA153、AFP和(;EA表達陰性的惡性腫瘤檢測陽性，故免疫組質譜技術特別對評估傳統腫瘤標記物陰性的惡性腫瘤有更大的意義。將1465土15Da、8938土15Da、11683土15Da、8707土15Da生物標志用多級質譜(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白質梯狀排序法(proteinladdersequencing)進行排序。通過將分子碎成碎片，可生成蛋白質梯度(proteinladders)。然后，用質譜對此梯度進行分析。鑒別出腫瘤生物標志為變異表達的生物標志群(A)1465+15Da:FPA-degAla(纖維蛋白肽A其氨基端除去了丙氨酸)序列FPAfragment(1465.7Da,DSGEGDFLAEGGGVR)。(B)8938+15Da:C3a-degArg(補體C3a其C端除去了精氨酸)序列N端Ser-Val-Gln-Leu—Thr—Glu—Lys-Arg-Met—Asp—Lys—Val—Gly—Lys-Tyr-Pro—Lys-Glu—Leu-Arg-Lys-Cys-Cys-Glu-Asp-Gly-Met-Arg-Glu-Asn-Pro-Met-Arg-Phe-Ser-Cys-Gln-Arg-Arg-Thr-Arg-Phe-Ile-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Cys-Lys-Lys-Val-Phe-Leu-Asp-Cys-Cys-Asn-Tyr-Ile-Thr-Glu-Leu-Arg-Arg-Gln-His-Ala-Arg-Ala-Ser-His-Leu-Gly-Leu-AlaC端。(C)11683i15Da:變異的血清淀粉樣蛋白A序列N端RSFFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGGVWAAEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPAGLPEKYC丄山順o變異的血清淀粉樣蛋白AMolecularMass:11683Da(D)8707+15Da:ApoA-II(載脂蛋白A-II)序列QAKEPCVESLVSQYFQTVTDYGKDLMEKVKSPELQAEAKSYFEKSKEQLTPLIKKAGTELVNFLSYFVELGTQPATQ變異的ApoA-IIMolecularMass:8707Da，pi:5.1抗體及質譜聯合，可省去變異的生物標志群的排序鑒定。將變異的生物標記FPA-degAla，C3a-degArg，血清淀粉樣蛋白A，ApoA-1[合成、制備抗體。選治療有效的腫瘤病人，發現分子量為1465土15Da、8938土15Da、11683土15Da、8707i15Da生物標志的變化(圖1-4)對腫瘤治療療效監測具有重要意義。通過這組峰的鑒別，本實驗中腫瘤治療有效病人上述的血清生物標志組合為陰性。此結果表明，該方法可用于療效評估。本發明中的試劑盒及方法與其他非侵入性的體外檢測方法比較，具有以下的特點(1)準確及精確用多種抗體及質譜聯合精確檢測多種生物標志方法的一個特點是能夠從復雜的樣品混合物中準確地分辨出分析物。抗體與抗原結合的準確率超過35%。這是ELISA及免疫熒光試劑盒等的基楚。免疫組質譜分析發現對傳統腫瘤標記物CA125、CA153、AFP和CEA等表達陰性的惡性腫瘤檢測陽性，故免疫組質譜技術特別對評估傳統腫瘤標記物陰性的惡性腫瘤有更大的意義。質譜直接分析有很強的精確性，一般誤差率只有0.1Da。因為蛋白質是由氨基酸組成的，而氨基酸的平均質量是已知的，如果知道了抗原或生物標志的總分子量，那么抗原的變異(指氨基酸變化)就很容易被推測出來。但ELISA及免疫熒光試劑盒無法知道抗原的變異。所以，用抗體及質譜聯合精確檢測生物標志方法可提供被分析物(抗原或生物標志)化學或結構特征的直接信息。舉例己知纖維蛋白肽A分子的分子量為1536Da，化學結構為16個氨基酸(N端Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端)。纖維蛋白肽A的抗體與質譜儀聯合應用發現分子量為1536Da的纖維蛋白肽A。則10()%可確定被分析物是纖維蛋白肽A，即最精確鑒別(金標準)。用纖維蛋白肽A的抗體與質譜儀聯合應用發現被分析物是分子量為1465土1Da變異的纖維蛋白肽A。則化學結構可以(從N端至C端)推測為15個氨基酸N端Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Va二-ArgC端。即抗體及質譜聯合，可省去變異的纖維蛋白肽A的排序鑒定(實施例1及實施例2)。(2)便于聯合檢測用三種以上抗體組標在基質上與質譜聯合，可同時檢測出多種(三種以上)的生物標志及一種或一種以上變異的或修飾的生物標志。這樣產生了一種可用質譜儀直接進行分析多種(三種以上)的生物標志及一種或一種以上變異的或修飾的生物標志的方法(實施例1)。三色免疫熒光法可以同時分析三種生物標志，但無法達到三種以上的生物標志的分析或像抗體與質譜聯合來精確地、高效地確定一種變異的或修飾的被分析物(抗原或生物標志)。基質可用任何能與抗體選擇性或特異性結合的物質。(3)快捷用本發明提供的多種已知抗體組及質譜聯合精確檢測多種生物標志方法進行多種疾病檢測時，無需對蛋白質進行測序即可知"變異的或修飾的生物標志"。不像免疫熒光法試劑盒，一個試劑盒最多可同時標記三種抗體，無法知道"變異的或修飾的生物標志"。本發明提供的一個多種抗體試劑盒方法用于質譜來同時檢測，可不限于三種抗體。從而有助于臨床復雜的檢測，如可用此法進行免疫組質譜檢測個體化腫瘤病人離體體液的生物標志及監測腫瘤療效的的應用。免疫組質譜技術特別對評估傳統腫瘤標記物陰性的惡性腫瘤及腫瘤治療療效監測具有重要意義。說明書附圖圖1腫瘤治療前后變異的纖維蛋白肽A的一個特征峰圖2腫瘤治療前后變異的載脂蛋白A-II的一個特征峰圖3腫瘤治療前后變異的補體C3a的一個特征峰圖4腫瘤治療前后變異的血清淀粉樣蛋白A的一個特征峰具體實施例方式本發明將結合具體實施例作進一步說明，這些實例僅用于說明目的，而不用于限制本發明范圍。實施例1免疫組質譜檢測個體化腫瘤生物標志試劑盒和方法的應用(1)實驗方法一、材料1.標本來源A.102例正常人對照組；B.82例胃癌病人(其中CEA陰性37例)；C.98例肝癌病人(其中AFP陰性53例)；D.86例乳，泉癌病人(其中CA153陰性43例)；E.38例卵巢癌病人(其中CA125陰性27例)；F.36例膀胱癌病人；G.92例結直腸癌病人(其中CEA陰性37例)。2.質量控制A.人標準化質控血清B.質譜激光能量調控每次測試前，用上述標準化質控血清。3.基質含已標記的等量抗體抗FPA(纖維蛋白肽A)、抗C3a(補體C3a)、抗ApoA-lI(載脂蛋白A-II)、抗血清淀粉樣蛋白A。二、方法1.樣品的收集全血采集后吸取血清，置于一8(TC保存；-3(TC冰箱中取出血清樣品，置冰盒上融解；以10,000轉/分，4。C離心2分鐘；取上清液。2.樣品的準備每個吸附劑支持物點需要血清lW，將血清用緩沖液稀釋，將樣品充分混勻。3.樣品檢測上樣，在吸附劑支持物(基質，如磁珠，含己標記的等量抗體抗纖維蛋白肽A、抗補體3a、抗載脂蛋白A-II、抗血清淀粉樣蛋白A)中加入處理好的樣品，置振蕩器，400-600轉/分，震蕩3060分鐘。加入200W的結合緩沖液X2。加入200WHPLC水X1。取出吸附劑支持物后，待干后，樣品加入O.5u1的SINAPINIC酸(5mg/mL50呢乙腈；0.5%三氟乙酸)，任其自然干燥。4.將上述樣品加入質譜中，就會生成飛行時間質譜圖譜。外部使用多肽分子質量標準來校正質量精確性。實驗結果用統計學方法，通過分析血清蛋白指紋峰，發現下述生物標志可以用于區分正常人、個體化腫瘤病人離體體液的生物標志的變異表達(表一)。表一、區分正常人、腫瘤生物標志群表達<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>發現分子量為1465土15Da、8938土15Da、11683土15Da、8707i15Da生物標志的變化區分正常人、腫瘤生物標志群變異表達(圖1-4治療前)具有重要意義。通過這組峰的鑒別，本實驗中82例胃癌病人(其中CEA陰性37例)、98例肝癌病人(其中AFP陰性53例)、86例乳腺癌病人(其中CA153陰性43例)、38例卵巢癌病人(其中CA125陰性27例)、36例膀胱癌病人、92例結直腸癌病人(其中CEA陰性37例)的血清生物標志組合陽性。此結果表明，該方法的靈敏度為100%，有個體化生物標志組合特征，可檢測CA125、C/U53、AFP和CEA陰性的腫瘤。腫瘤的CA125、CA153、AFP和CEA靈敏度為21%至60%。免疫組質譜分析發現對CA125、CA153、AFP和CEA表達陰性的惡性腫瘤檢測陽性，故免疫組質譜技術特別對評估傳統腫瘤標記物陰性的惡性腫瘤有更大的意義。實施例2腫瘤生物標志群的排序鑒定將1465土15Da、8938土15Da、11683土15Da、8707土15Da生物標志用多級質譜(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白質梯狀排序法(proteinladdersequencing)進行排序。通過將分子碎成碎片，可生成蛋白質梯度(proteinladders)。然后，用質譜對此梯度進行分析。鑒別出生物標志為變異表達的生物標志群實驗結果(A)1465t15Da:FPA-degAla(纖維蛋白肽A其氨基端除去了丙氨酸)序列FPAfragment(1465.7Da,DSGEGDFLAEGGGVR)(B)8938土15Da:C3a-degArg(補體C3a其C端除去了精氨酸)序列N端Ser-Val—Gln-Leu-Thr-Glu-Lys—Arg-Met—Asp-Lys—Val-Gly—Lys-Tyr-Pro-Lys-Glu-Leu-Arg-Lys-Cys-Cys-Glu-Asp-Gly-Met-Arg-Glu-Asn-Pro-Met-Arg-Phe-Ser-Cys-Gln-Arg-Arg-Thr-Arg-Phe-Ile-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Cys-Lys-Lys-Val-l)he-Leu-Asp-Cys-Cys-Asn-Tyr-Ile-Thr-Glu-Leu-Arg-Arg-Gin-His-Ala-Arg-Ala-Ser-His-Leu-Gly-Leu-AlaC端。(C)11683土15Da:變異的血清淀粉樣蛋白A序列N端RSFFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGGVWAAEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPAGLPEKYC端。變異的血清淀粉樣蛋白AMolecularMass:11683Da(D)8707土15Da:ApoA-II(載脂蛋白A-II)序列1QAKEPCVESLVSQYFQTVTDYGKDLMEKVKSPELQAEAKSYFEKSKEQLT51PLIKKAGTELVNFLSYFVELGTQPATQ變異的ApoA-IIMolecularMass:8707.9Da,pi:5.1用實施例1，即抗體及質譜聯合，可省去變異的生物標志群的排序鑒定。實施例3變異的或修飾的生物標記抗體的制備變異的或修飾的生物標記的合成合成FPA-degAla，C3a-degArg，變異的血.清淀粉樣蛋白A，變異的ApoA-II。將合成的變異的生物標記免疫小鼠，待免疫反應出現后，從外周血中分離B細胞。用溶血噬菌斑分析法選擇并分離出能分泌所需抗體的單個淋巴細胞。將單個細胞擴增至1X10'個以上，用QuicktiiRNAPurificationKit提取mRNA。以提取的mRNA為模板，合成cDNA鏈。以此cDNA為模板，加入鼠抗體重鏈可變區(V,,)通用引物，輕鏈可變區(V,)通用引物，進行聚合酶鏈反應，獲得擴增的V基因片段和Vl基因片段。將擴增產物在15g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定和分離。用gLassmilk回收擴增的Vh基因片段和Vl基因片段。與等摩爾嘗試的LimkerPrimerMix混合，進行聚合酶鏈反應，連接Vii和V,。擴增產物分離純化后，獲得特異性單鏈抗體(ScFV)。此ScFV可用于制備檢測所需DNA片。將此擴增產物兩端加限制性酶切位點，純化定量后，連接到P""載體上。將連接產物轉化感染大腸桿菌T()PIO。經藍白斑篩選及酶切鑒定，篩選出重組質粒。在96孔板形成單克隆抗體。用ELISA法篩選出效價最高的單克隆抗體株，大量制備，并從培養上清中提取所需抗體。此抗體可用于制備檢測所需試劑盒。實施例4免疫組質譜檢測腫瘤治療療效的試劑盒和方法材料4.標本來源A.102例正常人對照組；B.82例胃癌病人(其中CEA陰性37例)；C.98例肝癌病人(其中AFP陰性53例):D.86例乳腺癌病人(其中(〕A153陰性43例);E.38例卵巢癌病人(其中CA125陰性27例)；F.36例膀胱癌病人；G.92例結直腸癌病人(其中CEA陰性37例)。5.質量控制A.人標準化質控血.清B.質譜激光能量調控每次測試前，用上述標準化質控血清。6.基質含已標記的等量抗體抗FPA(纖維蛋白肽A)、抗C3a(補體C3a)、抗ApoA-II(載脂蛋白A-n)、抗血清淀粉樣蛋白A。方法1.樣品的收集全血采集后吸取血清，置于一8(TC保存；-30卩冰箱中取出血清樣品，置冰盒上融解以IO，OOO轉/分，4'C離心2分鐘；取上清液。2.樣品的準備每個吸附劑支持物點需要血清lW，將血清用緩沖液稀釋，將樣品充分混勻。3.樣品檢測上樣，在吸附劑支持物(基質含己標記的等量抗體抗纖維蛋白肽A、抗補體3a、抗載脂蛋白A-II、抗血清淀粉樣蛋白A)中加入處理好的樣品，置振蕩器，400-600轉/分，震蕩3()60分鐘。加入200W的結合緩沖液X2。加入200WHPLC水X1。取出吸附劑支持物后，待干后，樣品加入O.5ul的SINAPINIC酸(5mg/mL50%乙腈；0.5%三氟乙酸)，任其g然干燥。4.將上述樣品加入質譜中，就會生成飛行時間質譜。外部使用多肽分子質量標準來校正質量精確性。實驗結果用統計學方法，通過分析，發現下述生物標志可以用于檢測腫瘤治療療效(表二)。表二、腫瘤治療有效的病人<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>選治療有效的腫瘤病人，發現分子量為1465土15Da、8938土15Da、11683土15Da、8707土15Da生物標志的變化(圖卜4)對腫瘤治療療效監測具有重要意義。通過這組峰的鑒別，本實驗中腫瘤治療有效病人上述的血清生物標志組合為陰性。此結果表明，該方法可用于療效評估。目前用于臨床疾病治療療效監測的方法和評估預后的指標多為宏觀和粗略的。如根據腫瘤包塊大小變化，陰影消失與否；血象和生化指標的改變；根據骨髓中原始幼稚細胞的百分比作為判斷白血病緩解與否的指標；有時還采用的是回顧性分析指標。W此，難以反映疾病本身本質變化規律，在一定程度上缺乏客觀性。如果根據疾病生物標志類型和含量的改變，可能更符合客觀實際，更有助于臨床治療。本發明涉及一種通過被抗體組吸附表面基質上捕獲的生物標志，用標準化質控血清控制下的定量性質譜分析來檢測。在一個抗體組基質上同時捕獲多個生物標志，并對捕獲的變異的或修飾的生物標志進行質譜精確分析。可以同時檢測多個生物標志群。本發明的方法可用于檢測己經脫離人體的體液中的生物標志組合。這些生物標志組合可以用于同時鑒別正常人及個體化腫瘤病人離體體液的生物標志及監測腫瘤療效的試劑盒及新檢測方法。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用參考，就如同每一篇文獻被單獨弓I用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。權利要求1.一種用含有抗體組的基質去捕獲生物樣品中生物標志的分析方法，其特征是采用免疫組質譜法對樣品中已被抗體組捕獲的生物標志進行精確地鑒別、檢測的方法。該方法通過以下步驟實現(1)樣品處理及質譜標準化質控血清制備；(2)基質與多種抗體結合試劑盒制備、樣品上樣；(3)洗滌；(4)質譜的定量控制及質譜測試；其中所述步驟(1)將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中。用O型血，男女相等，混合制備質譜的標準化質控血清；所述步驟(2)將質譜的標準化質控血清及樣品點樣在有支持物的基質中的一個位點上。支持物可用金屬片、玻璃片、陶瓷片、陶瓷珠、磁性珠、多聚體、液相色譜柱子或毛細管電泳柱子等。基質是任何能與抗體選擇性或特異性結合的物質；所述步驟(3)用結合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復以上步驟。用水徹底洗滌整個陣列點，自然干燥基質及滯留的生物標志；或用三氟乙酸徹底洗滌整個陣列點(當用陶瓷珠、磁性珠、多聚體、液相色譜柱子或毛細管電泳柱子為支持物時)，將生物標志洗脫至質譜專用金屬片或位點上。所述步驟(4)加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制備的飽和標準溶液)用質譜儀去分析滯留與各位點的生物標志或用電噴霧電離已洗脫的生物標志后用質譜儀去分析。用計算機分析數據。2.權利要求l所述的基質是用于捕獲多種抗體的，抗體是用于捕獲已知的生物標志。所述的生物標志的分析方法，可以檢測多個的、變異的或修飾的生物標志群。3.權利要求1所述的生物標志的分析方法，所捕獲的生物標志群來源于已經脫離人體的血液。4.用權利要求1的方法分析生物樣品中特異的生物標志以檢測正常與腫瘤個體化生物標志的方法。5.用權利要求2的方法，可以同時檢測出多種腫瘤的生物標志及一種或多種氨基酸變異的生物標志的方法。6.權利要求5中所述生物標志及序列為1465i1Da(纖維蛋白肽A其氨基端除去了丙氨酸)、8938土1Da(補體C3a其C端除去了精氨酸)、]1683土1Da(變異的血清淀粉樣蛋白A)和8707土1Da(變異的載脂蛋白A-11)。7.權利要求1中基質的支持物可以是金屬片、玻璃片、陶瓷片、陶瓷珠、磁性珠、多聚體、液相色譜柱子或毛細管電泳柱子。8.—種權利要求6所述的生物標志的用途，其特征在于，用于制備檢測變異或修飾的腫瘤個體化生物標志及療效評估的試劑盒。9.一種權利要求8所述的檢測變異或修飾生物標志的試劑盒，其特征在于，它包括一容器以及裝于容器中的權利要求8所述的檢測多種變異或修飾生物標志序列的抗體及抗體組。10.如權利要求9所述的試劑盒，其特征于，所述的抗體(組)為單克隆抗體(組)或多克隆抗體(組)。全文摘要本發明涉及一種通過被抗體組吸附表面基質上捕獲的生物標志，用標準化質控血清控制下的定量性質譜分析來檢測。免疫組質譜(Immunomicmassspectrometry，IMS)檢測的定義為一組多種(類)抗體與質譜聯合來精確地鑒別變異的或修飾生物標志群的方法。在一個抗體組基質上同時捕獲多個生物標志，并對捕獲的變異的或修飾的生物標志進行質譜精確分析。可以同時檢測多個生物標志群。本發明的方法可用于檢測已經脫離人體的體液中的生物標志組合。本發明特別對評估傳統腫瘤標記物陰性的惡性腫瘤及腫瘤治療療效監測具有重要意義。這些生物標志組合可以用于同時鑒別正常人及個體化腫瘤病人離體體液的生物標志及監測腫瘤療效的試劑盒和檢測方法。本方法精確、方便且快捷。文檔編號G01N33/543GK101201355SQ20061016811公開日2008年6月18日申請日期2006年12月15日優先權日2006年12月15日發明者洋許申請人:洋許