專利名稱：一種融合蛋白的表達方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物領域，涉及一種融合蛋白的表達方法，尤其涉及人脂聯素球狀域-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白的表達方法及用途。
背景技術：
2型糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是嚴重危害人類健康的疾病，患病人數正隨著生活水平的提高、人口老齡化，以及診斷技術的進步而迅速增加。近年的研究表明胰島素抵抗和胰島素分泌不足是2型糖尿病特征性的病理生理改變，二者相互作用，最終導致2型糖尿病的發生。不僅如此，胰島素抵抗還參與了糖尿病慢性并發癥如心血管并發癥、糖尿病腎病等的發生、發展，是聯系2型糖尿病、高血壓、高脂血癥、冠心病的一個重要樞紐。因此針對2型糖尿病的發病機制，采用有效的藥物減輕胰島素抵抗、增加胰島素分泌對于2型糖尿病及其并發癥的治療具有重要的意義。在目前尚無有效的藥物能同時針對2型糖尿病發病機制的兩個方面既胰島素抵抗和胰島素分泌不足進行治療。盡管已經有胰島素增敏劑如噻唑烷二酮類藥物和許多種類的口服降糖藥物在臨床上應用，但這些藥物主要是針對2型糖尿病發病機制的某一方面(單純針對胰島素抵抗或胰島素分泌不足或作用于糖吸收或代謝的某一環節)進行治療，而且它們分別改善胰島素抵抗、促進胰島素分泌、降低血糖的能力并不盡如人意，長期應用作用會逐漸降低，同時這些藥物所具有的副作用，也極大地限制了它們在臨床上的應用。即使是胰島素，也因為胰島素抵抗的存在降糖作用大大降低，大劑量應用胰島素還可能加重糖尿病慢性并發癥的發展。鑒于此，國際上正在積極地尋找新的能改善胰島素抵抗、促進胰島素分泌的藥物，以期能更有效、安全地治療2型糖尿病。脂聯素(Adiponectin)是近年發現的脂肪細胞分泌的特異性蛋白，其分泌異常在胰島素抵抗和2型糖尿病的發生、發展中起著重要作用，血清脂聯素濃度可以預測個體將來發生的胰島素抵抗的風險。2型糖尿病患者血漿脂聯素水平明顯下降，前瞻性縱向研究表明，基礎血漿脂聯素濃度是2型糖尿病發病的獨立危險因子，高濃度的血漿脂聯素提示有較小的2型糖尿病發病風險，在以后要發展為2型糖尿病的個體，其血漿脂聯素濃度顯著低于對照組，2型糖尿病發病后仍持續下降，并與胰島素的敏感性下降相平行。脂聯素基因可能是2型糖尿病的易感基因，脂聯素基因缺乏的純合子小鼠(Adipo-/-小鼠)表現出中度的胰島素抵抗和糖耐量異常。這些研究表明脂聯素產生的異常參與了胰島素抵抗和2型糖尿病的發生、發展，而用重組脂聯素對糖尿病和胰島素抵抗動物治療后可顯著改善胰島素抵抗，降低血糖。脂聯素不刺激胰島素分泌，但增強胰島素對肝細胞葡萄糖生成的抑制， 使亞生理濃度的胰島素同樣能抑制肝糖輸出。脂聯素還可降低高脂高蔗糖喂養的小鼠循環游離脂肪酸和甘油三酯水平，減輕小鼠體重，增加骨骼肌細胞對游離脂肪酸的攝取、氧化和能量消耗，使骨骼肌甘油三酯含量降低，從而增強骨骼肌細胞胰島素信號傳導，增加胰島素敏感性。脂聯素除了可改善胰島素抵抗，參與調節糖、脂代謝外，還拮抗動脈粥樣硬化的形成。低水平的血漿脂聯素是糖尿病患者發生心血管疾病的獨立危險因子。此外，伴糖尿病性視網膜病變的2型糖尿病患者的血漿脂聯素濃度顯著低于不伴視網膜病變的2型糖尿病患者，提示脂聯素產生的減少也可能參與了糖尿病微血管病變的發生、發展。總之，脂聯素具有降糖、降脂，增加胰島素敏感性的作用，同時可拮抗動脈粥樣硬化的形成，不會使體重增加，在人體內未發現脂聯素抵抗的存在，而且脂聯素是機體自身產生的蛋白，對人體幾乎沒有副作用，因此脂聯素有可能成為治療糖尿病的一類新藥，國際上正在積極地對其進行研究和開發。研究表明，脂聯素具有較長的血漿半衰期，達到2. 5-6h。 人脂聯素共M4個氨基酸，從N-端到C-端依次為信號序列(I-ISaa)，非螺旋區(19-41aa)， 22個膠原重復序列G2-107aa)，C-端球狀域(即脂聯素球狀域，108-244aa)，脂聯素球狀域(Globular Adiponectin, gAd)為其功能域。有研究者用胰蛋白酶裂解全長的脂聯素得到含gAd的片斷，其活性遠大于全長的脂聯素。研究表明，細菌表達的gAd具有很好的生物活性，這為進一步研究和開發脂聯素提供了有利的條件。胰升糖素樣肽-KGlucagons-like P印tide-1，GLP-1)是胰島α細胞和腸粘膜 L細胞分泌的一種激素，胰島α細胞和腸粘膜L細胞先產生胰升糖素原，進一步經過水解成為具有生物活性的GLP-I (7-37)，其中一部分分子C-端的一個氨基酸被分解，余端被酰胺化為具有生物活性的GLP-I (7-36)酰胺。在體內80%的GLP-I以GLP-I (7_36)酰胺的形式存在，少量以GLP-I (7-37)的形式存在，但兩者的生理活性相同。GLP-I的活性域位于 N-端，可與胰島β細胞上的GLP-I受體結合，增加胰島細胞內腺甘酸環化酶的活性，促進胰島素的釋放，其作用是依賴葡萄糖的，在血糖升高時，靜脈輸注GLP-I能明顯增加胰島素分泌，隨著血糖水平的下降，葡萄糖刺激的消失，GLP-I促進胰島素分泌的作用變小，繼續輸注 GLP-I血糖不會繼續下降。在2型糖尿病患者，飲食誘導的GLP-I分泌受損，引起胰島β細胞分泌胰島素的惡化，從而導致2型糖尿病的發生。GLP-I還具有增加肝糖原及肌糖原的合成，促進脂肪酸合成，抑制胰升糖素的分泌，抑制胃腸動力，延緩食物的吸收，抑制胰島細胞凋亡，促進胰島細胞增生，抑制食欲，減輕體重，延緩糖尿病的發生等作用。由于GLP-I具有多種藥理作用，正在試用于2型糖尿病的治療。研究表明輸入外源性GLP-I能明顯改善2型糖尿病患者空腹及餐后血糖，從而減少胰島素的用量，甚至停用胰島素，而且不會發生低血糖，長期輸注GLP-I可顯著增加2型糖尿病患者胰島素的1相分泌。GLP-I還可降低甘油三酯水平，增大低密度脂蛋白顆粒體積，改善2型糖尿病伴冠心病患者的內皮功能紊亂，延緩2型糖尿病心血管并發癥的發生、發展。盡管GLP-I在治療 2型糖尿病方面具有很多優點，但尚存在難以克服的缺點，GLP-I的體內半衰期很短，靜脈輸注的半衰期約為5分鐘，從而使得GLP-I難以在臨床上應用，因此，積極尋找有效的方法延長GLP-I的半衰期具有非常重要的意義。在體內GLP-I主要以兩種形式進行清除酶清除與器官清除。GLP-I在二肽肽酶IV的作用下失去N-端的兩個氨基酸殘基成為無活性的 GLP-I (9 36)酰胺。由于二肽肽酶IV具有高度的底物特異性，改變GLP-I的N-端氨基酸組成可增加GLP-I對二肽肽酶IV的抵抗力。Deacon等以甘氨酸代替GLP-I (7 37)第 8 位氨基酸丙氨酸后獲得的 GLP-I 類似肽(Glucagons-like Peptide-I Analog，GLP-1-A)， 對二肽肽酶IV的抵抗力顯著增加，其體外半衰期延長到159分鐘，而且和GLP-I (7 37) 具有相近的生物活性。但僅有二肽肽酶IV的參與不能解釋GLP-I在體內的所有清除機制， GLP-I在體外血漿中的半衰期為20分鐘，遠遠超過許多研究所得出3 11分的體內半衰期。Deacon等以甘氨酸代替GLP-I (7 37)第8位氨基酸丙氨酸后獲得的GLP-I-A的體外半衰期顯著延長，但體內半衰期并沒有得到相應的改善，提示尚有別的機制參與了 GLP-I的體內清除。腎臟在這一過程中起著重要的作用，GLP-I是小分子肽，易從腎臟濾過，在腎小管上皮細胞刷狀緣有二肽肽酶IV，GLP-I被腎臟濾過后，可被腎小管上皮細胞攝取而分解。 大鼠腎臟切除后GLP-I的清除率下降，離體研究表明，腎臟一次可將灌注液中超過80%的 GLP-I濾過而清除。因此，尋找有效的方法延緩GLP-I從腎臟的清除對于延長GLP-I的體內半衰期具有重要的意義。研究表明，將GLP-I與其他具有較長血漿半衰期的大分子物質如白蛋白相連接可減少GLP-I從腎臟的清除。在自然界中，許多多結構域(或多功能域)的蛋白質是由數個多肽鏈片段拼接在一起形成的，由相對較小的結構域拼裝成較大的多功能蛋白是自然進化的一個重要因素。 基因重組技術的發展使得人類能把不同基因或基因片段相融合，通過蛋白表達得到不同功能的蛋白拼接在一起形成的新型多結構域的人工融合蛋白，目前這種方法已被應用于許多領域的研究中，并顯示出較高的價值。在蛋白融合的過程中，為了最大限度地保持融合蛋白上各個蛋白的空間構象及生物活性，常把不同的蛋白通過空間活動性較大的接頭相連， 結構簡單、不易形成折疊的富含甘氨酸的短肽常用來作為接頭。由于脂聯素的功能域位于 C-端，GLP-I的功能域位于N-端，從而可應用基因重組技術將脂聯素的N-端和GLP-I的 C-端通過一個空間活動性較大的接頭相連，產生一種新的蛋白，該蛋白同時具有脂聯素的 C-端和GLP-I的N-端，故可具有脂聯素和GLP-I的兩種功能，新的蛋白由于分子體積增大， 不易從腎臟濾過而清除，可克服單一的GLP-I多肽易從腎臟清除、半衰期短的缺點，同時如將GLP-I的第8位氨基酸丙氨酸以甘氨酸代替，則新蛋白的N-端還具有抵抗二肽肽酶IV 的能力，可同時消除GLP-I在體內易被清除的兩種因素，顯著延長GLP-I的體內半衰期。由于gAd的活性大于全長的脂聯素，而且細菌表達的gAd具有活性，在該融合蛋白中如進一步以gAd代替全長的脂聯素，則可使該融合蛋白表現出更強的脂聯素活性。本發明在國內、外首次運用基因重組技術，構建含人脂聯素球狀域-胰升糖素樣肽-1 融合基因(Globular Adiponectin-glucagon-1 ike Peptide-I Analog 融合基因， gAd-GLP-1-A 融合基因)的原核表達載體 PEI^8a-gAd-GLP-l-A，用 PEI^8a-gAd-GLP-l_A 轉化蛋白表達細coli BL21(DE3)，經過蛋白誘導表達，發現表達的目的蛋白主要存在于包涵體內，包涵體蛋白經過純化、復性，獲得含6 X Hi s tag的gAd-GLP-1-A融合蛋白(6XHis tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白)，進一步用腸激酶對其切割去除6XHis tag獲得gAd-GLP-1-A融合蛋白，在該融合蛋白中，gAd的N-端和GLP-I-A的C-端通過一富含甘氨酸的短肽(接頭肽)相連接，通過將人GLP-I (7-37)第8位氨基酸丙氨酸突變為甘氨酸獲得GLP-1-A，動物研究表明gAd-GLP-1-A融合蛋白具有顯著的降低血糖的活性。本發明為進一步分析gAd-GLP-1-A融合蛋白改善胰島素抵抗、促進胰島素分泌等作用，測定融合蛋白上GLP-I-A的半衰期，獲得既能促進胰島β細胞分泌胰島素，又能改善胰島素抵抗，可顯著糾正2型糖尿病體內代謝紊亂，副作用小的新蛋白，提供前期研究。本研究所獲得的新蛋白將有可能取代相當部分的口服降糖藥物，且降糖作用會更好、更安全、更符合人體的生理需要，具有極大的社會意義和經濟意義。

發明內容
本發明的目的之一是提供人脂聯素球狀域-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白 (Globular Adiponectin-glucagon-1 ike Peptide-I Analog 融合蛋白，gAd-GLP-l-A 融合蛋白)，該融合蛋白的氨基酸序列見SEQ. ID NOl，全長共183個氨基酸，1-31氨基酸為人胰升糖素樣肽-1類似肽，通過將人胰升糖素樣肽-1 (7-37)第8位氨基酸丙氨酸突變為甘氨酸而獲得，32-46氨基酸為接頭肽(富含甘氨酸的短肽)，47-183氨基酸為人聯素球狀域，模式圖見圖1。本發明的目的之二是提供人gAd-GLP-1-A融合蛋白的表達方法，通過以下步驟實現1.含6XHis tag 的 gAd-GLP-1-A 融合蛋白(6XHis tag-gAd-GLP-l-A融合蛋白) 的表達(1)構建含人脂聯素球狀域-胰升糖素樣肽-1類似肽融合基因(Globular Adiponectin-glucagon-like Peptide-I AnaloggAd-GLP-l-A)白勺HC 核表達載體PET28a-gAd-GLP-l-A。在gAd-GLP-l-A融合基因的5’端還引入了腸激酶識別序列。(2)用 PET28a-gAd-GLP-l-A 轉化 Escherichia coli BL21 (DE3)，加異丙基硫代-β -D-半乳糖苷誘導后，證實此載體能很好地表達6 X His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白， 融合蛋白主要存在于包涵體內。(3)大量表達6XHis tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白，收集細菌，超聲破碎后，離心， 保留沉淀(主要為包涵體蛋白)用以進一步純化融合蛋白，6XHis tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白的模式圖見圖1。2.人gAd-GLP-1-A融合蛋白的獲得(1)將包涵體蛋白洗滌并溶解后，用High-Affinity Ni-IDA Resin純化，獲得純化的 6XHis tag-gAd-GLP-1-A 融合蛋白。(2)將純化后的6XHis tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白在尿素梯度溶液中透析復性。(3)將復性后的6 X Hi s tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白與腸激酶孵育，切割去除 6 X His tag，獲得 gAd-GLP-1-A 融合蛋白。由于 Escherichia coli BL21 (DE3)表達的 6XHis tag-gAd-GLP-l-A 融合蛋白主要存在于包涵體內，在本專利中通過蛋白的誘導表達，細菌破碎獲得包涵體，進一步對包涵體蛋白進行處理獲得gAd-GLP-1-A融合蛋白，這是和以往的專利(ZL 2005 1 0050844. 8) 不同的地方。本發明的目的之三是提供人gAd-GLP-1-A融合蛋白在制備治療2型糖尿病藥物中的應用。本發明經動物研究表明該融合蛋白具有顯著的降低血糖的活性。本發明的優點在于1.在世界上首次將gAd編碼基因和GLP-I-A的編碼基因進行融合獲得 gAd-GLP-1-A融合基因，通過蛋白表達、純化、復性及腸激酶切割獲得gAd-GLP-1-A融合蛋
白。 2.在gAd-GLP-1-A融合蛋白中，通過一富含甘氨酸的接頭肽連接gAd的N-端和 GLP-I-A的C-端，有利于最大限度地保持融合蛋白上各個蛋白的空間構象及生物活性。5.由于PET28a表達的蛋白在N-端含有6XHis tag，我們在gAd-GLP-l-A融合基因中還引入了腸激酶識別序列，即在gAd-GLP-1-A融合蛋白的N-端引入了腸激酶識別序列八8 ^8 48 48 -1^8，可以通過與腸激酶孵育去除6\見8 tag，使GLP-I-A的N-端游離出來，而易與其受體結合發揮生物活性。6 .本發明通過兩種機制保證獲得的gAd-GLP-1-A融合蛋白上的GLP-I-A有長的體內半衰期。一方面在gAd-GLP-1-A融合蛋白中，GLP-I-A是將GLP-I (7-37)第8位氨基酸丙氨酸突變為甘氨酸而獲得，該突變可以使GLP-I-A具有顯著的抵抗二肽肽酶IV降解的能力；另一方面融合蛋白本身分子體積增大，不易從腎臟濾過而清除，可克服單一的GLP-I多肽易從腎臟清除、半衰期短的缺點。通過接頭肽將GLP-I-A與gAd相連接構建融合蛋白以延長GLP-I的體內半衰期在世界上屬于首創。7.用PET28a-gAd-GLP-l-A轉化蛋白表達細菌，發現此載體能很好地表達6XHis tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白，融合蛋白主要存在于包涵體內，表達量大，進一步對包涵體內蛋白進行洗滌、純化、復性，并經過腸激酶切割去除6XHis tag獲得gAd-GLP-1-A融合蛋白，動物研究表明該融合蛋白具有顯著的降低血糖的活性。具有降糖活性的gAd-GLP-1-A 融合蛋白為世界上首次獲得。8.我們將在前期研究的基礎上進一步研究gAd-GLP-1-A融合蛋白改善胰島素抵抗、促進胰島素分泌的作用，研究其體內半衰期和毒理學作用，如結果能符合預期的目標， 將在國內、外首次建立獲得具有生物活性的gAd-GLP-1-A融合蛋白的方法，獲得既能促進胰島β細胞分泌胰島素，又能改善胰島素抵抗，可顯著糾正2型糖尿病體內代謝紊亂，副作用小的新蛋白，具有極大的經濟意義和社會意義。


圖1為6XHis tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白，gAd-GLP-l-A融合蛋白模式圖，其中 (A) 6 XHis tag-gAd-GLP-1-A 融合蛋白，(B) gAd-GLP-l-A 融合蛋白。圖2為腸激酶識別序列-GLP-I-A-接頭肽融合基因、gAd編碼基因瓊脂糖凝膠電泳，其中1. DNA mark ；2.腸激酶識別序列-GLP-I-A-接頭肽融合基因；3. gAd。圖3為PET28a-gAd-GLP-l-A酶切結果瓊脂糖凝膠電泳，其中M. DNA marker ； 1. PET28a-gAd-GLP-l-A未酶切；2. BamH Ι/HindIII 酶切結果；3. Xba Ι/HindIII 酶切結果。圖4為6XHis {叫1々(1-61^-14融合蛋白表達結果12%505-聚丙烯酰胺凝膠電泳；其中M 蛋白marker ；1. IPTG誘導后5h沉淀蛋白；2. IPTG誘導后5h上清蛋白；3. IPTG 誘導前菌液；4-9.分別為IPTG誘導Ih 6h總蛋白。圖5為6XHis tag-gAd-GLP-l-A融合蛋白表達結果12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；其中M 蛋白marker ；1. IPTG誘導后5h沉淀蛋白；2. IPTG誘導后5h上清蛋白。圖 6 為 6XHis tag-gAd-GLP-l-A 融合蛋白 Western Blot 分析；其中 1. IPTG誘導后5h沉淀蛋白；2. IPTG誘導后5h上清蛋白。圖7為6XHis tag-gAd-GLP-l-A融合蛋白純化結果12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；其中M 蛋白marker ；1.過柱后的Elution buffer ；2.洗滌層析柱后的LEW buffer。圖8為6XHis tag-gAd-GLP-l-A融合蛋白腸激酶切割結果12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；其中M 蛋白marker ；1.腸激酶切割后；2.腸激酶切割前。圖9為6XHis tag-gAd-GLP-l-A融合蛋白腸激酶切割結果Western Blot分析 (一抗為抗組氨酸單克隆抗體)；其中1.腸激酶切割前；2.腸激酶切割后。圖10為gAd-GLP-1-A融合蛋白Western Blot分析(一抗為抗-gAd抗體)。
圖11 為 gAd-GLP-1-A 融合蛋白 Western Blot 分析[一抗為抗 GLP-I (7-37)抗體]。
具體實施例方式本發明結合附圖和實施例作進一步的說明。以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明范圍。實施例一 1.材料和儀器1. 1 材料大腸桿菌菌株Escherichia coli DH5 α，BL21(DE3)由浙江大學附屬第二醫院腫瘤研究所提供，原核表達質粒PET28a購自德國Novagen公司，RNA抽提液(Trizol)購自美國Gibcol BRL公司，焦碳酸二乙酯、Oligo (dT)15、UNIQ-IO柱式基因組DNA抽提試劑盒均購自上海生工生物工程公司，M-MLV Reverse Transcriptase、RNasin, dNTPs、Taq DNA polymerase、瓊脂糖、T4 DNA連接酶、限制性內切酶Nhe I、BamH I、HindIII、Xba I均購自美國Promega公司，淋巴細胞提取液購自上海恒信化學試劑有限公司，GeneRuler DNA Ladder Mix購自德國Fermentas公司，DNA Marker DL2000、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)購自日本 TaKaRa 公司，SDS 聚丙稀酰胺凝膠電泳低分子量標準蛋白質購自上海博亞生物技術有限公司，6XHis Monoclonal Antibody (抗組氨酸單克隆抗體)購自美國BD Biosciences公司，辣根酶標記的山羊抗小鼠IgG購自北京中山生物技術有限公司，抗GLP-I (7-37)單克隆抗體及抗gAd單克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；質粒提取試劑盒購自上海申能博彩生物技術有限公司，Western Blotting Luminol Reagent購自美國Santa Cruz公司，聚偏二氟乙烯膜購自美國 Bio-Rad 公司，QIA quick Gel Extraction kit 購自德國 QIAGEN公司，High-Affinity Ni-IDA Resin購自Genscript公司，體重18_20g的雄性KM小鼠購自浙江中醫藥大學實驗動物中心。1. 2主要儀器高速低溫離心機(Biofuge 28RS)為德國Heraeus公司產品，細菌恒溫搖床 (Orbital Shaker)為美國Forma Scientific公司產品，紫外分光光度儀(8453型)購自美國 Hewlett Packard 公司，GeneAmp PCR system 2400 購自美國 Perkin Elmer 公司，垂直電泳儀(Mini Protean 3 cell)和電轉移儀均為美國Bio-Rad公司產品，真空冷凍干燥儀 (UVS400A)購自美國Savant Instruments公司，超聲波細胞粉碎機(JY88-2型)購自寧波新芝科器研究所，ABI377DNA測序儀購自美國PIERCE公司。2.引物的設計根據原核表達載體PET28a和GenBank中公布的人GLP-1 (7-37)與gAd的基因序列，設計GLP-I-A與gAd編碼基因的引物及插入載體的位置。GLP-I-A編碼基因弓I 物:P1 :5，-CgC gctagc gacRatRacRataaRcat ggt gaagggaccttt-3，， P 2 5 ， -cgc ggatc cagaaccagaaccagaaccagaaccagaacc agaaccaga tcctcggcctttcacca-3，；gAd 編碼基因弓I物P3 :5，-ccc ggatCC gcctatgtataccgctca-3，， P4 :5，-CCC aagct t tcagttggtgtcatggta-3。Pl 將 GLP-1 (7-37)編碼基因第 8 位氨基酸丙氨酸密碼子GCT突變為甘氨酸密碼子GGT (加粗斜體表示)，還包括N端腸激酶識別序列 (下劃線表示，PET28a表達的蛋白N端含有6XHis tag，所以引物上設計了腸激酶識別序列，用來去除融合蛋白N端的6XHis tag) ,Nhe I酶切位點(GCTAGC，加粗表示)，P2，P3含接頭序列(斜體表示)及BamH I酶切位點(GGATCC，加粗表示)，P4含Hind III酶切位點 (AAGCTT，加粗表示)。接頭序列為45個堿基的核苷酸序列5’ -tctggttctggttctggttctgg ttctggttctggttctggatcc-3’，連接GLP-I-A與gAd兩個基因，編碼15個氨基酸，序列為 N-(絲氨酸-甘氨酸)7-絲氨酸-C。引物由上海生工生物工程公司合成。GLP-I-A編碼基因引物序列見SEQ. ID N02，SEQ. ID N03，gAd編碼基因引物序列見SEQ. ID N04，SEQ. IDN05, 編碼柔性接頭肽的核苷酸序列見SEQ. ID N06。3. gAd編碼基因的RT-PCR擴增3. 1脂肪組織總RNA的抽提 取-80°C保存的人脂肪組織約lOOmg，在液氮中研成粉末，參考Trizol試劑說明書抽提脂肪組織的總RNA，用紫外分光光度儀測定分析RNA純度，所有RNA A260A280比值在 1. 80以上。3. 2逆轉錄以mRNA為模板，Oligo(ClT)15S引物，經逆轉錄合成cDNA，反應條件為取2yg 總 RNA, 1. O μ 1 IOpmol/ μ 1 Iigo (dT) 15，加 0. 1 % DEPC 水 9 μ 1，總體積 10 μ 1，混勻，65°C， 變性 lOmin，立即置于冰上，冷卻后加入 4μ 1 5XM-MLV Buffer, 1 μ 1 25mM dNTPs，0. 5μ 1 RNasin,0. 5μ 1 M-MLV Reverse Transcriptase，力口 0. 1 % DEPC/K至 20 μ 1，37°C反應 lh，所得cDNA用于PCR擴增。3. 3 擴增反應體系10XPCRBuffer 5 μ l,25mM MgCl2 3 μ 1, IOmM dNTPs ΙμΙ,ΙΟμΜ P3 1 μ 1,10 μ M P4 1 μ 1, cDNA 2 μ 1，Taq DNA polymerase (5u/μ 1)0. 5 μ 1，ddH20 36. 5 μ 1， 總體積50 μ 1。PCR擴增條件為94°C預變性5min，94°C變性30s，60°C退火lmin，68°C延伸2min，40個循環后68°C延伸7min。擴增產物經1. 5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(電壓80V， 電泳30min)。用QIA quick Gel Extraction kit回收目的基因。擴增結果見圖2，其中 1. DNA mark ；2.腸激酶識別序列-GLP-I-A-接頭肽融合基因；3. gAd, gAd編碼基因序列見 SEQ. IDN07。4.腸激酶識別序列-GLP-I-A-接頭肽融合基因的PCR擴增4. 1人類基因組DNA的提取取人外周靜脈5ml抗凝血，分離人外周血有核細胞，用UNIQ-10柱式基因組抽提試劑盒提取人類基因組DNA。4. 2PCR 擴增反應體系為10XPCRBuffer 5 μ l,25mM MgCl2 3 μ 1, IOmM dNTPs 1μ1，10μΜ P1 1 μ 1,10 μ M P2 1 μ l，cDNA 2μ l，Taq DNA polymerase (5u/ μ 1)0. 5 μ l,ddH20 36. 5 μ 1， 反應總體積50μ 1。PCR擴增條件為94°C預變性5min，94°C變性30s，62°C退火30s, 72 °C 延伸30s，40個循環后72°C延伸5min。擴增產物經1. 5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(電壓80V， 電泳30min)。用QIA quick Gel Extraction kit回收目的基因(由于該目的基因同時含有腸激酶識別序列、GLP-1-A、柔性接頭肽基因序列，故稱為腸激酶識別序列-GLP-I-A-接頭肽融合基因)。擴增結果見圖2，腸激酶識別序列-GLP-I-A-接頭肽融合基因序列見SEQ. ID N08。5. gAd-GLP-1-A融合基因及含該融合基因的原核表達載體PET28a-gAd-GLP-l_A 的構建5. lPET28a -GLP-l_A 重組質粒的構建①酶切與連接分別將割膠回收的腸激酶識別序列-GLP-I-A-接頭肽融合基因及 PET28a質粒用Nhe I和BamH I在37°C的條件下進行酶切反應，酶切體系為ddH20 10μ 1, IOXbuffer MC 2 μ 1，BSA (10 μ g/μ 1) 0. 5 μ 1，腸激酶識別序列-GLP-l-A-接頭肽融合基因或 PET28a 質粒 6. 5 μ 1，Nhe I 0. 5 μ 1，BamH I 0. 5 μ 1，反應總體積 20 μ 1，反應 3h。然后將酶切產物分別進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳(電壓80V，電泳30min)后，用QIA quick Gel Extraction kit割膠回收酶切后的目的片段，將回收產物用T4DNA連接酶4°C連接過夜， 連接體系為ddH20 4. 5 μ 1，IOXbuffer 1 μ 1，PET28a酶切回收產物3 μ 1，腸激酶識別序列-GLP-I-A-接頭肽融合基因酶切回收產物1 μ 1，Τ4 DNA連接酶0. 5 μ 1，總體積10 μ 1。 次日將連接產物轉化感受態細菌DH5 α，以擴增連接質粒。②鑒定挑取幾個平板上已經長出的單菌落，分別在含7ml LB液體培養基(含卡那霉素80yg/ml)的擴增管中37°C，300rpm振搖過夜，用質粒提取試劑盒提取質粒，用Xba I和BamH I在37°C的條件下雙酶切質粒，酶切體系為ddH20 10 μ 1, IOXbuffer MC 2μ 1, BSA(10y g/μ 1)0. 5μ 1，連接質粒 6. 5μ l，Xba I 0. 5 μ l,BamH I 0. 5 μ 1，總體積 20 μ 1，反應3h，酶切產物經1. 5%瓊脂糖凝膠電泳(電壓80V，電泳30min)后，觀察酶切結果，留取陽性克隆的菌液和質粒，獲得PET28a-GLP-l-A重組質粒。5. 2gAd-GLP-l-A融合基因及含該融合基因的原核表達載體PET28a-gAd-GLP-l_A 的構建①酶切與連接分別將構建好的PET28a-GLP-l_A質粒及割膠回收的gAd目的基因用BamH I、HindIII在37°C的條件下進行酶切反應，酶切體系為ddH20 10 μ 1, IOXbuffer E 2μ l，BSA(10y g/μ 1)0. 5μ l，PET28a-GLP-l-A 或 gAd 目的基因 6· 5μ l，BamH I 0. 5μ 1, HindIII 0. 5 μ 1，總體積20 μ 1，反應3h。然后將酶切產物分別進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳 (電壓80V，電泳30min)，割膠回收酶切后目的片段，回收產物用T4 DNA連接酶4°C連接過夜，連接體系為ddH20 14. 5 μ 1, IOXbuffer 2 μ 1，PET28a_GLP-l_A 酶切回收產物 2 μ 1， gAd目的基因酶切回收產物1 μ 1，T4 DNA連接酶0. 5 μ 1，總體積20 μ 1。次日將連接產物轉化感受態細菌DH5 α，以擴增連接質粒。②鑒定挑取幾個平板上已經長出的單菌落，在7ml LB液體培養基(含卡那霉素 80μ g/ml)的擴增管中37°C，300rpm振搖過夜，用質粒提取試劑盒提取質粒，分別用BamH I、HindIII (酶切體系為ddH20 10 μ 1, IOXbuffer E 2 μ 1，BSA(10 μ g/μ 1) 0· 5 μ 1，連接質粒 6. 5 μ 1，BamH I 0. 5 μ 1，HindIII 0. 5 μ 1，總體積 20 μ 1，37°C反應 3h)及 Xba I、 HindIII(酶切體系為:ddH20 10 μ 1, IOXbufferB 2μ l,BSA(10y g/μ 1)0. 5 μ 1，連接質粒 6. 5 μ 1，Xba I 0. 5 μ 1，HindIII 0. 5 μ 1，總體積 20 μ 1，37°C反應 3h)雙酶切質粒，酶切產物經1. 5%瓊脂糖凝膠電泳(電壓80V，電泳30min)后，出現426bp及683bp的小片斷，酶切產物符合預期值，說明gAd-GLP-1-A融合基因已成功插入PET28a的預期酶切位點，獲得了 gAd-GLP-1-A融合基因及含該融合基因的原核表達載體PET28a-gAd-GLP-l-A。見圖3，其中 Μ. DNA marker ；1. PET28a-gAd-GLP-l_A 未酶切；2. BamH Ι/HindIII 酶切結果；3. Xba I/ HindIII酶切結果。經PET通用引物通過ABI377DNA測序儀對PET28a-gAd-GLP-l_A進行測序鑒定，表明各基因的插入方向及順序完全正確，所測序列和預期完全一致。gAd-GLP-1-A 融合基因序列見SEQ. ID N09，全長共567個bp，l_15bp編碼腸激酶識別序列，16_108bp編碼人GLP-1-A，序列長93bp，109-153bp編碼接頭肽，序列長45bp，154_564bp編碼gAd，序列長411bp，565-567bp為終止密碼子。 6. gAd-GLP-1-A融合蛋白的表達6.1 6XHis tag-gAd-GLP-l-A 融合蛋白的表達用PET28a-gAd-GLP-l-A轉化感受態表達細菌BL21 (DE3)，次日挑取單菌落于7ml LB液體培養基(含卡那霉素80 μ g/ml)中，37°C振搖過夜，吸取70 μ 1到7ml LB液體培養基(含卡那霉素80 μ g/ml)中，37°C振搖2h，使菌液在600nm處吸光度(A6tltl)為0.4 0.6， 留取誘導前菌液Iml作為對照，剩下菌液中加異丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)誘導， 37°C分別振搖1 6h，分別收集1 6h各時段細菌，將每管細菌量進行調整，直至A_基本一致，將收集的菌液以5，OOOrpm離心lOmin，棄上清，沉淀用PBS洗滌3次后，以適量PBS 重懸，將菌液取10 μ 1加等量的2 X SDS凝膠加樣緩沖液，100°C煮沸5min，13，OOOrpm，離心 Imin后上樣，行12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后確定目的蛋白是否表達及表達量最大時間段。結果顯示，與誘導前的菌液相比，IPTG誘導后在25KD處有較濃的蛋白條帶，與預期的融合蛋白大小一致，且IPTG誘導5 6h的蛋白條帶最濃，較誘導前均明顯增多。取誘導后5h菌液Iml冰浴上超聲破碎細菌，分別留取上清及沉淀(包涵體在沉淀內)，將沉淀用與上清等體積的PBS重懸混勻，分別取10 μ 1上清和10 μ 1重懸后的沉淀，加等量的2 X SDS 凝膠加樣緩沖液，100°C煮沸5min，13，OOOrpm,離心Imin后上樣，用12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析目的蛋白在上清和沉淀中的表達情況，結果發現，在25KD處有較濃的蛋白條帶，以沉淀的電泳條帶為濃，與預期的融合蛋白大小一致，表明表達的融合蛋白主要存在于包涵體內。見圖4、圖5，在圖4中M:蛋白marker，1. IPTG誘導后5h沉淀蛋白，2. IPTG誘導后5h上清蛋白，3. IPTG誘導前菌液，4-9.分別為IPTG誘導Ih 6h總蛋白；圖5中M : 蛋白marker，1. IPTG誘導后5h沉淀蛋白，2. IPTG誘導后5h上清蛋白；用抗組氨酸單克隆抗體對產物行Western Blot分析顯示上清及沉淀中均有特異性的蛋白表達，以沉淀中融合蛋白表達量大，表明表達的融合蛋白主要存在于包涵體內，參見圖6，其中1.IPTG誘導后5h沉淀蛋白，2. IPTG誘導后5h上清蛋白。PET28a-gAd-GLP-l-A表達的蛋白為6XHis tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白，其模式圖見圖1。6. 2gAd-GLP-l-A融合蛋白的獲得6.2.1 6XHis tag-gAd-GLP-l-A融合蛋白的大量表達挑取鑒定表達的單菌落于7ml LB液體培養基(含卡那霉素80 μ g/ml)中，37°C振搖過夜，吸取5ml到500ml LB液體培養基(含卡那霉素80 μ g/ml)中，37°C振搖2h，調整菌液的A_為0. 4 0. 6，留取誘導前菌液Iml作為對照，剩下菌液中加IPTG 0. 4mmol/L誘導，37°C振搖5h，5，OOOrpm，離心 IOmin收集細菌，PBS洗滌3次后，5，OOOrpm離心IOmin收集細菌，用適量PBS重懸，加入溶菌酶，室溫放置30min，加入100mg/ml PMSF至終濃度lmg/ml，超聲破碎后，14000rpm,離心 20min,保留沉淀用以純化融合蛋白。6. 2. 2包涵體蛋白的洗滌及溶解
將沉淀的包涵體用包涵體洗滌液1(0. 5% Triton X-100，50mmol/L Tris · Cl， 10mmol/L EDTA, ρΗ 8. 0)勻漿洗滌 3 次，再用包涵體洗滌液 II (2mol/L urea, 50mmol/L Tris 'Cl, 10mmol/L EDTA，pH 8.0)洗滌 2 次，每次 lOmin，4°C lOOOOr/min 離心 15min，收集沉淀，最后用為PH 8. 0的50mmol/L Tris · Cl液再洗滌1次，離心后收集沉淀，用含Smol/ L 尿素的 IXBinding Buffer (5mmol/L 咪唑，0. 5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris ‘ Cl, ρΗ 8.0) 在4°C溶解2h，然后4°C 12000g離心15min收集上清，6 XHis tag-gAd-GLP-l-A融合蛋白溶解在上清中。 6. 2. 3 6 X His tag-gAd-GLP-l-A 融合蛋白的純化按照試劑盒說明書進行，將High-Affinity Ni-IDA Resin裝入Ni層析柱，用4 倍 Ni-IDA Resin 體禾只的 LEW buffer (50mM sodium dihydrogen phosphate, 300mM sodium chloride, pH 8. 0)平衡；將前述獲得的上清加到Ni層析柱中，流速控制在15ml/小時左右，過柱完成后，6XHis tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白結合在Ni層析柱上，用8倍Ni-IDA Resin體積的LEW buffer洗滌層析柱以去除未結合蛋白，流速控制在30ml/小時左右，
10 Ni-IDA Resin ^ Elute buffer (50mM sodium dihydrogen phosphate, 300mM sodium chloride, 250mM imidazole, 8M urea, pH 8.0)洗脫結合蛋白(即 6XHis tag-gAd-GLP-l-A融合蛋白)，流速控制在15ml/小時左右，收集過柱后的液體，取部分液體行12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，發現在過柱后的Elution Buffer中有25KD的蛋白，表明結合在Ni層析柱上的6XHis tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白被Elution buffer洗脫，得到純化，結果見圖7，其中M 蛋白marker ;1過柱后的Elution buffer, 2洗滌層析柱后的LEW buffe。6.2.4 6XHis tag-gAd-GLP-l-A 融合蛋白的透析復性將純化后的6 XHis tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白的濃度調整為0. 5g/L裝入透析袋，置于20倍體積的透析復性液(20mmol/L Tris · HCl，Immo 1/L EDTA,6mol/L尿素，pH 8.0)中，臨用前加入0. 2mmol/L氧化型谷胱甘肽，2mmol/L還原型谷胱甘肽，0.6mol/L L-精氨酸，10%甘油中，4°C透析，每隔12h換液1次，按照6，4，2，lmol/L的梯度依次降低尿素的濃度，最后在不含尿素的透析復性液中透析兩次，每次12h。用PEG20000濃縮蛋白，蛋白濃度用 BCA Protein Assay Kit 測定。6. 2. 5 6 X His tag-gAd-GLP-l-A 融合蛋白的腸激酶切割將復性后的6XHis tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白的濃度調整為lmg/ml，分別取 89 μ 1融合蛋白溶液，重組腸激酶1 μ 1 (2U)，10Χ切割緩沖液(500mmol/L NaCl, 200mmol/ L Tris 'HCl^Ommol/L CaCl2,pH 7. 4) 10 μ 1，22°C切割 16h 去除腸激酶，獲得 gAd-GLP-l-A 融合蛋白，對腸激酶切割結果行12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，顯示腸激酶切割后獲得一分子量大約為22KD的目的蛋白，表明6 XHis tag被切除，獲得gAd-GLP-1-A融合蛋白，結果見圖8，其中M 蛋白marker ;1.腸激酶切割后；2.腸激酶切割前；用抗組氨酸單克隆抗體對腸激酶切割結果行Western blot分析，結果顯示，腸激酶切割后的融合蛋白失去6XHis tag的免疫原性，結果見圖9，其中1.腸激酶切割前；2.腸激酶切割后。分別應用抗-gAd 單克隆抗體及抗GLP-I (7-37)單克隆抗體對蛋白行Western blot分析，顯示目的蛋白具有 gAd及GLP-I (7-37)的抗原性，結果見圖10、圖11。人gAd-GLP-1-A融合蛋白的氨基酸序列見SEQ. ID NOl，全長共183個氨基酸，其中1_31氨基酸為GLP-1-A，32-46氨基酸為接頭肽(富含甘氨酸的短肽)，47-183氨基酸為gAd，gAd-GLP-1-A融合蛋白的模式圖見圖1。7gAd-GLP-l-A融合蛋白降低血糖的作用分析(1)雄性KM小鼠，分為正常對照組、糖尿病對照組和糖尿病治療組。(2)腹腔內注射鏈脲佐菌素制作糖尿病模型。(3)糖尿病治療組小鼠腹腔注射人gAd-GLP-1-A融合蛋白，結果顯示人 gAd-GLP-1-A融合蛋白具有顯著的降低血糖的作用。具體操作選擇體重18_20g的雄性KM小鼠，適應性喂養1周后，隨機分為正常對照組(8只)糖尿病制模組。糖尿病制模組小鼠禁食10小時后，腹腔內注射新鮮配制鏈脲佐菌素溶液150mg/kg (溶于0. lmmol/L檸檬酸緩沖液中，PH4. 2)，注射后72小時，空腹血糖大于200mg/dl者為成模小鼠。將成膜小鼠隨機分為糖尿病對照組和糖尿病治療組，每組8 只。各組小鼠空腹過夜后，糖尿病治療組每只小鼠腹腔注射融合蛋白300 μ g，正常對照組及糖尿病對照組腹腔注射等量的生理鹽水，分別在30min，lh，l. 5h，2h，2. 5h，3h觀察血糖變化。結果顯示在各個時間點糖尿病治療組血糖均低于糖尿病對照組，而在注射后2h，2. 5h， 3h有顯著性差異，表明gAd-GLP-1-A融合蛋白具有顯著的降糖活性，結果見表1。表IgAd-GLP-I-A融合蛋白降糖活性分析(均數士標準差)
權利要求
1.一種具有SEQ ID NO. 1氨基酸序列的人脂聯素球狀域-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白，全長共183個氨基酸，1-31氨基酸為人胰升糖素樣肽-1類似肽，32-46氨基酸為接頭肽，47-183氨基酸為人聯素球狀域。
2.根據權利要求1所述的人脂聯素球狀域-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白的表達方法，通過以下步驟實現(1)含6XHistag人脂聯素球狀域-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白的表達(a)構建含人脂聯素球狀域-胰升糖素樣肽-1類似肽融合基因的原核表達載體 PEI^8a-gAd-GLP-l-A，在gAd-GLP-1-A融合基因的5’端還引入了腸激酶識別序列，(b)用PET28a-gAd-GLP-l-A 轉化 Escherichia coli BL21(DE3),加異丙基硫代-β -D-半乳糖苷誘導后，證實此載體能很好地表達6XHistag-gAd-GLP-l-A融合蛋白， 融合蛋白主要存在于包涵體內，(c)大量表達6XHistag-gAd-GLP-1-A融合蛋白，收集細菌，超聲破碎后，離心，保留沉淀，沉淀為包涵體蛋白；(2)人脂聯素球狀域-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白的獲得(a)將包涵體蛋白洗滌并溶解后，用High-AffinityNi-IDA Resin純化，獲得純化的 6XHis tag-gAd-GLP-1-A 融合蛋白，(b)將純化后的6XHistag-gAd-GLP-1-A融合蛋白在尿素梯度溶液中透析復性，(c)將復性后的6XHistag-gAd-GLP-1-A融合蛋白與腸激酶孵育，切割去除6XHis tag,獲得gAd-GLP-1-A融合蛋白。
3.根據權利要求1所述的人脂聯素球狀域-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白在制備治療2型糖尿病藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供人脂聯素狀域-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白的表達方法，通過構建含人gAd-GLP-1-A融合基因的原核表達載體，轉化Escherichia coliBL21(DE3)，經過誘導表達，從包涵體內獲得含6×His tag的gAd-GLP-1-A融合蛋白，進一步用腸激酶對其切割獲得該融合蛋白。動物研究表明該融合蛋白具有顯著的降低血糖的活性。本發明既能促進胰島β細胞分泌胰島素，又能改善胰島素抵抗，可顯著糾正2型糖尿病體內代謝紊亂，可在制備治療2型糖尿病藥物中應用。
文檔編號C12N15/62GK102153652SQ20101059563
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月10日 優先權日2010年12月10日
發明者趙同峰, 趙江佩, 黃曉 申請人:浙江大學