專利名稱：中分子量硫酸軟骨素的制備方法
專利說明中分子量硫酸軟骨素的制備方法 本發明涉及一種中分子量硫酸軟骨素系列產品的制備方法。硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate，簡稱CS)是一種以豬、牛、羊等動物軟骨組織和鯊魚軟骨等水產品的廢料為原材料，利用生化提取工藝技術提取得到的大分子酸性粘多糖類物質。其鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋅鹽等廣泛應用于制造藥品、醫藥保健產品、食品、化妝品、寵物飼料等。作為降血脂藥，我國已有應于臨床治療高血脂癥的硫酸軟骨素片劑和針劑。硫酸軟骨素還具有多種生理功能，在維持關節功能和維持免疫機能上起著重要作用，用于防治冠心病、治療偏頭痛等神經性疼痛、改善老年性關節功能退化等。作為食品補充劑，美國的硫酸軟骨素制劑(包括片劑、膠囊劑、溶液劑等)被廣泛地用于延緩老年性關節功能退化、改善關節運動機能。
硫酸軟骨素的生產方法主要有三種鹽解法、堿解法、酶解法；其鈉鹽較為常見，還可根據需要，生產硫酸軟骨素鈣鹽、鉀鹽或鋅鹽，如專利申請號為99112553.3、99112554.1的《硫酸軟骨素及其生產方法》。
不同工藝方法生產的硫酸軟骨素分子量不同。一般而言，低分子量硫酸軟骨素是指平均分子量小于10,000道爾頓的硫酸軟骨素；中分子量硫酸軟骨素則是指平均分子量在10,000-30,000道爾頓范圍的硫酸軟骨素。普通分子量硫酸軟骨素產品的平均分子量均大于30,000道爾頓。
硫酸軟骨素的生物活性隨分子量不同而各異，其藥理活性與分子量有著密切的關系，而分子量的大小對口服后胃腸吸收率的影響也十分明顯。
美國專利USP 3,405,120已證明，分子量在5,300-3,500道爾頓時，硫酸軟骨素的藥理活性最強，對防治動脈粥樣硬化、風濕性炎癥和傷口愈合等具有更好的療效。
經口服給藥后，分子量較小的硫酸軟骨素較容易被胃腸所吸收，這也已經被現代醫學實驗所證實。美國馬里蘭大學以Caco-2細胞為吸收模型，對西班牙Bioiberica公司生產的平均分子量為16,900、8,000、4,000道爾頓的原料樣品進行了實驗研究(Spring 2000，Vol.3，No.1 JANA)。代表胃腸吸收率的細胞膜滲透系數(Permeability Coefficient)分別為10.1×10-6cm/sec，12.5×10-6cm/sec，16.2×10-6cm/sec。而幾種市售普通分子量硫酸軟骨素原料的細胞膜滲透系數分別為0.00、1.03、3.63×10-6cm/sec。實驗結果表明，中分子量、小分子量硫酸軟骨素產品的體內吸收均明顯優于普通分子量的產品，分子量越小吸收率越高。
國外已有低分子量硫酸軟骨素的制備方法，包括酸水解法(美國專利USP3,405,120 Patented Oct.8，1968)、離子交換樹脂法(日本特許70-04734、74-30817)和酶解法(日本特許73-14078)等。我國專利申請號為03114375.X的發明專利，也首次公開了低分子量硫酸軟骨素的制備方法。
我國市售并主要出口銷往美國市場的硫酸軟骨素的原料，平均分子量大多大于45,000道爾頓。最近，我們用GPC法(中國藥典2000年版二部附錄VH)檢測了國內不同公司生產的普通分子量硫酸軟骨素產品十四份，包括牛、豬、鯊魚硫酸軟骨素，平均分子量在47,500-85,700道爾頓之間(表1)，我們很容易得出這樣的結論，目前我國生產并主要出口美國的普通硫分子量酸軟骨素產品，普遍存在分子量波動大、口服吸收差、生物利用度低、療效不穩定等缺點。
目前，我們尚沒有見到有關中分子量(30,000-10,0000道爾頓之間)硫酸軟骨素產品的生產工藝技術方面的報道或資料，市場上也沒有分子量低于30,000道爾頓的中分子量硫酸軟骨素產品銷售。本發明涉及的技術方法是以市售普通分子量硫酸軟骨素(分子量45,000道
表1 市售硫酸軟骨素原料的平均分子量樣品編號 軟骨來源及純度 平均分子量1 牛，90％ 69,4002 鯊魚，90％ 85,7003 牛，90％ 57,6004 牛，90％ 59,9005 牛，90％ 54,8006 鯊魚，90％ 83,4007 牛，90％ 59,9008 牛，90％ 62,5009 牛，85％ 45,70010牛，90％ 51,10011牛，90％ 73,60012牛，95％ 51,10013鯊魚，90％ 47,50014牛，90％ 62,400爾頓以上)或動物軟骨為原料，采用常規的堿液提取、酶解等工藝方法，通過控制硫酸軟骨素的酸水解條件和水解時間，應用不同截留分子量的超濾膜、納濾膜進行分子量截留、純化、濃縮等特殊工藝，所得到的中分子量硫酸軟骨素產品的分子量可穩定地控制在10,000-30,0000道爾頓之間。本發明采用超濾、納濾膜法分級純化硫酸軟骨素，是中分子量硫酸軟骨素工業化生產的新型技術，具有高效、節能、無污染等特點。截留分子量30,000道爾頓的超濾膜可除去蛋白質、大分子多糖等雜質；截留分子量500道爾頓的納濾膜可進行濃縮、去除小分子雜質。生產過程反應溫和、收率高、成本低、三廢少、操作簡便、工藝合理，十分適合工業化生產。
本發明的目的是這樣實現的1.將經粉碎的動物軟骨置夾層反應鍋內，加入適量的15-20％氫氧化鈉溶液，40℃攪拌提取、過濾，殘渣用適量的堿液再提取，合并兩次濾液。用鹽酸調節pH至8.0-9.0，加入0.2-0.8％胰酶，45-48℃水解4-6小時，鹽酸調節pH至6.5-7.0，加熱至70-80℃，加入白陶土或滑石粉、活性炭攪拌吸附30分鐘，過濾。
2.將上述濾液用納濾設備濃縮至硫酸軟骨素的濃度為5％左右，或將市售普通分子量硫酸軟骨素置夾層反應鍋內，加入去離子水使硫酸軟骨素的濃度為5％，加入適量濃鹽酸，使水解液的酸度為0.1-1.0N，在35-95℃條件下，攪拌水解2-12小時，用氫氧化鈉、碳酸鈉或碳酸鈣調節pH至4.5-5.5，用不同截留分子量的超濾裝置進行多級超濾、納濾濃縮，加入95％乙醇沉淀，真空干燥，得到平均分子量在30,000-10,000道爾頓范圍內的中分子量硫酸軟骨素產品。
本發明的制備方法，通過控制酸水解條件(如酸度、溫度等)和水解時間，使用不同截留分子量的超濾膜，可以得到不同分子量規格的中分子量硫酸軟骨素。例如平均分子量為30,000、20,000、16,000、12,000道爾頓等不同規格或用途的中分子量硫酸軟骨素產品。
本發明所生產的中分子量硫酸軟骨素與市售普通硫酸軟骨素相比，具有純度高、口服易吸收、體內生物利用度高、生物活性好、藥理作用強等特點，是醫藥產品、保健產品、化妝品、食品等類產品的重要原料，附加值高于普通硫酸軟骨素，經濟效益十分明顯。
本發明得到的中分子量硫酸軟骨素可以根據需要，按照常規工藝，制備得到其鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋅鹽、鉍鹽、鎂鹽、鋁鹽等。
本發明生產工藝制得的中分子量硫酸軟骨素的主要理化指標如下性狀白色或類白色粉末分子量范圍30,000-10,000道爾頓純度≥90％
干燥失重≤10％蛋白≤3.0％[具體實施方式
]提供下面的實施例，以便在各個方面詳細敘述本發明的范圍，但不以任何方式限制本發明。
實施例1將4.5升去離子水置于玻璃燒杯中，水浴加熱至70℃，加入250克市售硫酸軟骨素(平均分子量48,000道爾頓)，攪拌溶解，溶液加入36％鹽酸145毫升，加入去離子水至5升，使溶液的鹽酸濃度約為0.3N。保溫并攪拌反應6小時后，迅速冷卻，加入10％氫氧化鈉水溶液500毫升，使溶液的pH值在4.8左右，用截留分子量10,000道爾頓的超濾元件(聚砜中空纖維超濾膜，上海一鳴過濾技術有限公司)三級超濾，納濾元件(國家海洋局杭州水處理技術開發中心)進行濃縮，濃縮液加入95％乙醇，結晶，真空干燥，得到215.6克白色中分子量硫酸軟骨素(平均分子量11,200)。
實施例2將4.5升去離子水置于玻璃燒杯中，水浴加熱至80℃，加入300克市售硫酸軟骨素(平均分子量51,000道爾頓)粗品，攪拌溶解，溶液加入45克草酸，加入去離子水至5升，使溶液的草酸濃度約為0.1N。保溫并攪拌反應8小時后，迅速冷卻，加入50克碳酸鈣，分離草酸鈣沉淀后，溶液的pH值在5.1左右，用截留分子量20,000道爾頓的超濾膜過濾，納濾膜進行濃縮，濃縮液加入95％乙醇結晶，60℃真空干燥，得到276.8克白色中分子量硫酸軟骨素(分子量16,300)。
實施例3將650升去離子水置于夾層反應罐內，加熱至73℃，加入40公斤市售普通分子量硫酸軟骨素(平均分子量48,000道爾頓)粗品，攪拌溶解，溶液加入36％鹽酸11.2升，使溶液的鹽酸濃度約為0.2N。保溫并攪拌反應4小時后，迅速冷卻，加入6.8公斤碳酸鈉，使溶液的pH值在4.6左右，用截留分子量20,000道爾頓的超濾膜過濾，納濾膜進行濃縮，濃縮液加入95％乙醇結晶，60℃真空干燥，得到37公斤白色中分子量硫酸軟骨素(分子量19,400)。
實施例4將經粉碎的新鮮動物軟骨(牛氣管)40公斤置夾層反應鍋內，加入100升20％氫氧化鈉溶液，40℃攪拌提取4小時后過濾，殘渣用適量的堿液再次提取，合并兩次濾液。用HCl調節pH至8.0-9.0，加入0.5％胰酶，45-48℃水解4-6小時，HCl調節pH至6.5-7.0，加熱至70-80℃，加入白陶土或滑石粉、活性炭攪拌吸附30分鐘，過濾。將上述濾液用納濾設備濃縮，使硫酸軟骨素的濃度為5％左右，加入適量濃鹽酸，使水解液的酸度為0.3N，在75℃條件下，攪拌水解5小時，用碳酸鈉調節pH至4.5-5.5，用截留分子量為20,000的超濾裝置進行三級超濾、納濾濃縮，加入95％乙醇沉淀，60℃真空干燥，得到平均分子量為13,500道爾頓中分子量硫酸軟骨素產品1.05公斤。
權利要求
1.一種中分子量硫酸軟骨素系列產品的制備方法，其特征是利用動物軟骨和/或市售普通分子量硫酸軟骨素，經過常規的堿液提取、酶解等生產工藝，通過控制硫酸軟骨素的酸水解條件和水解時間，應用超濾膜、納濾膜進行分離、純化、濃縮等工藝，可以得到平均分子量在30,000-10,000道爾頓范圍內的不同平均分子量的硫酸軟骨素系列產品。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是得到的硫酸軟骨素系列產品的分子量在30,000-10,000道爾頓之間。
3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是酸水解使用的酸可以是但不限于鹽酸、硫酸、硝酸、醋酸、草酸。中和酸水解液所使用的堿可以是但不限于氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鈣、碳酸氫鈉。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是酸水解的溫度為30-99℃之間。水解液的酸濃度為0.01-5N。
5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是水解時間為0.5-48小時。
6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是利用不同截留分子量的超濾膜，除去低分子量硫酸軟骨素中的蛋白質、大分子多糖等雜質、純化硫酸軟骨素。
7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是利用不同截留分子量的納濾膜，對低分子量硫酸軟骨素水解液進行濃縮并去除水溶性小分子雜質和無機鹽、水分等。
8.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是控制酸水解條件和水解時間，利用不同截留分子量的超濾膜，可以得到不同平均分子量的中分子量硫酸軟骨素產品，可以是但不限于平均分子量為30,000、25,000、20,000、16,000、12,000道爾頓的硫酸軟骨素產品。
9.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是得到的中分子量硫酸軟骨素可以用于生產但不限于藥品、保健產品、化妝品、食品、動物飼料等產品。
10.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是得到的中分子量硫酸軟骨素可以是但不限于其鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋅鹽、鉍鹽、鎂鹽、鋁鹽。
全文摘要
本發明是一種制備平均分子量在10,000－30,000道爾頓范圍之間的中分子量硫酸軟骨素系列產品的方法。利用動物軟骨和/或市售普通分子量硫酸軟骨素為原料，經過常規的堿液提取、酶解等生產工藝，通過控制硫酸軟骨素的酸水解條件和水解時間，應用超濾膜、納濾膜進行分離、純化、濃縮等工藝，可以得到平均分子量在30,000－10,000道爾頓范圍之間、不同分子量規格的硫酸軟骨素系列產品。該系列產品與市售普通分子量硫酸軟骨素相比，具有純度高、口服易吸收、體內生物利用度高、生物活性好、藥理作用強等特點，是醫藥產品、保健產品、化妝品、食品等類產品的重要原料，附加值高于普通分子量硫酸軟骨素產品，經濟效益十分明顯。
文檔編號C08B37/00GK1486993SQ0315277
公開日2004年4月7日 申請日期2003年8月19日 優先權日2003年8月19日
發明者湯毅, 湯 毅 申請人:湯毅, 湯 毅