在單分子水平上在細胞環境中分析蛋白-蛋白相互作用的方法和裝置制造方法
【專利摘要】本發明公開了一種在單分子水平上分析蛋白-蛋白相互作用的方法和裝置。本發明通過以下步驟的方法實現：提供第一蛋白于第一基片，在該基片上，生物分子篩與第一蛋白上的第一標記結合，從而誘導生物分子篩與第一蛋白上的第一標記的結合；在生物分子篩與第一標記結合后，提供含有第二標記第二蛋白的細胞的胞液于該基片；在將胞液提供給所述基片的同時，分析第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用。通過本發明的方法，甚至能夠在細胞的實際環境中在單分子水平上分析蛋白-蛋白之間的相互作用。
【專利說明】在單分子水平上在細胞環境中分析蛋白-蛋白相互作用的方法和裝置
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種分析蛋白-蛋白相互作用的方法。更具體講，本發明涉及一種用于在正常細胞內環境條件下在單分子水平上分析蛋白-蛋白相互作用，以及在實際細胞內環境條件下分析不同蛋白對特異性蛋白-蛋白相互作用的影響程度的方法和裝置。
【背景技術】
[0002]細胞通過完成多種生物學功能而維持生命現象，如基因表達，細胞生長，細胞周期，代謝作用和通過多樣的和復雜的蛋白-蛋白相互作用介導的信號轉導等。因此，了解所述細胞內蛋白-蛋白相互作用的性質和功能一直是我們理解基本細胞過程的重要基礎，并且，還在我們開發新藥和治療疾病的能力方面發揮了重要作用。
[0003]一種在體外研究蛋白-蛋白相互作用的典型方法是親和層析法。
[0004]對于蛋白質親和層析法來說，蛋白要經過嚴格而且復雜的純化處理。不利的是，由于上述蛋白間的相互作用只進行了體外評估，該方法可能產生假陽性結果。例如，蛋白在通過層析柱時可能通過靜電相互作用而結合。
[0005]為了進行定量測量，按照常規技術分析蛋白-蛋白相互作用的方法是在分離條件下分析所述相互作用的。換言之，所研究的蛋白的相互作用是在沒有其他細胞內物質的條件下評估的，包括從細胞環境中分離并純化每一種蛋白，并且分析所述蛋白-蛋白相互作用。不利的是，所述常規技術限制或妨礙了在所述正常細胞內環境條件下(例如，在存在其他蛋白等的條件下)，在單分子水平上分析所述蛋白-蛋白相互作用的能力.[0006]另外，按照常規技術研究蛋白-蛋白相互作用的方法還具有不能在實際細胞內環境條件下評估其他蛋白對特異性蛋白-蛋白相互作用的影響程度的缺陷。

【發明內容】

[0007]技術問題
[0008]本發明的一個目的是提供一種用于分析蛋白-蛋白相互作用的方法和裝置，所述方法和裝置能夠在所述正常細胞內環境條件下，在單分子水平上分析所述蛋白-蛋白相互作用。另外，本發明的另一個目的是當不同蛋白出現在正常細胞內環境中時，評估不同蛋白對特異性蛋白-蛋白相互作用的影響程度。
[0009]技術方案
[0010]因此，本發明的一個典型實施方案提供了一種在單分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用的方法，包括:(a)將第一蛋白結合在基片上，其中，所述第一蛋白是用第一標記物標記的，所述第一標記物與固定在所述基片上的生物分子特異性結合;
(b)使用含有由第二標記物標記的第二蛋白的細胞溶胞產物孵育與所述基片結合的第一蛋白；和((3)在細胞溶胞產物中，分析所述第一蛋白和所述第二蛋白之間的相互作用。
[0011]根據本發明的另一方面，提供了一種在單分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用的方法，包括:(a)將第一蛋白結合在基片上，其中，第一蛋白與固定在所述基片上的生物分子特異性結合；(b)使用含有由第二標記物標記的第二蛋白的細胞溶胞產物孵育與所述基片結合的第一蛋白；和(C)在細胞溶胞產物中，分析所述第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用。
[0012]根據一種優選實施方案，步驟(C)包括使用產生近場的光學設備測量具有特定波長的熒光信號，所述的具有特定波長的熒光信號由包含在與所述第一蛋白結合的第二蛋白中的標記物所產生。優選地，在步驟(C)中，所述具有特定波長的熒光信號是在預定時段內累加測量的。優選地，在步驟(c)中，所述具有特定波長的熒光信號是在提供給所述基片的細胞溶胞產物存在的條件下實時測量的。 [0013]優選地，步驟(a)包括提供包含第一蛋白的細胞溶胞產物.[0014]優選地，所述方法還包括在所述步驟(b)之前給所述基片提供緩沖液。
[0015]優選地，所述第一標記物和所述第二標記物是具有不同波長的熒光蛋白。
[0016]根據本發明的另一方面，提供了一種在單分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用的方法，包括:(a)將第一蛋白結合在基片上，其中，所述第一蛋白是用第一標記物標記的，所述標記物與固定在所述基片上的生物分子特異性結合；(b)使用含有用第二標記物標記的第二蛋白的細胞溶胞產物孵育與所述基片結合的第一蛋白；(c)在細胞溶胞產物中，分析所述第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用，并且獲得表示所述相互作用的動態圖像的第一分析值；(d)使用來自步驟(b)的細胞溶胞產物和具有其他蛋白的另一種細胞溶胞產物組成的細胞溶胞產物混合物孵育來自步驟(a)的與基片結合的第一蛋白；(e)然后在來自細胞溶胞產物混合物的其他蛋白存在的條件下，分析所述第一蛋白和所述第二蛋白之間的相互作用，并且獲得表示所述相互作用的動態圖像的第二分析值；和(f)比較和分析所述第一和第二分析值。
[0017]根據本發明的另一方面，提供了一種在單分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用的方法，包括:(a)將第一蛋白結合在基片上，其中，所述第一蛋白與固定在所述基片上的生物分子特異性結合；(b)使用含有用第二標記物標記的第二蛋白的細胞溶胞產物孵育與所述基片結合的第一蛋白；(c)分析所述第一蛋白和所述細胞溶胞產物中的第二蛋白之間的相互作用，并且獲得表示所述相互作用的動態圖像的第一分析值；(d)使用來自所述步驟(b)的細胞溶胞產物和具有其他蛋白的另一種細胞溶胞產物組成的細胞溶胞產物混合物孵育來自步驟(a)的與所述基片結合的第一蛋白；(e)然后在來自細胞溶胞產物混合物的其他蛋白存在的條件下，分析所述第一蛋白和所述第二蛋白之間的相互作用，并且獲得表示所述相互作用的動態圖像的第二分析值4P(f)比較和分析所述第一和第二分析值。
[0018]優選地，所述步驟(C)包括當第二蛋白與所述第一蛋白結合時，使用生成近場的光學設備，測量由標記所述第二蛋白的第二標記物生成的具有特定波長的熒光信號。
[0019]優選地，在所述步驟(c )中，所述具有特定波長的熒光信號是在預定時段內累加測量的。
[0020]優選地，在所述步驟(c )中，所述具有特定波長的熒光信號是在提供給所述基片的細胞溶胞產物存在的條件下實時測量的。
[0021]優選地，所述步驟(a)包括提供包含所述第一蛋白的細胞溶胞產物。[0022]優選地，所述方法還包括在所述步驟(b)之前給所述基片提供緩沖液。
[0023]優選地，所述第一標記物和所述第二標記物是具有不同波長的熒光蛋白。
[0024]根據本發明的另一方面，提供了一種在單分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用的裝置，包括:一個用于加載基片的樣品加載元件，所述基片包括與其結合的生物分子，所述生物分子與標記第一蛋白的第一標記物特異性結合，其中，提供所述第一蛋白給所述基片，以便誘導所述生物分子和所述第一標記物結合，然后將含有所述第二標記物標記的第二蛋白的細胞溶胞產物提供給所述基片；一個光激發元件，用于在加載在所述樣品加載元件上的基片表面產生具有第一波長的近場；以及一個光學測量元件，用于檢測隨著細胞溶胞產物中第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用在所述基片表面上產生的從第一波長到第二波長的變化。
[0025]根據本發明的另一方面，提供了一種在單分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用的裝置，包括:一個用于加載基片的樣品加載元件，所述基片包括與其結合的生物分子，所述生物分子與所述第一蛋白特異性結合，其中，提供第一蛋白給所述基片，并且與所述生物分子結合，然后將含有第二標記物標記的第二蛋白的細胞溶胞產物提供給所述基片；一個光激發元件，用于在加載在所述樣品加載元件上的基片表面產生具有第一波長的近場；以及一個光學測量元件，用于檢測隨著細胞溶胞產物中所述第一蛋白和所述第二蛋白之間的相互作用，在所述基片表面上產生的從第一波長到第二波長的變化。.[0026]根據一種優選實施方案，所述光學測量元件在預定時段內累加測量具有第二波長的突光信號。
[0027]優選地，所述光學測量元件在所述細胞溶胞產物存在的條件下實時測量所述具有第二波長的突光信號。
[0028]優選地，所述第一標記物和所述第二標記物是具有不同波長的熒光蛋白。
[0029]優選地，所述裝置還包括一個信號分析元件，用于分析由光學測量元件通過圖像處理測量的具有第二波長的熒光信號。
[0030]根據本發明的另一方面，提供了一種在單分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用的裝置，包括:一個用于加載基片的樣品加載元件，所述基片包括與其結合的生物分子，所述生物分子與標記所述第一蛋白的第一標記物特異性結合，其中，提供所述第一蛋白給所述基片，以便誘導所述生物分子和所述第一標記物結合，然后將含有所述第二標記物標記的第二蛋白的細胞溶胞產物提供給所述基片；一個光激發元件，用于在加載在所述樣品加載元件上的基片表面產生具有第一波長的近場；一個光學測量元件，用于檢測隨著細胞溶胞產物中第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用，在所述基片表面上產生的從第一波長到第二波長的變化；以及一個信號分析元件，用于通過分析具有第二波長的熒光信號獲得表示所述相互作用的動態圖像的第一分析值，所述的具有第二波長的熒光信號由所述光學測量元件通過圖像處理測量的；其中，一個包括與其結合的生物分子的新基片被加載在所述樣品加載元件上，所述生物分子與標記所述加載于加載元件上的第一蛋白的第一標記物特異性結合，然后將包含由所述第二標記物標記的第二蛋白的細胞溶胞產物和具有其他蛋白的另一種細胞溶胞產物構成的細胞溶胞產物混合物提供給所述新基片，以便隨著提供給所述新基片的細胞溶胞產物混合物中第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用，由所述光學測量元件檢測在所述基片表面上產生的從第一波長到第二波長的變化，接著信號分析元件通過分析由光學測量元件通過圖像處理測量的具有第二波長的熒光信號獲得第二分析值。
[0031]根據本發明的另一方面，提供了一種在單分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用的裝置，包括:一個用于加載基片的樣品加載元件，所述基片包括與其結合的生物分子，所述生物分子與第一蛋白特異性結合，其中，提供所述第一蛋白給所述基片，并且與所述生物分子結合，然后將含有第二標記物標記的第二蛋白的細胞溶胞產物提供給所述基片；一個光激發元件，用于在加載在所述樣品加載元件上的基片表面產生具有第一波長的近場；一個光學測量元件，用于檢測隨著所述細胞溶胞產物中所述第一蛋白和所述第二蛋白之間的相互作用，在所述基片表面上產生的從第一波長到第二波長的變化；以及一個信號分析元件，通過分析由光學測量元件通過圖像處理測量的具有第二波長的熒光信號獲得第二分析值；其中，一個包括與其結合的生物分子的新基片被加載在所述樣品加載元件上，所述生物分子與標記加載于加載元件上的所述第一蛋白的第一標記物特異性結合，然后將包含由第二標記物標記的第二蛋白的細胞溶胞產物和具有其他蛋白的另一種細胞溶胞產物構成的細胞溶胞產物混合物提供給所述新基片，以便隨著提供給所述新基片的細胞溶胞產物混合物中第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用，由所述光學測量元件檢測所述基片表面上產生的從第一波長到第二波長的變化，并且所述信號分析元件通過分析由所述光學測量元件通過圖像處理測量的具有第二波長的熒光信號獲得第二分析值。
[0032]根據一種優選實施方案，所述裝置還包括一個信號診斷元件，用于比較和分析所述第一分析值和所述第二分析值。
[0033]優選地，所述光學測量元件在預定時段內累加測量所述具有第二波長的熒光信號。
[0034]優選地，所述光學測量元件在提供給所述基片的細胞溶胞產物存在的條件下實時測量。
[0035]優選地，所述第一標記物和第二標記物是具有不同波長的熒光蛋白。
[0036]有益效果
[0037]根據本發明，可以在正常細胞內環境的條件下，在單分子水平上分析蛋白-蛋白相互作用，還可以在實際細胞內環境條件下分析不同蛋白對特異性蛋白-蛋白相互作用的影響程度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]通過結合附圖對本發明的典型實施方案進行詳細說明，本領域普通技術人員可以理解本發明的上述及其他目的、特征和優點，其中:
[0039]圖1表示根據本發明的一個典型實施方案的分析蛋白-蛋白相互作用的方法的過程的程序框圖；
[0040]圖2-圖4表示根據本發明的一個典型實施方案的分析蛋白-蛋白相互作用的方法的每一個步驟的示意圖；
[0041]圖5表示根據本發明的另一個典型實施方案的分析蛋白-蛋白相互作用的方法的過程的程序框圖；
[0042]圖6表示實施圖1-圖5所示分析蛋白-蛋白相互作用的方法的裝置的典型結構的功能塊圖；和
[0043]圖7表示通過根據本發明的一個典型實施方案的分析蛋白-蛋白相互作用的裝置的一個光學測量元件測量信號的示意圖。
【具體實施方式】
[0044]實施例
[0045]在下文中，將詳細說明本發明的典型實施方案。不過，本發明不局限于下面披露的實施方案，而是能夠以各種方式實施。披露以下的實施方案，以便本領域普通技術人員能夠體現并且實現本發明。
[0046]參見附圖，下面詳細說明本發明的典型實施方案。為了便于理解本發明，在對所有的附圖進行說明時，類似的附圖標記表示類似的部件，并且，對相同部件的說明不再贅述。
[0047]圖1是說明根據本發明的一個典型實施方案的分析蛋白-蛋白相互作用的方法的程序框圖。參見圖1，在相關細胞中，分析者通過遺傳學操作在所述第一蛋白(即具有第一標記物的第一蛋白)上實施第一熒光蛋白標記，即第一蛋白的標記物的表達，以便在在單分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用(S110)。根據本發明的一個典型實施方案，所述第一突光蛋白可以通過物理化學方法結合(attached)或連接(connected)在所述第一蛋白上。
[0048]根據本發明的一個典型實施方案，所述第一蛋白是h-Ras蛋白，所述第二蛋白是C-Raf的Ras-結合結構域(RBD)蛋白，而所述第一突光蛋白是m-Cherry蛋白。
[0049]隨后，分析者將第一熒光蛋白-結合抗體結合在在基片上，所述的第一熒光蛋白-結合抗體將與作為上述步驟SllO中所述的第一蛋白的標記物的第一熒光蛋白結合，所述基片是用聚乙二醇(PEG)涂覆的石英載片，如圖2所示(S120)。
[0050]根據本發明的一個典型實施方案，與所述第一熒光蛋白結合的、具有能與蛋白相結合的特殊結構的生物分子，如DNA，RNA，脂質體等也可以用作抗體的替代物。
[0051]然后，分析者通過將在上述步驟SllO中制備的細胞的胞質溶胞產物提供給所述基片(S130)，以誘導所述第一熒光蛋白-結合抗體和所述第一熒光蛋白標記——第一標記物，在第一蛋白上相結合(S140)，其中，在所述細胞的胞質溶胞產物中，所述第一熒光蛋白被標記在所述第一蛋白上。
[0052]同時，按照上述步驟S130，除了所述細胞質溶胞產物之外，還可以使用細胞溶胞產物，例如，細胞溶解液，稀釋的細胞質溶胞產物和稀釋的細胞溶解液等。
[0053]如圖3所示，分析者通過使用全內反射熒光顯微鏡觀察基片表面，根據當第一熒光蛋白與結合在所述基片上的第一熒光蛋白-結合抗體結合時，由第一熒光蛋白所發射出的波長的變化(即，測量由所述第一熒光蛋白產生的獨特的單分子信號)，能夠證實所述第一熒光蛋白是否與多個結合在所述基片上的第一熒光蛋白-結合抗體結合。
[0054]根據本發明的一個典型實施方案，位于與抗體結合的第一蛋白上的蛋白標記物，即第一標記物不一定總是熒光蛋白，不過，所述第一蛋白上的蛋白標記物可以優選熒光蛋白，因為當其不是熒光蛋白時，就不能通過所述全內反射熒光顯微鏡證實其是否與抗體結
口 ο
[0055]換言之，根據本發明，第一蛋白上的預定的蛋白標記，即第一標記物，起著抗原作用，與結合在所述基片上的抗體結合。因此，結合在上述第一蛋白上的第一標記物，預定的抗原，甚至不一定是蛋白，相反，它們也可以是能與抗體結合的化合物。
[0056]就是說，由于當第一蛋白上的蛋白標記是熒光蛋白時，其是否與抗體結合，能夠用全內反射熒光顯微鏡來加以證實，因此，可以精確測量與結合在所述基片上的抗體結合的熒光蛋白數量及其結合密度。
[0057]—旦第一熒光蛋白分別與結合在所述基片上的多個第一熒光蛋白-結合抗體結合，分析者通過將緩沖液提供給所述基片，從基片上除去除了用第一熒光蛋白標記的第一蛋白之外的細胞質溶胞產物所包含的其余物質(S150)。
[0058]隨后，分析者通過對第二蛋白的遺傳學操作，以上述步驟SllO中使用的同一類型細胞中的相關細胞實施第二熒光蛋白標記，即所述第二蛋白的標記物，在第二蛋白(即具有第二標記物的第二蛋白)上的表達(S160)。根據本發明的一個實施方案，所述第二熒光蛋白可以通過物理化學方法結合或連接在所述第二蛋白上。在本發明的一個實施方案中，所述第二標記物發射與所述第一標記物不同波長的熒光。
[0059]上述步驟S160可以提前隨著上述步驟SllO —起實施，以便使分析順暢、連續。根據本發明的一個典型實施方案，由于第二熒光蛋白優選具有不同于第一熒光蛋白的波長范圍，當所述第一熒光蛋白為m-Cherry蛋白時，所述第二熒光蛋白可以選擇增強型綠色熒光蛋白(eGFP)，它屬于一種綠色熒光蛋白。
[0060]分析者將上述步驟S160的含有第二蛋白上表達的第二熒光蛋白標記的全細胞質溶胞產物提供給所述基片(S170)。
[0061]上述步驟S170中，除了所述細胞質溶胞產物之外，還可以使用細胞溶胞產物，如細胞溶解液，稀釋的細胞質溶胞產物和稀釋的細胞溶解液等。
[0062]所述第一蛋白分別通過第一熒光蛋白與結合在所述基片表面的多個第一熒光蛋白-結合抗體結合。當含有所述第二蛋白的全細胞質溶胞產物被提供給上述基片的表面時，基片表面上的第一蛋白在與細胞內環境相同的條件下，其中細胞質溶胞產物中包含的第二蛋白與全細胞溶胞產物中的天然蛋白共存時，與第二蛋白相互作用。
[0063]更具體講，如圖4所示，通過第一熒光蛋白與每一個結合在基片表面上的抗體結合的每一個第一蛋白，可以在單分子水平上，在細胞內進行的反復結合和解開的相同環境條件下，與第二蛋白反復地結合和解開。
[0064]如圖4所示，當在所述第一蛋白和所述第二蛋白之間，在單分子水平上發生結合時，分析者通過能生成近場的光學設備，如波長為473nm的全內反射熒光顯微鏡觀察基片的表面，能夠證實由于eGFP，即所述第二蛋白上的第二熒光蛋白標記的作用，基片的表面的波長從473nm變化到520nm。
[0065]換言之，通過檢查由于第一蛋白和第二蛋白的結合，其靠近基片表面的所述第二熒光蛋白(eGFP)所產生的特定波長帶寬(520nm)的熒光信號，能夠可證實第一蛋白和第二蛋白之間的結合/解開狀態，然后，分析者在單分子水平上通過持續觀察基片上每一個結合/解開位置上波長的變化，能夠對這種相互作用進行分析，例如第一蛋白和第二蛋白之間的結合和解開的頻率等(S180)。
[0066]另外，所述相互作用，如第一蛋白和第二蛋白之間的結合和解開的頻率等，，通過在存在上述步驟S170中提供給所述基片的細胞質溶胞產物的條件下，實時測定具有特定波長的熒光信號，可以在相當于正常細胞內條件的環境下進行分析。
[0067]在提供給所述基片的細胞質溶胞產物中漂浮和移動的過程中，沒有與所述第一蛋白結合的第二蛋白可能移動到更接近基片的表面。因此，在通過所述全內反射熒光顯微鏡觀察所述表面時，這可能由于eGFP，S卩，所述第二蛋白上的第二熒光蛋白標記，導致基片表面的波長從473nm改變到520nm,從而在蛋白-蛋白相互作用的分析中引入誤差。
[0068]因此，根據本發明的一個實施方案，當波長的變化是通過全內反射熒光顯微鏡在基片的表面測量時，波長的變化優選是在預定時段內累加測量的。
[0069]由于漂浮在細胞質溶胞產物中的沒有與所述第一蛋白結合的第二蛋白運動速度非常快，所以盡管所述第二蛋白在漂浮和移動中暫時的移動到接近基片的表面的位置，但是它們又會在累加測量期間再次離開基片的表面。
[0070]為了證實以上假設，通過實驗證實了當波長變化是在，例如50毫秒的整段時間內在基片的表面累加測量時，波長并沒有改變。這里，例如使用不相互結合的突變蛋白，所述細胞質溶胞產物中的所有第二蛋白都是漂浮和移動的而沒有與第一蛋白結合。
[0071 ] 根據本發明的一個典型實施方案，上述步驟S180中，分析蛋白-蛋白相互作用的值被設定為第一分析值，而在以下的不同環境中的分析的蛋白-蛋白相互作用的值被設定為第二分析值，這樣可以對兩個值進行比較分析。
[0072]就是說，在將上述步驟S180中分析所述相互作用的值設定為第一分析值之后，分析者同樣重復上述S110-S160。
[0073]為了實施上述步驟S170，分析者將來自，例如腫瘤細胞等的細胞質溶胞產物與不含上述步驟S160中所述第二熒光蛋白標記的第二蛋白的相關細胞的細胞質溶胞產物的混合物提供給所述基片(S190)。
[0074]為了實施上述步驟S190，除了所述混合的細胞質溶胞產物之外，還可以使用混合的細胞溶胞產物，如混合的細胞溶解液，稀釋的混合的細胞質溶胞產物，稀釋的混合的細胞溶解液等。
[0075]第一蛋白通過第一熒光蛋白分別與結合在基片表面上的多個第一熒光蛋白-結合抗體結合。當所研究的細胞質溶胞產物和包括所述第二蛋白的細胞質溶胞產物的混合物被提供給所述基片的表面時，會使得所述基片表面上的第一蛋白不僅與所述細胞質溶胞產物中的第二熒光蛋白標記的第二蛋白相互作用，而且還會與全細胞溶胞產物中共存的未標記的第二蛋白和天然蛋白相互作用。
[0076]換言之，與上述步驟S180不同，用第二熒光蛋白標記的第二蛋白與正進行研究的細胞溶胞產物中共存的未以第二熒光蛋白標記的第二蛋白，在與所述基片表面上的第一蛋白相互作用上展開競爭。另外，所述第二熒光蛋白標記的第二蛋白與第一蛋白的相互作用，會受到正進行研究的細胞中的其他蛋白的影響。
[0077]上述進行研究的細胞中的第二蛋白或該進行研究的細胞中的其他蛋白所產生的影響其程度，可以通過分析所述相互作用證實，如與上述步驟S180類似，由分析者通過使用生成近場的光學設備，如全內反射熒光顯微鏡等觀察基片的表面，分析用第二熒光蛋白標記的第二蛋白和所述基片表面上的所述第一蛋白結合和解開的頻率(S195)。
[0078]更具體講，分析者可以通過比較和分析所述第二分析值，即上述步驟S195中用于分析的值，和上述第一分析值來分析其他細胞中的第二蛋白以及其他細胞中的其他蛋白對于第二蛋白和第一蛋白之間的相互作用的促進或抑制作用的程度。
[0079]圖5是根據本發明的另一個典型實施方案的分析蛋白-蛋白相互作用的方法的過程的程序框圖。如圖5所示，通過將第一蛋白-結合抗體，而并非第一熒光蛋白-結合抗體結合在基片上，并且也就不在所述第一蛋白上表達第一熒光蛋白，從而在所述第一蛋白與結合在所述基片上的抗體直接結合的狀態下，分析所述第一蛋白和所述第二蛋白之間的相互作用。
[0080]參見圖5，根據本發明的另一個典型實施方案的分析蛋白-蛋白相互作用的方法，分析者將準備與第一蛋白結合的第一熒光蛋白-結合抗體結合在一個基片上，該基片是用聚乙二醇(PEG)涂覆的石英載片，以便在單分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用，這兩種蛋白的相互作用是特異性的(S210)。
[0081]根據本發明的一個典型實施方案，與第一熒光蛋白結合的具有能結合蛋白的特殊結構的生物分子，如DNA，RNA，脂質體等，也可用作所述抗體的替代物。隨后，分析者將包含第一蛋白的細胞質溶胞產物(S220)提供給所述基片，誘導所述第一蛋白和所述第一蛋白-結合抗體之間的結合(S230)。
[0082]為了實施上述步驟S220，除了細胞質溶胞產物之外，還可以使用細胞溶胞產物，如細胞溶解液，稀釋的細胞質溶胞產物，稀釋的細胞溶解液等。
[0083]根據本發明的另一個典型實施方案，分析者可以進行預處理，以便在第一蛋白上表達預定的突光蛋白標記，如H1-Cherry0在這種情況下，當所述第一蛋白-結合抗體與所述第一蛋白結合時，分析者可以利用全內反射熒光顯微鏡觀察基片的表面，根據由第一蛋白上的第一熒光蛋白標記所產生的波長的變化，證實所述第一蛋白是否與結合在所述基片上的多個第一蛋白-結合抗體結合。
[0084]然后，分析者通過將緩沖液提供給所述基片，從所述基片上除去細胞質溶胞產物所包含的除了第一蛋白之外的其余物質(S240)。隨后，分析者通過在與上述細胞同一類型的不同細胞中對第二蛋白進行遺傳學操作，操縱所述細胞表達熒光蛋白標記的第二蛋白(S250)。
[0085]上述步驟S250，可以在上述步驟S210之前實施，以便所述分析順暢、連續。根據本發明的熒光優選實施方案，在所述第二蛋白上表達的熒光蛋白可以是eGFP。
[0086]隨后，分析者將具有在第二蛋白上表達的熒光蛋白標記的細胞的全細胞質溶胞產物提供給所述基片(S260)。
[0087]為了實施上述步驟S260，除了細胞質溶胞產物之外，還可以使用細胞溶胞產物，如細胞溶解液，稀釋的細胞質溶胞產物，稀釋的細胞溶解液等。
[0088]多個結合在基片表面上的第一蛋白-結合抗體分別與第一蛋白結合。當包括第二蛋白的全細胞質溶胞產物被提供給上述基片的表面時，所述基片表面上的第一蛋白與包含在細胞質溶胞產物中的第二蛋白在與細胞內環境相同的條件下相互作用。
[0089]換言之，與結合在基片表面的抗體結合的第一蛋白各自在與正常細胞內環境相同的條件下與第二蛋白相互作用，正如它們在細胞中所進行的一樣，在單分子水平上反復結合和解開。
[0090]當第一蛋白在單分子水平上與第二蛋白結合時，由于第二蛋白上的熒光蛋白標記，即eGFPs的作用，基片表面的波長從473nm變化到520nm ;然后，分析者可以利用全內反射熒光顯微鏡觀察基片的表面，根據上述波長變化，證實所述第一蛋白和所述第二蛋白之間的結合狀態，并對這種相互作用進行分析，例如通過連續觀察結合在所述基片表面的每一個抗體波長的變化，分析第一蛋白和所述第二蛋白之間的結合和解開的頻率等(S270)。
[0091]另外，為了實施如圖5所示的根據本發明的另一個實施方案的分析蛋白-蛋白相互作用的方法，上述步驟S270中分析蛋白-蛋白相互作用的值被設定為第一分析值，在隨后的不同環境中分析蛋白-蛋白相互作用的值被設定為第二分析值，然后對著兩個值進行比較和分析。
[0092]換言之，將上述步驟S270中分析所述相互作用的值設定為第一分析值之后，分析者同樣且反復地實施上述步驟S210-S250。
[0093]為了實施上述步驟，分析者提供了一種細胞質溶胞產物混合物，包括例如來自腫瘤細胞等的細胞質溶胞產物，以及上述步驟S260中的不含第二熒光蛋白標記的第二蛋白的相關細胞的細胞質溶胞產物的混合物(S280)。
[0094]為了實施上述步驟S280，除了混合的細胞質溶胞產物之外，還可以使用混合的細胞溶胞產物，如混合的細胞溶解液，稀釋的混合的細胞質溶胞產物，稀釋的混合的細胞溶解液等。
[0095]第一蛋白通過第一熒光蛋白分別與結合在基片表面上的多個第一熒光蛋白-結合抗體結合。當所研究的細胞質溶胞產物和包括所述第二蛋白的細胞質溶胞產物的混合物被提供給所述基片的表面時，會使得所述基片表面上的所述第一蛋白不僅與所述細胞質溶胞產物中的第二熒光蛋白標記的第二蛋白相互作用，而且還會與所述全細胞溶胞產物中共存的未標記的第二蛋白和天然蛋白相互作用。
[0096]換言之，與上述步驟S270不同，所述用第二熒光蛋白標記的第二蛋白，與所研究的細胞溶胞產物中共存的沒有第二熒光蛋白標記的第二蛋白，在與基片表面上的所述第一蛋白的相互作用上展開競爭。另外，所述第二熒光蛋白標記的第二蛋白與所述第一蛋白的相互作用，受到所研究的細胞中的其他蛋白的影響。
[0097]上述所研究的細胞中的第二蛋白或所研究的細胞中的其他蛋白產生的影響程度，可以通過分析所述相互作用來證實，如與上述步驟S180類似，由分析者使用生成近場的光學設備，如全內反射熒光顯微鏡等觀察基片的表面，分析用第二熒光蛋白標記的第二蛋白和所述基片表面上的所述第一蛋白結合和解開的頻率(S290 )。
[0098]更具體講，分析者可以通過比較和分析第二分析值，即上述步驟S290中用于分析的值，和上述第一分析值，分析其他細胞中的其他蛋白和第二蛋白對所述第二蛋白和所述第一蛋白之間的相互作用，例如促進或抑制作用的影響程度。
[0099]同時，如圖1-圖5所示的根據本發明的分析蛋白-蛋白相互作用的方法，可以通過具有如圖6所示結構的分析裝置實施。
[0100]參見圖6，根據本發明的一個典型實施方案，用于分析蛋白-蛋白相互作用的分析裝置300包括一個光激發元件320，一個樣品加載元件310，一個光學測量元件330，一個信號分析元件340，一個信號診斷元件360，和一個存儲元件350。
[0101]首先，用于上述本發明的分析蛋白-蛋白相互作用的方法中的基片被加載在所述樣品加載兀件310上。光激發兀件320在加載在所述樣品加載兀件310上的基片的表面產生具有第一波長的近場。[0102]在將混合的細胞質溶胞產物或細胞質溶胞產物提供給所述基片后，光學測量元件330檢測隨著具有所述熒光蛋白的所述第二蛋白和結合在所述基片表面的所述第一蛋白之間的相互作用，在基片的表面發生的從所述第一波長到所述第二波長的波長變化。
[0103]根據本發明的一個實施方案，當第二蛋白具有的熒光蛋白是eGFP時，第一波長將為473nm，而第二波長將為520nm。
[0104]另外，光學測量元件330能夠在預定時段內累加測量具有第二波長的熒光信號；還能夠在所述基片上存在細胞質溶胞產物或混合的細胞質溶胞產物的條件下，實時測量具有第二波長的熒光信號；并且可以優選其對于以上測量具有單分子靈敏度。
[0105]同時，信號分析元件340分析由光學測量元件330通過圖像處理測量的具有第二波長的熒光信號，以便計算一個分析值，然后將計算的分析值保存在存儲元件350中。
[0106]另外，信號分析元件340，對根據光學測量元件330在各種情況下測量的第二波長的熒光信號，進行分別計算所得的值進行分析，所述各種情況包括將各種細胞質溶胞產物，如細胞質溶胞產物，混合的細胞質溶胞產物等不同物質提供給所述基片。然后，信號分析元件340將所述值保存在存儲元件350中。
[0107]具體講，如圖7所示，信號分析元件340在由光學測量元件330測定的多個熒光信號中找到了用紅色標記的信號基線。
[0108]所述信號基線在10-20秒之間升高，這意味著包括第二蛋白的細胞質溶胞產物或混合的細胞質溶胞產物到達了光學測量元件330的成像區。
[0109]同時，信號分析元件340測量在升高的信號基線周圍產生的波動(例如，噪聲)，然后，根據所述噪聲設定一個界定有意義的蛋白-蛋白相互作用閾值。
`[0110]信號基線周圍產生的噪聲，可能是由那些沒有與蛋白相互作用的第二蛋白在周圍連續并且快速地運動所形成的，信號分析元件340將所述基線設定為不管上述相互作用如何，都不會被所述噪聲超過的值。
[0111]當存在超過所述基線的信號時，信號分析元件340判斷在相關的點上存在有意義的第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用，測定所述相互作用的持續時間(τ。?)和形成隨后的所述第一蛋白和所述第二蛋白之間的結合所需要的時間(Tm)，然后將上述值作為分析值保存在存儲元件350中。
[0112]可以對信號分析元件340獲得的相互作用的持續時間(τ off)和形成隨后的第一蛋白和第二蛋白之間的結合所需要的時間(τ οη)進行分析，以便獲得有關所述蛋白-蛋白相互作用的一系列數據。用信號診斷元件360比較和分析在將不同的細胞質溶胞產物提供給所述基片的每一種條件下計算的分析值，然后基于所述比較和分析的結果，根據預定的診斷算法，進行每一種細胞質條件的生物學和醫學診斷的功能推測。
[0113]根據本發明，實際細胞內環境中的蛋白-蛋白相互作用可以在單分子水平上進行分析。
[0114]另外，根據本發明，當其他蛋白包含在相當于所述正常細胞內環境的細胞溶胞產物中時，可以分析其他蛋白對特異性蛋白-蛋白相互作用的影響程度。
[0115]盡管業已結合某些典型實施方案對本發明進行了圖解和說明，本領域技術人員可以理解的是，在不脫離由權利要求書限定的本發明的構思和范圍的前提下，可以對公開的形式和細節做出各種改變。[0116]工業應用性
[0117]本發明可用于醫藥工業。
【權利要求】
1.一種在單分子水平上分析蛋白相互作用的方法，包括:(a)將第一蛋白結合在基片上，其中，所述第一蛋白是用第一標記物標記的，所述第一標記物與固定在所述基片上的生物分子特異性結合；(b)使用含有用第二標記物標記的第二蛋白的細胞溶胞產物孵育與所述基片結合的第一蛋白；(C)在細胞溶胞產物中，分析所述第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用。
2.一種在單分子水平上分析蛋白的方法，包括:(a)將第一蛋白結合在基片上，其中，所述第一蛋白與固定在所述基片上的生物分子特異性結合；(b)使用含有用第二標記物標記的第二蛋白的細胞溶胞產物孵育與所述基片結合的第一蛋白；(c)在細胞溶胞產物中，分析所述第一蛋白和第二蛋白的相互作用。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中，步驟(c)包括當第二蛋白與第一蛋白結合時，使用生成近場的光學設備測量由標記第二蛋白的第二標記物所產生的具有特定波長的熒光信號。
4.如權利要求3所述的方法，在步驟(c)中，其中，所述具有所述特定波長的熒光信號是在預定的時段內累加測量的。
5.如權利要求3所述的方法，在步驟(c)中，其中，所述具有所述特定波長的熒光信號是在提供給所述基片的細胞溶胞產物中實時測量的。
6.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述步驟(a)包括孵育包含所述第一蛋白的細胞溶胞產物。
7.如權利要求6所述的方法，還包括在所述步驟(b)之前將所述基片用一種緩沖液孵育。
8.如權利要求1所述的方法，其中，所述第一標記物和第二標記物是具有不同波長的熒光蛋白。
9.一種在單分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用的方法，包括:(a)將第一蛋白結合在基片上，其中，所述第一蛋白是用第一標記物標記的，所述第一標記物與固定在所述基片上的生物分子特異性結合；(b)使用含有用第二標記物標記的第二蛋白的細胞溶胞產物孵育與所述基片結合的第一蛋白；(c)分析在細胞溶胞產物中，所述第一蛋白和所述第二蛋白之間的相互作用，并且獲得表示所述相互作用的動態圖像的第一分析值；Cd)使用含有來自步驟(b)的細胞溶胞產物和具有其他蛋白的另一種細胞溶胞產物的細胞溶胞產物混合物孵育來自步驟(a)的與所述基片結合的第一蛋白；(e)在來自所述細胞溶胞產物混合物的其他蛋白存在的條件下，分析所述第一蛋白和所述第二蛋白之間的相互作用，并且獲得表示所述相互作用的動態圖像的第二分析值；和Cf)比較和分析所述第一和第二分析值。
10.一種在單分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用的方法，包括:(a)將第一蛋白結合在基片上，其中，所述第一蛋白與固定在所述基片上的生物分子特異性結合；(b)使用含有用第二標記物標記的第二蛋白的細胞溶胞產物孵育與所述基片結合的第 一蛋白；(c)分析在細胞溶胞產物中，第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用，并且獲得表示所述相互作用的動態圖像的第一分析值；Cd)使用含有來自步驟(b)的細胞溶胞產物和具有其他蛋白的另一種細胞溶胞產物的細胞溶胞產物混合物孵育來自步驟(a)的與所述基片結合的第一蛋白；(e)在來自所述細胞溶胞產物混合物的其他蛋白存在的條件下分析所述第一蛋白和所述第二蛋白之間的相互作用，并且獲得表示所述相互作用的動態圖像的第二分析值；和Cf)比較和分析所述第一和第二分析值。
11.如權利要求9或10所述的方法，其中，步驟(C)包括當第二蛋白與第一蛋白結合時，使用生成近場的光學設備測量由標記所述第二蛋白的第二標記物所產生的具有特定波長的突光信號。
12.如權利要求11所述的方法，其中，在步驟(c)中，所述具有特定波長的熒光信號是在預定時段內累加測量的。
13.如權利要求11所述的方法，其中，在步驟(c)中，所述具特定波長的熒光信號是在提供給所述基片的細胞溶胞產物存在的條件下實時測量的。
14.如權利要求9或10所述的方法，其中，所述步驟(a)包括培養所述包含第一蛋白的細胞溶胞產物。
15.如權利要求14所述的方法，還包括在步驟(b)之前將所述基片用一種緩沖液孵育。
16.如權利要求9所述的方法，其中，所述第一標記物和第二標記物是具有不同波長的熒光蛋白。
17.一種用于分析蛋白相互作用的裝置，包括:一個用于加載基片的樣品加載元件，所述基片包括與其結合的生物分子，所述生物分子特異性結合標記所述第一蛋白的第一標記物，其中，提供所述第一蛋白給所述基片，以便誘導所述生物分子和所述第一標記物結合，然后將含有所述第二標記物標記的第二蛋白的細胞溶胞產物提供給所述基片；一個光激發元件，用于在加載在所述樣品加載元件上的基片表面產生具有第一波長的近場；和一個光學測量元件，用于檢測隨著細胞溶胞產物中第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用，在所述基片表面上產生的從第一波長到第二波長的變化。
18.—種在單分子水平上分析蛋白相互作用的裝置，包括:一個用于加載基片的樣品加載元件，所述基片包括結合的生物分子，所述生物分子特異性結合所述第一蛋白，其中，所述第一蛋白被提供給所述基片，并且與所述生物分子結合，并且將含有所述第二標記物標記的第二蛋白的細胞溶胞產物提供給所述基片；一個光激發元件，用于在加載在所述樣品加載元件上的基片表面產生具有第一波長的近場；和一個光學測量元件，用于檢測隨著所述細胞溶胞產物中第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用，在所述基片表面上產生的從第一波長到第二波長的變化。
19.如權利要求17或18所述的裝置，其中，所述光學測量元件在預定時段內累加測量具有第二波長的熒光信號。
20.如權利要求17或18所述的裝置，其中，所述光學測量元件在細胞溶胞產物存在的條件下實時測量具有第二波長的熒光信號。
21.如權利要求17所述的裝置，其中，所述第一標記物和第二標記物是具有不同波長的熒光蛋白。
22.如權利要求17或18所述的裝置，還包括一個信號分析元件，用于分析由光學測量元件通過圖像處理測量的具有第二波長的熒光信號。
23.一種用于分析蛋白相互作用的裝置，包括:一個用于加載基片的樣品加載元件，所述基片包括與其結合的生物分子，所述生物分子特異性結合標記第一蛋白的第一標記物，其中，提供所述第一蛋白給所述基片，以便誘導所述生物分子和所述第一標記物結合，然后將含有第二標記物標記的第二蛋白的細胞溶胞產物提供給所述基片；一個光激發元件，用于在加載在所述樣品加載元件上的基片表面產生具有第一波長的近場；和一個光學測量元件，用于檢測隨著所述細胞溶胞產物中所述第一蛋白和所述第二蛋白之間的相互作用，在所述基片表面上發生的從第一波長到第二波長的變化；一個信號分析元件，通過分析具有第二波長的熒光信號，獲得表示相互作用的動態圖像的第一分析值，其中，具有第二波長的熒光信號由光學測量元件通過圖像處理測量的；其中，一個包括與其結合 的生物分子的新基片被加載在所述樣品加載元件上，所述生物分子與標記第一蛋白的第一標記物特異性結合，和含有由第二標記物標記的第二蛋白的細胞溶胞產物和具有其他蛋白的另一種細胞溶胞產物的細胞溶胞產物混合物被提供給所述新基片，由此隨著提供給所述新基片的細胞溶胞產物混合物中第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用，所述光學測量元件檢測在所述基片表面上發生的從所述第一波長到所述第二波長的變化，和所述信號分析元件通過分析由光學測量元件通過圖像處理測量的具有第二波長的熒光信號獲得第二分析值。
24.一種在單分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用的裝置，包括:一個用于加載基片的樣品加載元件，所述基片包括與其結合的生物分子，所述生物分子特異性結合第一蛋白，其中，提供所述第一蛋白給所述基片，并且與所述生物分子結合，然后將含有第二標記物標記的第二蛋白的細胞溶胞產物提供給所述基片；一個光激發元件，用于在加載在所述樣品加載元件上的基片表面產生具有第一波長的近場；和一個光學測量元件，用于檢測隨著細胞溶胞產物中第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用，在所述基片表面上發生的從第一波長到第二波長的變化；一個信號分析元件，通過分析具有第二波長的熒光信號獲得表示相互作用的動態圖像的第一分析值，其中，具有第二波長的熒光信號由所述光學測量元件通過圖像處理測量的；其中，一個包括與其結合的生物分子的新基片被加載在所述樣品加載元件上，所述生物分子特異性的與標記所述第一蛋白的第一標記物結合，和包含由第二標記物標記的第二蛋白的細胞溶胞產物和具有其他蛋白的另一種細胞溶胞產物的細胞溶胞產物混合物被提供給所述新基片，由此，隨著提供給所述新基片的細胞溶胞產物混合物中第一蛋白和第二蛋白之間的相互作用，由所述光學測量元件檢測所述基片表面上發生的從所述第一波長到所述第二波長的變化，和所述信號分析元件通過分析由光學測量元件通過圖像處理測量的具有第二波長的熒光信號獲得第二分析值。
25.如權利要求23或24所述的裝置，還包括一個信號診斷元件，用于比較和分析所述第一分析值和所述第二分析值。
26.如權利要求23或24所述的裝置，其中，所述光學測量元件在預定時段內累加測量所述具有第二波長的熒光信號。
27.如權利要求23或24所述的裝置，其中，所述光學測量元件在所述細胞溶胞產物存在的條件下實時測量。
28.如權利要 求23所述的裝置，其中，所述第一標記物和第二標記物是具有不同波長的熒光蛋白。
【文檔編號】G01N21/64GK103608677SQ201280026166
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2012年4月20日 優先權日:2011年4月20日
【發明者】尹兌榮 申請人:韓國科學技術院