一種蜱傳萊姆病伯氏疏螺旋體檢測試劑及應用
【專利說明】-種蝸傳菜姆病伯氏疏螺旋體檢測試劑及應用 (-)技術領域
[0001] 本發明涉及一種婢傳萊姆病伯氏疏螺旋體的檢測試劑及應用。 (二)【背景技術】
[0002] 萊姆病化D)是由硬婢屬(Ixodes)傳播的自然疫源性疾病，其病原體是呈革蘭氏陰 性的伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi sensu lato)，包括3個致病基因型 B.burgdorferi sensu stricto(美洲型）、Β· garinii (亞洲型）和B.afzeliK歐洲型）D萊姆 病可引起皮膚、關節、屯、血管和中樞神經系統組織等多系統感染，但由于基因組序列的差異 (GlocknerG.，Lehmann 民.，民omualdi A. ，Pradella S.，Schulte-Spechtel U.， Schilhabel M.，Wilske B.，Suhnel J.，and Platzer M..2004.Comparative analysis of 化e Borrelia garinii genome.Nucleic Acids Res.32,6038-6046. )，S種基因型所引起 的臨床表現癥狀相差較大，美洲型B.burgdo^eri sensu stricto主要引起萊姆關節炎，歐 洲型B.afzelii主要侵犯皮膚組織，而亞洲型B.garinii主要引起神經功能棄亂(BuschU.， Hizo-Teufel C.,Boehmer 民.，Fingerle V.,Nitschko Η.,Wilske B.,and Preac-Mursic V..1996.Three species of Borrelia burgdorferi sensu lato(Borrelia burgdorferi sensu stricto，B.afzelii，and B.garinii)identified from cerebrospinal fluid isolates by pulsed-field gel electrophoresis and PC民.J.Clin.Microbiol.34, 1072-1078.;Steere A.C..2001 丄yme disease .N.Engl.J.Med.345，115-125.;Steere A.C.,Coburn J . , an d Glickstein L..2004.The emergence of Lyme disease.J.Cl in.Invest.113,1093-1101.)〇
[0003] 萊姆病被世界衛生組織列為應重點防治研究的新發現傳染病之一，在我國的分布 也相當廣泛，在20多個省、自治區、直轄市都有報道，由于臨床癥狀復雜易于誤診，致殘率較 高，已成為我國一種重要的蟲媒傳播疾病（萬康林，張哲夫，張金聲，竇桂蘭，王宏英，侯學 霞，朱桂鳳.1998.中國20個省、區、市動物萊姆病的初步調查研究.中國媒介生物學及控制 雜志.9,366-370.)。但是迄今為止，還未見檢測哺乳動物是否感染萊姆病螺旋體的有效方 法。 (Ξ)
【發明內容】

[0004] 本發明目的是提供一種婢傳萊姆病伯氏疏螺旋體的檢測試劑及檢測方法，首先獲 得高表達感染因子的狹義伯氏疏螺旋體(B. burgdorferi sensu StriCto)和伽氏疏螺旋體 (B. garinii)，然后將培養菌體離屯、收集沉淀，制備全菌抗原，再將全菌抗原進行SDS-PAGE 分離后轉印至微孔基膜，解決了高表達抗原性強的菌體的培養及對哺乳動物感染萊姆病螺 旋體的篩選檢測問題。
[0005] 本發明采用的技術方案是：
[0006] 本發明提供一種婢傳萊姆病伯氏疏螺旋體檢測試劑，所述檢測試劑由狹義伯氏疏 螺旋體(B.burgdorferi sensu stricto)全菌抗原和伽氏疏螺旋體(B.garinii)全菌抗原 組成，優選所述狹義伯氏疏螺旋體全菌抗原和伽氏疏螺旋體全菌抗原體積比為1:1( W蛋白 分離前菌體量計，菌體含量比為1:1)。
[0007] 進一步，所述狹義伯氏疏螺旋體全菌抗原制備方法為:將狹義伯氏疏螺旋體菌株 接種至BSK-II培養基，在33-37°C、5%C〇2恒溫培養箱培養至菌體濃度1-2 X 108個/ml，獲得 培養液;然后將培養液在4°C，320化cf離屯、25min，收集沉淀并用質量濃度0.9%化C1水溶液 重懸清洗兩次，最終獲得菌體沉淀用2XSDS上樣緩沖液在沸水浴中裂解10min，4°C離屯、，取 上清，獲得狹義伯氏疏螺旋體全菌抗原。
[0008] 進一步，所述伽氏疏螺旋體全菌抗原制備方法為：將伽氏疏螺旋體菌株接種至 BSK-II培養基，在33-37°C、5%C02恒溫培養箱培養至菌體濃度1-2X108個/ml,獲得培養液； 然后將培養液在4°C，32(K)rcf離屯、25min，收集沉淀并用質量濃度0.9%化C1水溶液重懸清 洗兩次，最終獲得菌體沉淀用2XSDS上樣緩沖液在沸水浴中裂解10min，4°C離屯、，取上清， 獲得伽氏疏螺旋體全菌抗原。
[0009] 本發明所述狹義伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi sensu stricto)菌株和伽氏疏螺 旋體(B.garinii)菌株來源廣泛，本發明中優選為B.burgdo;rfe;ri B31A3化lias A.F., Stewart P.E.,Grimm D.，Caimano Μ.J.，Eggers C.H.,Tilly Κ.,Βοηο J.L.,Akins D.民.， 民adolf J.D.，Schwan T.G.，and Rosa P..2002. Clonal polymorphism of Borrelia burgdorferi strain B31MI: implications for mutagenesis in an infectious strain background·InfectImmun·70,2139-2150·)和B·gariniiMV[JWl菌株（ChuC·Y·，Jiang B.G.'He J.，Gao Y.'Zhang P.H.'Wu X.M.'Zhang W.Y.'Shi H.'Gaowa H.S.'Wang J.B·， Foley J.E.，Liu W.，and Cao W.C..2010.Genetic diversity of Borrelia burgdorferi sensu lato isolates from Northeastern China.Vector Borne And Zoonotic Dis.11， 877-882.)。
[0010] 本發明還提供一種所述婢傳萊姆病伯氏疏螺旋體檢測試劑在檢測婢傳萊姆病伯 氏疏螺旋體中的應用，所述檢測方法包括:將含有兩種基因型萊姆病螺旋體全菌抗原的硝 酸纖維素膜與待檢測哺乳動物血清進行Western Blot雜交(Western Blot顯色方式可選用 本領域已知的各種化學發光或底物生色方法），根據所得的特異性陽性雜交蛋白的分子量 判斷是否感染萊姆病伯氏疏螺旋體，具體所述檢測方法為:將狹義伯氏疏螺旋體全菌抗原 和伽氏疏螺旋體全菌抗原分別進行SDS-PAGE蛋白分離，上樣量化1/孔，含有菌體量為2 X 1〇8個/孔，其中濃縮膠、分離膠濃度為5%、12.5%，獲得SDS-PAGE分離的全菌抗原;將SDS- PAGE分離的全菌抗原通過半干轉方法轉移至同一微孔基膜(優選0.2μπι孔徑硝酸纖維素膜） 上，轉膜條件為〇.8mA/cm2,35-40min，獲得含有兩種基因型(狹義伯氏疏螺旋體和伽氏疏螺 旋體）全菌抗原的微孔基膜；將含有兩種基因型全菌抗原微孔基膜與待檢測血清采用 Western Blot雜交方法進行檢測，若在特異性陽性雜交蛋白分子量17KDa、23KDa、34KDa、 4化化、44邸a、58邸a處出現2條及W上陽性條帶，則待測血清含有萊姆病伯氏疏螺旋體。
[0011] 本發明所述Western Blot雜交方法按如下步驟進行：（1)將含有兩種基因型萊姆 病螺旋體全菌抗原的硝酸纖維素膜放入封閉液中，室溫振蕩封閉30-60min;所述封閉液為 含有質量濃度5%脫脂牛奶的1 X PBST溶液；（2)在步驟（1)所述封閉液中加入待檢血清，室 溫振蕩解育1-化;所述待檢血清與封閉液體積比為1:100; (3)取出硝酸纖維素膜，用IX PBST溶液振蕩洗膜3次，每次5min，得洗涂后的硝酸纖維素膜；（4)在封閉液中加入兔抗大鼠 IgG化+L)-皿P作為二抗工作液，放入步驟(3)洗涂后的硝酸纖維素膜，室溫振蕩解育1-化； 所述封閉液為含有質量濃度5 %脫脂牛奶的1 X PBST溶液;所述兔抗大鼠 IgG化+U-HRP與封 閉液體積比為1:5000; (4)重復步驟(3); (5)將步驟(4)洗涂后的硝酸纖維素膜置于顯色液 中顯色，4-氯-1-奈酪為顯色底物；（6)雙蒸水沖洗步驟（5)處理后的硝酸纖維素膜終止反 應;若特異性陽性雜交蛋白在分子量17KDa、23邸a、34KDa、4化Da、44KDa、58邸a處出現2條及 W上陽性條帶，則待測血清含有萊姆病伯氏疏螺旋體。
[0012] 與現有技術相比，本發明有益效果主要體現在：
[0013] (1)目前還缺乏哺乳動物感染萊姆病螺旋體的有效檢測方法，本發明制備的含有 B.burgdorferi B31A3和B.garinii NMJW1兩種全菌抗原的硝酸纖維素膜能有效檢測出哺 乳動物是否感染萊姆病螺旋體。本方法已通過大鼠實驗得到驗證。
[0014] (2)能有效檢測出多種萊姆病螺旋體。萊姆病螺旋體致病株包括B.burgdo計eri sensu st;ricto(美洲型）、B.ga;rinii(亞洲型）和B.afzeliK歐洲型），后兩種致病株在我國 同時存在。本申請的方法可檢測出B. bu;rgdorferi sensu stricto、B. garinii，已通過大鼠 實驗得到驗證。
[0015] (3)用于檢測陽性反應的條帶與其他條帶易于分離，雜交信號明顯，易于實際檢測 過程中對哺乳動物是否感染萊姆病螺旋體做出正確判斷。 (四）
【附圖說明】
[0016] 圖 1 顯示了Β.Ιχ?ΓΚ?ΙοΚΘΓ? B31A3和B.garinii NMJW1 全菌抗原的SDS-PAGE分離的 結果。泳道1，蛋白標準分子量；泳道2，B.bu;rgdo;rferi B31A3全菌抗原；3，B.