專利名稱：：一種分離富集和鑒定大分子量蛋白質的方法
技術領域：
：本發明屬生化分析領域，涉及一種分離富集和鑒定大分子量蛋白質的方法。具體涉及一種利用低熔點瓊脂糖和聚丙烯酰胺混合凝膠(AgPAGE)作為電泳支持介質分離大分子量蛋白質的方法。
背景技術：
：蛋白質組是研究發現臨床重大疾病的生物靶標的一個有力的工具。目前，蛋白質組研究正日益受到國內外科研工作者的密切關注。時間顯示，為了減少實際樣品的復雜性，蛋白質的分離是至關重要的。現有技術公開了大規模的蛋白質分離主要依賴于凝膠電泳技術和液相色譜技術。前者由于其成熟的技術和良好的分離能力，仍是當今分離復雜蛋白質樣品的首選，并得到生物質譜的技術支持得以大規模分析鑒定。但是低豐度蛋白、極酸極堿性區蛋白、高分子量蛋白和疏水性蛋白等的分析和鑒定仍是蛋白質組學研究的重點和難點內容。其中，大分子量蛋白質(分子量大于100kDa)由于其和很多重大疾病相關，如迪謝納_貝克肌肉萎縮癥、原發性心肌炎等，越來越受到重視。一般分離采用的聚丙烯酰胺水凝膠，是由丙烯酰胺單體和少量交聯劑甲叉雙丙烯酰胺通過化學催化劑(過硫酸銨)，四甲基乙二胺(TEMED)作為加速劑催化聚合作用形成的三維空間的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網狀結構，具有濃縮效應、電荷效應、分子篩效應，通過蛋白質的分子量差異對蛋白進行分離。但是，分離大分子量蛋白所需要的聚丙烯酰胺凝膠單體濃度太低(小于5%w/v)，這樣的聚丙烯酰胺凝膠易碎，不易于操作。因此很多學者將另一種水凝膠——瓊脂糖凝膠引入蛋白質分離系統中，以期具有相對大孔徑且機械強度較大的瓊脂糖凝膠可以實現大分子蛋白的分離。但是無論是將瓊脂糖膠作為等電聚焦介質還是分子篩作用的垂直電泳介質，都面臨了很多問題，包括其凝固點高不利于室溫操作和膠的重現性，染色方法與質譜鑒定不兼容等。
發明內容本發明的目的是針對現有技術大分子量蛋白分離分析困難的問題，提供一種分離富集和鑒定大分子量蛋白質的方法。本發明以水凝膠作為電泳支持介質，尤其是利用低熔點瓊脂糖和聚丙烯酰胺混合凝膠(AgPAGE)作為電泳支持介質分離大分子量蛋白質。本發明所述的新型凝膠是一種低熔點瓊脂糖和聚丙烯酰胺的混合凝膠，其特點在于既具有瓊脂糖凝膠平均孔徑大、分辨率高、機械強度好的特點，又具有聚丙烯酰胺凝膠質譜兼容型的特點，最重要的是采用了低熔點瓊脂糖代替普通瓊脂糖，熔點和凝固點都大大低于普通瓊脂糖，便于操作和充分混勻，適用于普通薄板垂直電泳，可形成均一的、重現性好的混合凝膠。本發明中，聯和應用新型凝膠垂直電泳結合高效液相色譜分離_電噴霧質譜鑒定的分析路線(AgPAGE-LC-ESI-MS/MS)和固相梯度pH干膠條等電聚焦結合新型凝膠垂直電泳分離-基質輔助激光解吸電離質譜鑒定的分析路線(IEF-AgPAGE-MALDI-MS)。3所述MALDI-MS鑒定的路線中，采用納米核殼復合材料對酶解的蛋白進行快速、高效富集除鹽，使得大分子量蛋白質的鑒定率大大提高。。本發明的目的通過下述技術方案實現1.采用低熔點瓊脂糖(凝固點接近或低于室溫)和聚丙烯酰胺混合凝膠(AgPAGE)作為電泳支持介質來分離分子量大于100kDa的蛋白質。2.根據低熔點瓊脂糖和聚丙烯酰胺兩個組分的不同比例調整合適的大分子量分離范圍。3.利用與質譜兼容的銀染方法進行蛋白質顯色且進行膠內酶解提肽。4.ESI-MS鑒定路線中，先用新型凝膠將大分子量蛋白從其他蛋白中得到初分離，酶解后的肽段再進入LC分離，簡化了分離體系。5.MALDI-MS鑒定的路線中，采用納米核殼復合材料對酶解的蛋白進行快速、高效雖集fe鹽o本發明中，通過下述方法制備低熔點瓊脂糖和聚丙烯酰胺混合凝膠低熔點瓊脂糖(凝固點接近或低于室溫)溶于含有pH79的緩沖溶液中，在高于熔點的水浴中充分溶解，然后冷卻至室溫，制成低熔點瓊脂糖溶液；另一方面，制備低濃度的丙烯酰胺溶液，丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺交聯劑的質量比范圍為2540，然后將以上兩種溶液按照丙烯酰胺與低熔點瓊脂糖的質量比在352的范圍內混合，再加入TEMED加速催化劑，倒入垂直電泳玻璃板槽，引發自由基聚合反應，形成均勻的薄板凝膠。表1為幾種典型的低熔點瓊脂糖和聚丙烯酰胺混合凝膠的制備步驟。表lStepOne0.8%lmpAga10mL7%polyacrylamideb20mLAgarose80mg30%Stockaerylamide4.67mL1.5MTris-HC18.82.5mL1.5MTris—HC18.85mL10%SDS0.1mL腦SDS0.2mL5%ammoniumpersulfate0.2H207.4mLH209.93mLStepTwoComponentSDS-PAGESDS-lmpAgPAGE1SDS-ImpAgPAGE2SDS-ImpAgPAGE30.8%LMPA01.5raL2mL3mL7%polyacrylamide64.5mL4mL3TEMED3.6L3.6L3.6L3.6L本發明中，采用質譜兼容的染色方法，如考馬斯亮藍染色和硝酸銀染色法，染色過程中無需干膠步驟。4聯用新型凝膠垂直電泳結合高效液相色譜分離-電噴霧質譜鑒定的分析路線(AgPAGE-LC-ESI-MS/MS)和固相梯度pH干膠條等電聚焦結合新型凝膠垂直電泳分離_基質輔助激光解吸電離質譜鑒定的分析路線(IEF-AgPAGE-MALDI-MS)。其中，AgPAGE-LC-ESI-MS/MS路線中，由于LC系統有在線除鹽系統，所以凝膠電泳后的蛋白條帶酶解產物可直接在線LC-MS聯用；IEF-AgPAGE-MALDI-MS路線中，采用納米核殼復合材料酶解的單個蛋白點進行快速、高效富集除鹽，實現離線富集除鹽，然后進入質譜分析。該納米核殼復合材料是一類含有無機納米內核的聚甲基丙烯酸甲酯(P匿A)微球，直徑在100500納米范圍。將此材料加入多肽或蛋白質樣品的溶液富集，富集時間在10-12分鐘之間，富集溫度在25-37攝氏度之間，離心去除上清后，可直接與基質均勻混合，形成均勻細致的結晶，進行基質輔助激光解析離子化質譜分析。本發明使用的混合凝膠結合了兩種常用于生物大分子電泳的凝膠的優勢低熔點瓊脂糖凝膠平均孔徑大，可以使大分子量蛋白質得到有效分離；低熔點瓊脂糖相對普通瓊脂糖便于操作和充分混勻的優勢，適用于普通薄板垂直電泳，可形成均一的、重現性好的混合凝膠；聚丙烯酰胺的存在，使得該凝膠適用于與質譜相兼容的染色和酶解提肽方法。該新型凝膠具有孔徑大、機械強度大、分辨率高、重現性好、及質譜兼容性好的特點，同時可以根據兩個組分的不同比例來調整合適的大分子量分離范圍，是分離大分子量蛋白質的有效工具。本發明新型凝膠與基于質譜鑒定的兩條蛋白質組學技術路線聯用方法的建立，為大分子量蛋白的分離分析提供了新的方法學。本發明可以選擇性地分離100kDa以上分子量區間的蛋白質，重現性可達RSD7.6%，與納米核殼復合材料富集法聯用可使得鑒定率大大提高。本發明可以廣泛應用于蛋白質組學研究領域，開拓了大分子量蛋白質的組學研究方法。圖1為標準分子量標示蛋白的一維薄板垂直電泳圖。(a)為7%SDS-PAGE;(b)為SDS-lmpAgPAGE1(0.8%SDS-lmpAg/7%SDS-PAGEgel:1/3，v/v);(c)為SDS-lmpAgPAGE2(0.8%SDS-lmpAg/7%SDS-PAGEgel:1/2，v/v);(d)為SDS-lmpAgPAGE3(0.8%SDS-lmpAg/7%SDS-PAGEgel:1/1，v/v)。圖2為各種凝膠的蛋白相對遷移率-蛋白分子量關系圖。蛋白相對遷移率是蛋白在膠上的移動距離和溴酚蘭指示帶移動距離的比值。(a)為7%SDS-PAGE;(b)為SDS-lmpAgPAGE1(0.8%SDS-lmpAg/7%SDS-PAGEgel:1/3，v/v);(c)為SDS-lmpAgPAGE2(0.8%SDS-lmpAg/7%SDS—PAGEgel:1/2，v/v);(d)為SDS—lmpAgPAGE3(0.8%SDS-lmpAg/7%SDS-PAGEgel:1/1，v/v)。圖3為SD-ratGST-Pulldown純化后的腦組織蛋白提取物的一維凝膠圖，(a)為SDS-lmpAgPAGE2(0.8%SDS—lmpAg/7%SDS—PAGEgel:1/2，v/v)，(b)7%SDS-PAGE;膠上標示的阿拉伯數字和羅馬數字均代表表觀分子量150kDa以上的蛋白條帶。圖4為SD-rat大腸組織蛋白提取物的二維凝膠圖，其中，第一維均采用的是固相梯度Ph干膠條等電聚焦，第二維采用的是混合凝膠或普通聚丙烯酰胺凝膠(a)為SDS-lmpAgPAGE1(0.8%SDS-lmpAg/7%SDS-PAGEgel:1/3，v/v);(b)為7%SDS-PAGE。圖5為MALDI-TOFMS鑒定到的蛋白肽段親疏水性分布柱狀圖，(a)為采用凍干法鑒定成功的7個蛋白被檢測到的142條肽段親疏水性分布；(b)為同樣這7個蛋白用氧化鋅-聚甲基丙烯酸甲酯核殼材料富集除鹽后鑒定到的被檢測到的197條肽段親疏水性分布；(c)為所有26個被核殼材料富集除鹽法鑒定成功的蛋白的501條肽段親疏水性分布。圖6為SD-rat大腸組織蛋白提取物的二維凝膠的三次平行實驗。具體實施例方式下面的實例是對本發明提出的基于低熔點瓊脂糖/聚丙烯酰胺混合凝膠大分子量蛋白質的電泳分離和質譜鑒定的方法的進一步說明。實施例l低熔點瓊脂糖/聚丙烯酰胺混合凝膠的蛋白高分子量端最佳分離分子量范圍的研究采用標準分子量標示蛋白質(分子量范圍10-250kDa)作為標準樣品，考察不同比例的低熔點瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠混合物的分離分子量范圍。圖1顯示0.8%ImpAg的比例從O到1/2增加的凝膠電泳結果。隨著ImpAg的比例上升，混合凝膠的平均孔徑增大，可分離的分子量范圍趨近更高。由Ferguson定律可計算出每種凝膠的分離分子量范圍，如圖2所示7%SDS-PAGE，35-270kDa;SDS-lmpAgPAGE1(0.8%SDS-lmpAg/7%SDS-PAGEgel:1/3，v/v)，60-330kDa;SDS-lmpAgPAGE2(0.8%SDS-lmpAg/7%SDS-PAGEgel:1/2，v/v)，75-360kDa;SDS-lmpAgPAGE3(0.8%SDS-lmpAg/7%SDS-PAGEgel:1/1，v/v)，125-420kDa。實施例2AgPAGE-LC-ESI-MS/MS路線的應用實例采用GST-Pulldown純化的SD-rat腦組織蛋白提取物進行一維混合凝膠電泳，且與常規低濃度的聚丙烯酰胺凝膠比較，。圖3顯示了，使用ImpAgPAGE作為電泳介質使得高分子量端分離效果明顯優于普通凝膠，并且很好地分離了Spectrinisoforms，質譜鑒定支持了這一結果，見表2。表2為收縮蛋白異構體(Spectrinisoforms)的ESI-MS/MS鑒定結果列表。結果顯示，所述的收縮蛋白異構體來源于經過谷胱甘肽-S-轉移酶親和層析試驗(GST-Pulldown)純化的斯普拉格-道利大鼠(SD-rat)腦組織蛋白提取物。該純化后的腦組織蛋白提取物先經過低熔點瓊脂糖和聚丙烯酰胺混合凝膠分離，切蛋白條帶酶解提取肽段，再結合高效液相色譜分離多肽段，最后ESI-MS/MS鑒定。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例3IEF-AgPAGE-MALDI-TOFMS/MS路線的應用實例采用SD-rat大腸組織全蛋白進行二維凝膠電泳，第一維均采用的是固相梯度Ph干膠條等電聚焦，第二維采用的是混合凝膠或普通低濃度聚丙烯酰胺凝膠，如圖4所示。ImageMaster2_D軟件分析出，使用混合凝膠的分子量高于lOOkDa的蛋白個數明顯高于使用普通凝膠，分別為298個蛋白點和224個蛋白點。對于凝膠上任選的26個點用兩種富集方法處理納米核殼復合物富集除鹽法和離心凍干法。通過質譜數據表明，材料富集法對這26個點的鑒定率達到了100%，而離心凍干法只鑒定到了7個蛋白點，鑒定率為27%。(表3和表4)通過對這些成功鑒定點的肽段進行GRAVY親疏水性分析發現，材料富集法對疏水性肽段具有優于凍干法的富集除鹽效果，因此可使得鑒定率大大提高，如圖5所示。表3為二維凝膠上26個蛋白點使用氧化鋅_聚甲基丙烯酸甲酯核殼材料富集法得到的MALDI-T0FMS鑒定結果。其中，蛋白來源于SD-rat大腸組織，經過固相梯度Ph干膠條等電聚焦和低熔點瓊脂糖和聚丙烯酰胺混合凝膠二維凝膠電泳分離，切蛋白點酶解提取肽段，采用氧化鋅-聚甲基丙烯酸甲酯核殼材料富集法富集除鹽，最后用MALDI-T0FMS鑒定。表4為二維凝膠上26個蛋白點凍干法富集得到的MALDI-T0FMS成功鑒定到的蛋白結果。其中樣本和分離條件與表3—致，富集方法采用離心凍干法，最后仍用MALDI-T0FMS鑒定。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表4<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例4低熔點瓊脂糖/聚丙烯酰胺混合凝膠的重現性研究采用SD-rat大腸組織蛋白提取物進行三次平行二維凝膠電泳實驗。第一維均采用的是固相梯度Ph干膠條等電聚焦，第二維采用的是低熔點瓊脂糖/聚丙烯酰胺混合凝膠。如圖6所示，ImageMaster2_D軟件分析出，使用混合凝膠的分子量高于lOOkDa的蛋白個數分別為268,258和298，RSD為7.6%;同時，圖4所選的26個蛋白點在所述的三張凝膠中都可以清楚地被找到。結果充分的顯示了該凝膠良好的重現性。權利要求一種分離富集和鑒定大分子量蛋白質的方法，其特征是利用低熔點瓊脂糖和聚丙烯酰胺混合凝膠作為電泳支持介質，聯和應用所述凝膠垂直電泳結合高效液相色譜分離-電噴霧質譜鑒定的分析路線和固相梯度pH干膠條等電聚焦結合所述凝膠垂直電泳分離-基質輔助激光解吸電離質譜鑒定的分析路線，分離大分子量蛋白質。2.按權利要求1所述的分離富集和鑒定大分子量蛋白質的方法，其特征是所述的方法包括下述步驟1)制備低熔點瓊脂糖和聚丙烯酰胺混合凝膠；2)采用質譜兼容的染色；3)采用上述混合凝膠垂直電泳將大分子量蛋白從全蛋白中分離出來后，酶解肽段進入LC分離體系分離，進行ESI-MS鑒定；4)采用納米核殼復合材料對二維凝膠電泳后膠粒酶解的單個大分子量蛋白點進行快速、高效富集除鹽，實現離線富集除鹽，然后進入MALDI-MS質譜分析。3.按權利要求1或2所述的分離富集和鑒定大分子量蛋白質的方法，其特征是所述的低熔點瓊脂糖和聚丙烯酰胺混合凝膠通過下述步驟制備1)低熔點瓊脂糖溶于含有PH79的緩沖溶液中，在高于熔點的水浴中充分溶解后，冷卻至室溫，制成低熔點瓊脂糖溶液，其中低熔點瓊脂糖凝固點接近或低于室溫；2)制備低濃度的丙烯酰胺溶液，其中丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺交聯劑的質量比范圍為2540;3)將以上兩種溶液混合，其中丙烯酰胺與低熔點瓊脂糖的質量比為352，再加入TEMED加速催化劑，倒入垂直電泳玻璃板槽，引發自由基聚合反應，形成均勻的薄板凝膠。4.按權利要求1或2所述的分離富集和鑒定大分子量蛋白質的方法，其特征是所述的納米核殼復合材料為含有無機納米內核的聚甲基丙烯酸甲酯(P匿A)微球，直徑為100500納米。5.按權利要求4所述的分離富集和鑒定大分子量蛋白質的方法，其特征是所述的納米核殼復合材料加入多肽或蛋白質樣品的溶液富集，富集時間為10-12分鐘，富集溫度為25-37攝氏度，離心除上清，與基質均勻混合，形成結晶，進行基質輔助激光解析離子化質譜分析。6.按權利要求2所述的分離富集和鑒定大分子量蛋白質的方法，其特征是所述的染色方法為考馬斯亮藍染色或硝酸銀染色法，染色過程中無需干膠步驟。7.按權利要求1所述的分離富集和鑒定大分子量蛋白質的方法，其特征是所述的聚丙烯酰胺和低熔點瓊脂糖在352的質量比范圍內調整大分子量分離范圍。8.按權利要求1或2所述的分離富集和鑒定大分子量蛋白質的方法，其特征是所述的低熔點瓊脂糖粉末的溶解體系是PH79的緩沖溶液體系。9.按權利要求1或2所述的分離富集和鑒定大分子量蛋白質的方法，其特征是所述的低熔點瓊脂糖和聚丙烯酰胺混合凝膠電泳使用的平板垂直電泳體系。全文摘要本發明屬生化分析領域，涉及一種分離富集和鑒定大分子量蛋白質的方法。本發明利用低熔點瓊脂糖和聚丙烯酰胺混合凝膠作為電泳支持介質，聯和應用凝膠垂直電泳結合高效液相色譜分離-電噴霧質譜鑒定的分析路線和固相梯度pH干膠條等電聚焦結合所述凝膠垂直電泳分離-基質輔助激光解吸電離質譜鑒定的分析路線，分離鑒定大分子量蛋白質。所提供的凝膠孔徑大、機械強度大、分辨率高、重現性好、及質譜兼容性好，可同時根據組分的不同比例調整合適的大分子量分離范圍。能選擇性地分離100kDa以上分子量區間的蛋白質，重現性達RSD7.6％，明顯提高鑒定率。本方法為分離大分子量蛋白質提供有效工具，可應于蛋白質組學研究領域。文檔編號G01N1/28GK101788541SQ20091004588公開日2010年7月28日申請日期2009年1月24日優先權日2009年1月24日發明者楊芃原,沈雯雯,陸豪杰申請人:復旦大學