專利名稱：用磁珠支持基質及質譜判斷質譜多肽譜和蛋白指紋的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的生物樣品中蛋白質分析方法，具體搪用于生物樣品分析的蛋白指 紋法。本發明還涉及用磁珠支持的基質捕獲蛋白質組并采用計算機可讀取的條碼格式(蛋 白指紋)分析的蛋白指紋法。所述的條碼格式(蛋白指紋)，其條碼帶(分子量)塞義的確 定采用了加減法，即加入或減去某種物質來確定其質譜分子量的意義。蛋白指紋法確定某 生物樣品在第一和第二 (加入或減去某種物質)樣品中蛋白指紋差異兩種蛋白指紋圖的
差異條碼帶肯定了其分子l:在生物樣品中的臨床意義，從而判斷毎一條碼帶中單一蛋白指
紋的意義。蛋白指紋中的蛋白質單一蛋白指紋及分子序列可以用于離體體液的試劑盒的檢 測方法。
背景技術：
不論是細胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細胞所表達的蛋白質功 能。閔此，鑒定細胞內表達的蛋白質的區別，可用于診斷疾病，并最終用于藥物開發和疾 病治療。而要進行蛋白質表達和功能的差異化分析，要求能夠達到分辨細胞內分子的復雜 混合物的程度。但細胞內許多物質往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方 面都有局限，用這些常規手段難以進行定性鑒定和定》分析。
如， 一種常用的分子分離方法是凝膠電泳。通常是用凝膠內等電點聚焦先分離蛋白 質，再用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進行第二次分離.結果得到一張根據等電點 范圍(凈電荷)和大小(質量)來區分蛋白質的圖。雖然有用，但是該方法存在以下幾方 面的局限。首先，該方法只提供生物分子的兩項特征一質量和等電點(pl)。其次，各維
度的分辨率受到凝膠分辨能力的限制。例如，通常很難區分質l:差異小于5*或pi差異 的生物分子。第三，凝膠的容量和靈敏度都有限，可能無法檢測出少量表達的生物分子。
第四，無法觀察到分子Jt低于約10-20 kDa的小蛋白或小肽。
又如，臨床診斷疾病一般方法是要求特異性地檢測出疾病的已知標記。但是，制備特
異性結合標記并且能在復雜的混合物中鑒別出標記的試劑籌要大l:時間，這阻礙了此類診 斷方法的發展.
其它分析方法可能克JR以上局限之一或幾項，但是難以將它們有效組合.例如，分析
層析能夠根據多種分析物/吸附劑相互作用來分離生物分子，但是作多維度分析卻困難而 費時。而且，該方法的靈敏度也很有限。
用質譜的方法測定蛋白質是較新的方法。但沒有與用磁珠支持的基質法聯合應用時， 質譜分析方法只能對蛋白質進行定性分析，無法進行定量分析，尤其在是樣品中混合物復 雜，蛋白質含量極小的情況下。
蛋白指紋技術最早源于馬鈴蹇/土豆品種鑒定(Desborough S and Peloquin SJ, American Potato Journal. 45, 220-229: 1968 and Desborough S and Peloquin SJ, Theoretical and Applied Genetics. 39, 43-47: 1969),當時用電泳技術來區別分不同 品種土豆。因為不同品種的土豆在電泳下有不同的蛋白指紋組合.由于人體細胞蛋白比土 豆要復雜的多，故僅用電泳來鑒別疾病的蛋白指紋遠遠不能滿足臨床需要。
用磁珠支持的基質法中先將待測樣品與選定的吸附劑結合，然后檢測滯留在吸附劑上 的分析物。用磁珠支持的基質法時需將分析物先從吸附劑上洗脫進行檢測。用磁珠支持的 基質法與質譜聯合應用其優點是能夠從復雜的樣品混合物中準確地分辨出分析物分子量。 并且能夠根據分子i大小將生物樣品組成按條碼格式排列。用磁珠支持的基質法可以將血 淸蛋白排出成千上萬條分子量帶。但目前人血液中只有289個蛋白分子量可以被臨床應 用，未見到文獻有用磁珠支持的基質法進行蛋白指紋鑒定分析并且解讀出成千上萬條分子 量帶的方法學 (Anderson NL and Anderson NG, Molecular & Cellular Prot的mics 1:845-867; 2002)。

發明內容
本發明的目的是建立一種確定某生物樣品在第一和第二樣品中蛋白指紋差異存在的 意義。包括A)測定生物樣品在第一樣品中至少一種選擇性條件下的第一蛋白指紋圖；B) 測定生物樣品在第二樣品中(減去某種物質某種特異性單克隆抗體柱子處理過的或加 入某種物質)相同選擇性條件下的第二蛋白指紋圖和C)比較第一和第二蛋白指紋圖之 間的差異。利用加減物質法來判斷兩種蛋白指紋圖的差異條碼帶青定了分析物在樣品中的 蛋白質分子序列及意義，從而判斷每一條碼帶中單一蛋白指紋的意義。蛋白指紋中的蛋白 質單一蛋白指紋及分子序列可以用于離體體液的試劑盒的檢擁方法。
本發明采用蛋白指紋法對蛋白質組進行鑒別。
蛋白指紋法是通過鑒別檢測特定的蛋白質組用于疾;病診斷試劑盒。蛋白質組學 (Proteomics)的定義是研究一組蛋白質在細胞終身表達的變化狀態。蛋白質組學的目的 之一是鑒定和描述由于不同細胞差異表達的有機生物分子，通過比較表達情況可以鑒定 細胞內表達的蛋白質的區別。鑒別出可作為某種疾病標志的蛋白質組，可用于該疾病的診 斷試劑盒及治療藥物的蹄選。
本發明所述的鑒別檢測蛋白質組的方法是質譜法。
本發明用磁珠支持的基質法從復雜的樣品混合物中準確地分辨出并捕獲到用于檢測 的蛋白質組。磁珠支持的基質法是將樣品與用于解吸譜分析的多種吸附劑/洗脫劑組合接 觸，由此利用其它分離和檢測系統所無法達到的高信息分辨能力鑒定在兩樣品中存在情況 不同的分析物(即，兩份細胞或組織液提取物中差異表達的蛋白質)。根據吸附劑/洗脫劑 組合的化學特性測定包括分子量在內的理化特征的蛋白質。詳述本方法如下
I吸附劑
包含陰離子，陽離子，親水，疏水或配位共價金屬整命劑作用吸附劑，分離生物化學 中的這些方法和由這些方法產生的吸附劑具有捕獲生物樣品中蛋白質的用途(即陰離子 吸附劑捕獲陽離子蛋白質，配位共價金屬整合劑上滯留說明多肽分析物內存在組氛酸殘 基)。更具體的說，可以用陰離子吸附劑捕獲生物樣品中所有帶陽離子的蛋白質，然后用 質譜儀去讀出分子量(條碼帶)。
II信息處理
在特定洗脫條件下檢測被吸附結合的分析物提供了有關樣品中分析物及其化學特征 的信息。吸附作用在一定程度上取決于吸附劑的結合特性，與吸附劑結合的分析物具有使 得結合成為可能性的特性。例如，在特定pH下是陽離子的分子在具有該pH的洗脫條件下 將與陰離子吸附劑結合。強陽離子分子只有在很強的洗脫條件下才從吸附劑上洗脫。所以， 樣品中特定分析物在特定洗脫條件下結合某種吸附劑的確定不僅通過分析物的彼此分離 和與不具有結合所霈的相應化學特性的分析的分離而分辨了混合物中的分析物，而且鑒定 出了具有特定化學特性的一類或單一分析物。采集有關分析物在多種洗脫條件下在一種 或多種吸附劑上的滯留信息不僅可詳細分辨混合物中的分析物，而且提供有關分析物的化 學信息，這些信息本身就可以完成對他們的鑒定。這種數據被稱為"滯留數據"，
用可編程計算機分析滯留試驗得出的數據是最簡單的。計算機程序一般包括一個儲
存編碼的可讀介質。某計算機編碼進入存儲，其中包含了基質陣列上各種征點的位覚，該 處的吸附和用來洗滌吸附劑的洗脫條件，程序于是可用這些信息鑒定出陣列上確定某選 擇性的一組特征。計算機還包括這樣的編碼，它們接受來自探針上特定可定址位置的不同
分子i的信號強度數據。這些數據指示所測分析物的數i，可能包括所測各分析物的信號 強度和測得的分子量，
計算機還具有處理數據的編碼。實施例之一中，處理方法涉及形成一個分析物識別特 征概況。例如，可將據分子量測得的特定分析物的滯留數據根據特定的結合特性(例如與 陰離子吸附劑)分類。收集到的數據提供某特定分析物化學特征的概況。滯留特性反映分 析物功能，后者繼而反映結構。例如，根據不同pH洗脫條件下在多種陽離子和陰離子吸 附劑上的滯留水平數據所揭示的信息可以得出某蛋白質的等電點。這進而反映出該蛋白 質內離子氨基酸的大致數量.所以，計算機可能包含將結合信息轉化結構信息的編碼。 而且，對分析物的二次處理(例如翻譯后修飾)改變識別特征，這可以由結合或質量差異 反映出來。
得出的數據即蛋白指紋，它可以各種格式顯示。一種格式中，信號強度顯示成分子i 的函數圖。另一種格式又稱"條碼格式"，其中，信號強度沿著線性軸以暗度強度值顯示, 得出外觀類似商場上所用條碼帶讀取商品名稱。
ni分離方法的組^"差異蛋白質展示
實施例對該方法進行了詳細的描述。生物樣品通常包含數以百千計的蛋白質，人們可 能希望準確分辨出樣品中的每一種耙蛋白。第一步，用多種選擇性條件建立靶分析物的滯 留圖，例如，磁珠支持的陰離子基質吸附劑。
舉例，如用磁珠支持的陰離子基質吸附劑，可以將某種pH值狀況下的血淸中所有帶 正點的蛋白質捕獲至吸附劑上。然后用質譜讀出各自的分子量，按分子量大小排列出條碼 格式。計算機將記住這種條碼格式。第二步，將這份血淸通過一個單克隆抗體柱子(如抗 胰島素或抗生長激素)，胰島素或生長激素被捕獲并留在柱子上。然后，用上述同樣方法 去分析，就可以產生沒有胰島素或生長激素的條碼格式.
通過分析兩種條碼格式差異，計算機能夠知道某種條碼帶(分子量)是來自于胰島素 或生長激素。
本發明利用這種方法學，可無限量地解讀毎種條碼帶中的肽類、蛋白質或小分子(如 血淸藥物)指紋的意義。
這種方法學可以比目前所有生化診斷手段(ELISA,免疫熒光法)更有優勢。
IV鑒定生物材料間差異表達的分析物的方法
技術領域：
本發明的另一方面內容提供了鑒定在兩種以上樣品中差異表達的有機生物分子，特別 是蛋白質的方法."差異表達"指兩樣品間分析物量或質上的差異。這些差異可能緣于蛋 白質表達的任一階段，該方法利用了磁珠支持基質的吸附劑的超常分辨能力和靈敏度，首 先，使用同一組分辨率高、可比較的分析物數量多的制備條件。
然后，比較識別圖以鑒定被兩組吸附劑差異保留的分析物。差異滯留包括定i滯留。 這提示表達的正調控或負調控。差異滯留還包括分析物質的差異。例如，蛋白質翻譯后修 飾的不同會造成識別圖的不同，檢測時表現為結合特性差異(例如，如果蛋白質被糖基化 與凝集素結合將不同)或質i差異(例如翻譯后切割的不同).這種分析也可以用可編程. 計算機進行。
本發明提供一種統一的操作系統，用于蛋白質功能，細跑功能和生物整體功能的發現 和診斷。
更具體的說，根據分析物在至少兩種不同選擇條件下哦附固定相的能力(例如陰離子 /陽離子，疏水性/親水性，或特異性生物分子識別作用)在至少兩種不同的第一維度上分 離分析物。然后，用解吸譜(例如激光解吸質譜)根據質量在第二維度上分離分析物，進 一步檢測己分離的分析物。分析物所吸附的性質提供了分析物的物理化學信息，
在實施例中，所述的方法包括I)分析物與確切位置上的第一選擇性條件(吸附劑)
接觸，使得分析物被吸附劑保留。II)在第一選擇性條件下用解吸譜檢測滯留的分析物。 III)檢測步驟包括用激光解吸質譜測定分析物的質量。
洗脫條件的差異在于pH，緩沖能力，離子強度，水結構特征，除^劑種類，除垢劑 強度，疏水性或介電常數。
本發明提供一種用磁珠支持基質的方法捕獲生物樣品中蛋白質組的蛋白質分析方法， 其特征是采用蛋白指紋法對生物樣品中蛋白質組進行鑒別檢擁。其中所述的鑒別檢淵蛋白 質組的方法是質譜法.分析所得數據的形式是可用計算機讀取的條碼格式(蛋白指紋)一 蛋白指紋法，其質譜分析范圍為0-500 kDa。每一條碼帶代表一種分子量，其顏色深淺代 表蛋白質量多與少。本發明提供一種確定某分析物在第一和第二品中是否存在差異(例如 差異表達)的方法。該方法可以用于通過差異蛋白質展示來檢測差異蛋白表達的組合方法。 該方法包括A)測定分析物在第一樣品中至少一種選擇性條件下的第一滯留圖B)測定 分析物在第二樣品中相同選擇性條件下的第二滯留圖和C)比較第一和第二滯留圖之間 的差異。兩滯留圖的差異肯定了分析物在第一和第二樣品中的差異存在的意義。這些蛋白
指紋的意義可以用于離體體液的試劑盒的檢測方法。
本發明所述的條碼格式(蛋白指紋)，其條碼帶(分子量)意義的確定采用了加減法, 即加入或減去某種物質來確定其質譜分子量的意義。蛋白ffigt法確定某生物樣品在第一和 第二 (加入或減去某種物質)樣品中蛋白指紋差異兩種蛋白指紋圖的差異條碼帶肯定了 其分子i在生物樣品中的臨床意義，從而判斷每一條碼帶中單一蛋白指紋的意義.其中所 述的蛋白指紋(條碼格式或質譜分子量的函數圖)可以被編程計算機存儲和用軟件分析。 在磁珠支持基質的方法所用的基質包括陰離子、陽離子、親水、疏水或配位共價金厲整合 劑作用吸附劑。磁珠支持基質的方法所用吸附劑的支持物是磁性微粒或磁珠，所述的加減 法中，減去某種物質所用的抗體吸附表面物質是任何能與抗體選擇性或特異性結合的物 質，如蛋白A和G (Protein A and Protein G)柱子。抗體吸附表面物質是用于捕獲抗 原標記的單克隆或多克隆抗體，可以無限Jt地增加抗體組^到無限i地檢測多個或多種 蛋白指紋。
生物樣品可來源于血液，體液，分泌物，細胞溶解物，組織溶解物和器官溶解物。生 物樣品可以來自動物與植物。
本發明所述蛋白指紋圖譜在定期監測生物樣品中蛋白指紋動態變化的用途.
用磁珠支持基質的方法捕獲生物樣品、進行質譜分析的蛋白指紋 *~可用計算機讀取 的條碼格式(蛋白指紋)。本發明提供確定某生物樣品在第一和第二樣品中差異存在的意 義。包括A)測定生物樣品在第一樣品中至少一種選擇性條件下的第一蛋白指紋圖B) 測定生物樣品在第二樣品中(加入某種物質；或減去某種4 質某種特異性單克隆抗體柱 子處理過的)相同選擇性條件下的第二蛋白指紋圖和C)比較第一和第二蛋白指紋圖之 間的差異。兩種蛋白指紋圖的差異條碼帶肯定了分析物在樣品中的臨床意義，從而判斷每 一條碼帶中單一蛋白指紋的意義。當特異性抗體Jl無限地増加，所測定蛋白指紋條碼帶中 單一蛋白指紋的意義可以相應增大。另可以將某種蛋白質從抗體柱子上還原，然后將這種 蛋白質用胰蛋白,切成多肽指紋或做N-端^C基酸序列分析、蛋白質梯狀排序法等進行排 序以鑒定蛋白質分子序列，即最精確鑒別(金標準)。
實施例之一是測定某種蛋白指紋在生物樣品中的意義. 磁珠支持基質及蛋白指紋方法的具體操作步驟
以下是用本發明提供的磁珠支持基質及蛋白指紋方法的一個操作方案實例。
1. 樣品處理
將生物樣品稀釋在溶液中，視需要離心澄淸樣品。
2. 上樣
將樣品點樣在基質(包括陰離子、陽離子、親水、琉水或配位共價金屬螯合劑) 一個 位點上。
3. 洗錄
用結合緩沖液洗滌.在樣品完全干燥前將第一份洗滌裕液加到該位點。洗滌溶液在位
點上至少停留10秒。徹底淸除第一份洗滌溶液,用第二份洗欲液重復以上步驟。用0.05% 1%三氣乙酸徹底洗滌整個磁珠陣列點，將生物標志洗脫至質镥專用金屬片(有3x3咖圓 孔)上，自然千燥金屬片，加0.5 nL吸能分子(以50%乙腈，0.5%二氟乙酸制備的飽和 標準溶液),極能分子可用Si卿inic acid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic acid等。
4. 質譜的定量控制及測試
用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀，用氮激光儀(337咖)和80 cm或120 cm飛行 管分析陣列，或用電噴霧電離已洗脫的生物標志后用液相色誰質譜聯用儀(LC-MS)標準 方法去分析滯留于各位點的生物標志或蛋白質。串聯四極桿質譜或線性離子阱質譜來鑒定 條飾的與變異的的生物標志及多肽de novo的測序。用計算機分析數據進行數據重疊展示。
定量性質譜調控每次測試前，用質譜的標準化質控血淸，將標準化質控血清中用于 定量的標準峰6634.0 Da等強度調至40-5(Mb信號強度的最大值(圖3)。圖3顯示了 正常人貳種血淸蛋白指紋圖譜及質譜多肽譜。2746 ± 1 Da、 5恥9 ± 1 Da、 6634之1 Da峰 可用于分子量質控的標準峰。
本發明將蛋白質分成了幾大類，即WCX陰離子、SAX陽離子、C8/C18疏水作用等蛋白 指紋圖譜。這樣，可用質譜儀直接進行分析。用6634土lDa標準峰為質譜定量質控標準: 用2746 土 1 Da、 5恥9 土 1 Da、 6634 土 1 Da標準峰為JKit定性(分子 )質控標準。 蛋白指紋圖譜的霣大意義在于定期監測人體活動或血液中蛋白指紋的動態變化狀態。這些 蛋白指紋的意義可以用于離體體液的試劑盒的檢測方法。
本發明提供的方法的特點為 (1)準確
磁珠支持基質的一個特點是能夠從復雜的樣品混合物中準確地分辨出分析物，磁珠支
持基質中檢測的是滯留在吸附劑上的分析物。所以，磁珠支持基質可提供有關滯留分析 物化學或結構特征的直接信息.
第一，磁珠支持基質與解吸質譜檢測相結合提供了毫微微庫爾級的優良靈敏以及極高
的分辨率。第二，在一定程度上，因為允許直接檢測分析^r,磁珠支持基質提供了用多種 不同選擇性條件迅速分析滯留物的能力，由此提供多樣品中分析物的快速維度的描述。第 三，吸附劑可以于預先確定的排列，可定址位置附著于基質上，這就能夠對在不同洗脫條 件下接觸不同吸跗位置(即，"親合性位置"或"位點")的分析物進行并行處理。
蛋白質是由氨基酸組成的而氨基酸的平均質量為100 Da。質譜直接分析有很強的準 確性，一般誤差率只有0.01%_0.1%。例如，檢測出7030 Da及7110 Da被配位共價金屬 整合劑表面的基質所捕捉的蛋白，由于質譜差率只有0.01%-0.1*，蛋白7030 Da及7110 Da 不可能是同一種蛋白質。因此，蛋白指紋法可分辨蛋白質。
(2) 方便
本方法將蛋白質分成了幾大類，即陰離子、陽離子、親水、琉水或配位共價金屬整合 劑作用蛋白。磁珠支持基質的方法所用吸附劑的支持物是磁性微粒或磁珠，用磁性分離器 分離磁珠及樣品，無需離心樣品。這樣，可用質譜儀直接進行分析。
(3) 快捷
用本發明提供的蛋白指紋法進行疾病檢測時，無需對蛋白質進行測序，本發明采用了 計算機"條碼格式"，信號強度沿著線性軸以暗度強度值顯示。此強度可以用掃描儀記錄 并用分析軟件自動分析對比強弱，從而有助于臨床復雜的檢測，如可用此"蛋白指紋"或 條碼格式進行醫學分析。這些蛋白指紋的意義可以用于離體體液的試劑盒的檢測方法。
說明書附圖


圖1 Anti-Insulin Immunoassay
圖2 Anti-SAA Immunoassay
圖3正常人血淸蛋白指紋圖譜及質譜多肽譜
具體實施例方式
實施例1生物樣品中蛋白指紋圖譜差異表達區分意義
(1)實驗方法 一、材料
1. 標本來源IO例正常人血清，8例肺炎病人的血淸。
2. 試劑Protein A and G、人標準血清、人生長激素、胰島素(分子量明07Da)、 抗胰島素抗體、抗人血淸淀粉樣蛋白A抗體、抗纖維蛋白肽A抗體；乙腈、三氟乙酸、 SINAPINIC酸(Sin印inic acid) 、 CHAPS、 Urea、 NaAC、 Tris-HCl均購自Sig腿公司或贈 送.
3. 質量控制人標準血清(Sigma),加入人生長激素(Sigma),調制人生長激素在 標準人血淸中的濃度為50 ng /ml。
二、方法
1. 樣品的收集全血采集后吸取血淸，置于一80TC保存-80X:冰箱中取出血淸樣品， 置冰盒上融解；以10，000轉/分，4"C離心2分鐘取上清液。
2. 樣品的準備A:每個陰離子吸附劑支持物點需要血清3W,將血清用2倍體積U9緩沖液 (9MUrea, 2%CHAPS, 50mMTris-HCl， pH7-9)稀釋(例如3W血清用6W U9緩沖液稀釋)。
將樣品充分混勻。將9W上述變性后樣品加入111W相應的結合緩沖液(50mM NaAC, PH4.0-4.5),使得血清的總稀釋倍數達到約40倍。將處理好的血清樣品40W上樣到陰離子 吸附劑上。
3. 樣品的準備B:先將1種抗體結合至一個Protein A柱子(Coluim)上(一個柱子l種抗 體)，然后將血清樣品樣本加載到柱子中并在室溫條件下輕微簾蕩0.5小時。取上清液。
4. 樣品檢測上樣，在吸附劑支持物中加入40W處理好的樣品，置振蕩器，400-600轉/ 分，410驟蕩0.5小時。用磁性分離器分離磁珠及樣品，每管加入200l4的結合緩沖液(50mM NaAc, pH 4.0-4.5),室溫置振蕩器400-600轉/分，展蕩5分鐘，用磁性分離器分離磁珠 及樣品、管中液體，再次加入結合緩沖液200W,重復操作一次。每管加入20(mi HPLC水， 用磁性分離器分離磁珠及液體。用0.05% 1%二氟乙酸徹底洗滌整個磁珠陣列點，將生物 標志洗脫至質譜專用金屬片(有3x3 mm圓孔)上，自然千燥金屬片，加O. 5 ^L吸能分子(以 50%乙腈，0.5%二瓶乙酸制備的飽和標準溶液)，任其自然干燥。金屬片放入質譜中，就 會生成飛行時間質譜。外部使用多肽分子質量標準來校正質量精確性。
(2)實驗結果 分析10例正常人血淸中蛋白質的組成。
先用加入法在正常人血清中加入胰島素(Insulin),我們可以看到5807分子量的 物質增加(圖l， A)。這證明胰島素的分子量5807Da，即見箭頭所示的條碼帶為胰島素。
然后ffl減法將上述血清通過抗胰島素的柱子(Anti-Insulin Immunoassay,圖1), 我們看到5807 Da分子i的條碼帶消失了 (圖1, B)這也證明5807 Da條碼帶是胰島素。
分析8例肺炎病人的血清，已知該血淸中血清淀粉樣蛋白A(SerumAmyloidA， SAA) 增加。假設我們不知道血清淀粉樣蛋白A (SAA)已知條碼帶位置(圖2, A)。血淸通過 抗血淸淀粉樣蛋白A (抗SAA)的柱子(Anti-SAA Immunoassay,圖2)后，我們可以發 現箭頭下11. 5 kDa的條碼帶消失了 (圖2, B)。這證明11. 5 kDa條碼帶是血清淀粉樣 蛋白A (SAA)。
實施例2血淸生物標志的排序鑒定
閑為本項發明中的生物標志是通過質譜和磁珠支持基質及抗體柱子來標識的，因而它 們可通過質譜測定法進行檢測而直接知道它們特定的身份。這種方法比抗體為基礎的 ELISA及免疫熒光法更準確。
將血清1536. 7 Da生物標志蛋白質從纖維蛋白肽A抗體柱子上還原，用MALDI-Qq-TOF 多級質譜(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白質梯狀排序法(protein ladder sequencing) 進行排序。通過將分子碎成碎片，可生成蛋白質梯度(protein ladders)。然后，用質譜 對此梯度進行分析。鑒別出生物標志及其化學結構為纖維蛋白肽A (從N端至C端排列):
N端Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu"Gly-Gly-Gly-Va卜Arg C端
査已知基因組或cDNA庫數據庫中的正常纖維蛋白肽A分子的化學結構(從N端至C 端排列16個氨基酸，分子量為1536.7 Da):
N端Ala-A印-Ser-Gly-Glu-Gly-A印-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly"Gly-Gly-Val-Arg C端
生物樣品可來源于血漿，體液，分泌物，細胞溶解物，組織溶解物和器官溶解物的實 驗結果與上述血清的實驗結果(實施例1、 2)—致。
實施例3正常人血淸蛋白指紋圖譜及質譜多肽譜
定量性質譜調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清，將標準化質控血淸中用于 定i的標準峰6634.0 Da等強度調至40-50%信號強度的最大值(圖3)。圖3顯示了 正常人貳種血淸蛋白指紋圖譜及質譜多肽譜。2746 ± 1 Da、 5909 土 1 Da、 6634 土 1 Da峰 可用于分子量質控的標準峰。
結論
ffl磁珠支持基質的方法捕獲生物樣品、進行質譜分析的蛋白指紋Ji"可用計算機讀取 的條碼格式(蛋白指紋)。本發明提供確定某生物樣品在第一和第二樣品中差異存在的意 義。包括A)測定生物樣品在第一樣品中至少一種選擇性條件下的第一蛋白指紋圖B) 測定生物樣品在第二樣品中(加入某種物質或減去某種物質某種特異性單克隆抗體柱 子處理過的)相同選擇性條件下的第二蛋白指紋圖和C)比較第一和第二蛋白指紋圖之 間的差異。兩種蛋白指紋圖的差異條碼帶肯定了分析物在樣品中的臨床意義，從而判斷每 —條碼帶中單一蛋白指紋的意義。當特異性抗體量無限地增加，所測定蛋白指紋條碼帶中 單一蛋白指紋的意義可以相應增大。可用6634 i 1 Da標準峰為質譜定量質控標準；可用 2746 土 1 Da、 5909 土 1 Da、 6634 土 1 Da標準峰為質譜定性(分子量)質控標準。另可 以將某種蛋白質從抗體柱子上還原，然后將這種蛋白質用胰蛋白嗨切成多肽指紋或做N-. 端貧基酸序列分析、蛋白質梯狀排序法等進行排序以鑒定蛋白質分子序列，即最精確鑒別 (金標準)。
這些蛋白指紋中的蛋白質分子序列可以用于離體體液的試劑盒的檢測方法。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為 參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本 發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種用磁珠支持基質的方法捕獲生物樣品中蛋白質組的蛋白質分析方法，其特征是采用蛋白指紋法對生物樣品中蛋白質組或質譜多肽圖譜進行鑒別檢測。
2. 權利要求1所述的蛋白質分析方法，其中所述的鑒別檢測蛋白質組的方法是質請 法。分析所得數據的形式是可用計算機讀取的條碼格式(蛋白指紋) 一蛋白指紋法或質請 多肽圖譜法，其質譜分析范圍為0-500 kDa。每一條碼帶代表一種分子量，其顏色深淺代 表蛋白質量多與少。
3.權利要求2所述的條碼格式(蛋白指紋)，其條碼帶(分子Jt)或質镥多肽圖镥意 義的確定采用了加減法，即加入或減去某種物質來確定其質譜分子量的意義。蛋白指紋法 確定某生物樣品在第一和第二 (加入或減去某種物質)樣品中蛋白指紋差異兩種蛋白指 紋圖的差異條碼帶肯定了其分子量在生物樣品中的臨床意義，從而判斷每一條碼帶中單一 蛋白指紋的意義。用6634 土 1 Da標準峰為質譜定量質控標準；用2746 土 1 Da、 5909 土 1 Da、 6634 土 1 Da標準峰為質譜定性(分子量)質控標準。
4. 權利要求1所述的蛋白質分析方法，其中所述的蛋白指紋(條碼格式或質譜分子 量的函數圖)可以被編程計算機存儲和用軟件分析。
5. 權利要求1所述的蛋白質分析方法，在磁珠支持基質的方法所用的基質包括陰離 子、陽離子、親水、疏水或配位共價金屬螯合劑作用吸附劑.
6. 權利要求5中磁珠支持基質的方法所用吸附劑的支持物是磁性微粒或磁珠，用磁 性分離器分離磁珠及樣品，無需離心樣品。
7. 權利要求3所述的加減法中，減去某種物質所用的抗體吸附表面物質是任何能與 抗體選擇性或特異性結合的物質，如蛋白A和G (Protein A and Protein G)柱子，
8. 權利要求7中抗體吸附表面物質是用于捕獲抗原標記的單克隆或多克隆抗體.可 以無限i地增加抗體組來達到無限Jt地檢測多個或多種蛋白指紋.
9. 權利要求1所述生物樣品來源于血液，體液，分泌物，細胞溶解物，組織溶解物 和器官溶解物。生物樣品可以來自動物與植物。
10.權利要求1所述蛋白指紋圖譜在定期監測生物樣品中蛋白指紋動態變化的用途。
全文摘要
本發明涉及一種用磁珠支持基質的方法捕獲生物樣品中蛋白質組，用磁性分離器分離磁珠及樣品，無需離心樣品。然后用質潛法進行分析的蛋白指紋法。分析所得蛋白質分子量的形式是可用計算機讀取的條碼格式(蛋白指紋)。本發明提供一種確定某生物樣品中質潛條碼格式的意義。所述的條碼格式(蛋白指紋)，其條碼帶(分子量)意義的確定采用了加減法—即加入或減去某種物質來確定其質譜分子量或生物標志物譜的意義。本發明的方法可用于正常人與病人的蛋白指紋條碼帶的鑒定。蛋白指紋圖譜的重大意義在于定期監測人體活動或血液中質譜多肽譜、蛋白指紋及重要生物標志物譜的動態變化。蛋白指紋中的蛋白質單一蛋白指紋及分子序列可以用于離體體液的試劑盒的檢測方法。本方法準確、方便且快捷。
文檔編號G01N33/68GK101169416SQ20061014028
公開日2008年4月30日 申請日期2006年10月23日 優先權日2006年10月23日
發明者洋 許 申請人:洋 許