專利名稱：一種在有機玻璃上固定蛋白質分子的方法
技術領域：
本發明屬于蛋白芯片及其制作方法領域。具體是一種在有機玻璃上固定蛋白質分
子的方法。
背景技術：
蛋白質芯片技術是一種高通量、高靈敏度、微型化、自動化的蛋白質分析技術，可 用于蛋白質表達譜分析、抗原抗體篩選、藥物靶標篩選、蛋白質與蛋白質相互作用、蛋白與 小分子之間的相互作用等許多領域。蛋白質芯片技術都包括樣品制備、芯片制作、生物學反 應、信號的檢測與分析4大技術環節，其中蛋白質芯片的制備是最基礎的起始環節，而蛋白 質芯片的制作主要在于基片載體的選擇和修飾，將靶標分子通過物理吸附或化學方法固定 在某種固體基片材料上是制備生物芯片或生物傳感器的核心步驟，是制備高質量蛋白質芯 片的關鍵問題。目前制作蛋白芯片的固相支持物即基片載體有多種材料，如玻片、硅片、聚 丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等，但這些材料均需要特殊處理，從而使它們的使用往往受 到一定程度的限制，因此尋找一些新的更有效和簡便的材料和方法仍然是開發高質量蛋白 質芯片的關鍵。

發明內容
本發明的目的是提供一種在有機玻璃上固定蛋白質分子的方法，它是一種新的基
片材料和固定蛋白質分子的方法。 本發明解決上述技術問題的技術方案是 —種在有機玻璃上固定蛋白質分子的方法，是用丙酮和鉻酸液處理后的有機玻璃
作為固定蛋白質分子的載體，然后才用于固定蛋白質分子，具體制作步驟如下 1)有機玻璃的預處理 將有機玻片切裁至玻璃載玻片大小，先用市售洗潔精清洗，然后浸泡入5g/L碳酸 鈉、25g/L碳酸氫鈉混合溶液清洗，蒸餾水洗干凈后置于5(TC烘箱內烘干；
2)有機玻璃的處理 (1)烘干后的有機玻璃基片置于丙酮液浸泡作用5秒至15分鐘。
(2)用1 5g重鉻酸鉀加2 20ml蒸餾水，加熱溶解，取18 180ml重量百分 濃度為98%的濃硫酸，將硫酸緩緩加入，并攪拌配制成新鉻酸液，盛于玻璃器皿中，將經步 驟(1)處理后的有機玻璃基片在新鉻酸液中浸泡0.5 10小時取出，用蒸餾水洗3次，室
溫干燥。 3)蛋白質分子的固定 (1)用加樣器將蛋白質分子在處理好的有機玻璃基片上點樣，4t:放置0. 5 12小 時； (2)第二天用pH7. 4磷酸緩沖液清洗基片3次，濾紙吸干表面水分。 (3)滴加封閉液，如用pH7. 4磷酸緩沖液配制10%的脫脂奶粉液，封閉1小時；用
3pH7. 4磷酸緩沖液加0. 2%的吐溫液清洗3次，最后用pH7. 4磷酸緩沖液清洗1次，濾紙吸 干表面水分。 4)蛋白質分子活性判斷 滴加反應底物進行分子反應，用顯色劑或檢測儀器分析蛋白質分子與底物的反應 性質或狀態，從而作出檢驗檢測判斷。 本發明的主要特點是使用一種廉價、來源廣泛易得到的材料有機玻璃作為蛋白 質芯片制備中關鍵的基片載體，這種材料只需要經過簡單的處理就具有固定蛋白質分子， 并保持蛋白質分子生物活性的特點；這種新的制備生物芯片的材料與傳統的材料如玻片、 硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等相比，除了具有上述所說的廉價、來源易得到外， 還具有柔性和可塑性強可以通過切割、粘合、溶化等加工加工手段很方便的將其加工成不 同形狀和結構。有機玻璃的這些特性不僅對制備蛋白質芯片而且對設計和研制各種生物傳 感器或各種微型生物反應室、實驗室都是一種不可多得的獨特的材料，從而為蛋白質芯片 的制備和其他新的檢測方法的開發提供新的更有效的材料。
具體實施例方式
本發明以有機玻璃作為制作生物芯片的基片載體材料來固定蛋白質分子。有機玻 璃經過預處理后，用丙酮以及鉻酸液處理后，即可用于固定蛋白質分子，并保持蛋白質分子 的活性，從而可以完成各種生物反應，達到檢測分析的目的。 下面結合實施例對本發明方法作進一步描述。但需要說明的是，實施例并不構成
對本發明要求保護范圍的限制。
實施例1 在有機玻璃上固定蛋白質分子的方法步驟如下
(1)有機玻璃的預處理 將有機玻片切裁至玻璃載玻片大小，先用市售洗潔精清洗，然后浸泡入5g/L碳酸 鈉、25g/L碳酸氫鈉混合溶液清洗，蒸餾水洗干凈后置于50°C烘箱內烘干。
(2)有機玻璃的處理 烘干后的有機玻璃基片置于丙酮中浸泡作用3分鐘。再置于新配制的鉻酸液(5g 重鉻酸鉀加10ml蒸餾水，加熱溶解，取90ml濃硫酸，將硫酸緩緩加入，并攪拌，盛于玻璃器 皿中)浸泡作用5小時，取出蒸餾水洗3次。室溫干燥。
(3)蛋白分子固定及其活性測定 本實例用淀粉酶作為準備固定的蛋白質分子，以淀粉作為反應底物。在上述處理 好的有機玻璃基片上貼上打孔的陣列塑料標標簽紙，用加樣器在有機玻璃基片上點制濃度 為10. Og/L淀粉酶液7 ii L/孔，對照組加等量pH7. 4的磷酸緩沖液，4t:放置過夜；用pH7. 4 的PBS清洗基片3次，濾紙吸干表面水分；每孔滴加10%的脫脂奶粉(溶于pH7. 4的PBS) 封閉液7 ii L，封閉1小時；用PBST (在PBS加0. 2 %的Twen-20)洗滌液清洗3次，最后用 PBS清洗1次，濾紙吸干表面水分；每孔滴加O. 25%淀粉溶液511 L，置于濕盒內37t:攝氏度 下作用。 (4)蛋白質分子活性判斷 在上述的操作中，如果如果淀粉酶分子被固定在有機玻璃基片上并有活性的話，滴加的淀粉液中的淀粉將固定在基片上的淀粉酶被分解，加碘液后將不顯藍色。因此可以 根據加碘液后樣點有無顯藍色以及藍色的深淺可直觀快速的對基片固定蛋白分子的活性 作出快速的判斷。方法在濕盒內作用2. 0小時后取出有機玻片基片，在樣點上滴加稀碘液 (碘液作為顯色劑，稀碘液配置方法先配制原碘液稱取碘11克，碘化鉀22克，加水溶解， 稀釋至500毫升得原碘液；稀碘液取碘原液2毫升，加碘化鉀20克，稀釋至500毫升，此試 劑隨配隨用)，樣點不顯藍色，而對照基片，即沒有處理過的有機玻璃基片上的樣點呈藍色。
實施例2 在有機玻璃上固定蛋白質分子的方法步驟如下
(1)有機玻璃的預處理同例1。
(2)有機玻璃的處理同例1。
(3)蛋白分子固定及其活性測定 本實施例用兔IgG(即兔免疫球蛋白G)作為準備固定的蛋白質分子，以異硫氰酸 熒光素(FITC)標記的羊抗兔IgG作為反應底物。如果能將兔IgG固定在處理過的有機玻 璃基片上，并且固定的兔IgG保持活性，那么則固定的蛋白質分子兔IgG與異硫氰酸熒光素 (FITC)標記的羊抗兔IgG出現結合反應，這種反應的結果可以通過儀器(如GeneTACTMl000 芯片掃描儀)來檢測標記的熒光素發出的熒光進行判斷。 用加樣器以陣列方式將濃度為1.0g/L兔IgG(用pH7.4磷酸緩沖液配制)點制到 處理過的有機玻璃表面，4t:放置過夜；用pH7. 4的PBS清洗基片3次，濾紙吸干表面水分； 每孔滴加10%的脫脂奶粉(溶于pH7. 4的PBS)封閉液7ii L，封閉1小時；再用PBST(在 pH7. 4磷酸緩沖液加0. 2%的吐溫-20)洗滌液清洗3次，最后用PBS清洗1次。把羊抗兔 IgG-FITC溶液加到蛋白芯片陣列表面(用PBS制成濃度為lmg/L的羊抗兔IgG-FITC溶 液)，在室溫下作用1小時，用pH7. 4的PBST緩沖液清洗有機玻片3次，最后用蒸餾水清洗 l次。用GeneTACTMlOOO芯片掃描儀可檢測到有機玻璃基片上樣點陣列的熒光。根據掃描 的熒光強度數據即可判斷有機玻璃上結合的蛋白質分子的量和反應活性。
權利要求
一種在有機玻璃上固定蛋白質分子的方法，其特征在于，是用丙酮和鉻酸液處理后的有機玻璃作為固定蛋白質分子的載體，然后才用于固定蛋白質分子，具體制作步驟如下1)有機玻璃的預處理將有機玻片切裁至玻璃載玻片大小，先用市售洗潔精清洗，然后浸泡入5g/L碳酸鈉、25g/L碳酸氫鈉混合溶液清洗，蒸餾水洗干凈后置于50℃烘箱內烘干；2)有機玻璃的處理(1)烘干后的有機玻璃基片置于丙酮液浸泡作用5秒至15分鐘；(2)用1～5g重鉻酸鉀加2～20ml蒸餾水，加熱溶解，取18～180ml重量百分濃度為98％的濃硫酸，將硫酸緩緩加入，并攪拌配制成新鉻酸液，盛于玻璃器皿中，將經步驟(1)處理后的有機玻璃基片在鉻酸液中浸泡0.5～10小時取出，用蒸餾水洗3次，室溫干燥；3)蛋白質分子的固定(1)用加樣器將蛋白質分子在處理好的有機玻璃基片上點樣，4℃放置0.5～12小時；(2)第二天用pH7.4磷酸緩沖液清洗基片3次，濾紙吸干表面水分；(3)滴加封閉液，如用pH7.4磷酸緩沖液配制10％的脫脂奶粉液，封閉1小時；用pH7.4的磷酸緩沖液加0.2％的吐溫液清洗3次，最后用pH7.4的磷酸緩沖液清洗1次，濾紙吸干表面水分；4)蛋白質分子活性判斷滴加反應底物進行分子反應，用顯色劑或檢測儀器分析蛋白質分子與底物的反應性質或狀態，從而作出檢驗檢測判斷。
全文摘要
本發明公開了一種在有機玻璃上固定蛋白質分子的方法。是用丙酮和鉻酸液處理后的有機玻璃作為固定蛋白質分子的載體，然后才用于固定蛋白質分子。具體制作步驟是1)有機玻璃的預處理，2)有機玻璃的處理，3)蛋白質分子的固定和4)蛋白質分子活性判斷。本發明為蛋白質芯片的制備提供了新的可塑性強、處理簡便、來源容易、經濟的載體材料。
文檔編號G01N1/36GK101776546SQ201010045620
公開日2010年7月14日 申請日期2010年1月8日 優先權日2010年1月8日
發明者陳漢忠 申請人:廣西大學