專利名稱：新風膠囊水溶性蛋白分子量檢測方法
技術領域：
本發明涉及中藥類水溶性蛋白分子量的檢測領域，具體是涉及一種新風膠囊水溶性蛋白分子量檢測方法。
背景技術：
新風膠囊系安徽中醫學院第一附屬醫院的醫院制劑(皖藥制Z20050062)，該藥由黃芪、薏苡仁、雷公藤和蜈蚣4味中藥組成，具有益氣健脾，化濕通絡之功效，具有廣闊的開發前景。隨著分子生物學的快速發展及應用，為中藥的質量控制提供了新的思路。由于中藥主要來源于動植物等生物體，其細胞內都含有受遺傳基因調控、代表其品種特征性的蛋白質分子，不同蛋白質的分子大小、空間結構和電荷數目上的差異，可以通過電泳得到分離。因此，應用現代分子生物學的原理和方法，將中藥制劑質量評價技術從形態、組織、細胞推進到分子水平，對中藥制劑中蛋白質成分分析，可以解決目前中藥制劑鑒定以及內在質量評價的難題。

發明內容
針對現有技術中存在的技術問題，本發明提供了一種新風膠囊水溶性蛋白分子量檢測方法，將SDS-PAGE電泳方法應用于新風膠囊中水溶性蛋白成分測定，為建立該制劑電泳特征圖譜提供依據。為了實現上述目的，采用的技術方案如下:新風膠囊水溶性蛋白分子量檢測方法，其特征在于，包括如下步驟:①、試劑的配制電極緩沖液，稱取甘氨酸5.0g、三羥甲基氨基甲烷3.0g，十二烷基磺酸鈉1.0g，力口適量雙蒸水溶解后，用lmol/1鹽酸調pH至8.3，然后加雙蒸水至1000ml，置于4°C保存；固定液，稱取三氯醋酸5.0g,加雙蒸水200ml溶解后，加甲醇200ml，再加雙蒸水至500ml ；考馬斯亮藍脫色液，量取乙醇400ml、冰醋酸IOOml與雙蒸水500ml，混勻；I %瓊脂糖溶液，稱取瓊脂糖0.2g，加電極緩沖液20ml，加熱溶解成澄清溶液；10%過硫酸銨溶液,稱取過硫酸銨0.“，加Iml雙蒸水溶解至澄清；②、供試品溶液的制備取新風膠囊內容物5.0g，于研缽中研成細粉，加6ml IM Tris-HCl緩沖液溶解，研勻，靜置5min, 4000r/min離心20min,吸取上清液900 μ I,加300 μ I 4X蛋白質上樣緩沖液混合，沸水浴5min，以12000r/min離心20min，冷卻后吸取上清液分裝，每管分裝20 μ 1，-20°C貯存；③、電泳槽的安裝電泳槽的各部件在組裝前均需清洗干凈，選擇水平操作臺面，首先將白色內芯放入黑色內槽中，然后將電泳玻璃采取凹形玻璃板在白色內芯內側、矩形玻璃板在白色內芯外側的方向，順著白色內芯一側的膠條小心放入內芯；當兩側的玻璃全部放入到白色內芯后，確認凹、平板的底部邊緣均與黑色內槽密封槽平齊，旋緊緊固旋鈕；用移液槍吸取1%瓊脂糖溶液，沿密封槽一端灌入封閉玻璃板，為防止留存氣泡，稍抬起一端趕去氣泡，瓊脂糖溶液需進入膠室0.9 1.1cm,凝固5 7min后進行灌膠操作；④、凝膠的制備按4ml 1.5M Tris-HCl緩沖液、6.7ml 30%丙烯酰胺、1.6ml 1%十二烷基磺酸鈉、
0.1ml 10%四甲基乙二胺、0.1ml 10%過硫酸銨和3.3ml雙蒸水配制12.5%分離膠溶液，
然后開始灌膠，并防止氣泡產生，水封室溫下聚合；待分離膠溶液聚合后，用濾紙吸取上面的水層，再灌入4.5%濃縮膠溶液，并插上樣品梳，4.5%濃縮膠溶液按1.35ml 30%丙烯酰胺、0.9ml I %十二烷基磺酸鈉、0.07ml10%四甲基乙二胺、0.07ml 10%過硫酸銨、2.25ml IM Tris-HCl緩沖液和4.33ml雙蒸水配制；⑤、上樣與電泳待濃縮膠溶液聚合后，雙手輕取出梳子，提住白色把手將黑色內槽放入外槽中，用微量注射器吸取樣品提取液5μ 1，緩緩注入加樣孔中，動作要輕，不能破壞膠面；在黑色內槽內部和外部分別加注電極緩沖液，內部液面高度要高過凹板下沿10mm，外部液面高度為外槽的1/3 ；蓋上安全蓋，接通電泳儀，80v電壓I小時后，待溴酚藍示蹤指示劑前沿到達分離膠上沿時，把電壓調至ΙΟΟν，待示蹤指示劑行至距瓊脂層0.9 1.1cm時，關閉電源，停止電泳，整個電泳過程需要3 4個小時；⑥、染色與脫色電泳結束后，打開電泳槽，取出凝膠，切去濃縮膠，保留分離膠并標記溴酚藍前沿，置固定液中固定半小時后，取凝膠放入適量考馬斯亮藍染色液中，確保染色液可以充分覆蓋凝膠，置于水平搖床上緩慢搖動，室溫染色1.5 2.5小時；倒出染色液，加入適量考馬斯亮藍脫色液，確保考馬斯亮藍脫色液可以充分覆蓋凝膠，置于水平搖床上緩慢搖動，室溫脫色3.5 4.5小時；更換考馬斯亮藍脫色液2 4次，直至藍色背景全部被脫去，并且蛋白條帶染色效果達到預期，完成脫色后，把凝膠保存在含20%甘油的水中，進行拍照；對拍射照片進行光密度積分值分析；⑦、蛋白質分子量的測定根據樣品遷移距離/指示劑遷移距離計算相對遷移率，以標準蛋白質分子量對數對其相對遷移率作標準曲線，根據待測樣品相對遷移率查該曲線，計算其分子量。本發明新風膠囊水溶性蛋白分子量檢測方法，運用分子生物學和指紋圖譜的原理與技術，將先進的生物技術與指紋圖譜新思路相結合，運用SDS-PAGE電泳技術，對新風膠囊中水溶性蛋白成分分析，為今后建立該制劑電泳特征圖譜提供依據。


為了便于本領域技術人員理解，下面結合附圖對本發明作進一步的說明。圖1是含Marker的新風膠囊水溶性蛋白SDS-PAGE電泳圖。圖2是寬分子量標準蛋白曲線。
具體實施例方式一、儀器與材料1、儀器SYZ-B型石英亞沸高純水蒸餾器(江蘇金壇市環宇科學儀器廠)。PHS-25型實驗室pH計(上海今邁儀器儀表有限公司)。BP211D型十萬分之一電子天平(德國賽多利斯公司)。HH-S型水浴鍋(鄭州長城科工貿有限公司)。手動移液器(BIOHIT)。80-2離心沉淀器(上海手術器械廠)。KDC-16H高速離心機(科大創新股份有限公司中佳分公司)。JY-JX系列垂直電泳槽、JY-C系列電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)。WD-9405B脫色搖床(北京六一儀器廠)。2、材料新風膠囊(由安徽省中醫院制劑中心提供，批號:20120112、20111025)。甘氨酸Glycine (Solarbio ;Cat#G8200)。十二烷基磺酸鈉SDS (Sigma ;20110105488)。三羥甲基氨基甲烷TRIS(Sigma)。三氯醋酸(天津市光復精細化工研究所；批號:2010.6.17)。瓊脂糖(GENECOMPANY LTO ；L0T N0.111860)。IM Tris-HCl 緩沖液(Solarbio ；Cat.N0.T1020 Lot.N0.20110307)。1.5MTris-HCl 緩沖液(Solarbio ；Cat.N0.TlOlO Lot.N0.20110307)。PageRuIer Unstained Protein ladder (Thermo Scientific,賽默飛世爾科技Lot#000961)。4X 蛋白質上樣緩沖液(Solarbio ；Cat.N0.P1015 Lot.N0.20110222)。30 % 丙烯酰胺(29: I) (30 % Arc-Bis) (Solarbio ；Cat.N0.AlOlOLot.N0.20101020)。四甲基乙二胺TEMED (Beyot ime ；ST728)。過硫酸銨Ammonium Persulfate (Sigma A6761)。考馬斯亮藍染色液(Beyotime ；P0017B)碧云天生物技術研究所。H2O為雙蒸水,余試劑為分析純。二、新風膠囊水溶性蛋白分子量檢測方法①、試劑的配制電極緩沖液，稱取甘氨酸5.0g、三羥甲基氨基甲烷3.0g，十二烷基磺酸鈉1.0g，力口適量雙蒸水溶解后，用lmol/1鹽酸調pH至8.3，然后加雙蒸水至1000ml，置于4°C保存。
固定液，稱取三氯醋酸5.0g,加雙蒸水200ml溶解后，加甲醇200ml，再加雙蒸水至500ml ο考馬斯亮藍脫色液，量取乙醇400ml、冰醋酸IOOml與雙蒸水500ml，混勻。I %瓊脂糖溶液，稱取瓊脂糖0.2g，加電極緩沖液20ml，加熱溶解成澄清溶液。10%過硫酸銨溶液,稱取過硫酸銨0.1g,加Iml雙蒸水溶解至澄清。②、供試品溶液的制備取新風膠囊內容物5.0g，于研缽中研成細粉，加6ml IM Tris-HCl緩沖液溶解，研勻，靜置5min, 4000r/min離心20min,吸取上清液900 μ I,加300 μ I 4X蛋白質上樣緩沖液混合，沸水浴5min，以12000r/min離心20min，冷卻后吸取上清液分裝，每管分裝20 μ 1，-20°C貯存。③、電泳槽的安裝電泳槽的各部件在組裝前均需清洗干凈，選擇水平操作臺面，首先將白色內芯放入黑色內槽中，然后將電泳玻璃采取凹形玻璃板在白色內芯內側、矩形玻璃板在白色內芯外側的方向，順著白色內芯一側的膠條小心放入內芯。當兩側的玻璃全部放入到白色內芯后，確認凹、平板的底部邊緣均與黑色內槽密封槽平齊，旋緊緊固旋鈕。用移液槍吸取1%瓊脂糖溶液，沿密封槽一端灌入封閉玻璃板，為防止留存氣泡，稍抬起一端趕去氣泡，瓊脂糖溶液需進入膠室1cm，凝固5 7min后進行灌膠操作。④、凝膠的制備按4ml 1.5M Tris-HCl緩沖液、6.7ml 30%丙烯酰胺、1.6ml 1%十二烷基磺酸鈉、
0.1ml 10%四甲基乙二胺、0.1ml 10%過硫酸銨和3.3ml雙蒸水配制12.5%分離膠溶液，
然后開始灌膠，并防止氣泡產生，水封室溫下聚合。待分離膠溶液聚合后，用濾紙吸取上面的水層，再灌入4.5%濃縮膠溶液，并插上樣品梳，4.5%濃縮膠溶液按1.35ml 30%丙烯酰胺、0.9ml I %十二烷基磺酸鈉、0.07ml10%四甲基乙二胺、0.07ml 10%過硫酸銨、2.25ml IM Tris-HCl緩沖液和4.33ml雙蒸水配制。⑤、上樣與電泳 待濃縮膠溶液聚合后，雙手輕取出梳子，提住白色把手將黑色內槽放入外槽中，用微量注射器吸取樣品提取液5 μ 1，緩緩注入加樣孔中，動作要輕，不能破壞膠面。在黑色內槽內部和外部分別加注電極緩沖液，內部液面高度要高過凹板下沿10mm，外部液面高度為外槽的1/3。蓋上安全蓋，接通電泳儀，80v電壓I小時后，待溴酚藍示蹤指示劑前沿到達分離膠上沿時，把電壓調至ΙΟΟν，待示蹤指示劑行至距瓊脂層Icm時，關閉電源，停止電泳，整個電泳過程需要3 4個小時。⑥、染色與脫色電泳結束后，打開電泳槽，取出凝膠，切去濃縮膠，保留分離膠并標記溴酚藍前沿，置固定液中固定半小時后，取凝膠放入適量考馬斯亮藍染色液中，確保染色液可以充分覆蓋凝膠，置于水平搖床上緩慢搖動，室溫染色2小時。倒出染色液，加入適量考馬斯亮藍脫色液，確保考馬斯亮藍脫色液可以充分覆蓋凝膠，置于水平搖床上緩慢搖動，室溫脫色4小時。更換考馬斯亮藍脫色液2 4次，直至藍色背景全部被脫去，并且蛋白條帶染色效果達到預期，完成脫色后，把凝膠保存在含20 %甘油的水中，進行拍照。采用凝膠圖像分析軟件BandScan5.0對拍攝的照片進行光密度積分值分析。⑦、蛋白質分子量的測定根據樣品遷移距離/指示劑遷移距離計算相對遷移率，以標準蛋白質分子量對數對其相對遷移率作標準曲線，根據待測樣品相對遷移率查該曲線，計算其分子量。三、檢測結果將樣品與Thermo Scientific公司生產的寬分子量標準蛋白(分子量標準)加在同一塊凝膠上電泳，結果請參閱圖1，圖1中，1、2為樣品(批號分別為:20120112、20111025) ;M為寬相對分子質量標準蛋白(自上至下相對分子質量分別為200，150，120，100,85,70,60,50,40,30,25,20,15，IOkDa)。通過圖1可知，寬分子量標準蛋白在SDS-PAGE梯度凝膠上可見14條帶，以各帶的遷移率(Rf)為橫坐標，相應的蛋白質分子量的對數值為縱坐標作圖，通過SPSS16.0統計學軟件，可得到分子量的標準曲線圖，請參閱圖2，其蛋白質分子量的對數值與相對遷移率(Rf)關系的標準曲線方程:Y = -1.616Χ+5.202 (r = 0.968 ；r2 = 0.936)。根據SDS-PAGE圖譜上主要待測蛋白質點的縱向遷移率，便可從標準曲線上測定相應的分子量。新風膠囊水溶性蛋白成分共分離出深淺不一的35條蛋白帶，蛋白質大小在12.5kDa 200kDa范圍內均有分布，其中主帶有2條，其分子量分別為16.38kDa、17.07kDa左右，每條軌道2主帶的蛋白含量分別占各自軌道總蛋白的86.8%，84.9%。四、結果分析1、新風膠囊水溶性蛋白成分SDS-PAGE電泳圖譜有2條特強的蛋白帶，分子量分別為16.38kDa、17.07kDa。這2條蛋白帶，可作為新風膠囊水溶性蛋白成分特征指標。2、SDS-PAGE電泳最佳條件篩選考馬斯亮藍染色目前廣泛運用的是考馬斯亮藍R-250，其原理是利用考馬斯亮藍分子上的芳香苯環，與蛋白質的疏水區結合；同時其亞硫酸基團(-SO32O與蛋白質的正電荷結合，可使蛋白質染出藍色條帶。該法簡單、快速，是蛋白質電泳檢測和定量分析常用的一種方法。但是該方法靈敏度相對不高，且背景較高。而且在試驗過程中發現，由于蛋白質特性不同，堿性蛋白和低分子量蛋白在醇、酸固定及脫色時，如果時間控制不好，則容易從凝膠中洗脫下來。中藥復方制劑以水提工藝為主，制劑中可溶性蛋白質的種類較多，分子量變化范圍大，且每種蛋白質的含量也不一樣，為了獲得較理想的電泳效果，要選擇適當的凝膠濃度和上樣量。其他條件如實驗室的溫濕度、試劑的配制新鮮與否、瓊脂糖封底齊否、有無氣泡產生、水封等因素，也影響試驗結果。通過上述試驗數據結果表明，分離膠濃度取12.5%、每槽上樣量為5 μ I時，電泳效果最好。以上內容僅僅是對本發明的構思所作的舉例和說明，所屬本技術領域的技術人員對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，只要不偏離發明的構思或者超越本權利要求書所定義的范圍，均應屬于本發明的保護范圍。
權利要求
1.新風膠囊水溶性蛋白分子量檢測方法，其特征在于，包括如下步驟: ①、試劑的配制 電極緩沖液，稱取甘氨酸5.0g、三羥甲基氨基甲烷3.0g，十二烷基磺酸鈉1.0g，加適量雙蒸水溶解后，用lmol/1鹽酸調pH至8.3，然后加雙蒸水至1000ml，置于4°C保存； 固定液，稱取三氯醋酸5.0g,加雙蒸水200ml溶解后，加甲醇200ml，再加雙蒸水至.500ml ； 考馬斯亮藍脫色液，量取乙醇400ml、冰醋酸IOOml與雙蒸水500ml，混勻； I %瓊脂糖溶液，稱取瓊脂糖0.2g，加電極緩沖液20ml，加熱溶解成澄清溶液； . 10%過硫酸銨溶液,稱取過硫酸銨0.1g,加Iml雙蒸水溶解至澄清； ②、供試品溶液的制備 取新風膠囊內容物5.0g,于研缽中研成細粉，加6ml IM Tris-HCl緩沖液溶解，研勻，靜置5min,4000r/min離心 20min,吸取上清液900 μ I,加300 μ I 4Χ蛋白質上樣緩沖液混合，沸水浴5min，以12000r/min離心20min，冷卻后吸取上清液分裝，每管分裝20μ 1，-20°C貯存； ③、電泳槽的安裝 電泳槽的各部件在組裝前均需清洗干凈，選擇水平操作臺面，首先將白色內芯放入黑色內槽中，然后將電泳玻璃采取凹形玻璃板在白色內芯內側、矩形玻璃板在白色內芯外側的方向，順著白色內芯一側的膠條小心放入內芯； 當兩側的玻璃全部放入到白色內芯后，確認凹、平板的底部邊緣均與黑色內槽密封槽平齊，旋緊緊固旋鈕； 用移液槍吸取I %瓊脂糖溶液，沿密封槽一端灌入封閉玻璃板，為防止留存氣泡，稍抬起一端趕去氣泡，瓊脂糖溶液需進入膠室0.9 1.1cm，凝固5 7min后進行灌膠操作； ④、凝膠的制備 按4ml 1.5M Tris-HCl緩沖液、6.7ml 30 %丙烯酰胺、1.6ml I %十二烷基磺酸鈉、.0.1ml 10%四甲基乙二胺、0.1ml 10%過硫酸銨和3.3ml雙蒸水配制12.5%分離膠溶液，然后開始灌膠，并防止氣泡產生，水封室溫下聚合； 待分離膠溶液聚合后，用濾紙吸取上面的水層，再灌入4.5%濃縮膠溶液，并插上樣品梳，4.5%濃縮膠溶液按1.35ml 30%丙烯酰胺、0.9ml I %十二烷基磺酸鈉、0.07ml 10%四甲基乙二胺、0.07ml 10%過硫酸銨、2.25ml IM Tris-HCl緩沖液和4.33ml雙蒸水配制; ⑤、上樣與電泳 待濃縮膠溶液聚合后，雙手輕取出梳子，提住白色把手將黑色內槽放入外槽中，用微量注射器吸取樣品提取液5μ 1，緩緩注入加樣孔中，動作要輕，不能破壞膠面； 在黑色內槽內部和外部分別加注電極緩沖液，內部液面高度要高過凹板下沿10mm，夕卜部液面高度為外槽的1/3 ； 蓋上安全蓋，接通電泳儀，80v電壓I小時后，待溴酚藍示蹤指示劑前沿到達分離膠上沿時，把電壓調至ΙΟΟν，待示蹤指示劑行至距瓊脂層0.9 1.1cm時，關閉電源，停止電泳，整個電泳過程需要3 4個小時； ⑥、染色與脫色 電泳結束后，打開電泳槽，取出凝膠，切去濃縮膠，保留分離膠并標記溴酚藍前沿，置固定液中固定半小時后，取凝膠放入適量考馬斯亮藍染色液中，確保染色液可以充分覆蓋凝膠，置于水平搖床上緩慢搖動，室溫染色1.5 2.5小時； 倒出染色液，加入適量考馬斯亮藍脫色液，確保考馬斯亮藍脫色液可以充分覆蓋凝膠，置于水平搖床上緩慢搖動，室溫脫色3.5 4.5小時； 更換考馬斯亮藍脫色液2 4次，直至藍色背景全部被脫去，并且蛋白條帶染色效果達到預期，完成脫色后，把凝膠保存在含20%甘油的水中，進行拍照； 對拍射照片進行光密度積分值分析； ⑦、蛋白質分子量的測定 根據樣品遷移距離/指示劑遷移距離計算相對遷移率，以標準蛋白質分子量對數對其相對遷移率作標準曲線，根據待測樣 品相對遷移率查該曲線，計算其分子量。
全文摘要
本發明涉及中藥類水溶性蛋白分子量的檢測領域，具體是涉及一種新風膠囊水溶性蛋白分子量檢測方法。本發明新風膠囊水溶性蛋白分子量檢測方法，運用分子生物學和指紋圖譜的原理與技術，將先進的生物技術與指紋圖譜新思路相結合，運用SDS-PAGE電泳技術，對新風膠囊中水溶性蛋白成分分析，為今后建立該制劑電泳特征圖譜提供依據。通過實驗可知，新風膠囊水溶性蛋白共分離出成分深淺不一的35條蛋白帶，蛋白質大小在12.5kDa～200kDa范圍內均有分布，其中主帶有2條，其分子量分別為16.38kDa、17.07kDa左右，這2條主帶，可作為新風膠囊水溶性蛋白成分特征指標。
文檔編號G01N1/30GK103149262SQ201310011369
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月11日 優先權日2013年1月11日
發明者劉健, 孟楣, 高家榮, 王曉玉, 姜輝 申請人:安徽中醫學院第一附屬醫院