專利名稱::蛋白功能的體外分子進化方法
技術領域:
:本發明涉及蛋白功能的體外分子進化方法,其允許控制引入選擇的母蛋白質區域的變異性。
背景技術:
:可通過包括定點誘變(Alber&a/.,Nature,5;330(6143):41-46,1987)、組合克隆(Huse&a/.,Science,246:1275-1281,1989;Marksd"/.,Biotechnology,10:779-783,1992)以及同適當的選擇系統組合的隨機誘變(Barbasda/.,PNAS.USA,89:4457-4461,1992)的多種體外方法修飾和改善蛋白功能。已經在許多情況下使用了同選擇共同使用的隨機誘變方法以改善蛋白功能,且存在兩個不同的策略。首先,隨機化整條基因序列并結合選擇具有期望特性的變體(突變)蛋白,然后是新一輪的隨機誘變和選擇。然后可重復該方法直至發現認為是優化的蛋白變體(SchierR."《J.Mol.Biol.1996263(4):551-567)。在這里,引入突變的傳統途徑是通過具有大約0.7呢突變率的易錯PCR(LeungWW.,Technique,1:11-15,1989)。其次,可使用允許高達100%突變率的簡并引物誘變基因的確定區域(GriffithsEMBO.J,13:3245-3260,1994;Yang"aZ"J.Mol.Biol.254:392-403,1995)。在抗體工程領域廣泛使用了隨機突變。可在體外克隆體內形成的抗體基因(LarrickdBiochem.Biophys.Res.Commun.160:1250-1256,1989)并且可將編碼可變重鏈和輕鏈基因的基因的隨機組合置于選擇中(Marks"a/.,Biotechnology,10:779-783,1992)。可使用隨機誘變和額外的多輪選擇進一步改善通過這些方法選擇的功能抗體片段(SchierR."W.,J.Mol.Biol.1996263(4):551-567)。典型地,隨機誘變策略后進行選擇。可選擇具有目標特性的變體并且可將來源于每一種均具有目標特性的不同變體的突變DNA區域組合成一條編碼序列(Yang"aZ.,J.Mol.Biol.254:392-403,1995)。也已經使用了基因的組合配對來改善蛋白功能,如抗體親和性(Marks"Biotechnology,10:779-783,1992)。另一種己知的用于蛋白功能體外突變的也稱為"DNA改組"(DNAshuffling)的方法利用了DNA的隨機片段化和片段組裝成功能編碼序列(Stemmer,Nature370:389-391,1994)。DNA改組方法通過重組組合來源于單個基因的有用突變而產生多樣性。不同蛋白,如酶和細胞因子的人工進化已經成功使用了該方法(Chang"NatureBiotech.17,793-797,1999;Zhang"a/.Pro"Natl.Acad.Sci.USA94,4504-4509,1997;Christians"NatureBiotech.17,259-264,1999)。使用DNA酶I將基因隨機片段化,然后通過彼此間重組進行重新組合。起始材料能是單個基因(使用易錯PCR第一個隨機突變的)或天然發生的同源序列(所謂的家族改組)。DNA酶I優先在靠近嘧啶核苷酸的位點水解DNA,因此,它是DNA隨機片段化的合適選擇。然而,該活性依賴于Mg或Mn離子,Mg離子限制了片段大小到50bp,而Mn離子將給出低于50bp的片段大小。因此,為了擁有用于重組的所有可能的大小,上述基因需要用DNA酶I在存在兩種不同離子之一的情況下處理至少兩次,然后除去這些非常相同的離子。盡管,在理論上,在任何克隆間改組DNA是可能的,假如產生的改組的基因關于表達和活性是有功能的,優選地,除了低水平的隨機突變,待改組的克隆必須是相關的或甚至是相同的。遺傳上不同的克隆間的DNA改組通常生產非功能性基因。
發明內容本發明尋求提供體外蛋白進化的改善方法。特別地,本發明的目標是提供允許控制引入選擇的母多核苷酸序列的區域內的變異性程度的方法。因此,根據本發明的第一方面提供的是用于從母多核苷酸分子產生變體多核苷酸分子或其群體的方法,該方法包括下述步驟(a)提供多核苷酸分子的第一群體和多核苷酸分子的第二群體,第一和第二群體共同組成母多核苷酸分子的正鏈和負鏈;(b)用核酸酶消化多核苷酸分子的第一和第二群體以產生多核苷酸片段;(c)將所述產生自正鏈的多核苷酸片段同產生自負鏈的片段接觸(在允許片段退火的條件下);和(d)擴增退火到彼此的片段以產生至少一條其序列與母多核苷酸分子不同的多核苷酸分子其中通過加入一條或更多條具有預決的變異性的寡核苷酸控制在歩驟(d)中產生的至少一條多核苷酸分子的選擇區域內的序列變異性程度,該寡核苷酸退火到位于母多核苷酸分子3'和5'末端核苷酸之間但排除該3'和5'末端核苷酸的序列。本發明的方法提供的主要優點是,它們允許控制通過加入一條或更多條具有預決的變異性的寡核苷酸引入到母多核苷酸序列內的序列變異性的程度。這樣的寡核苷酸能退火(優選在高嚴謹條件下)到存在于一條或更多條母多核苷酸序列內的內部目標序列。具有預決的變異性的寡核苷酸能退火到位于母多核苷酸分子的3'或5'末端核苷酸間但排除該3'或5'末端核苷酸的內部序列(使得寡核苷酸不能退火到3'或5'末端核苷酸)。因此,術語'具有預決的變異性的寡核苷酸'未預期包圍3'或5'端引物序列或全長模板。然而,最好是步驟(c)額外地包括加入在退火條件下退火到至少一條母多核苷酸的3'和/或5'端的引物序列。在本發明的方法的優選實施方案中,其中多核苷酸的第一和第二群體是單鏈的,在步驟(b)前或步驟(b)中加入具有預決的變異性的寡核苷酸,并且用來消化母多核苷酸的核酸酶對單鏈多核苷酸特異(例如,Sl核酸酶、Exol、ExoT和綠豆核酸酶)。當被這樣加上時,寡核苷酸退火/雜交到單鏈母多核苷酸的第一和第二群體,借此產生其因此免受單鏈特異性核酸酶消化的雙鏈區域(參見圖2)。作為結果,該受保護序列內的變異性在步驟(d)中生產的因而發生的多核苷酸內是受控制的。在可選的優選實施方案中,在步驟(b)后歩驟(c)前或步驟(c)中加入具有預決的變異性的寡核苷酸。在該實施方案中,通過核酸酶消化生產的多核苷酸片段同寡核苷酸釘在一塊,其然后在再退火/雜交過程中被整合入在歩驟(d)中生產的變體多核苷酸中(參見圖3)。再一次地,優選地,在該實施方案中的多核苷酸的第一和第二群體是單鏈的。通過使用具有預決的變異性的寡核苷酸完成引入通過使用本發明的方法生產的變體多核苷酸內的變異性控制。例如,可通過使用本領域公知的方法,如易錯PCR或通過使用寡核苷酸合成(如那些能從德國埃伯斯貝格MWGBiotech商業購得的)生產整合變化的核苷酸序列變異性程度(從沒有變異性到高變異性)的寡核苷酸。因此,最好是具有預決的變異性的寡核苷酸序列的知識不是基本的;重要的是,寡核苷酸內的變異性程度是已知的(假如不是絕對的了解,至少是相對的了解)。有利地,具有預決的變異性的寡核苷酸同母多核苷酸序列的內部序列分享至少90%的序列同一性,例如至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。可通過使用合適的計算機程序測定兩條多核苷酸間的序列同一性百分比,許多這樣的程序可在線獲得(例如參見www.hgmp.mrc.ac.uk/GenomeWeb/nuc-mult.html)。例如,可通過使用ClustalW程序分析序列同一性(Thompsone/a/.,(1994)7VMc/e/c^c/A22,4673-80)。使用的參數可以如下快速配對比對參數K-字長(字)大小;1,窗口大小;5,空位罰分;3,頂對角線數目;5.打分方法X百分比。多比對參數起始空位罰分;10,延伸空位罰分;0.05。打分矩陣BLOSUM。在優選的實施方案中,具有預決的變異性的寡核苷酸同母多核苷酸序列的內部序列分析了100%的序列同一性。因此,寡核苷酸可能全部具有相同的核苷酸序列。在可選的實施方案中,具有預決的變異性的寡核苷酸具有至少兩條不同的序列。優選地,寡核苷酸是具有母多核苷酸序列的相同內部序列的變體。最好地,可將具有預決的變異性的寡核苷酸靶向母多核苷酸的相同內部序列或不同內部序列。在優選的實施方案中,具有預決的變異性的寡核苷酸同母多核苷酸的至少兩個不同區域分析100%序列同一性,或是母多核苷酸的至少兩個不同區域的變體。最好地,具有預決的變異性的寡核苷酸可能具有任何長度,只要它們不組成全長模板。然而,優選地,寡核苷酸的長度在10和500個核苷酸之間。更優選地,寡核苷酸的長度在50和200個核苷酸之間,例如長度為大約100個核苷酸。本發明提供產生母多核苷酸序列的變體形式的方法。最好地,可在任何編碼包括具有結合或催化性質的任何蛋白質,例如抗體或抗體的部分、酶或受體的多肽產物的多核苷酸上進行本發明的方法。此外,可依照本發明突變具有可能改變的功能的多核苷酸,如催化RNA。優選地,編碼一條或更多條蛋白基序的母多核苷酸長度至少是12個核苷酸,更優選地,長度至少為20個核苷酸,更優選地,長度超過50個核苷酸。可使用長度為至少100個核苷酸或長度甚至至少200個核苷酸的多核苷酸。當使用的母多核苷酸編碼巨大蛋白如酶或抗體時,其長度可能是好幾百或數千個堿基。可在任何大小的母多核苷酸上進行本發明。有利地,在步驟(d)中生產的至少一條多核苷酸分子的改變的序列與該多核苷酸或借此編碼的多肽的改變的性質或特性相關。通過本發明的方法產生的多核苷酸或多肽的改變的性質或特性可能是野生型(母)多核苷酸或其編碼的多肽、蛋白或蛋白基序的正常活性中的任何變異或改變。例如,可按下述方式應用本發明的方法(i)或正向或負向地調整酶的催化活性;(ii)調整抗體的結合特異性和/或親和性;(iii)調整配體-受體相互作用的結合特異性和/或親和性,如白介素和它的受體間的(通過生產配體和/或受體的變體);(iv)調整多肽單體形成多體形式的能力,如在用于疫苗的病毒衣殼蛋白中;(v)調整免疫原刺激抵抗它的特異抗體的生產能力;和(vi)調整蛋白的穩定性(如激素和生長因子的血清穩定性)。因此,最有利地,可使用本發明的方法改變任何蛋白、多肽或多核苷酸的性質/功能。本領域公知檢測通過本發明的方法產生的變體多核苷酸或多肽的改變的性質的方法。例如,噬菌體展示技術的發展已經徹底改變了分子文庫中功能蛋白的選擇(Parmley"Gene,73:;McCafferty"Nature,348:552-554,1990;Barbas"PNAS.USA,88:7978-7982,1991)。在該方法中,表型(蛋白)與它相應的基因型(DNA)直接連接并且這允許有遺傳物質的直接克隆的余地,其然后能被進一步修飾以改善蛋白功能。已使用噬菌體展示來從具有高達1011個轉化體大小的多種分子文庫中克隆功能結合劑(Griffiths"d.,EMBO.J.13:3245-3260,1994)。因此,能使用噬菌體展示來從分子文庫中直接克隆功能結合劑,也能使用噬菌體展示來進一步改善最初選擇的克隆。已經用于蛋白文庫的表面表達及其選擇的其它類型病毒是桿狀病毒(Boublik"Biotechnol13:1079-1084.1995;Mottershead"BiochemBiophysResCom238:717-722,1997;Grabherr"ZBiotechniques22:730-735,1997)禾口反轉錄病毒(Buchholz"dNatureBiotechnoll6:951-954,1998)。也可使用細胞表面展示從分子文庫中選擇功能蛋白。此處也是如此,表型同它相應的基因型直接相連。已使用細菌細胞表面展示進行例如改善的羧甲基纖維素酶(CMCase)變體的篩選(KimWApplEnvironMicrobiol66:788-93,2000)。其它能用于該目的的細胞是酵母細胞(BoderandWittrupNat.Biotechnol15:553-557,1997)、COS細胞(HiguchiadJImmunolMeth202:193-204,1997)和昆蟲細胞(Granzerio"JImmunolMeth203:131-139,1997;Ernst"NucleicAcidsRes26:1718-1723,1998)。母多核苷酸優選地編碼一個或更多個蛋白基序。將這些基序定義為編碼具有獨特蛋白功能的多肽(即氨基酸)序列的多核苷酸序列的區域或元件。例如,蛋白基序可能定義了完整蛋白的一部分,如表位、切割位點或催化位點等。數個可搜索蛋白基序和潛在蛋白基序的數據庫是可提供的,如MOTIF、PROSITE、SMART和BLOCKS(www.blocks.fhcrc.org)。優選地,選擇的變異性程度受控的母多核苷酸分子的區域相應于(即編碼)一個或更多個這樣的蛋白基序。因此,可使具有預決的變異性的寡核苷酸針對編碼蛋白基序的母多核苷酸分子的內部序列。本領域技術人員認為通過使用作為母多核苷酸的能雜交以形成雙鏈互補核苷酸序列的任何核酸起始物質,如基因組DNA(gDNA)或互補DNA(cDNA)進行本發明的方法是有利的。優選地,多核苷酸的第一和第二群體是cDNA。在優選的實施方案中,多核苷酸的第一和第二群體是單鏈的。合宜地,多核苷酸的第一群體由母多核苷酸分子的正鏈組成,多核苷酸的第二群體由母多核苷酸的負鏈組成。可選地,多核苷酸的第一和/或第二群體可能包含母多核苷酸分子的正鏈和負鏈。如上所述,可使用本發明的方法生產任何母多核苷酸序列的變體形式。有利地,利用單條母多核苷酸序列的誘變獲得母多核苷酸序列,即母多核苷酸序列組成單條多核苷酸序列的變體形式。可利用上面公開的任何常規方法,如易錯PCR完成母多核苷酸序列的隨機突變。在優選的本發明的方法的實施方案中,母多核苷酸序列編碼配體多肽。通過"配體多肽",我們包括了任何在體內或體外同其它生物分子(例如另一種多肽或多核苷酸)相互作用的多肽。優選地,具有預決的變異性的寡核苷酸同編碼與生物分子,如結合位點或調控位點直接或間接相互作用的氨基酸序列的母多核苷酸序列的區域分享序列同一性,或是所述母多核苷酸序列的區域的變體。在進一步優選的實施方案中,母多核苷酸序列編碼抗體或抗體片段,如Fab-樣分子(Better"a/(1988)5Wewce240,1041)、Fv分子(Skerra"a/(1988)Sc/e膨240,1038)、單鏈Fv(ScFv)分子(Birdda/(1988)Sc/ertce242,423;Huston&a/(1988)尸裂淑/.Jcad園85,5879)和單結構域抗體(dAbs)(Wardda/(1989)Atowm341,544)。在該實施方案中,具有預決的變異性的寡核苷酸優選地同編碼互補性決定區(CDR)的母多核苷酸序列的區域分享序列同一性,或是所述母多核苷酸序列的區域的變體。可選地,具有預決的變異性的寡核苷酸可能同編碼框架(framework)多肽的母多核苷酸序列的區域分享序列同一性,或是所述母多核苷酸序列的區域的變體。在進一步優選的實施方案中,母多核苷酸序列編碼酶或其催化活性片段。盡管使用的是術語"酶",也將其解釋為包括任何具有酶樣活性,即催化功能的多肽。例如,是酶的部分的多肽可能仍然具有催化功能。此外,也包括蛋白如干擾素和細胞因子。在該實施方案中,具有預決的變異性的寡核苷酸優選地同編碼活性位點或調控位點(如變構調控位點,如輔因子結合位點)或涉及到酶穩定性中的區域(如蛋白酶切割位點)的母多核苷酸序列的區域分享序列同一性,或是所述母多核苷酸序列的區域的變體。-在進一步優選的實施方案中,母多核苷酸序列編碼抗原。通過"抗原",我們包括了當將其給予到哺乳動物宿主時能急性地或慢性地誘導免疫反應的抗原肽。在該實施方案中,具有預決的變異性的寡核苷酸優選地同編碼表位的母多核苷酸序列的區域分享序列同一性,或是所述母多核苷酸序列的區域的變體。本領域的技術人員認為在消化步驟(b)中使用任何核酸酶以產生多核苷酸片段,如外切核酸酶、內切核酸酶或限制酶或其組合是有利的。純化并混合單個消化的片段并用PCR技術進行重新組合。然后將組合的(再造的)基因克隆入表達蛋白的表達載體中。然后分析蛋白的改變的特性。通過"核酸酶",我們指具有溶核酸活性的多肽,如酶或其片段。優選地,核酸酶是外切核酸酶。更優選地,多肽的外切核酸酶活性大于多肽的內切核酸酶活性。更優選地,多肽具有外切核酸酶活性但基本沒有內切核酸酶活性。合適的外切核酸酶包括BAL31、外切核酸酶I、外切核酸酶V、外切核酸酶VII、外切核酸酶T7基因6、細菌噬菌體A外切核酸酶和外切核酸酶RecJf。優選地,在步驟(b)中單獨地消化多核苷酸的第一和第二群體。通過控制核酸酶消化反應的參數,可控制多核苷酸片段的大小。以該方式測定多核苷酸片段的長度避免了必須提供如從凝膠中純化目標長度的片段的進一步步驟的必需性。有利地,用于消化多核苷酸分子的第一群體的反應的至少一個參數不同于在用于消化多核苷酸分子的第二群體的反應中使用的相當的參數。通過"相當的參數",我們指,在用于消化單鏈多核苷酸分子的其它群體的反應中使用的相同的參數。其可能發生變化的合適反應參數包括核酸酶類型、核酸酶濃度、反應體積、消化反應的持續時間、反應混合物的溫度、反應混合物的pH、母多核苷酸序列的長度、母多核苷酸分子的量和反應混合物的緩沖液組成。用于消化多核苷酸分子的第一和第二群體的反應的不同參數的使用提供了通過本發明的方法生產的變體多核苷酸的增加的變異性的優點。因此,本發明第一方面的優選實施方案提供組合多核苷酸片段以產生變體多核苷酸序列的方法,該方法包括以下歩驟(a)用核酸酶消化(優選線性的)母多核苷酸以產生具有不同長度的片段的群體;(b)從來源于步驟(a)的序列中組合多核苷酸序列其中使用具有預決的變異性的寡核苷酸來控制在產生的多核苷酸序列的選擇區域中的變異性的程度。優選地,該方法進一步包括步驟(c)表達產生的被組合的多核苷酸序列編碼的蛋白和步驟(d)篩選蛋白的改變的性質或特性。本發明也提供可通過上述方法獲得的或可獲得的具有改變的核苷酸序列(優選地編碼具有改變的/目標特性的多肽)的多核苷酸序列。可將這些多核苷酸序列用于產生基因治療載體和復制缺陷基因治療構建物或用于基于DNA的疫苗接種的疫苗接種載體。此外,可將多核苷酸序列用做研究工具。本發明也提供具有通過上述方法產生的序列的多核苷酸文庫,從該文庫中可選擇編碼具有改變的/目標特性的蛋白的多核苷酸。優選地,多核苷酸文庫是DNA或cDNA文庫。本發明也提供具有不同于野生型的特性的通過上述方法生產的蛋白如酶、抗體和受體。可單獨地或在藥學上可接受的載體中將這些蛋白用作疫苗或用于治療的藥物,例如,用作免疫原、抗原或用于獲得特定的抗體。也可將它們用作研究工具。為了獲得產生的多核苷酸序列的表達,可將多核苷酸整合入具有可操作地連接到多核苷酸序列的控制序列的載體以控制它的表達。載體可能包括其它的序列如啟動子或增強子以驅動插入的多核苷酸序列的表達,進一步的多核苷酸序列以便被多核苷酸編碼的蛋白以融合形式生產,和/或編碼分泌信號的核酸以便使在宿主細胞中生產的蛋白從細胞中分泌出來。然后可通過將載體轉化入載體在其中是有功能的宿主細胞中、培養宿主細胞以便生產蛋白并從宿主細胞或周圍培養基中回收蛋白獲得多核苷酸序列編碼的蛋白。本領域中將原核和真核細胞用于該目的,包括大腸桿菌菌株、酵母菌和真核細胞如COS或CHO細胞。可使用宿主細胞的選擇來控制在那些細胞中表達的蛋白的性質,如控制蛋白在宿主細胞中沉積的位置或影響其性質如它的糖基化。可通過本領域公知的方法表達被多核苷酸序列編碼的蛋白。合宜地,可通過在培養基中在導致或允許蛋白表達的合適條件下培養含有這樣的載體的宿主細胞獲得表達。公知在各種不同的宿主細胞中克隆和表達蛋白的系統。合適的宿主細胞包括細菌、真核細胞如哺乳動物細胞和酵母菌和桿狀病毒系統。并且,利用反轉錄病毒作為克隆和表達系統是良好的可選方案,因為可將該病毒同大量細胞類型共同使用。本領域中可獲得的用于表達外源多肽的哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢細胞、HeLa細胞、乳倉鼠腎細胞、COS細胞和許多其它細胞。通常,優選的細菌宿主是大腸桿菌。可選擇或構建含有合適的包括啟動子序列、終止子片段、多聚腺苷酸序列、增強子序列、標記基因的調控序列和其它合適序列的合適的載體。載體可以是合適的質粒、病毒如噬菌體或噬菌粒。如欲了解進一步的詳情,可參見例如MolecularCloning:aLaboratoryManual:3rdedition,Sambrook禾口Russell,2001,ColdSpringHarborLaboratoryPress。在CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel"Z.eds.,JohnWiley&Sons,1992中詳細公開了許多著名的操作多核苷酸序列,如制備多核苷酸構建物、誘變、測序、將DNA引入細胞和基因表達、分析蛋白的技術和規程。可將該系統用于創建包含可將其以大量方式篩選目標蛋白功能的可變序列的DNA文庫。可用對實際的酶功能,如CMCase活性、P-葡糖苷酶活性和熱穩定性特異的方法篩選酶功能。此外,可使用噬菌體展示和細胞表面展示篩選酶功能(CrameriA.WW.,Nature199815;391(6664):288-291;ZhangJ.H.dPNAS.USA199794(9):4504-4509;WarrenM.S."Biochemistry1996,9;35(27):8855-8862;Kim"W.,ApplEnvironMicrobiol66:788-93,2000)和篩選如抗體的改變的結合性質(Griffith"fl/.,EMBOJ.113:3245-3260,1994)。可在篩選影響或調控其活性或功能的分子中使用本發明提供的多肽。這樣的分子在治療性(可能包括預防性)環境中可能是有用的。本發明也提供包含通過上述方法產生的多核苷酸序列的載體。本發明也提供包含多核苷酸序列、包含多核苷酸序列的載體或通過上述方法產生的多肽和藥學上可接受的載體或適用于研究目的的載體的組合物。本發明進一歩提供包含,在鑒定具有通過上述方法獲得的目標特性的多核苷酸或多肽后,生產完整的或部分該多肽或多核苷酸,隨意地與額外的多肽或多核苷酸連起來的方法。因此,本發明進一步的方面提供制備具有改變的/目標性質的多肽的方法,該方法包含下述步驟(a)通過使用根據本發明第一方面的方法產生母多核苷酸的變體形式;(b)表達步驟(a)中生產的變體多核苷酸以生產變體多肽;(C)篩選變體多肽的目標性質;和(d)從變體多肽中選擇具有目標性質的多肽。本發明進一步提供通過上述方法獲得的多肽。在鑒定了具有改變的/目標特性的多核苷酸或多肽后,能通過公知的技術如PCR、克隆和在宿主細胞內表達生產這些多核苷酸或多肽以提供更大的數目。可將產生的多肽或多核苷酸用于制備工業酶,如洗衣洗滌劑酶,其中在更低的溫度下優選增加的活性。可選地,可將生產的多核苷酸或多肽用作研究工具,即可將抗體用于免疫分析,可將多核苷酸用作雜交探針或引物。可選地,可將產生的多肽或多核苷酸用于制備如下所述的用于診斷用途、藥物用途、治療等的藥物。可將通過本發明的方法產生的并鑒定為具有改變的特性的多肽或多核苷酸在藥物組合物中按配方制造。這些組合物可能包含,除上述物質之一外,藥學上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩定劑或本領域技術人員公知的其它物質。這樣的物質應無毒且不應干擾活性成份的效力。載體或其它物質的準確的性質可能依賴于給藥途徑,如口服、靜脈內、皮膚或皮下、鼻、肌內、腹腔途徑。口服給藥的藥物組合物可能是片劑、膠囊、粉末或液體形式。片劑可能包括固體載體如明膠或佐劑。液體藥物組合物通常包括液體載體如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油。也可包括生理鹽水溶液、葡萄糖或其它糖類溶液或二醇類如乙二醇、丙二醇或聚丙二醇。對于靜脈內、皮膚或皮下注射或在患病位點的注射,活性成分將處于胃腸外可接受的水溶液形式,其無熱源且具有合適的pH、等張性和穩定性。本領域相關技術人員能通過使用,例如,等張賦形劑如氯化鈉注射液、林格注射液、乳酸林格注射液容易地制備合適的溶液。如果需要,可包括防腐劑、穩定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其它添加物。因此,本發明進一歩提供通過本發明的方法生產的用于藥物的多核苷酸或多肽以及通過本發明的方法生產的多核苷酸或多肽在制備用于處理(treament)、治療和/或診斷疾病的藥物中的用途。不管它是根據本發明產生后鑒定的并給予到個體的多肽,如抗體或其片段、酶、多核苷酸或核酸分子,優選以足以顯示對個體的益處的"預防有效量"或"治療有效量"給予它們(因為情況可能如此,盡管可將預防考慮為治療)。給予的實際量和給予的速度和時程將依賴于待處理的狀態的性質和嚴重性。處理的處方,如劑量的決定處于開業醫生和其它醫生的責任范圍內并典型地考慮待處理的紊亂、個體病人的狀況、給予的位點、給予的方法和開業醫生已知的其它因素。可在Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Osol,A.(ed),1980中發現上述技術和規程的例子。可選地,可通過使用靶向系統如抗體或細胞特異配體的靶向療法更特異地傳遞活性劑到某些類型的細胞。由于各種原因靶向是可期望的;例如,假如試劑是不可接受的有毒,或假如它可能需要太高的劑量,或假如它可能不能進入目標細胞。代替直接給予這些試劑的是,可通過在目標細胞中從引入細胞的編碼基因表達的方式生產它們,如在病毒載體中(VDEPT技術的變體,即在載體中通過從病毒載體中的編碼DNA表達的形式生產激活劑,如酶)。可將載體靶向待處理的特定細胞,或它能包含可被目標細胞更多或更少選擇性打開的調控元件。可選地,可以前體的形式給予試劑,通過在待處理細胞中生產的激活劑或靶向到待處理細胞的激活劑將前體轉變成活性形式。有時該類型的方法稱為ADEPT或VDEPT;前者涉及通過到特定細胞抗體的結合將激活劑靶向到細胞,而后者涉及在載體中通過從病毒載體中的編碼DNA的表達生產激活劑,如酶(參見例如,EP-A-415731和WO90/07936)。依賴于待處理的狀況,可單獨給予或與其它處理組合給予組合物,同時地或連續地。作為進一步的可選項,可將通過本發明的方法產生后鑒定為具有目標特性的多核苷酸用于基因治療的方法,以處理那些不能合成被多核苷酸編碼的活性多肽或不能在正常水平合成它的病人,借此提供被相應的野生型蛋白提供的效力。在現有技術中已經使用了載體如病毒載體來將多核苷酸引入各種不同的目標細胞。典型地,將載體暴露到目標細胞以便轉染能在足夠比例的細胞中發生以從目標多肽的表達中提供有用的治療或預防效果。轉染的核酸可能被持久地整合入每一個靶向的腫瘤細胞的基因組,提供長期的效果,或可選地必須周期性地重復該處理。各種載體,病毒載體和質粒載體均是本領域公知的,參見美國專利No.5,252,479和WO93/07282。特別地,已經將大量病毒用作基因轉移載體,包括乳多泡病毒如SV40、痘苗病毒、皰疹病毒包括HSV和EBV以及反轉錄病毒。現有技術中許多基因治療規程已經使用了喪失能力的鼠反轉錄病毒。作為使用病毒載體的可選項,其它已知的將核酸引入細胞的方法包括電穿孔、磷酸鈣共沉淀、機械技術如微注射、脂質體介導的轉移和直接的DNA攝取以及受體介導的DNA轉移。如上所述,使用編碼多肽或其活性部分的核酸的基因治療的目的是增加細胞中核酸表達產物的量,在該細胞中野生型多肽的水平缺失或僅以降低水平存在。這樣的處理在己經是癌化的細胞的處理中可能是治療性的,或在已知的通過篩選具有易感性等位基因并從而對例如癌易感的方式處理個體中是預防性的。本發明也提供用于產生多核苷酸序列或具有目標特性的序列的群體的試劑盒,其包含用于制備SSDNA的試劑、外切核酸酶和進行PCR技術的組分,例如,熱穩定DNA(核苷酸)和終止方法,如EGTA。如上所述,本發明合宜地提供創立具有目標特性的突變酶基因序列和它們到功能酶的隨機組合。作為本發明這個方面的例子,通過導致大約0.7%突變率的易錯PCR突變酶基因。然后用外切核酸酶如BAL31消化產生的突變酶基因的群,通過在不同時間點加入EGTA或熱滅活抑制反應,產生一組具有不同大小的DNA片段。然后可將這些片段置于如上面公開的基于PCR的重新組裝。然后克隆產生的重新組裝的DNA片段并構建基因文庫。然后從該文庫選擇克隆并測序。該技術進一歩的應用是產生可將其用于進一步選擇和分析的可變DNA序列的群體。除了編碼更大的蛋白,如抗體片段和酶,DNA可能編碼可將其分子功能特性用于設計不同的選擇系統的肽。先前已經公開了重組的編碼肽的DNA序列的選擇(Fisch"PNAS.USA1996Jul23;93(15):7761-7766)。此外,可使用可變的DNA群體生產具有例如催化活性的RNA分子群體。Vaish等人(PNAS.USA1998Mar3;95(5):2158-2162)證明了用于選擇催化性RNA的功能系統的設計,EcksteinF(CibaFound.Symp.1997;209;207-212)已經描述了通過將催化性RNA引入細胞應用催化性RNA的要點。可使用該系統進一步通過序列空間尋找具有基于重組DNA序列的催化活性的功能肽/分子。現在,將通過實施例并參考附圖解釋本發明的方面和實施方案。進一步的方面和實施方案對本領域技術人員是顯而易見的。圖1:顯示了使用AlligatorBioscience的FIND技術的體外分子進化的一般原理(如WO02/48351中公開的)。圖2:顯示了本發明的方法的優選實施方案,其中具有預決的變異性的寡核苷酸在步驟(b)中加入。圖3:顯示了本發明的方法的優選實施方案,其中具有預決的變異性的寡核苷酸在步驟(c)中加入。圖4:顯示了A.兩條具有不同長度和極性的不同ssDNA的雜交。B.用ExoI從3'—5'消化雜交分子。C.用ExoVII從5,—3,和3,—5'消化雜交分子。圖5:顯示試驗雜交的凝膠圖像泳道1:1kbDNA梯度(Invitrogen)。泳道2:CT17760bp和CT17285bp在10mMTris中的雜交。泳道3:CT17760bp和CT17285bp在1xPCR緩沖液中的雜交。泳道4:ssDNACT17760bp。泳道5:ssDNACT17285bp。圖6:顯示了EXOI和EXOVII消化的凝膠圖像泳道1:Exol緩沖液中未消化的CT17760bp/CT17285雜種。泳道2:用Exol消化10分鐘的CT17760bp/CT17285雜種。泳道3:用Exol消化20分鐘的CT17760bp/CT17285雜種。泳道4:ExoVII緩沖液中未消化的CT17760bp/CT17285雜種。泳道5:用ExoVII消化20分鐘的CT17760bp/CT17285雜種。泳道6:用ExoVII消化30分鐘的CT17760bp/CT17285雜種。泳道7:EZload精確分子量標準(Bio-RAD)。具體實施方式實施例在附圖1到3中圖解了本發明的方法。該方法在一條或更多條母多核苷酸序列的體外分子進化中利用如WO02/48351和WO03/097834公開的AlligatorBioscience的FINDTm技木。下面給出了本發明示例性實施方案的詳細描述。實施例l-FINDTM技術在WO02/48351和WO03/097834中公開了FINDTm技木。試效AmpliTaq⑧聚合酶購自Perkin-ElmerCorp.,dNTPs購自BoehringerMannheimBiochemica(德國,曼海姆),BAL31核酸酶購自NewEnglandBiolabsInc.(美國,貝弗利)。所有的限制酶購自NewEnglandBiolabsInc.(美國,貝弗利)。溴化乙錠購自Bio-RadLaboratories(Bio-RadLaboratories,美國加州Hercules)。T4DNA連接酶購自NewEnglandBiolabsInc.(美國,貝弗利)。EDTA和EGTA購自KeboLab(瑞典)。所有的引物均在實驗室中設計并從LifeTechnologies(瑞典,泰比)和SGS-DNA(瑞典,K6ping)。所有的聚合酶鏈反應(PCR)均以自動熱循環儀進行(Perkin-ElmerCetus480,Norwalk,CT和美國)。在美國專利No.4,683,195中公開了用于擴增核酸的PCR技術。涉及PCR技術一般使用的文獻包括Mullis"a/.,ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol"51:263,(1987),Ehrlich(ed),PCRtechnology,StocktonPress,NY,1989,EhrlichWa/.,Science,252:1643-1650,(1991),"PCRprotocols;AGuidetoMethodsandApplications",Eds.Innisda/.,AcademicPress,NewYork,(1990)。靜通過吏用BigDyeTerminatorCycle測序i式齊!j盒(Perkin-Elmer,美國加州Elmervill)將所有的構建物進行測序。在ABIPrism377DNA測序儀上進行測序。鄉籍微冶就用在Tris-乙酸緩沖液(TAE-緩沖液0.04MTris-乙酸、0.001MEDTA)中的2%的瓊脂糖凝膠(AGAROSE(FMCBioproducts,美國緬因州Rockland))和0.25[ig/ml的溴化乙錠進行DNA的瓊脂糖凝膠電泳。用由25%Ficoll和溴酚藍組成的無菌過濾的上樣緩沖液混合用于電泳的樣品并上樣到2%瓊脂糖凝膠的孔中。電泳在90V跑膠45分鐘,除非另外指明在具有0.25pg/ml溴化乙錠的Tris-乙酸緩沖液中。當需要時,使用Qiaquick凝膠抽提試劑盒(QiagenGmbH,德國希爾登)凝膠純化具有合適大小的條帶。作為分子量標準,使用了DNA分子量標記lkb梯度(GibcoBRL)。使用分光光度計估計凝膠抽提產物的DNA濃度。潘麟樣使用大腸桿菌菌株TOP10F'作為轉化的細菌宿主。基本上按照Hanahan,D.1983.StudiesontransformationofEscherichiacoliwithplasmid.J.Mol.Biol.166:557-580公開的方法生產該菌株的化學感受態細胞。生產了該細菌菌株的電效能細胞(Dower,W.J.,J.F.Miller&C.W.Ragsdale.1988:Highefficiencytransformationofi^.co//byhighvoltageelectroporation.NucleicAcidsRes.16:6127)。微按Sambrook,Mo/ecwZarc/omVig,'Za/wrator^附朋做Z(SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中描述的方法在pFab5chis中進行所有的遺傳操作。pFab5chis載體被設計來在Sfil和Notl位點間攜帶插入的任何scFv基因(參見Emgberg"W.,1995,MW/w^MoZ.51:355-376)。Sfil位點位于pdB前導區內,Notl位點恰好位于VL區域后,以使VH-接頭-VL被插入。在該情況中,使用了定向到CD40的抗體。用包括指定的獨特限制性位點的下述序列設計包圍pFab5chis的抗體基因的兩條生物素化的引物1736Sfil正向引物5'-ATTACTCGCGGCCCAGCTCGGCCATGGCCCACAGGTCAAGCTCGA和1735Notl反向引物5'-TTAGAGCCTGC,GGCCGCCTTGTCATCGTCGTCCTT(其中指定了切割位點)用包括指定的獨特限制性位點的下述序列設計包圍pFab5chis的抗體基因的兩條非生物素化的引物1664Sfil正向引物5'-ATTACTCGCGGCCCAGCTCGGCCATGGCCCACAGGTCAAGCTCGA禾口1635Notl反向引物5'-TTAGAGCCTGCTGGCCGCCTTGTCATCGTCGTCCTT按下述輪廓進行25個循環的標準PCR反應變性(94。C,1分鐘)、引物退火(55°C,l分鐘)和延伸(72°C,3分鐘)。每一個PCR反應包含10mMTris-HClpH8.3、50mMKC1、1.5mMMgCl2、200jiMdNTP、1.nM正向引物、1pM反向引物、1.25UAmpliTaq⑧熱穩定DNA聚合酶(Perkin-ElmerCorp.)和50ng模板,總體積為100jil。在包含500mMNaCl、100mMTris-HClpH8.8、5mMMgCl2100Hg明膠(根據Kuipers"fl/.,NucleicAcidsRes.1991,Aug25;19(16):4558但將MgCl2濃度從2mM增加到5mM)的10x緩沖液中進行易錯PCR反應。對于每一個lOOpl反應,混合下述成份dATP5mM5jaldGTP5mM5pidTTP10mM10pidCTP10mMlOjal20|aM3,引物1.5)il20|iM5,-引物1.5}il10xKuipers緩沖液10jal滅菌mpH2046.3jal以50ng的量加入pFab5chis載體中的模板。加入lO(il10mM的MnCb并檢査試管沒有發生Mn02的沉淀。最后,加入5單位Taq酶。在沒有熱啟動下在下述溫度進行25個循環的易錯PCR:94°Cl'、45°C1,、72°C1,、十72。C7分鐘。產生的產物是易錯的(即突變的)750bp的插入物。用GibcoPCR純化試劑盒在進一步處理前純化該插入物。^^主象素眾游歹/激產f卓鏈Zm4利用兩個單獨的PCR反應擴增目標片段。這些反應能是上述的標準PCR或上述的易錯PCR。應設計引物以使在一個反應中,正向引物是生物素化的且在另一個反應中,反向引物是生物素化的。例如,用pFab5chis-抗體作為模板進行25個循環的使用A)引物1736和1635和B)引物1664和1735的具有上述輪廓的PCR反應。這產生了大約750bp的PCR產物在A中上鏈是生物素化的;在B中,下鏈是生物素化的。通過使用用抗生蛋白鏈菌素包被的固體基體如免疫磁珠進行的純化恢復非生物素化的鏈。洗滌磁珠并用PBS/1%BSA和包含5mMTrispH7.5、1MNaCl和0.5mMEGTA的B&W緩沖液平衡磁珠。用溶解在2xB&W緩沖液中的100(il磁珠混合100(il的每一種PCR產物并在室溫下旋轉孵育15分鐘。通過用B&W小心地洗滌兩次將未結合的PCR產物移除。通過在室溫下用25pl0.1MNaOH孵育DNA10分鐘的堿變性法洗脫捕獲的DNA的非生物素化鏈。從磁珠上分離溶液并用7.5pl0.33MHC1禾口2.5jil1MTrispH8中和。,麼離產主微細使用Pstl/Hindlll限制酶將目標片段克隆入細菌噬菌體M13載體M13mpl8和M13mpl9。使用大腸桿菌菌株TOP10F根據常規技術繁殖細菌噬菌體。從細菌噬菌體載體M13mpl8制備針對上鏈的單鏈DNA,從細菌噬菌體載體M13mpl9制備針對下鏈的單鏈DNA。簡言之,在4°C12000g離心1.5ml感染的細菌培養物5分鐘。用200pi20%PEG8000/2.5MNaCl沉淀上清。將沉淀的細菌噬菌體重懸在lOOplTE中。加入5(^1用Tris-Cl(pH8.0)平衡的酚并將樣品渦旋。在RT下12000g離心1分鐘后,轉移包含DNA的上相并用乙醇沉淀。在50^1TE(pH8.0)中溶解DNA沉淀并在-20。C保存。(Sambrooka"/.MolecularCloning,Alaboratorymanual2ndedition.ColdSpringHaborLaboratoryPress.1989,第4章)。從噬菌體制備的單鏈DNA是環狀的并且必須在BAL31處理前打開。可用能切割單鏈DNA的內切酶進行該步驟。使用離心柱純化PCR產物以從早先的PCR中去除多余的引物。將150ng的純化產物用作在含1.5mMMgCl2(AppliedBiosystems)、200)iM每種dNTP(NewEnglandBioLabs)、1.25UAmpliTaqDNA聚合酶(AppliedBiosystems)和l.OjiM單條引物的100|ilIxGeneAmp10xPCR緩沖液中進行的線性擴增的模板。PCR循環條件是94"C變性1分鐘,94°C30秒、55°C30秒、72°C1分鐘循環35個循環,72。C延伸7分鐘。不對稱PCR產物是從在1%瓊脂糖凝膠上的雙鏈模板分離并使用Qiaquick凝膠抽提試劑盒(Qiagen)純化的大小。2//效提廢,f/^生卓鏈DA^最初,使用創制在5,和3,端分別具有獨特限制酶(RE)位點的DNA的標準PCR反應生產dsDNA片段。將PCR反應分別分成兩個并RE消化以優選地用創制3'突出端或平末端的限制酶創制5'磷酸化。在合適的緩沖液中并過夜進行消化以徹底進行消化。假如必須使用創制5'突出端的酶,可使用DNA聚合酶填上該突出端。在純化后用10U入外切核酸酶在配套的特定緩沖液中37。C處理1-4嗎dsDNA(例如購自Novagen的Strandase或購自NEB的A外切核酸酶)30分鐘,在75°CIO分鐘終止反應。使用標準凝膠抽提方法將ssDNA從瓊脂糖凝膠上的任何dsDNA殘留中進一歩分離出。伊^5AL"產主卓錄^皮眾游DA^將ssDNA鏈(分別含有上鏈和下鏈)進行使用如BAL31(即上鏈從下鏈單獨地消化)的單獨酶學處理。每一個消化反應包含0.02pg/VlssDNA、600mMNaCl、20mMTris畫HC1、12mMCaCl2、12mMMgCl2,1mMEDTApH8.0和從0.1到5U/ml的各種酶濃度的BAL31。在30"C孵育反應并在10、30、60和120秒或更長的時間連續收集消化的ssDNA的部分。通過加入EDTA和在65"C熱處理10分鐘終止反應。通過酚/氯仿抽提和乙醇沉淀純化ssDNA片段。將ssDNA重懸在10mMTrispH8.0中。通過1%瓊脂糖凝膠電泳評價消化圖譜。微主產敝虔鵬必通過酚/氯仿/異戊醇抽提純化消化的DNA片段。將50|il緩沖的酚加到每一管100(il樣品和50^il氯仿和異戊醇混合物(24:1)中。將試管渦旋30秒,然后在微量離心機中以14000r.p.m.離心1分鐘。然后收集上相并用2.5倍體積的99.5%乙醇(其1/10是3M的乙酸鈉,pH5.2)混合。在-80。C沉淀DNAl小時。然后,通過在微量離心機中以14.000r.p.m.離心30分鐘沉淀DNA。用70%乙醇洗滌沉淀一次,然后將其重溶在10(il無菌水中。絲微微_/:分腳/姓產氛績眾#皮將5pl來源于每一個時間點和空白的溶解的沉淀同2.5(ll上樣緩沖液(25%蔗聚糖和溴酚藍)混合并上樣到2%瓊脂糖凝膠的孔中。按上述方法進行不同時間點的電泳。全長A皮艦髓發通過兩個連續的PCR反應獲得ssDNA片段的重新組裝。第一個PCR反應應包含全部處于25|il總體積中的10mMTris-HClpH8.3、50mMKC1、1.5mMMgCl2、200jiMdNTP、0.3UTaq聚合酶和2)ilBAL31處理的樣品,并按下述輪廓進行5個循環94°Cl分鐘、50°Cl分鐘和72°C2分鐘+72°C5分鐘。第二個PCR反應應包含全部處于50jil總體積中的10mMTris-HC1pH8.3、50mMKCl、1.5mMMgCl2、200jiMdNTP、0.6UTaq聚合酶、ljiM正向引物,l(iM反向引物和來源于第一個PCR反應的5^1樣品,并按下述輪廓進行15個循環94°C1分鐘、55°C1分鐘和72。C2分鐘+72t:7分鐘。可通過瓊脂糖凝膠電泳評價產生的產物。^胡/,7VW/銜劍教眾羞箭資麥游#虔浙廣*首先用Sfil通過使用包括BSA和11U酶/嗎DNA的NEB緩沖液2切割重新組裝的片段和質粒pFab5chis。在50'C進行該反應4小時。在此之后,用Notl通過加入轉化緩沖液和6U酶/嗎DNA切割DNA。在37'C過夜進行該反應。卿微麟,層潛,置微麥縱虔層麟眾在1%瓊脂糖凝膠上分析切割反應。限制消化的插入物顯示了大約750bp的切割產物。這同預期的大小良好對應。將切割的插入物和質粒的條帶切下并按上述方法進行凝膠抽提。墓,發嫌劍/靴縱虔離麟歸p認c/^離麥在12"C水浴槽中將純化的切割的pFab5chis同純化的重新組裝的限制消化的片段連接16小時。將50|11載體與5(^1插入物和15|^110x緩沖液(同酶一塊提供的)、7.5pl連接酶(5U/pl)和無菌水混合,使終體積為150(il。也以相同方式進行沒有任何插入物的限制消化的pFab5chis的連接。通過上述的酚/氯仿抽提純化連接反應物。從抽提收集上相并將其與2.5倍體積的99.5%乙醇(其1/10為3M乙酸鈉,pH5.2)混合。在-8(TC沉淀DNA1小時。然后,通過在微量離心機中以14.000r.p.m.離心30分鐘沉淀DNA。用70%乙醇洗滌沉淀一次并將其重溶與10^1的無菌水中。將5^1每一種連接物單獨同95|il在冰上孵育1小時的化學感受態大腸桿菌TOP10F,混合,然后將其轉化(SambrookWa/.MolecularCloning,Alaboratorymanual2ndedition.ColdSpringHaborLaboratoryPress,1989)。在培養一小時后,將來源于兩個轉化的細菌涂布到含氨芐西林的瓊脂平板上(100(ig/ml)。將平板在37'C倒置培養14小時。實施例2-使用具有預決的變異性I的寡核苷酸控制變異性說明這套實驗的原理是,在許多情況中,感興趣的是特定突變目標區域如抗體的CDR區域中的并保持該框架^^改變或加入抑制該區域中的重組事件的非突變的區域如酶的活性位點。此處使用的試驗基因是A2.30和A2.54(Ellmark"2002Mo^CM^r/附mM朋^gy39:349-356)、兩個具有針對CD40的特異性的scFv克隆。材料和方法棘織游顆飾驗微縱產按下述方法生產相應于A2.30的CDR2的突變形式的具有預決的變異性的寡核苷酸。使用創制覆蓋A2.30從bp56到bp352的突變的PCR產物的引物#137和#138(參見表lc)對A2.30克隆進行使用易錯條件的(參見表la和lb)的兩輪連續的PCR。使用創制覆蓋A2.30克隆從bpl04到bp221的內部序列的CDR2片段的引物#351禾口#357*或#354*和#350(*表明了5,-生物素標記)進行使用易錯條件的第三個PCR。使用GeneMorphPCR誘變試劑盒(Stmtagene)并使用相同的引物進一步突變這些PCR產物。使用(iMACSStrepatavidin試齊lj盒(MiltenyiBiotec)將ssDNA從生物素化的PCR產物中純化出,在瓊脂糖凝膠上進行進一步的純化,其中使用Recochips(TaKaRa)恢復ssDNA。用NaAc/乙醇沉淀ssDNA,然后將其重溶在iomMTris-HClpH8.0中。表1(a)<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>354*BIO-GACTCTCCTGTGCAGCCTCT357*BIO-TTGTCTCTGGAGATGGTGAA226CTCACTATAGGGCGAATTGG415TTCAGATCTCGAGGTGCAGCTGTTGGAG224CCTATTGCCTACGGCAGCC332*BIO-CCTATTGCCTACGGCAGCC333*BIO-CTCACTATAGGGCGAATTGG卓鏈母多凝-,^^游主產f,覆"用引物#224和#333*或#332*和#226(*表明5,-生物素標記)對A2.30和A2.54克隆進行標準的PCR反應(表2a和2b)。按上述方法純化充當母多核苷酸的ssDNA。卓遂母多^,麼游教眾C謬》?將顯示在表3中的單獨的正義鏈和反義鏈在生產商標明的緩沖液系統中進行外切核酸酶處理。表2a<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表2(b)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>,銀多孩微游產主淑f'c,/〃W"在兩個階段中獲得重新組裝。在第一個重新組裝反應中(PCRl,表4a和4b),7.5ng外切核酸酶片段化的來源于A2-30和A2-54的正義和反義ssDNA分別與5ngCDR2正義片段(后者組成了具有預決的變異性的寡核苷酸;參見上述內容)混合。在PCR1的25個循環后,將整個反應混合物加到用于擴增的第二個PCR反應中,其中將引物加入以能形成全長的多核苷酸(PCR2表4a和4b)。將產生的PCR產物連接入pGEM-T載體系統(Promega)并測序。表4(a)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>結果和結論將使用本發明的方法按上述方法生產的二十個克隆進行測序并與A.2-30和A.2-54比較分析突變。總突變率是1個突變/1000bp,其與使用標準PCR擴增獲得的正常突變率相一致(即不是易錯PCR)。然而,二十個克隆中的七個(35%)在內部的78bpCDR2區域具有一個或兩個突變。這顯然高于單獨PCR誘導的突變的幾率,因此,僅能將其解釋為被步驟(c)中加入的預突變的CDR2寡核苷酸(即具有預決的變異性的寡核苷酸)所誘導。所有在CDR2區域中具有突變的克隆顯示了在兩個最初克隆A2.30和A2.54間的重組。在這些克隆中的突變的數目在一到四間變動。文庫的總重組率是每序列1.4個重組。結論,該實驗證明,可使用具有預決的變異性的寡核苷酸來選擇性地增加編碼scFc分子的母多核苷酸的選擇的區域(CDR2)內的變異性。實施例3-使用具有預決的變異性II的寡核苷酸控制變異性說明也使用A2.30和A2.54scFv克隆進行下述實驗。材料和方法棘微艦雜游寡孩微鵬產按下述方法生產相應于突變的CDR1、CDR2、CDR3和CDR1+2ssDNA片段的具有預決的變異性的寡核苷酸。使用創制覆蓋A2.30的bp56到bp352的突變PCR產物的引物M37和#138(參見表5c)對A2.30克隆進行使用易錯條件(表5a和5b)的連續兩輪PCR。使用創制顯示在表6中的片段的引物進行使用易錯條件的第三個PCR。使用與上述以及在表6中標明的引物相同的引物并使用GeneMorphPCR誘變試劑盒(Stratagene)將這些PCR產物進在pGEM-T載體系統(Promega)中連接并測序后,計算了與A2-30相比較的如表7所示的突變率。表5(a)<table>complextableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表5(b)<table>complextableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>引物#序列137CGCGAATTGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAG138AGATGGGGGACTAGTGCTGCTCACGGTGAC349GACTCTCCTGTGCAGCCTCT350CCTGGAGCCTGGCGGACCCA351GCTGGGTCCGCCAGGCTCCA352TTGTCTCTGGAGATGGTGAA354*BIO-GACTCTCCTGTGCAGCCTCT355*BIO-CCTGGAGCCTGGCGGACCCA356*BIO-GCTGGGTCCGCCAGGCTCCA357*BIO-TTGTCTCTGGAGATGGTGAA226CTCACTATAGGGCGAATTGG415TTCAGATCTCGAGGTGCAGCTGTTGGAG224CCTATTGCCTACGGCAGCC332*—BIO-CCTATTGCCTACGGCAGCC333*BIO-CTCACTATAGGGCGAATTGG384CACTGCCGTGTATTACTGT386*BIO-CAGTGTACCTTGGCCCCA表6<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表明寡核苷酸的5'-生物素標記7<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>根據在表6中表明的生物素化的PCR產物,使用pMACSStrepatavidin試劑盒(MiltenyiBiotec)純化ssDNA。在瓊脂糖凝膠上進行進一步的純化,由此使用Recochips(TaKaRa)恢復ssDNA。用NaAc/乙醇沉淀在后續實驗中用作具有預決的變異性的寡核苷酸的ssDNA,然后重溶在10mMTris-HClpH8.0中。夠凝微》姓產御f^"用表明的引物(表9)對A2.30和A2.54進行標準的PCR反應(表8)。按上述方法純化用作母多核苷酸的ssDNA。卓慈母多凝,麼游將眾》"如表IO所示,對單獨的正義和反義鏈進行外切核酸酶處理。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>制備了一套文庫。在兩個階段中制備重新組裝的PCR。在第一個階段,PCRl中,將分別來源于A2-30和A2-54的外切核酸酶片段化的正義和反義ssDNA與相應于如表lla和13b中表明的CDRl、CDR2和/或CDR3的突變形式('具有預決的變異性的寡核苷酸')的寡核苷酸混合。在PCR1的25個循環后(表12a和12b),將整個反應混合物加到第二個反應(PCR2;表12a和12b)中,其也包含末端特異性引物,并進行20個循環。在pGEM-T載體系統(Promega)中連接PCR產物并測序。表ll(a)<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表11(b)<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表12(a)<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>結果和結論總突變率是1個突變/1000bp,其相應于標準PCR擴增的正常突變率(即不是易錯PCR)。在不同文庫中11%和56%間的克隆在它們的相應于加上的具有預決的變異性的寡核苷酸的CDR區域顯示了突變(表13)。突變的序列對于CDR1、CDR2和CDR3分別是30bp、78bp和46bp。在加上CDR片段后在這些區域中的突變的發生率顯然高于單獨PCR誘導產生的突變的概率并因此僅能將其原因解釋為預突變的寡核苷酸的加載。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>na:不適用a具有CDR2和CDR3突變的一個克隆"具有CDR1禾nCDR3突變的一個克隆結論,該實驗證明,可將具有預決的變異性的寡核苷酸用于選擇性增加編碼scFv分子的母多核苷酸的多個選擇的區域(CDR1、CDR2和CDR3)中的變異性。實施例4-使用具有預決的變異性III的寡核苷酸控制變異性說明進行下述實驗以證明保護核苷酸序列的一個區域/多個區域免于外切核酸酶的降解。原理是能通過保持這些區域中的原始序列未被外切核酸酶消化而保護在FINDTM反應中基因中的區域免于重組。在下述FINDTM反應中,這些未消化的區域總具有母類型,從而是未重組的。用一條生物素化的引物和一條未修飾的引物進行兩個獨立的PCR以創制用作用于ssDNA制備的模板的兩種不同的PCR產物(參見表14和15)。在制備ssDNA后,將產生的具有不同大小和極性的ssDNA雜交。然后分別用外切核酸酶I和外切核酸酶VII處理產生的雜交分子,將消化產物跑瓊脂糖凝膠以評價實驗結果(參見圖4)。表14用于制備相應的ssDNA的產物和極性的引物。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表15引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>材料和方法表16CT17760bp的PCR擴增。(a)<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>DNA聚合酶Amplitaq(5U/(il),AppliedBiosystems用JetQuickPCR純化系統(Genomed)純化PCR產物。總收率52.5昭,濃度132.6ng/|al表17CT17285bp的PCR擴增。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>(b)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>*100u1珠子結合上X嗎DNA(X=bpx0.066數目。**珠子加到5x過量中。*用"針對核酸應用的平衡緩沖液"平衡柱子,然后使2XlOOpl的lXB&W(5mMTrispH7.5、0.5mMEDTA、lMNaCl)流過柱子。*將dsDNA和珠子混合并應用。*用lOOjil的1XB&W洗滌柱子4次,用150(il的O.lMNaOH(存于-2(TC,新鮮解凍的)洗脫ssDNA,然后向洗脫物加入45^1的0.33MHC1和15|il的1MTris-HClpH8.0以中和ssDNA。在1。/。瓊脂糖/lxTAE凝膠上在100V將65filssDNA/孔跑膠60分鐘。插入Recochip并用反極性在100V跑膠10+2分鐘。用UV證實recochip中的DNA含量。將recochip移到管(提供的)中,然后將管在5000rpm離心5秒。在用2.5倍體積的乙醇和0.1體積的3MNaAcpH4.6沉淀后,將CT17760和CT17285分別溶解于50^1和35^110mMTrispH8.0中。表19<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>在PCR機器中在95。C將樣品雜交5分鐘,然后進行異源雙鏈步驟,該步驟由每個i分鐘的45個循環組成,其中每個循環的溫度降低rc,然后將樣品在1.5%瓊脂糖凝膠上跑膠。表20<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>樣品中的DNA終濃度是44ng/pl。在PCR機器中在95。C將樣品雜交5分鐘,然后進行異源雙鏈步驟,該歩驟由每個1分鐘的45個循環組成,其中每個循環的溫度降低rc。按上述方法進行沉淀并將沉淀溶解在40^110mMTrispH8中。,xo/搭染充游CJ7776,-C7772S5一#皮眾。表21<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>將Exol和雜交的DNA加到37'C預熱的水/緩沖液混合物中。對于樣品1,在10分鐘和15分鐘時分別移出17.5^1并在96。C熱滅活10分鐘。對于樣品2,將全部體積移出并在15分鐘后在96'C熱滅活10分鐘。將全部的對照反應(60ng)和來源于IO分鐘和15分鐘時的2.8^1(60ng)跑1.2%瓊脂糖凝膠。表23<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表24<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>*10xExoVII緩沖液500mMTrisHClpH7.9、500mM磷酸鉀pH7.6、83mMEDTA、lOOmMB-巰基乙醇參在37。C將H20和緩沖液預熱10分鐘。參力口入ExoVII。*加入雜交的DNA。對于樣品l,在20分鐘和30分鐘分別取出17.5^1,并在96。C熱滅活10分鐘。*對于樣品2,在30分鐘時將全部體積取出,并在96'C熱滅活IO分鐘。*將全部的對照反應(60ng)和來源于20分鐘和30分鐘的2.8^1(60ng)跑1.2%瓊脂糖凝膠。結果M藩J游縦進行兩個單獨的PCR反應以生產下述PCR-產物CT17760bp(3'生物素化的)禾t]CT17285bp(5'生物素化的)。從這些dsDNA模板制備了ssDNA(參見上述材料和方法)。C77776,浙CT772S5游試毅染文評價了兩種不同的雜交緩沖液10mMTrispH8.0和lxPCR緩沖液(AppliedBiosystems)(參見材料和方法)。將全部的反應物跑瓊脂糖凝膠(參見圖5)。CJ7776,浙C7772S56p游染效鄉五xo/狗jC//微以摩爾比率1:5在lxPCR緩沖液中將CT17760bp和CT17285bp雜交,然后用Exol和ExoVII在兩個單獨的反應中將它們消化(參見材料和方法)。將60ng每種消化產物跑瓊脂糖凝膠(參見圖6)。討論兩個片段的試驗雜交清楚地顯示,在PCR緩沖液中雜交的樣品中發生了雜交,其中我們看到了相應于具有dsDNA區域和在其末端具有ssDNA突出端的雜交物的條帶。該條帶比預測的大小760bp小,但這可能是由于ssDNA突出端導致的改變的遷移性。在瓊脂糖凝膠中ssDNA的遷移不同于dsDNA,其經常遷移在相應于dsDNA的大約一半大小的地方。在其它樣品中沒有發生任何雜交,其中我們僅看到相應于兩條原始ssDNA的條帶。這證實,PCR緩沖液的離子強度是足夠的,但10mMTris不足以使雜交發生。所有進一歩的雜交均在PCR緩沖液中進行。用ExoI和ExoVII進行的消化給出了預期的結果僅能從3'—5'消化的Exol留下了懸于5'端的ssDNA仍然存在但在3'端的ssDNA被移除的條帶。再一次地,該條帶小于預期的大小(558bp)但懸于5'端的ssDNA可能改變了在凝膠中的移動模式。從5'—3'和3'—5'進行消化的ExoVII移除了所有的突出ssDNA并僅留下285bp的dsDNA。這些實驗清楚地顯示,通過用互補ssDNA進行雜交,在核苷酸序列中選擇的區域可免受外切核酸酶的消化。權利要求1、用于從母多核苷酸序列產生多核苷酸序列或序列的群體的方法,該方法包括下述步驟(a)提供多核苷酸分子的第一群體和多核苷酸分子的第二群體,第一和第二群體共同組成母多核苷酸分子的正鏈和負鏈;(b)用核酸酶消化多核苷酸分子的第一和第二群體以生產多核苷酸片段;(c)將產生自正鏈的所述多核苷酸片段與產生自負鏈的片段接觸(在允許片段退火的條件下);和(d)擴增退火到彼此的片段以產生至少一條其序列不同于母多核苷酸分子的多核苷酸分子其中通過加入一條或更多條具有預決的變異性的寡核苷酸控制在步驟(d)中生產的至少一條多核苷酸分子的選擇區域內的序列變異性程度,該寡核苷酸退火到位于母多核苷酸分子的3’和5’末端核苷酸間但排除3’和5’末端核苷酸的序列上。2、根據權利要求1所述的方法,其中母多核苷酸編碼一個或更多個蛋白基序。3、根據權利要求1或2所述的方法,其中多核苷酸的第一和第二群體是cDNA。4、根據權利要求l、2或3所述的方法,其中多核苷酸的第一和第二群體是單鏈的。5、根據上述權利要求的任一項所述的方法,其中多核苷酸的第一群體由母多核苷酸序列的正鏈組成,多核苷酸的第二群體由母多核苷酸序列的負鏈組成。6、根據上述權利要求的任一項所述的方法,其中將多核苷酸的第一和第二群體單獨地在步驟(b)中進行消化。7、根據上述權利要求任一項所述的方法,其中步驟(b)中的核苷酸酶是外切核酸酶。8、根據權利要求7所述的方法,其中外切核酸酶選自BAL31、外切核酸酶I、外切核酸酶V、外切核酸酶VII、外切核酸酶T7基因6、細菌噬菌體A外切核酸酶或外切核酸酶RecJf。9、根據上述權利要求任一項所述的方法,其中在步驟(d)中生產的至少一條多核苷酸序列的改變的氨基酸序列與編碼的多肽的改變的性質相關。10、根據權利要求4到9任一項所述的方法,其中在步驟(b)之前或在步驟(b)中加入具有預決的變異性的寡核苷酸,且其中核酸酶特異于單鏈多核苷酸。11、根據權利要求1到9任一項所述的方法,其中在步驟(b)后步驟(c)前加入具有預決的變異性的寡核苷酸。12、根據上述權利要求任一項所述的方法,其中具有預決的變異性的寡核苷酸與母多核苷酸序列的內部序列分享至少90%的序列同一性,例如至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。13、根據上述權利要求任一項所述的方法,其中具有預決的變異性的寡核苷酸與母多核苷酸序列的內部序列分享100%的序列同一性。14、根據上述權利要求任一項所述的方法,其中具有預決的變異性的寡核苷酸具有單條核苷酸序列。15、根據上述權利要求任一項所述的方法,其中具有預決的變異性的寡核苷酸具有至少兩條不同的序列。16、根據權利要求15所述的方法,其中具有預決的變異性的寡核苷酸是母多核苷酸序列的相同內部序列的變體。17、根據權利要求15所述的方法,其中具有預決的變異性的寡核苷酸與母多核苷酸的至少兩個不同區域分享100%序列同一性或是其變體。18、根據上述權利要求任一項所述的方法,其中通過易錯PCR或使用寡核苷酸合成儀生產具有預決的變異性的寡核苷酸。19、根據上述權利要求任一項所述的方法,其中具有預決的變異性的寡核苷酸的長度介于10和500個核苷酸間。20、根據權利要求19所述的方法,其中具有預決的變異性的寡核苷酸的長度介于50和200個核苷酸間。21、根據權利要求1到20任一項所述的方法,其中母多核苷酸序列編碼配體。22、根據權利要求21所述的方法,其中具有預決的變異性的寡核苷酸同編碼與生物分子直接或間接作用的氨基酸序列的母多核苷酸序列的區域分享序列同一性,或是所述母多核苷酸序列的區域的變體。23、根據權利要求l到20任一項所述的方法,其中母多核苷酸序列編碼抗體或抗體片段。24、根據權利要求23所述的方法,其中具有預決的變異性的寡核苷酸同編碼框架多肽的母多核苷酸序列的區域分享序列同一性或是所述母多核苷酸序列的區域的變體。25、根據權利要求23所述的方法,其中具有預決的變異性的寡核苷酸同編碼CDR的母多核苷酸序列的區域分享序列同一性或是所述母多核苷酸序列的區域的變體。26、根據權利要求l到20任一項所述的方法,其中母多核苷酸序列編碼酶或其催化活性片段。27、根據權利要求26所述的方法,其中具有預決的變異性的寡核苷酸同編碼活性位點、調控位點或涉及到酶穩定性中的區域的母多核苷酸序列的區域分享序列同一性或是所述母多核苷酸序列的區域的變體。28、根據權利要求l到20任一項所述的方法,其中母多核苷酸序列編碼抗原。29、根據權利要求28所述的方法,其中具有預決的變異性的寡核苷酸同編碼表位的母多核苷酸序列的區域分享序列同一性或是所述母多核苷酸序列的區域的變體。30、根據上述權利要求任一項所述的方法,其中步驟(c)進一步包含加入在退火條件下退火到至少母多核苷酸之一的3,和/或5'端的引物序列。31、根據權利要求1到30任一項所述的方法,其中,在步驟(b),用于消化多核苷酸分子的第一群體的至少一個反應參數不同于用于消化多核苷酸分子的第二群體的反應的同等的參數。32、根據權利要求31所述的方法,其中反應參數選自核酸酶類型、核酸酶濃度、反應體積、消化反應的持續時間、反應混合物的溫度、反應混合物的pH、母多核苷酸序列的長度、母多核苷酸分子的量或反應混合物的緩沖液成分。33、根據上述權利要求任一項所述的方法,其中將母多核苷酸序列進行誘變。34、根據上述權利要求任一項所述的方法,其中將在歩驟(b)中產生的片段的一個或兩個群體進行誘變。35、根據權利要求33或34所述的方法,其中誘變是易錯PCR。36、根據上述權利要求任一項所述的方法,其中進行步驟(b)以產生長度不同的單鏈片段的群體。37、根據權利要求36所述的方法,其中控制步驟(b)以產生具有超過大約50個核苷酸的平均長度的單鏈片段的群體。38、根據上述權利要求任一項所述的方法,進一步包括表達步驟(d)中產生的至少一條多核苷酸序列的步驟以生產編碼的多肽。39、根據權利要求28所述的方法,進一步包括檢測編碼的多肽的改變的特性的步驟。40、通過根據權利要求1到39任一項所述的方法獲得的或可獲得的多核苷酸。41、包含根據權利要求40所述的多個多核苷酸的多核苷酸文庫。42、包含根據權利要求40所述的多核苷酸的載體。43、用于制備具有改變的性質的多肽的方法,該方法包含下述步驟(a)使用如權利要求1到39任一項所述的方法產生母多核苷酸的變體形式;(b)表達步驟(a)中生產的變體多核苷酸以生產變體多肽;(c)篩選變體多肽的改變的性質;禾口(d)從變體多肽中選擇具有改變的性質的多肽。44、通過根據權利要求43所述的方法獲得的或可獲得的多肽。45、藥物組合物,其包含根據權利要求40所述的多核苷酸或根據權利要求44所述的多肽以及藥學上可接受的載體。46、用做藥物的如權利要求40所述的多核苷酸或如權利要求44所述的多肽。47、根據權利要求40所述的多核苷酸或根據權利要求44所述的多肽在制備用于處理、治療和/或診斷疾病的藥物中的用途。48、用于制備藥物組合物的方法,其包括,經如權利要求1到39任一項所述的方法鑒定具有改變的序列或特性的多核苷酸和/或編碼的多肽后,將所述多核苷酸和/或編碼的多肽加到藥學上可接受的載體中。49、一種方法,其包括,經如權利要求1到39任一項所述的方法鑒定具有改變的序列或特性的多核苷酸和/或編碼的多肽后,將該多核苷酸和/或編碼的多肽全部或部分用于藥物。50、根據權利要求49所述的方法,其中所述的用于藥物是用于處理、治療和/或診斷疾病。51、一種方法,其包括,經如權利要求1到39任一項所述的方法鑒定具有改變的序列的多核苷酸后,將該多核苷酸用于檢測和/或擴增樣品中的目標多核苷酸。52、基本上如實施例中產生多核苷酸序列或序列群體的方法。53、基本上如實施例中制備具有改變的性質的多肽的方法。全文摘要本發明提供用于從母多核苷酸序列產生多核苷酸序列或序列的群體的方法,該方法包括步驟(a)提供多核苷酸分子的第一群體和多核苷酸分子的第二群體,第一和第二群體共同組成了母多核苷酸序列的正鏈和負鏈,(b)用核酸酶消化多核苷酸分子的第一和第二群體以產生多核苷酸片段,(c)將產生自正鏈的所述多核苷酸片段與產生自負鏈的片段接觸和(d)擴增退火到彼此的片段以產生與母多核苷酸編碼的那些氨基酸序列相比較,具有改變的氨基酸序列的一個或更多個蛋白基序,其中通過加入一個或更多個具有預決的變異性的寡核苷酸控制在步驟(d)中生產的至少一條多核苷酸分子的選擇區域內的序列變異性程度,該寡核苷酸退火到位于母多核苷酸分子的3′或5′末端核苷酸間但排除3′或5′末端核苷酸的序列。本發明也提供通過本發明的方法獲得的多核苷酸及被相同的多核苷酸編碼的多肽。文檔編號C12N15/10GK101351553SQ200680050127公開日2009年1月21日申請日期2006年11月17日優先權日2005年11月19日發明者A-C·M·哈格爾,C·菲雷布林,F·卡爾松,K·哈拉爾德松,M·卡爾松,P·埃爾馬克申請人:鱷魚生物科學公司