專利名稱：一種新型蛋白質分子量標準及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種在蛋白免疫印跡實驗中實 現不同分子量蛋白同時顯示的新型蛋白質分子量標準，此蛋白質分子量標
準由一系列串聯不同數目SPA的重組蛋白組成。
背景技術：
蛋白免疫印跡法(Western Blot)在免疫學中有著極其廣泛的應用，它 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質樣品，轉移到固相載體(例如硝酸纖 維素薄膜)上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離 的蛋白質類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質作為抗原，與 對應的抗體孵育結合，再與酶標記的第二抗體孵育結合，經過底物顯色或 產生熒光并底片曝光以檢測電泳分離的特異性蛋白的表達情況。
蛋白質分子量標準通常是由 一系列已知分子量但大小不同的蛋白質 組成，它主要應用于蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過分子量的比較從而判 斷目的蛋白在凝膠上的位置。在免疫印跡法實驗中，由于常規的蛋白質分 子量標準無法和目的蛋白的抗體及相應的第二抗體反應，從而無法顯色， 尤其是無法產生熒光從而在底片上顯影，導致無法通過蛋白質分子量標準 的輔助而正確判斷目的蛋白在底片上的正確位置。
葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A， SPA)是致病性金黃色葡 萄球菌細胞表面一種特有的蛋白質，具有與多種哺乳動物IgG的Fc段結合 的能力，它的基因序列已經公開。因此，利用SPA蛋白的獨特性質，采用基因工程技術優化其核苷酸序列，使不同數目的SPA串聯表達并純化，研 制出能夠在蛋白免疫印跡實驗中實現不同分子量蛋白同時顯示的新型蛋 白質分子量標準，為蛋白免疫印跡法的廣泛使用提供了一種重要試劑。

發明內容
本發明的目的是提供一種能夠在蛋白免疫印跡實驗中實現不同分子量 蛋白同時結合多種哺乳動物IgG抗體，并且能夠在底片上顯示的新型蛋白 質分子量標準。這種蛋白質分子量標準是由一系列串聯不同數目SPA的重 組蛋白組成。
為實現本發明的目的，擬采用以下技術方案(1)釆用大腸桿菌偏愛
密碼子將天然SPA基因核苷酸序列優化，以利于目的蛋白在大腸桿菌中的 表達。(2)以優化過的SPA序列為模板進行引物設計、合成，通過拼接引 物并PCR擴增得到目的片段。(3)將目的片段以不同串聯數目的方式插入 表達載體PET-28a(+)，并在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達。(4)通過鎳 瓊脂糖親和層析純化，得到一系列串聯不同數目SPA的重組蛋白，即蛋白 質分子量標準。(5)通過蛋白免疫印跡實驗證實該蛋白質分子量標準能與 多種哺乳動物IgG抗體結合。
與現有技術相比，本發明利用葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A， SPA)具有與多種哺乳動物IgG的Fc段結合的能力，采用基因工程技術優化 其核苷酸序列，使不同數目的SPA串聯表達并純化，研制出能夠在蛋白免 疫印跡實驗中實現不同分子量蛋白在底片上同時顯示的新型蛋白質分子 量標準，克服了傳統蛋白質分子量標準無法在膠片上顯示的缺點，為蛋白 免疫印跡法的廣泛使用提供了一種重要試劑，使得蛋白免疫印跡法的結果更具可信度和說服力。


圖l是質粒構建過程示意圖。
圖2是鼠源性IgG抗體和兔源性IgG抗體在X光底片曝光、顯影、定影 后的結果。
具體實施例方式
下面結合具體實施例及附圖對本發明作進一步詳細說明，所述實驗例旨 在以舉例方式具體闡明本發明。試劑、試劑的濃度、溫度和其它變量的值 以及載體和宿主的選擇只是舉例說明本發明的應用，而不構成對本發明的 限制。以下說明不用于限制本發明的范圍。
1. 優化編碼SPA蛋白的核苷酸序列
為了提高SPA蛋白的表達量，在SPA蛋白氨基酸序列不變的前提下,采 用大腸桿菌偏愛密碼子將編碼SPA蛋白的核苷酸序列優化，優化后的核苷 酸序列是序列表中SEQ ID NO: 1。
2. SPA多重串聯質粒的構建
以優化后的SPA核苷酸序列為模板進行引物設計合成，通過引物退火 拼接并PCR擴增獲得目的片段。PCR反應條件為94。C變性5分鐘，55。C退 火20秒，72。C延伸30秒，總共35個循環，最后再72。C延伸10分鐘。PCR 產物行1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段。引物序列如下所示
Fl of SPA:
5'-GGATCCGTGGATAAC嵐TTTMCAMGMCAGCAGAACGCCTTTTATGAAATTCTGCATCT-3'Rl of SPA:
5'-CAGGCTCTGMTAAAGGCGTTGCGCTGTTCTTCGTTCAGGTTCGGCAGATGCAGAATTTCATA-3' F2 of SPA:
5'-CGCCTTTATTCAGAGCCTGAAAGATGATCCGAGCCAGAGCGCCMCCTGCTGGCCGMGCCM-3' R2 Of SPANS' -GAATTCTTAGGTCTCGGATCACTTCGGGGCCTGGGCATCGTTCAGCTTCTTGGCTTCGGCCAGCAG-3' 將該目的片段連接pMD19-T載體，得到重組質粒pMD19-T-SPA*1 。由
于插入的目的片段末端設計有Bsal酶切位點，該內切酶的識別序列與剪
切序列不同，所以以pMD19-T-SPAW為出發質粒，可實現目的片段的再次
插入，得到重組質粒pMD19-T-SPA求2。同理類推，依次可得到SPA多重串
聯的重組PMD19-T質粒(詳細質粒構建過程參見圖1)。
3. 重組表達載體的構建
將實施步驟2中的SPA多重串聯的重組pMD-19T質粒用BamHI、 EcoRI 雙酶切處理，膠回收試劑盒回收目的片段。BamHI、 EcoRI雙酶切處理原核 表達質粒PET-28a(+),膠回收試劑盒回收載體。用T4 DNA連接酶將目的片 段和PET-28a(+)連接，經酶切鑒定后，得到多個表達SPA多重串聯的原核 表達質粒。
4. 蛋白質分子量標準的表達及純化
將實施步驟3中獲得多個表達SPA多重串聯的原核表達質粒轉入大腸 桿菌BL21(DE3)中，得到一系列表達蛋白質分子量標準的菌種。將這些菌 種分別接種于含卡那青霉素的LB液體培養基中，250rpm/min， 37。C培養 12小時后加誘導劑異丙基硫代-e -D-半乳糖苷至終濃度為1. 0mmol/L，繼 續培養4小時后，5000rpm/min，離心20分鐘，富集菌體。菌體用lOmMPBS(ra7.4)緩沖液重懸，冰浴，超聲波破碎5-10分鐘，高速冷凍離心并 收集上清。收集到的上清分別和鎳瓊脂糖混和后，先用低濃度咪唑溶液 (50mM)洗滌雜蛋白，再用高濃度咪唑溶液(300mM)洗脫并收集目的蛋 白，透析后于-2(TC備用，得到一系列串聯不同數目SPA的重組蛋白，即 蛋白質分子量標準，各個蛋白的分子量分別為15kD、 21kD、 30kD、 40kD、 60kD、 95kD。 5. Western Blot
純化后的蛋白質分子量標準行12%SDS-PAGE,電轉移到PVDF膜，一 抗分別為隨機挑選的鼠源性IgG抗體和兔源性IgG抗體，二抗為相對應的 HRP標記的羊抗鼠抗體和羊抗兔抗體，底物為Western Blot常用的魯咪諾 熒光底物。X光底片曝光、顯影、定影(結果參見圖2)。 相關溶液配方
1. 電泳緩沖液
Glyl 8. 8g, Tris 3. 03g， SDS lg，加雙蒸水定容至1000ral。
2. 轉膜緩沖液
Gly 2. 9g， Tris 5. 8g， SDS 0. 37g，甲醇200ml，加雙蒸水定容至 1000ml。
3. 洗漆液
Tris 3g, NaCl 8g， KC1 0.2g， Tween-20 1ml ，定容至1000ml (pH7.8)。
4. 熒光底物
Pierce公司產品(貨號Prodtt34075)。序列表
〈101 〉杭州松華生物科技有限公司 <120>—種新型蛋白質分子量標準及其制備方法
<160〉2
<210〉1
<211〉174
<212〉腿
〈400〉1
GTGGATAACA AATTTAACAA AGAACAGCAG MCGCCTTTT ATGMATTCT 50
GCATCTGCCG AACCTGMCG AAGAACAGCG CAACGCCTTT ATTCAGAGCC 100
TGAAAGATGA TCCGAGCCAG AGCGCCAACC TGCTGGCCGA AGCCAAGAAG 150
CTGAACGATG CCCAGGCCCC GAAG 174
<210〉2
<211〉58
<212>PRT
<400〉2Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gin Gin Asn Ala Phe Tyr Glu 15 10 15
lie Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gin Arg Asn Ala Phe
20 25 30
lie Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gin Ser Ala Asn Leu Leu
35 40 45
Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gin Ala Pro Lys
50 55 End
權利要求
1.一種新型蛋白質分子量標準及其制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)將天然SPA基因采用大腸桿菌偏愛密碼子將其核苷酸序列優化，優化后的核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO1。(2)以優化后的SPA基因序列為模板設計引物并化學合成，通過引物拼接并PCR擴增的方法得到目的片段。(3)將目的片段以不同串聯數目的方式插入表達載體PET-28a(+)，并在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達。(4)通過鎳瓊脂糖親和層析純化，得到一系列串聯不同數目SPA的重組蛋白，即蛋白質分子量標準。(5)通過蛋白免疫印跡實驗證實該蛋白質分子量標準能與多種哺乳動物IgG抗體結合。
2. 根據權利要求1所述的一種新型蛋白質分子量標準及其制備方法，其 特征在于蛋白質分子量標準中的每個蛋白均串聯不同數目的SPA， SPA的 氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO: 2。
3. 根據權利要求1所述的一種新型蛋白質分子量標準及其制備方法，其特 征在于步驟(1)將天然SPA基因采用大腸桿菌偏愛密碼子將其核苷酸序 列優化。
4. 根據權利要求1所述的一種新型蛋白質分子量標準及其制備方法，其特 征在于步驟(2)中以步驟(1)優化后的SPA基因序列為模板設計引物并 化學合成，通過引物拼接并PCR擴增的方法得到目的片段，，最終得到的 目的片段包含步驟(1)所述的SPA核苷酸序列。
5. 根據權利要求1所述的一種新型蛋白質分子量標準及其制備方法，其特征在于步驟(3)將步驟(2)獲得的目的片段以不同串聯數目的方式插入 表達載體PET-28a (+)，具體的串聯數目不限。
6. 根據權利要求1所述的一種新型蛋白質分子量標準及其制備方法，其特 征在于步驟(3)還包括將步驟(2)獲得的目的片段以不同串聯數目的方 式插入表達載體PET-28a(+)后，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，得到一系列表 達蛋白質分子量標準的菌種。
7. 根據權利要求1所述的一種新型蛋白質分子量標準及其制備方法，其 特征在于步驟(3)還包括將權利要求6所述的一系列表達蛋白質分子量 標準的菌種分別接種于含卡那青霉素的LB液體培養基中，250rpm/inin， 37。C培養12小時后加誘導劑異丙基硫代-D-半乳糖苷至終濃度為 1. O咖ol/L，繼續培養4小時后，5000rpm/min，離心20分鐘，富集菌體。 菌體用10mMPBS(ra7.4)緩沖液重懸，冰浴，超聲波破碎5-10分鐘，高速 冷凍離心并收集上清。
8. 根據權利要求1所述的一種新型蛋白質分子量標準及其制備方法，其 特征在于步驟(4)將權利要求7所述得到的上清混和鎳瓊脂糖，先用低 濃度咪唑溶液(50mM)洗滌雜蛋白，再用高濃度咪唑溶液(300mM)洗脫 并收集目的蛋白，得到一系列串聯不同數目SPA的重組蛋白，即蛋白質分 子量標準。
9. 根據權利要求1所述的一種新型蛋白質分子量標準及其制備方法，其 特征在于步驟(5)蛋白免疫印跡實驗中所用的蛋白質分子量標準為步驟(4)得到的蛋白質分子量標準。免疫印跡實驗中， 一抗分別為多種哺乳 動物IgG抗體，二抗為相對應的HRP標記或其它標記的IgG抗體，催化底物為魯咪諾等熒光底物，膠片曝光并顯影、定影。
10.根據權利要求l所述的一種新型蛋白質分子量標準及其制備方法，其 特征在于所述的蛋白質分子量標準可用于哺乳動物IgG抗體的結合、檢測、 分離、純化。
全文摘要
本發明屬于生物工程技術領域。本發明公開了一種新型蛋白質分子量標準及其制備方法。具體方法是將不同數目SPA(金黃色葡萄球菌蛋白A，Staphylococcal protein A)串聯表達得到的重組蛋白作為蛋白質分子量標準。本發明還公開了利用SPA具有與多種哺乳動物IgG的Fc段結合的能力，應用該新型蛋白質分子量標準并最終使其在膠片上顯影的方法。本發明還公開了通過基因工程技術優化SPA核苷酸序列的方法及其優化后的核苷酸序列。本發明還公開了利用BsaI酶切位點將多個SPA串聯表達并純化的方法。
文檔編號G01N33/68GK101556287SQ20091009598
公開日2009年10月14日 申請日期2009年2月26日 優先權日2009年2月26日
發明者衛 余, 余銘恩, 馮俊濤, 吳瓊杉, 翔 敖, 李曉照 申請人:杭州松華生物科技有限公司