專利名稱：細胞因子拮抗劑分子的制作方法
技術領域：
本發明涉及新穎的蛋白質(稱之INSP052和INSP055)，經本發明鑒定為含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子，以及涉及這些蛋白質和編碼基因的核酸序列在診斷、預防和治療疾病中的應用，例如用于診斷、預防和治療炎癥疾病、自身免疫疾病、皮膚疾病、肝病或肝臟衰竭。
本文所引用的出版物、專利和專利申請，均納入其全文作為參考。
背景技術：
目前，藥物發現方法正蘊釀著一場根本革命，因為功能基因組學年代已經來臨。術語“功能基因組學”應用于使用生物信息學工具將功能歸因于感興趣的蛋白質序列的方法。這些工具正日益顯示其必要性，因為序列數據產生的速度遠遠高于研究實驗室將功能劃分給這些蛋白質序列的能力。
隨著生物信息學工具的功效和準確性提高，這些工具正快速取代生物化學特性鑒定的常規技術。事實上，鑒定本發明所用的先進生物信息學工具現在能夠輸出可獲得較高置信度的結果。
各所研究院和商業機構正在檢查已有的序列數據，并且逐漸獲得重大發現。然而，仍然有必要鑒定和特性分析其它基因和它們編碼的多肽，作為研究和藥物發現的目標。
本發明的申請人最近研制了一個卓越工具，用于評價未知功能的序列。此工具是一個數據庫系統(命名為Biopendium搜索數據庫)，它是WO01/69507的主題。該數據庫系統由利用專有技術(proprietary technology)建立的綜合數據資源組成，含有對全部已有蛋白質或核酸序列所作的逐一對比而獲得的信息。
將不同數據資源的這些序列數據綜合的目的在于把涉及序列本身和每一序列相關信息的盡可能多的數據集合成一個綜合資源。將涉及每一序列的所有已有數據(若有的話，包括編碼蛋白質的三維結構數據)綜合在一起，以便更好地利用各個序列的已知信息，從而通過對這些序列作對比獲得最佳的預測結果。從數據庫就每個序列輸入項目產生的詮釋可了解該序列信息的生物相關內容。
該數據資源使得僅從序列即可準確預測蛋白質功能成為可能。若使用常規技術，只能針對與同一功能家族的其它蛋白質有高度序列同一性(約20-30％同一性以上)的蛋白質。而準確預測與未知功能的其它相關蛋白質有低程度序列同源性的蛋白質是不可能的。
含有信號肽的蛋白質細胞制造和分泌胞外蛋白質的能力是許多生物過程的關鍵。酶、生長因子、胞外基質蛋白和信號傳導分子全部由細胞分泌出來。這是分泌小泡與質膜融合所致。多數情況下，但不是所有情況，蛋白質被信號肽導入內質網，并進入分泌小泡。信號肽是順式作用序列，影響多肽鏈從細胞質轉運至膜結合室如分泌小泡。靶向分泌小泡的多肽或者分泌進入胞外基質，或者留在質膜內。留在質膜內的多肽有一或多個跨膜結構域。在細胞機能中發揮中心作用的并含有信號肽的蛋白質的例子是細胞因子、激素、胞外基質蛋白、粘附分子、受體、蛋白酶及生長和分化因子。
含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子已經顯示，含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子在多種生理功能中起作用，其中很多能在疾病過程中扮演角色。改變它們的活性是改變疾病表型的一個工具，因此鑒定新穎的含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子與之密切相關，因為它們可能在許多疾病中起作用，尤其是炎癥疾病、腫瘤、和心血管疾病。含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子參與廣泛的生物過程，包括胚胎形成(Martin-Bermudo，M.D.等，Development.2000127(12)2607-15；Chen，L.M.，等，J Neurosci.2000 20(10)3776-84；Zweegman，S.，等，Exp Hematol.2000 28(4)401-10；Darribere，T.，等，Biol Cell.2000 92(1)5-25)，維持組織完整性(Eckes，B.，等，J Cell Sci.2000113(Pt 13)2455-2462；Buckwalter，J.A.，等，Instr Course Lect.2000 49481-9；Frenette，P.S.，等，.J Exp Med.2000 191(8)1413-22；Delmas，V.，等，Dev Biol.1999 216(2)491-506；Humphries，M.J.，等，Trends PharmacolSci.2000 21(1)29-32；Miosge，N.，等，Lab Invest.1999 79(12)1591-9；Nagaoka T，等Am J Pathol 2000 Jul 1571237-47；Nwariaku FE，等J Trauma1995 39(2)285-8；Zhu X，等Zhonghua Zheng Xing Shao Shang Wai Ke Za Zhi1999 15(1)53-5)，白細胞外滲/發炎(Lim，L.H.，等Am J Respir Cell Mol Biol.2000 22(6)693-701；Johnston，B.，等，Microcirculation.2000 7(2)109-18；Mertens，A.V.，等，Clin Exp Allergy.1993 23(10)868-73；Chcialowski，A.，等，Pol Merkuriusz Le k.2000 7(43)13-7；Rojas，A.I.，等，Crit Rev Oral Biol Med.1999 10(3)337-58；Marinova-Mutafchieva，L.，等，Arthritis Rheum.2000 43(3)638-44；Vijayan，K.V.，等，J Clin Invest.2000 105(6)793-802；Currie，A.J.，等，.J Immunol.2000 164(7)3878-86；Rowin，M.E.，等，Inflammation.2000 24(2)157-73；Johnston，B.，等，JImmunol.2000 164(6)3337-44；Gerst，J.L.，等，J Neurosci Res.2000 59(5)680-4；Kagawa，T.F.，等，Proc Natl Acad Sci U S A.2000 97(5)2235-40；Hillan，K.J.，等，Liver.1999 19(6)509-18；Panes，J.，1999 22(10)514-24；Arao，T.，等，J Clin Endocrinol Metab.2000 85(1)382-9；Souza，H.S.，等，Gut.1999 45(6)856-63；Grunstein，M.M.，等，Am J PhysiolLung Cell Mol Physiol.2000 278(6)L1154-63；Mertens，A.V.，等，Clin ExpAllergy.1993 23(10)868-73；Berends，C.，等，Clin Exp Allergy.199323(11)926-33；Fernvik，E.，等，Inflammation.2000 24(1)73-87；Bocchino，V.，等，J Allergy Clin Immunol.2000 105(1Pt 1)65-70；JonesSC，等，Gut 1995 36(5)724-30；Liu CM，等，Ann Allergy Asthma Immunol1998 81(2)176-80；McMurray RW Semin Arthritis Rheum 1996 25(4)215-33；Takahashi H，等Eur J Immunol 1992 22(11)2879-85；Carlos T，等JHeart Lung Transplant 1992 11(6)1103-8；Fabrega E，等，Transplantation2000 69(4)569-73；Zohrens G，等，Hepatology 1993 18(4)798-802；Montefort S，等Am J Respir Crit Care Med 1994 149(5)1149-52)，腫瘤生成(Orr，F.W.，等，Cancer.2000 88(S12)2912-2918；Zeller，W.，等，JHematother Stem Cell Res.1999 8(5)539-46；Okada，T.，等，Clin ExpMetastasis.1999 17(7)623-9；Mateo，V.，等，Nat Med.1999 5(11)1277-84；Yamaguchi，K.，等，J Exp Clin Cancer Res.2000 19(1)113-20；Maeshima，Y.，等，J Biol Chem.2000 275(28)21340-8；Van Waes，C.，等，Int J Oncol.2000 16(6)1189-95；Damiano，J.S.，等，Leuk Lymphoma.2000 38(1-2)71-81；Seftor，R.E.，等，Cancer Metastasis Rev.1999 18(3)359-75；Shaw，L.M.，J Mammary Gland Biol Neoplasia.1999 4(4)367-76；Weyant，M.J.，等，Clin Cancer Res.2000 6(3)949-56)，血管生成(KochAE，等Nature 1995 376(6540)517-9；Wagener C & Ergun S.Exp Cell Res2000 261(1)19-24；Ergun S，等Mol Cell 2000 5(2)311-20)，骨再吸收(Hartman GD，& Duggan ME.Expert Opin Investig Drugs 2000 9(6)1281-91；Tanaka Y，等J Bone Miner Res 1995 10(10)1462-9；Lark MW，等JPharmacol Exp Ther 1999 291(2)612-7；Raynal C，等Endocrinology 1996137(6)2347-54；Ilvesaro JM，等Exp Cell Res 1998 242(1)75-83)，神經功能異常(Ossege LM，等Int Immunopharmacol 2001 11085-100；Bitsch A，等，Stroke 1998 292129-35；Iadecola C & Alexander M.Curr Opin Neurol2001 1489-94；Becker K，等Stroke 2001 32(1)206-11；Relton JK，等Stroke 2001 32(1)199-205；Hamada Y，等J Neurochem 1996 661525-31)，血栓形成(Wang，Y.G.，等，J Physiol(Lond).2000 526(Pt 1)57-68；Matsuno，H.，等，Nippon Yakurigaku Zasshi.2000 115(3)143-50；Eliceiri，B.P.，等，Cancer J Sci Am.2000 6(Suppl 3)S245-9；von Beckerath，N.，等，Blood.2000 95(11)3297-301；Topol，E.J.，等，Am Heart J.2000139(6)927-33；Kroll，H.，等，Thromb Haemost.2000 83(3)392-6)，以及細菌病原體侵入/粘附在宿主細胞上(Dersch P，等EMBO J 1999 18(5)1199-1213)。
對一些含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子家族的結構和功能進行詳細特征鑒定，已使得很多醫藥公司積極開展計劃以研制用于治療包括炎癥、腫瘤、神經病、免疫和心血管功能等疾病的調節劑。事實上，含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子參與生物學上的每一方面，從胚胎生成至細胞凋亡。它們對大部分組織的結構完整性和自身穩定功能是必不可少的。因此，含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子存在缺陷能致病，并且許多疾病涉及對含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子的功能進行調節，此種現象是不奇怪的。該家族成員列于表1中。
含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子家族實際上含有多個不同家族。在這些家族中，有些因為具備小分子牽引性(tractability)而有特定的藥學價值。它們包括1.免疫球蛋白粘附分子代表整聯蛋白反受體，包括胞內粘附分子(ICAM)和血管細胞粘附分子(VCAM)。成員由球狀結構域、免疫球蛋白樣結構域、胞外結構域等多個成員組成。該家族的某些成員，例如PECAM-1(CD31)和NCAM，介導同質粘附。而該家族的另一些成員，例如ICAM-1和VCAM-1，通過與整聯蛋白相互作用來介導粘附。
2.細胞表面生長因子受體。生長因子位于細胞外，它們與靶細胞質膜上的具有特異性高親和力的受體相互作用而發揮生物作用。各種不同生長因子受體的分子特性揭示它們屬于定義的家族酪氨酸激酶受體、G-蛋白相關的七個跨膜受體、以及絲氨酸/蘇氨酸激酶受體。酪氨酸激酶受體的特征為一個胞外結構域、一個跨膜結構域和一個胞內結構域，它們均具有酪氨酸激酶活性。酪氨酸激酶生長因子受體的例子是VEGFR、PDGFR、FGFR、CSF-1R和c-KIT，它們的細胞外還含有免疫球蛋白結構域。對生長因子功能作Dys-調節，產生許多不同疾病的表型，包括但不限于腫瘤(Bartucci M等，(2001)Cancer Res.Sep 15；61(18)6747-54，Dias S等，(2001)Proc NatlAcad Sci U S A.Sep 11；98(19)10857-62，Djavan B等，(2001)World JUrol.19(4)225-33)，炎癥(Fiocchi C.(2001)J Clin Invest.Aug；108(4)523-6，Hodge S等，(2001)Respirology.Sep；6(3)205-211，Fenwick SA等，(2001)J Anat.Sep；199(Pt 3)231-40)，神經(Cooper JD等，(2001)Proc NatlAcad Sci U S A 98(18)10439-44，Fahnestock M等，(2001)Mol CellNeurosci 18(2)210-20)，以及新陳代謝(Vickers MH等，(2001)Endocrinology.142(9)3964-73)。
表1含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子

因此，業已證明，含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子在多種生理功能中起作用，它們當中很多能在疾病過程中扮演角色。改變它們的活性是改變疾病表型的一個工具，因此鑒定新穎的含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子與之密切相關，因為它們可能在許多疾病中起作用，尤其是免疫疾病、炎癥疾病、腫瘤、心血管疾病、中樞神經系統疾病和感染。

發明內容
本發明基于如下發現INSP052和INSP055蛋白質起著含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子的功能，特別是起著細胞因子拮抗劑的功能。含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子的例子列于表1中。
本發明第一方面的一實施例提供一種多肽，該多肽(i)包括或由SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ IDNO16、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ IDNO26所示的氨基酸序列組成；(ii)是其片段，該片段具有(i)的多肽的活性，或者具有與(i)的多肽相同的抗原決定簇；或者(iii)是(i)或(ii)的功能等同物。
“(i)的多肽的活性”指的是含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子的活性。而含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子的活性指的是包含能被鑒定為含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子家族內保守性特征的氨基酸序列或結構特征的多肽。
所述定義包括細胞因子拮抗劑活性。“細胞因子拮抗劑”指的是多肽、片斷或功能等同物抑制至少一種細胞因子的活性。較佳地，本發明的細胞因子拮抗劑可以通過抑制細胞因子表達和/或分泌來抑制細胞因子的活性。以其它機制抑制細胞因子表達(例如與細胞因子或細胞因子受體結合)的細胞因子拮抗劑包括在本發明范圍之內。較佳地，本發明的細胞因子拮抗劑能夠抑制一種以上細胞因子的活性。
較佳地，本發明的細胞因子拮抗劑具有免疫調節活性。“免疫調節活性”指的是在體內或體外檢測到的影響免疫反應的任何活性。免疫調節活性的例子包括免疫抑制活性、抗炎活性、促細胞凋亡活性、抗細胞凋亡活性以及抗腫瘤活性。
可由本發明的細胞因子拮抗劑抑制的細胞因子包括TGF-α、EGF、細胞因子(如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-13、G-CSF、GM-CSF、CNTF、OSM、EPO、IL-10、IFN-α、IFN-β、IFN-γ和M-CSF)的四α-螺旋束家族成員、細胞因子(如NGF、TGF-β、PDGF和VEGF)的半胱氨酸結家族成員、趨化因子(如IL-8、MIP-1-α、MIP-1-β、MIP-2、PF-4、PBP、1-309/TCA-3、MCP-1、MCP-2、MCP3和IP-10)、細胞因子(如TNF-α、TNF-β和LT-β)的TNF家族成員、以及細胞因子(包括FGF-α、FGF-β、IL-1-α、IL-1-β和IL-1ra)的β-三葉家族成員。本發明的優選細胞因子拮抗劑抑制TNF-α、IL-4和/或IL-2的活性。
細胞因子形成一個由分子量較低的分泌肽組成的異源家族，起著調節針對各類刺激物的細胞反應的調節劑，特別用作涉及炎癥和免疫反應的調節劑，但也可用作涉及細胞擴增、修復、細胞-細胞相互反應以及分化的調節劑。
細胞因子主要表現為非酶類糖蛋白，過去基于序列同源性、結構組件、表達細胞和/或結合活性等標準被分為幾類。這些序列家族的例子是白介素、淋巴因子、單核因子、干擾素，但近年已對許多其它序列作特性分析，認為它們具有細胞因子活性(例如，某些生長因子或趨化因子)，因此難以進行全面分類(Haddad JJ，2002，Biochem Biophys Res Commun，297700-13)。
細胞因子主要由單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞產生，但也可由其它類型細胞(如白細胞、造骨細胞、平滑肌細胞、上皮細胞、神經元細胞、內皮細胞或成纖維細胞)產生，不過，它們并非以組成型方式正常地產生。一般地，免疫細胞為應答攻擊物質(例如細菌、病毒或其它致病原)而分泌產生細胞因子，所述攻擊物質可以刺激它們的重新表達以及從細胞分泌出來，結果是或者改變它們的自身功能(自分泌/內分泌效應)或者改變附近細胞和局部小環境的功能(旁分泌/并列分泌效應)。
細胞因子通過觸發各種細胞信號傳導途徑的受體作用于目標細胞(Ishihara K and Hirano T，2002，Biochim Biophys Acta，1592281-296)。一般地，細胞因子的作用通常具有多效性(一種細胞因子可觸發多種生理作用)、重復性(不同細胞因子可負責一種近似的生理作用)、以及可以影響各種各樣和重疊的目標細胞群。
通過以下事實可以觀察細胞因子的生理作用要應答一種可導致細胞遷移和聚集的炎癥反應，細胞因子可以協同方式誘導(或抑制)許多蛋白質的產生，包括其它細胞因子和/或細胞因子受體的產生。所以，許多生理反應(在生理和病理條件下)是細胞因子之間協同或拮抗相互作用的相互連接重復網絡的結果。
對細胞因子及其受體的克隆和生理進行分析，大致上認識到它們基因多效性和重復性背后的分子基礎。通常將這種性質歸因于細胞因子受體復合物的組成，所述復合物包括一個被細胞因子家族全部成員使用的信號轉導受體亞基以及一個每個細胞因子特有的結合亞基。所以，由細胞因子誘導的信號級聯代表一種機理，對于特定細胞或組織具有最后結果，由細胞表面上同時收到的很多不同信息確定。
至今尚未能完全理解細胞因子網絡機能的細節，但已經很清楚的是，細胞因子是眾多疾病發病機理的重要介導劑，參與發病機理中，直接或間接地涉及先天和后天免疫反應。具體地說，細胞因子的主要病理-生理作用來自于它們過度或者不適當地局部產生，誘導炎癥狀態，從而不利于病人狀態。所以，一般認為，有效地抑制一或多種細胞因子特別是促炎細胞因子的任何機理對治療人的疾病都產生正面作用，方法是控制與特定細胞因子的不適當產生或延長產生有關的細胞事件的不良級聯。
就這一點而言，關于產生和/或給予細胞因子拮抗劑以阻斷它們的促炎活性的技術，現有文獻已經公開了大量的策略和化合物。這些技術的非完整清單包括人細胞因子受體的可溶性變體、細胞因子特異性抗體、病毒性蛋白結合細胞因子、抑制細胞因子產生的小分子。這些免疫調節分子可針對低效或不當引導的免疫反應。然而，可供用于治療人疾病的細胞因子拮抗劑是相當少的。藥物發現計劃仍未深入地研究潛在的替換化合物，它們通過調節胞外或胞內信號傳導途徑而用于細胞介導的炎癥過程的藥理干預中(StevcevaL，2002，Curr Med Chem.，92201-7；Inagaki-Ohara K等，2003，CurrOpin Pharmacol.，3435-42)。
以下實施例部分將提出證據，證明INSP052(本文也稱為INSP052EC)的胞外結構域在伴刀豆球蛋白(ConA)刺激的人外周血單核細胞(hPBMC)試驗中以及在使用CD4+T細胞的類似試驗中能夠使TNF-α、IL-4和IL-2的體外分泌下調。另外，還發現，在一個暴發型肝炎體內模型中導入INSP052ECcDNA，可以降低血清中的TNF-α和m-IL-6水平，對減少血清轉氨酶有明顯的作用。皮下注射INSP052EC蛋白質也證實了這種影響。
天冬氨酸氨基轉氨酶(ASAT)和丙氨酸氨基轉氨酶(ALAT)水平的大幅降低可能是由于TNF-α和IL-4水平降低所致。TNF-α和IL-4是重要的細胞因子，在注射ConA后參與誘導肝臟損壞。在肝炎小鼠模型中，TNF-α主要由肝巨噬細胞(也叫Kupfer細胞)產生，而IL-4由肝(天然殺傷T)NKT細胞產生。已經發現，抗TNF-α抗體能保護免于致病(Seino等，2001，Annals ofsurgery 234，681)，抑制NKT細胞產生IL-4也被證實在T細胞介導的小鼠肝炎中保護肝臟(Ajuebor等，2003J.Immunology 170，5252-9)。
此外，在LPS誘導釋放細胞因子的小鼠模型中，已經證明了INSP052EC具有使LPS誘導的TNF-α或IL-6的釋放下調的能力。
另外，將INSP052EC用在半抗原誘導的接觸超敏性(CHS，一種皮膚炎癥小鼠模型)中進行測試。我們注意到，INSP052EC以劑量依賴方式明顯地減輕耳朵腫脹，提示白細胞浸潤減少，隨后發生炎癥的機會也減少，所以證明了INSP052EC能夠用來治療T細胞介導的皮膚炎癥，如過敏性接觸皮炎和牛皮癬。
本文清楚地表明，INSP052(INSP052EC)的分離的胞外結構域(同樣地，含有這種蛋白質序列或全長蛋白質的變體或融合蛋白)可用來調節細胞因子活性，特別是用作細胞因子分泌和/或表達的拮抗劑，可以在與先天或后天免疫反應有直接或間接關系的疾病中發揮治療作用。由INSP052胞外結構域獲得的這些結果，讓我們推斷出INSP052多肽的其它變體以及全長多肽序列也可能與上述提到的物質具有相同功能。所以，在治療自身免疫疾病、病毒性或急性肝病以及酒精性肝臟衰竭時可以考慮采用INSP052、INSP052EC(SEQ ID NO20和SEQ ID NO22)以及相關的功能等同蛋白質。它們治療其它炎癥疾病也可能有效的。
由被測試的INSP052EC基分子在采用不同細胞的試驗和動物模型中所顯示的抑制活性的范圍確定，使用此類分子可以阻斷細胞因子由于過度或不適當地局部產生而引致的病理-生理作用。通過INSP052EC基分子可以控制與促炎細胞因子延長產生相關的細胞事件，所以這些分子可用來拮抗異常的炎癥狀態，尤其是累及各種組織和器官(例如肝臟、皮膚、肺、中樞神經系統)的自身免疫疾病和炎癥疾病相關的異常狀態，并且為腫瘤、神經系統障礙、心血管疾病和傳染性疾病提供了一個全新治療機會。采用細胞因子試驗，其中抽取自感染了其它疾病的病人的樣品顯示細胞因子過度表達和/或分泌，也可以鑒定INSP052EC基分子的其它臨床應用(Wong CK和LamCW，Adv Clin Chem.2003，371-46；Whiteside TL，Biotechniques，2002，Oct.Suppl4-8，10，12-5)，由此驗證了INSP052EC基分子作為細胞因子拮抗劑的治療用途。
下文將具有SEQ ID NO2所示的序列的多肽稱為“INSP052外顯子1多肽”。將具有SEQ ID NO4所示的序列的多肽稱為“INSP052外顯子2多肽”。將具有SEQ ID NO6所示的序列的多肽稱為“INSP052外顯子3多肽”。將具有SEQ ID NO8所示的序列的多肽稱為“INSP052外顯子4多肽”。將具有SEQ ID NO10所示的序列的多肽稱為“INSP052外顯子5多肽”。將具有SEQ ID NO12所示的序列的多肽稱為“INSP052外顯子6多肽”。將具有SEQ ID NO14所示的序列的多肽稱為“INSP052外顯子7多肽”。將SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12和SEQ ID NO14組合得到SEQ ID NO16所示的序列。將具有SEQ ID NO16所示的序列的多肽稱為“INSP052多肽”。具有SEQ ID NO20所示的序列的多肽是INSP052的胞外結構域。下文將具有SEQ ID NO22所示的序列的多肽稱為“成熟INSP052多肽的胞外結構域”。下文將具有SEQ ID NO24所示的序列的多肽稱為“成熟INSP052外顯子2多肽”。下文將具有SEQ ID NO26所示的序列的多肽稱為“成熟INSP052多肽”。下文將具有SEQ ID NO29所示的序列的多肽稱為“帶有組氨酸標簽的成熟INSP052胞外結構域”。下文將具有SEQ ID NO30所示的序列的多肽稱為“成熟INSP052胞外結構域的Fc融合子”。下文將具有SEQ ID NO31所示的序列的多肽稱為“含有Ig結構域的INSP052片段(INSP052Ig2)”。
本文所用的術語“INSP052外顯子多肽”包括如下的多肽包括或由此處所列的多肽序列組成，包括INSP052外顯子1多肽、INSP052外顯子2多肽、INSP052外顯子3多肽、INSP052外顯子4多肽、INSP052外顯子5多肽、INSP052外顯子6多肽、INSP052外顯子7多肽、INSP052多肽、INSP052的胞外結構域、成熟INSP052的胞外結構域、INSP052成熟外顯子2多肽、成熟INSP052的胞外結構域、帶組氨酸標簽的成熟INSP052胞外結構域、成熟INSP052胞外結構域的Fc融合子以及含有Ig結構域的INSP052片段。
在一實施例中的多肽由SEQ ID NO16所示的氨基酸序列(INSP052多肽)組成，或者是其片段或其功能等同物。而另一實施例的多肽由SEQ IDNO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12或SEQ ID NO14所示的任一氨基酸序列組成，或者是其變體。
本發明第一方面的另一實施例提供一種多肽，該多肽i)包括或由SEQ ID NO20或SEQ ID NO22所示的氨基酸序列組成；ii)是其片段，該片段具有(i)的多肽的活性，或者具有與(i)的多肽相同的抗原決定簇；或者iii)是(i)或(ii)的功能等同物。
SEQ ID NO20所示的氨基酸序列代表INSP052的胞外結構域，對應于全長蛋白質的氨基酸1-240(參見實施例部分)。SEQ ID NO22所示的氨基酸序列代表成熟INSP052的胞外結構域。INSP052胞外結構域可參見圖7。
如果多肽片段包含了多肽序列邊界C末端和/或N末端的附加殘基，則胞外結構域將正確地折疊并表現生物活性是很有可能的。例如，INSP052多肽序列或同源序列的5、10、20、30、40、50或者甚至100個附加氨基酸殘基包含在受體結合結構域邊界的C末端和/或N末端的一端或兩端，不會影響該多肽片段正確折疊和表現生物活性的能力。因為二級結構組件之間存在大環，所以可能需要將殘基延長至100或200個。
對于INSP052胞外結構域的截短型變體，該結構域的C末端或N末端的一端或兩端可以缺失一或幾個氨基酸殘基(例如2、3、4、5、10、15、20、25、30或以上)，而對其生物活性沒有任何損害。
INSP052胞外結構域的其中一個優選截短型變體是含有Ig結構域的INSP052片段(INSP052Ig2)，它具有SEQ ID NO31所示的序列。本發明提供一種多肽，該多肽i)包括或由SEQ ID NO31所示的氨基酸序列組成；ii)是其片段，該片段具有(i)的多肽的活性，或者具有與(i)的多肽相同的抗原決定簇；或者iii)是(i)或(ii)的功能等同物。
如下文所討論，本發明的多肽可以是融合蛋白質形式，或者是“獨立的(free-standing)”蛋白質形式。所以，本發明一個實施例提供一種多肽，該多肽由INSP052的胞外結構域組成。本發明另一個實施例提供一種多肽，該多肽由與至少一個其它多肽融合的INSP052(全長蛋白質或其胞外結構域，包括成熟版本及其截短型變體)組成，形成一個融合蛋白。
所以，本發明的又一實施例包括一種多肽，該多肽包括或由兩個序列(a)和(b)組成，其中(a)是與以下物質具有至少90％同一性的氨基酸序列i)如SEQ ID NO20、SEQ ID NO22或SEQ ID NO31所示的氨基酸序列；ii)是其片段，該片段具有(i)的多肽的活性，或者具有與(i)的多肽相同的抗原決定簇；或者iii)是(i)或(ii)的功能等同物；以及(b)是選自以下組內的異源氨基酸序列信號序列、純化標簽、膜結合蛋白質的胞外結構域、分泌蛋白質、起始甲硫氨酸、含有內肽酶識別位點的接頭區、或者來自免疫球蛋白分子的Fc區。
將編碼一種多肽的聚核苷酸在讀框內與一個異源蛋白質序列的編碼序列進行克隆就可以獲得這樣的融合蛋白，其中所述多肽包含的序列以該多肽長度計與上述提到的INSP052多肽中任一個具有至少90％同源性，更好具有至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同源性。
本文使用術語“異源”時，指的是人INSP052多肽以外的任何多肽。例如，可包含在融合蛋白N-或C-末端的異源序列包括膜結合蛋白的胞外結構域、免疫球蛋白恒定區(Fc區)、多聚區、胞外蛋白質結構域、信號序列、輸出序列、以及通過親和色譜法可以純化的序列。
很多這樣的異源序列都可通過商業途徑獲得，它們存在于表達質粒中，這是因為融合蛋白包含這些序列是為了不明顯損害與其融合的蛋白質的特異生物活性的前提下，提供附加性質(Terpe K，2003，Appl MicrobiolBiotechnol，60523-33)。
例如，這些附加性質是在體液停留的半衰期延長、純化程序更容易、附加結合基團、經內切蛋白酶解而成熟、在重組生產中穩定性更高、或者細胞外定位。后一種特征特為重要，因為它可允許多肽在有利于它們的分離和純化的空間定位。
現有文獻已對融合蛋白的構建、純化、檢測、成熟和使用的基團、配體、接頭的設計以及方法和策略進行了廣泛討論(Nilsson J等，Protein ExprPurif，111-16，1997；“Applications of chimeric genes and hybridproteins“Methods Enzymol.Vol.326-328，Academic Press，2000)。
若需要，在純化蛋白質后通過蛋白水解切割或者在體內除去異源序列。其實施方式可以是例如在蛋白質與異源序列之間插入蛋白水解切割位點、將融合蛋白與適當的外/內肽酶接觸。這些特征有利于融合蛋白的產生及其在制備藥物組合物中的用途。
例如，通過含有內肽酶(如caspase)識別位點的接頭序列將異源序列與蛋白質相連，所述的內切酶可在體內或體外將所希望的蛋白質與該異源序列分離。或者，如果需要表達的蛋白質未含有起始甲硫氨酸(例如，如果它是一個不帶信號肽的成熟序列)，則該異源序列可以是起始甲硫氨酸，以允許該蛋白質在宿主細胞中正確表達。以后再采用現有文獻公開的方法，以外肽酶(如甲硫氨酸氨基肽酶)除去此增加的氨基酸(Van Valkenburgh HA and KahnRA，Methods Enzymol，344186-193，2002；Ben-Bassat A，BioProccessTechnol，12147-159，1991)。
可與本發明的多肽融合的異源序列可以由有利于該蛋白質分泌的序列組成，例如信號肽和輸出肽(Rapoport TA等，Annu Rev Biochem.1996；65271-303)。
或者，融合蛋白中的異源序列能夠使蛋白質的純化更容易。例如，利用INSP052 C-末端融合的6-組氨酸肽可以純化INSP052多肽。這種融合蛋白質的一個例子如SEQ ID NO29所示。該6-組氨酸肽形成了一個所謂“組氨酸標簽”，對純化有利(Gentz等，1989，Proc Natl Acad Sci USA，86821-4)。“HA”標簽(由流行性感冒紅血球凝聚素蛋白質產生的表位)(Wilson等，1994，Cell，37767-78)或者其它親和純化標簽(如GST、FLAG或MBP)都可替代組氨酸標簽。
融合蛋白的異源序列可提供另一種功能活性。例如，具有細胞因子拮抗活性的INSP052胞外結構域可與具有抗炎活性或者一般地與具有免疫調節活性的異源序列融合，譬如說其它細胞因子拮抗劑、膠原II-結合劑(如WO01/37861公開的那些)以及細胞因子本身(如WO03/095488、WO03/014359和WO03/035105公開的那些)。
異源序列可提供更好的穩定性、延長本發明的多肽的半衰期，因而可提高它的治療活性。例如，多肽可以與人血清白蛋白融合，或者與能結合循環人血清白蛋白的其它序列融合(參見Chuang VT等，Pharm Res.2002；19569-577；Graslund T等，Protein Expr Purif.1997，9125-32；WO01/77137)。或者，附加序列可幫助例如在腦中靶向特定位置(WO03/32913)。
異源序列通過形成蛋白質多聚體而提高穩定性。可以促進多聚化作用的異源序列的例子包括由蛋白質分離出來的結構域，如hCG(WO 97/30161)、膠原X(WO 04/33486)、C4BP(WO 04/20639)、Erb蛋白質(WO 98/02540)、或者卷曲螺旋肽(WO 01/00814)。
在一優選實施例中，多肽與Ig分子的恒定區融合。這樣的多肽的例子如SEQ ID NO30所示。較佳地，多肽與人IgG1的CH2和CH3結構域等重鏈區融合。Ig分子的其它同種型也適合產生本發明的融合蛋白，譬如說同種型IgG2或IgG4，或者其它Ig類，如IgM或IgA。恒定區促進多聚化而能夠提高穩定性。融合蛋白可以是單聚體或多聚體、異源或同源多聚體。
如何產生包含蛋白質和免疫球蛋白片段的融合蛋白的策略例如已在現有文獻中有所描述(WO 91/08298；WO 96/08570；WO 93/22332；WO04/085478；WO 01/03737，WO 02/66514)。
例如，編碼成熟INSP052胞外結構域的核酸序列可在一個表達載體中克隆，該表達載體與一個編碼原始INSP052信號序列(或任何其它合適的信號/輸出序列)的核酸序列的5’端融合，該核酸序列的3’端編碼人免疫球蛋白λ重鏈IgG1的恒定區(NCBI Acc.No.CAA75302；segment 246-477)。得到的載體可用來轉化CHO或HEK293宿主細胞系，可選擇穩定地表達和分泌N-末端具有INSP052胞外結構域而C-末端具有IgG1序列的克隆。然后，再用該克隆按比例擴大生產以及在培養基中純化重組融合蛋白。或者，可將核酸分子編碼人免疫球蛋白λ重鏈IgG1的恒定區與INSP052胞外結構域的位置對換，仍然可以用INSP052的原始信號序列或任何其它合適的信號/輸出序列表達和分泌得到的蛋白質。
也可用此技術產生異二聚體，方法是將在同一細胞內編碼兩種不同融合蛋白的構建體共表達(WO00/18932)。例如，一個細胞可以表達第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中第一融合蛋白包含與Fc結構域融合的INSP052胞外結構域，第二融合蛋白包含與具有不同活性的蛋白質(如另一個細胞因子拮抗劑、膠原II-結合劑(如WO 01/37861公開的那些)和/或細胞因子(如WO03/095488、WO03/014359和WO03/035105公開的那些)融合的Fc結構域。
當融合蛋白包含一個免疫球蛋白區時，這種融合可以是直接的，或通過一個短接頭肽，長度短至1-3個氨基酸殘基或較長，如13到20個氨基酸殘基的長度相融合。例如，所述接頭可以是E-F-M(Glu-Phe-Met)序列的三肽或13個氨基酸的接頭序列Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met，將其導入本發明的多肽的序列和免疫球蛋白序列之間。所產生的融合蛋白具有改進的性能，如在體液的停留期(半衰期)延長，比活性提高，表達水平增加或有利于該融合蛋白的純化。
在一優選實施例中，將至少一部分連接于本發明多肽內一或多個官能團上，所述官能團以氨基酸殘基上一個或多個側鏈的形式出現。所述的部分最好是允許形成共軛物和復合物的穩定聚合物(Harris JM and Chess RB，NatRev Drug Discov，2214-221，2003；Greenwald RB等，Adv Drug DelivRev，55217-250，2003；Pillai O and Panchagnula R，Cur Opin ChemBiol，5447-451，2001)。該聚合物可在定點修飾適當殘基之后于內部位置或端點位置產生。多肽或融合蛋白內的氨基酸殘基可用作附著手段，只要它們的側鏈能夠導致聚合物附著(即氨基酸側鏈帶有一個官能團，例如賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、組氨酸等等)。或者，這些位置上的殘基可被一個不同氨基酸取代，后者所帶的側鏈能夠使聚合物附著。
例如，INSP052胞外結構域的N-或C-末端可加上一個允許直接聚乙二醇化的附加半胱氨酸。或者，例如在糖基化位點上置換一個殘基以使蛋白質包括一個半胱氨酸。另外，可對遺傳編碼的氨基酸上的側鏈進行化學修飾，以便能使聚合物附著，或者也可采用帶有合適側鏈官能團的非天然氨基酸。可將聚合物附著于碳水化合物或者附著于已連接在氨基酸側鏈目標位置的其它部分。
適用于這些目的聚合物都是對生物系統無毒的。這些聚合物可以是疏水的或親水的、可生物降解的、不可生物降解的、或其組合。這些聚合物包括天然聚合物(如膠原、凝膠、纖維素、透明質酸)以及合成聚合物(如聚酯、聚原酸酯、聚酸酐)。疏水性不可降解的聚合物的例子包括聚二甲基硅氧烷、聚氨酯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯以及聚甲基丙烯酸甲酯。親水性不可降解的聚合物的例子包括聚(2-甲基丙烯酸羥乙酯)、聚乙烯醇、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚亞烴、聚丙烯酰胺及其共聚物。優選的聚合物包括環氧乙烷，為接續重復單元，例如聚乙二醇(PEG)。優選的附著方法是肽合成與化學連接聯用。較佳地，通過可生物降解的連接物將水溶性聚合物專門附在蛋白質的氨基末端區上。這種修飾導致該蛋白質成為前體(或“前藥”)形式，在連接物被降解后，釋放出蛋白質，無聚合物修飾。
本發明第二方面提供一種編碼本發明第一方面的多肽的純化核酸分子。
較佳的是，該純化核酸分子包括或由SEQ ID NO1所示的核酸序列(編碼INSP052外顯子1多肽)、SEQ ID NO3所示的核酸序列(編碼INSP052外顯子2多肽)、SEQ ID NO5所示的核酸序列(編碼INSP052外顯子3多肽)、SEQ ID NO7所示的核酸序列(編碼INSP052外顯子4多肽)、SEQ IDNO9所示的核酸序列(編碼INSP052外顯子5多肽)、SEQ ID NO11所示的核酸序列(編碼INSP052外顯子6多肽)、SEQ ID NO13所示的核酸序列(編碼INSP052外顯子7多肽)、SEQ ID NO15所示的核酸序列(編碼INSP052多肽)、SEQ ID NO17所示的核酸序列(編碼INSP055多肽)、SEQID NO20所示的核酸序列(編碼INSP052多肽的胞外結構域)、SEQIDNO22所示的核酸序列(編碼INSP052成熟多肽的胞外結構域)、SEQ IDNO24所示的核酸序列(編碼成熟INSP052外顯子2多肽)、或者SEQ IDNO26所示的核酸序列(編碼成熟INSP055多肽)組成，或者是這些序列中任何一個的冗余等同物或片段。
將SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11和SEQ ID NO13所示的氨基酸序列組合，得到SEQ ID NO15所示的序列。
將SEQ ID NO23、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11和SEQ ID NO13所示的氨基酸序列組合，得到SEQID NO25所示的序列。
本發明第二方面的一個實施例提供一種核酸分子，其編碼包括或由INSP052胞外結構域(SEQ ID NO20)組成的多肽。較佳的是，該核酸分子包括或由SEQ ID NO19所示的核酸序列組成。該核酸序列也列于共同待批專利申請WO03/093316的圖7中，但這些序列的C-末端包括組氨酸殘基。
本發明第二方面的一個實施例提供一種核酸分子，其編碼包括或由成熟INSP052胞外結構域(SEQ ID NO22)組成的多肽。較佳的是，該核酸分子包括或由SEQ ID NO21所示的核酸序列組成。該核酸序列也列于共同待批專利申請WO03/093316的圖7中，但這些序列的C-末端包括組氨酸殘基。
本發明第二方面的一個實施例提供一種核酸分子，其編碼包括或由成熟INSP052胞外結構域的變體組成的多肽，其中該變體是含有Ig結構域的INSP052片段(SEQ ID NO31)。
本發明第三方面提供一種在高度嚴謹條件下與本發明第二方面的核酸分子雜交的純化核酸分子。
本發明第四方面提供一種含有本發明第二或第三方面的核酸分子的載體，例如表達載體。
本發明第五方面提供一種用本發明第四方面的載體轉化的宿主細胞。
本發明第六方面提供一種配體，它特異性地結合，優選抑制本發明第一方面的多肽的活性。本領域技術人員應當理解，術語“配體”包括能夠特異性地與本發明第一方面的多肽結合的任何分子，例如包括抗體和孤獨受體。
“本發明的多肽的活性”及類似表達形式指的是含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子的特征活性。具體地說，該定義包括如上所限定的細胞因子拮抗劑活性，特別是細胞因子表達和/或分泌的拮抗劑活性，尤其是TNF-α、IL-4和IL-2細胞因子。較佳地，本發明的細胞因子拮抗劑具有免疫調節活性。例如，本發明的多肽在這一方面的用途是治療T細胞介導的皮膚炎癥，譬如說過敏性接觸皮炎和牛皮癬。
以下詳細描述鑒定本發明第六方面的配體的方法。具體地說，本發明提供一種鑒定化合物的方法，所述化合物是與SEQ ID NO20或SEQ IDNO22所示的多肽特異性結合的配體，所述方法包括將本發明第一方面的多肽與推斷對所述多肽具有結合親和性的一或多個化合物接觸，以及選擇與所述多肽特異性結合的化合物。通過如此方法鑒定的本發明多肽的配體可用來鑒定其它細胞因子拮抗劑。例如，可用篩選方法來鑒定與這些配體結合的化合物，譬如說可用作細胞因子拮抗劑的抗體。
本發明第七方面提供一種化合物，它能有效地改變編碼本發明第一方面的多肽的天然基因的表達，或者能調節本發明第一方面的多肽的活性。
本發明第七方面的化合物可增加(激動)或者減少(拮抗)多肽的基因表達水平或活性。
重要的是，對INSP052和INSP055多肽功能的鑒定允許設計能夠鑒定有效地治療和/或診斷疾病的化合物的篩選方法。本發明第六和第七方面的配體和化合物可通過某些方法鑒定。這些方法也包括在本發明的內容之中。
以下實施例部分將提出證據，證明INSP052的胞外結構域可用來預防或治療炎癥疾病、自身免疫疾病、皮膚疾病、肝病或肝臟衰竭。所以，本發明第七方面優選提供一種化合物，它構象上模仿INSP052胞外結構域或者是INSP052胞外結構域的激動劑，因為這樣的化合物能用來預防或治療上述提到的炎癥疾病、自身免疫疾病、皮膚疾病、肝病或肝臟衰竭。
本發明第八方面提供本發明第一方面的多肽，或者本發明第二或第三方面的核酸分子，或者本發明第四方面的載體，或者第五方面的宿主細胞，或者本發明第六方面的配體，或者本發明第七方面的化合物在治療或診斷中的應用，尤其是涉及炎癥疾病、自身免疫疾病、皮膚疾病、肝病(包括病毒性或急性肝病)以及肝臟衰竭(包括酒精性肝臟衰竭)的治療或診斷。
本發明第一、第二、第三、第四和第六方面的這些分子還可應用于制造預防或治療如下疾病的藥物，包括但不限于，細胞增殖性疾病、自身免疫/炎癥疾病、心血管疾病、神經系統和精神障礙、發育障礙、遺傳病、代謝性疾病、感染和其它病理病癥的藥物。
這些疾病優選包括腫瘤、癌癥、腦瘤、神經膠質瘤、骨癌、肺癌、乳癌、前列腺癌、結腸癌、血管瘤、骨髓增生性疾病、白血病、血液病、中性白細胞減少癥、血小板減少癥、血管生成障礙、皮膚病、衰老、創傷、燒傷、纖維變性、心血管疾病、再狹窄、心臟病、周邊血管疾病、冠狀動脈病、水腫、血栓栓塞、月經不調、子宮內膜異位、先兆子癇、肺病、COPD、哮喘骨病、腎病、腎小球性腎炎、肝病、克勞恩(Cohn′s)病、胃炎、潰瘍性結腸炎、潰瘍、免疫疾病、自身免疫疾病、關節炎、類風濕關節炎、銀屑病、大皰性表皮松解癥、全身性紅斑性狼瘡、強直性脊椎炎、萊姆病、多發性硬化癥、神經退化、中風、腦/脊髓損傷、阿耳茨海默氏病、柏金森氏癥、運動神經元病、神經肌肉病、HIV、AIDS、細胞肥大病毒感染、真菌感染、視覺障礙、黃斑退化、青光眼、糖尿病性視網膜病、高眼壓及其它涉及免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子，特別是細胞因子拮抗劑的病癥。
特別優選的是，本發明第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的分子應用于制造治療炎癥疾病、自身免疫疾病、皮膚疾病、肝病(包括病毒性或急性肝病)以及肝臟衰竭(包括酒精性肝臟衰竭)的藥物。
本發明第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的分子還可與其它治療劑聯用，以治療上述列出的疾病。具體地說，具有細胞因子拮抗劑活性的本發明的多肽(包括融合蛋白)可與另一種治療劑聯用。
所以，本發明提供i)本發明第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的分子，特別是包含INSP052胞外結構域的多肽或融合蛋白和ii)另一種治療劑在制造治療涉及細胞因子優選涉及TNF、IL-2和/或IL-4的疾病或適應癥的藥物中的用途。較佳地，所述疾病或適應癥選自炎癥疾病、自身免疫疾病、皮膚疾病、肝病(包括病毒性或急性肝病)以及肝臟衰竭(包括酒精性肝臟衰竭)。
所述另一種治療劑可以與本發明的多肽一樣拮抗同樣的細胞因子，或者可以拮抗生理途徑上致病的另一種分子或減緩疾病癥狀。
較佳地，所述治療劑是一種細胞因子拮抗劑(最好是TNF、IL-2和/或IL-4拮抗劑)，或者是一種抗炎藥。
可用作另一種治療劑的細胞因子拮抗劑的例子包括TNF-α拮抗劑(如依那西普(etanercept)、infliximab TNF-α轉換酶抑制劑(TACE抑制劑)和治療類風濕性關節炎用的來氟米特(leflunomide))、以及IL-2拮抗劑(如防止移植排斥用的巴斯力莫(basilimab)和達克力莫(daclizumab))。另一種治療劑也可以是抗炎藥，例如類固醇或非類固醇類抗炎藥，或者可以是已經用在治療自身免疫疾病、皮膚疾病、肝病或肝衰竭中的其它藥劑。
另外的治療劑可與本發明第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的分子同時給予病人，即作為混合物給予。另一個選擇是，本發明第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的分子在病人已經接受了所述治療劑之后給予，或者所述治療劑在病人已經接受了本發明第一、第二、第三、第四和第六方面的分子之后給予。它們可以同時、先后或分開給藥。
本發明第九方面提供一種診斷病人疾病的方法，該方法包括評估所述病人組織中編碼本發明第一方面的多肽的天然基因的表達水平或者本發明第一方面的多肽的活性，并將所述表達水平或者活性與對照水平作比較，若該水平與所述對照水平不同，則表示患病。這種方法最好在體外進行。
可用類似方法監測對病人疾病的治療，其中多肽或核酸分子的表達水平或活性在一段時間內趨向于對照水平，表示該疾病獲得緩解。
檢測本發明第一方面的多肽的優選方法包括以下步驟(a)在適合形成配體-多肽復合物的條件下，將本發明第六方面的一種配體例如抗體與生物樣品接觸；以及(b)檢測所述復合物。
本領域的讀者將懂得，本發明第九方面的方法有很多種，各不相同，例如，核酸與短探針雜交法、點突變分析法、聚合酶鏈式反應(PCR)擴增法以及使用抗體檢測異常蛋白水平的方法。類似方法的使用可以是短期或長時間的，以便治療病人被監測的疾病。本發明還提供一些用于這些方法中診斷疾病的試劑盒。
較佳的是，用本發明第九方面的方法診斷的疾病是涉及含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子的疾病，如上所述。
由本發明第九方面的方法診斷的優選疾病是炎癥疾病、自身免疫疾病、皮膚疾病、肝病(包括病毒性或急性肝病)以及肝臟衰竭(包括酒精性肝臟衰竭)。
本發明第十方面提供本發明第一方面的多肽作為含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子的用途。Ig結構域在細胞表面受體中的重要性在LokkerNA等人的″Functional importance of platelet-derived growth factor(PDGF)receptor extracellular immunoglobulin-like domains.Identification of PDGFbinding site and neutralizing monoclonal antibodies，″J Biol Chem 1997 Dec26；272(52)33037-44中有描述。
本發明提供如上所述的本發明第一方面的多肽作為細胞因子拮抗劑，特別是TNF-α、IL-4和IL-2分泌的拮抗劑的用途。就這一點而言，本發明的多肽用作細胞因子拮抗劑是降低細胞因子表達水平、細胞因子活性水平、細胞因子分泌水平等等。
本發明也提供使用本發明第二或第三方面的核酸分子表達具有含免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子活性的蛋白質。本發明還提供實施含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子的活性的方法，所述方法采用本發明第一方面的多肽。
本發明第十一方面提供一種藥物組合物，該組合物含有本發明第一方面的多肽，或者本發明第二或第三方面的核酸分子，或者本發明第四方面的載體，或者本發明第五方面的宿主細胞，或者本發明第六方面的配體，或者本發明第七方面的化合物，并結合藥學上可接受的載體。
根據本發明第十一方面的一實施例，本發明的藥物組合物還可包含另一種治療劑。所述另一種治療劑可以與本發明的多肽一樣拮抗同樣的細胞因子，或者可以拮抗生理途徑上致病的另一種分子或減緩疾病癥狀。
較佳地，所述治療劑是一種細胞因子拮抗劑(最好是TNF、IL-2和/或IL-4拮抗劑)，或者是一種抗炎藥。
可用作另一種治療劑的細胞因子拮抗劑的例子包括TNF-α拮抗劑(如依那西普、infliximab TNF-α轉換酶抑制劑(TACE抑制劑)和治療類風濕性關節炎用的來氟米特)、以及IL-2拮抗劑(如防止移植排斥用的巴斯力莫和達克力莫)。另一種治療劑也可以是抗炎藥，例如類固醇或非類固醇類抗炎藥，或者可以是已經用在治療自身免疫疾病、皮膚疾病、肝病或肝衰竭中的其它藥劑。
本發明第十二方面提供本發明第一方面的多肽，或者本發明第二或第三方面的核酸分子，或者本發明第四方面的載體，或者本發明第五方面的宿主細胞，或者本發明第六方面的配體，或者本發明第七方面的化合物在診斷或治療中的用途。這些分子還可用來制造治療如下疾病的藥物，但不限于細胞增殖性疾病、自身免疫/炎癥疾病、心血管疾病、神經系統和精神障礙、發育障礙、遺傳病、代謝性疾病、感染和其它病理病癥的藥物。這些疾病優選包括腫瘤、癌癥、腦瘤、神經膠質瘤、骨癌、肺癌、乳癌、前列腺癌、結腸癌、血管瘤、骨髓增生性疾病、白血病、血液病、中性白細胞減少癥、血小板減少癥、血管生成障礙、皮膚病、衰老、創傷、燒傷、纖維變性、心血管疾病、再狹窄、心臟病、周邊血管疾病、冠狀動脈病、水腫、血栓栓塞、月經不調、子宮內膜異位、先兆子癇、肺病、COPD、哮喘骨病、腎病、腎小球性腎炎、皮膚疾病、肝病、克勞恩病、胃炎、潰瘍性結腸炎、潰瘍、免疫疾病、自身免疫疾病、關節炎、類風濕關節炎、銀屑病、大皰性表皮松解癥、全身性紅斑性狼瘡、強直性脊椎炎、萊姆病、多發性硬化癥、神經退化、中風、腦/脊髓損傷、阿耳茨海默氏病、柏金森氏癥、運動神經元病、神經肌肉病、HIV、AIDS、細胞肥大病毒感染、真菌感染、視覺障礙、黃斑退化、青光眼、糖尿病性視網膜病、高眼壓及其它涉及含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子的病癥。
特別優選的是，本發明第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的分子應用于制造治療炎癥疾病、自身免疫疾病、皮膚疾病、肝病以及肝臟衰竭的藥物。
本發明第十三方面提供一種治療病人疾病的方法，該方法包括把本發明第一方面的多肽，或者本發明第二或第三方面的核酸分子，或者本發明第四方面的載體，或者本發明第五方面的宿主細胞，或者本發明第六方面的配體，或者本發明第七方面的化合物給予該病人。
當與健康受試者中編碼本發明第一方面的多肽的天然基因的表達水平或者本發明第一方面的多肽的活性相比，病人的該表達水平或活性較低的，給予該病人的多肽、核酸分子、配體或化合物應該是激動劑。相反，當與健康受試者中所述多肽的天然基因的表達水平或者活性相比，病人的該表達水平或活性較高的，給予該病人的多肽、核酸分子、配體或化合物應該是拮抗劑。拮抗劑的例子包括反義核酸分子、核酶和配體，例如抗體。
較佳的是，該疾病是涉及含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子的疾病，如上所述。
特別優選的是，該疾病是炎癥疾病、自身免疫疾病、皮膚疾病、肝病以及肝臟衰竭。
本發明第十四方面提供轉基因或剔除非人動物，它們被轉化為表達更高水平、更低水平或者不表達本發明第一方面的多肽。這些轉基因動物是研究疾病極為有用的模型，也可用在鑒定有效治療或診斷這樣一種疾病的化合物的篩選方案中。
較佳的是，該疾病是涉及含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子的疾病，如上所述。
特別優選的是，該疾病是炎癥疾病、自身免疫疾病、皮膚疾病、肝病以及肝臟衰竭。
應當知道，針對本發明的多肽和核酸的保護范圍不會延伸至以它們天然來源形式存在的核酸或多肽。更正確地說，本發明要求保護的多肽和核酸可視為被“分離的”或“純化的”。本文所用的術語“分離的”和“純化的”指的是從它的天然來源核酸或多肽所含的至少一個成分(例如核酸或多肽)分離得到的核酸或多肽。因此，例如組織提取物含有的多肽可構成“分離的”或“純化的”多肽，就如合成或重組生成的多肽一樣。在一實施例中，核酸或多肽僅在溶劑、緩沖液、離子或它們的溶液中通常所帶有的其它成分存在下(如果有的話)找到。
應當注意，術語“分離的”和“純化的”并不表示獲得多肽或核酸的方法或者制成品的純化程度。因此，這些分離的或純化的物質可重組生產，從感興趣的細胞或組織直接分離，或者基于已測定的序列合成生產。
以下，給出為實施本發明而可采用的標準技術和步驟的概要。應明白，本發明并不限于所述的這些具體方法、方案、細胞系、載體和試劑。還應明白，本文所用的術語目的僅在于描述具體實施例，該術語不應該被看成為限定本發明的范圍。本發明的范圍只由所附權利要求書的術語限定。
本說明書中使用核苷酸和氨基酸標準縮寫。
除非另有指出，本發明的做法是采用分子生物學、微生物學、重組DNA技術和免疫學的常規技術，它們都已為本領域技術人員所掌握。
這些技術在有關文獻中已有詳細解釋。例如，可參考以下特別適用的文獻Sambrook Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Second Edition(1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription and Translation(B.D.Hames &S.J.Higgins eds.1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney ed.1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide to Molecular Cloning(1984)；the Methods in Enzymology series(Academic Press，Inc.)，especially volumes 154 & 155；Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.1987，Cold Spring HarborLaboratory)；Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Mayerand Walker，eds.1987，Academic Press，London)；Scopes，(1987)ProteinPurificationPrinciples and Practice，Second Edition(Springer Verlag，N.Y.)；Handbook of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir andC.C.Blackwell eds.1986)。
本文所用的術語“多肽”包括含有相互間以肽鍵或修飾肽鍵連接的兩個或以上氨基酸的任何肽或蛋白質，即肽同構物(isostere)。該術語指短鏈(肽和寡肽)和長鏈(蛋白質)。
本發明的多肽可以是成熟蛋白質形式，或者可以是前蛋白質，其可被前部分切割激活而產生活性成熟多肽。這些多肽中的前序列可以是先導序列或者分泌序列或者是用來純化成熟多肽序列的序列。
本發明第一方面的多肽可形成融合蛋白的一部分。例如，有利的往往包括一或多個附加氨基酸序列，這些附加氨基酸序列可含有分泌序列或先導序列、前序列(pro-sequences)、有助純化的序列、或者例如在重組生產中賦予蛋白質更高穩定性的序列。另一個選擇或者另一方面是，成熟多肽可與另一種化合物，例如與延長該多肽半衰期的化合物(譬如聚乙二醇)融合。
將編碼一種多肽的聚核苷酸與一個異源蛋白質序列的編碼序列在讀框內進行克隆，就可以獲得這樣的融合蛋白，其中所述多肽包含的序列與INSP052多肽具有至少85％同源性。
本文使用術語“異源”時，指的是人INSP052多肽以外的任何多肽。例如，可包含在融合蛋白N-或C-末端的異源序列包括膜結合蛋白的胞外結構域、免疫球蛋白恒定區(Fc區)、多聚區、胞外蛋白質結構域、信號序列、輸出序列、以及通過親和色譜法可以純化的序列。如上所述，若需要，可通過蛋白水解切割方法消除該異源序列。
在一優選實施例中，蛋白質與Ig分子的恒定區融合。較佳地，它與人IgG1的CH2和CH3結構域等重鏈區融合。Ig分子的其它同種型也適合產生本發明的融合蛋白，譬如說同種型IgG2或IgG4，或者其它Ig類，如IgM或IgA。融合蛋白可以是單聚體或多聚體、異源或同源多聚體。
在另一優選實施例中，功能性衍生物所含的至少一部分連接于一或多個官能團上，所述官能團以氨基酸殘基上一個或多個側鏈的形式出現。所述部分可以是聚乙二醇(PEG)部分。例如，可按已知的方法(例如WO99/55377所述的方法)進行聚乙二醇化。
多肽可含有除20個基因編碼的氨基酸外的由天然過程，例如翻譯后加工，或者由本領域公知的化學修飾技術修飾的氨基酸。在已知的修飾中，本發明的多肽通常帶有的修飾是糖基化、脂質附著、硫酸化、例如谷氨酸殘基的γ-羧酸化，羥基化和ADP-核糖基化。其它可能的修飾包括乙酰化、酰化、酰胺化、黃素的共價附著、血素分子的共價附著、核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著、脂質衍生物的共價附著、磷脂酰肌醇的共價附著、交聯、環化二硫鍵形成、脫甲基、共價交聯形成、半胱氨酸形成、焦谷氨酸鹽形成、甲酰化、GPI錨著形成、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒酰化、轉移-RNA介導的蛋白質中插入氨基酸例如精氨酰化，以及遍在蛋白化。
具體地說，氨基酸衍生物可含有取代或未取代的烷基，該烷基可以是直鏈、支鏈或環狀烷基，可包括一或多個雜原子。氨基酸衍生物可以重新制造或者通過商業途徑獲得(Calbiochem-Novabiochem AG，Switzerland；Bachem，USA)。
進行改造的目的是使本發明的多肽具有改進的純化、功效和/或藥物動力學特點。例如，當肽容易被肽酶切割，將它注射入受試者是一個問題，用不可切割的肽模擬物置換特別敏感的肽鍵，獲得的肽更穩定，因而更方便用在治療上。同樣，要使肽不容易被蛋白水解而更類似于非肽類有機化合物的標準方法是置換L-氨基酸殘基。可采用氨基末端阻斷基團，例如叔丁氧基羰基、乙酰基、theyl、琥珀酰基、甲氧基琥珀酰基、環庚基、己二酰基、壬二酰基、丹酰基、芐氧基羰基、芴基甲氧基羰基、甲氧基壬二酰基、甲氧基己二酰基、甲氧基環庚基以及2，4-二硝基苯基，來修飾本發明的多肽。
現有技術已經提供了許多能提高功效、延長活性、便于純化和/或延長半衰期的其它修飾方法以及合成和研制肽模擬物的技術(WO 02/10195；Villain M等，Chem Biol，8673-679，2001；Hruby VJ and Balse PM，CurrMed Chem，7945-970，2000；Golebiowski A等，Curr Opin Drug DiscovDevel，4428-34，2001)。如下文獻也公開了各種以體外和體內翻譯系統將非天然氨基酸引入蛋白質的方法，從而研究和/或改進蛋白質結構和功能(Dougherty DA，Curr Opin Chem Biol，4645-52，2000)。
修飾可發生于多肽的任何位置，包括肽骨架、氨基酸側鏈以及氨基或羧基末端。事實上，天然存在的肽和合成肽一般通過共價修飾封閉肽的氨基或羧基末端，或者封閉二者，這樣的修飾存在于本發明的多肽中。
發生在多肽內的修飾通常隨該多肽的制備方法而變化。對于重組制成的多肽，通過特定宿主細胞翻譯后修飾能力以及存在于所述多肽的氨基序列中的修飾信號來確定大部分修飾的性質和程度。例如，不同類型的宿主細胞之間糖基化型式是不同的。
本發明的多肽可以任何合適的方式制成。這些多肽包括分離的天然存在的多肽(例如自細胞培養基中純化而來)、重組產生的多肽(包括融合蛋白)、合成產生的多肽或者通過這些方法組合所產生的多肽。
本發明第一方面的功能等同多肽可以是與INSP052和INSP055多肽同源的多肽，較佳為INSP052的胞外結構域(即SEQ ID NO20或SEQ IDNO22)。如果一個多肽的序列與另一個多肽的序列具有足夠高程度的同一性或相似性，本文就用術語“同源的”來形容該兩個多肽。“同一性”表示在對比序列的任何特定位置上，兩個序列之間的氨基酸殘基是相同的。“相似性”表示在對比序列的任何特定位置上，兩個序列的氨基酸殘基是相似的。同一性和相似性的程度不難計算(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing.Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，NewYork，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part 1，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M StocktonPress，New York，1991)。
所以，同源多肽包括INSP052和INSP055多肽(較佳為INSP052的胞外結構域)的天然生物變體(例如，產生多肽的物種內等位基因變體或地理變體)和突變體(例如，含有氨基酸取代、插入或缺失的突變體)。這些突變體可包括其中一或多個氨基酸殘基被保守性或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)取代的多肽，這樣一個取代的氨基酸殘基可以或不必是遺傳密碼編碼的殘基。典型的取代是在Ala、Val、Leu和Ile之間；在Ser和Thr之間；在酸性殘基Asp和Glu之間；在Asn和Gln之間；在堿性殘基Lys和Arg之間；或者在芳香族殘基Phe和Tyr之間進行。特別優選的是這樣一些變體有多個氨基酸，即5至10個氨基酸，1至5個氨基酸，1至3個氨基酸，1至2個氨基酸，或者僅有1個氨基酸以任意組合取代、缺失或插入的變體。特別優選的是不改變該蛋白質的性質和活性的沉默取代、插入和缺失。就此而言，特別優選的還有保守性取代。這些突變體也包括其中一或多個氨基酸殘基包括一取代基團的多肽。
通常，兩個多肽之間的同一性大于30％，就認為它們在功能上是等同的。本發明第一方面的功能等同多肽與INSP052和INSP055多肽，或其活性片段的序列同一性優選大于80％。更好的多肽分別具有大于85％、90％、95％、98％或99％的同一性。
本發明第一方面的功能等同多肽還可以是已用一或多種結構對比技術鑒定的多肽。例如，可以應用Inpharmatica Genome ThreaderTM技術(它構成用于產生Biopendium檢索數據庫的檢索工具的其中一部分，參見共同待審批國際專利申請號PCT/GB01/01105，公開號為WO 01/69507)來鑒定現時具有未知功能的多肽，這些多肽雖然與INSP052和INSP055多肽具有較低的序列同一性，但由于與INSP052和INSP055多肽序列共享較高水平的結構同源性，故可預計它們是含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子，所述方法采用本發明第一方面多肽。“較高水平的結構同源性”指用InpharmaticaGenome ThreaderTM預測兩個蛋白質確定共享至少10％，更好是至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和以上的結構同源性。
本發明第一方面的多肽還包括INSP052和INSP055多肽的片段、INSP052和INSP055多肽的功能等同物的片段，只要那些片段保留了含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子活性，或者帶有與INSP052和INSP055多肽相同的抗原性決定簇。
本文所用的術語“片段”指氨基酸序列與INSP052和INSP055多肽或它的其中一種功能等同物的部分而非全部氨基酸序列相同的多肽。這些片段應包括所述序列的至少n個連續氨基酸，取決于特定的序列，n最好是7或以上(例如，8、10、12、14、16、18、20或以上)。小片段可形成抗原性決定簇。
這些片段可以是“獨立的(free-standing)”，即不是其它氨基酸或多肽的一部分，也不與其它氨基酸或多肽融合，或者它們可包含在它們構成其中一部分或區域的較大多肽之內。當包含在較大多肽之內時，本發明的片段最好構成單個連續區域。例如，一些優選實施例涉及一個片段，其具有與該片段的氨基末端融合的前多肽區域，和/或具有與該片段的羧基末端融合的附加區域。然而，單一個較大多肽內可含有多個片段。
本發明的多肽或其免疫原性片段(包含至少一個抗原性決定簇)可被應用來產生對這些多肽有免疫特異性的配體，例如多克隆或單克隆抗體。這些抗體可用于分離或鑒定表達本發明的多肽的克隆，或者用于親和力層析法純化這些多肽。抗體還可用來幫助診斷或治療，以及其它應用，這對本發領域技術人員是顯而易見的。
術語“免疫特異性”指抗體對本發明的多肽的親和力遠遠大于它們對現有領域其它相關多肽的親和力。本文所用的術語“抗體”指能夠與所述抗原性決定簇結合的完整分子及其片段，例如Fab、F(ab′)2和Fv。所以，這些抗體與本發明第一方面的多肽結合。
“遠遠較大的親和力”指的是與已知的含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子的親和力相比，本發明多肽的親和力有可測量的增大。
較佳的是，對本發明多肽的親和力相對于已知的含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子至少增大1.5倍，2倍，5倍，10倍，100倍，103倍，104倍，105倍或106倍。
如果需要多克隆抗體，可用本發明第一方面的多肽使一種選定哺乳動物免疫，例如小鼠、兔、山羊或馬。用來免疫動物的多肽可通過重組DNA技術產生，或者可通過化學方法合成。有需要的時候，可將多肽與一載體蛋白質連接。通過化學方法與多肽偶聯的常用載體包括牛血清白蛋白、甲狀腺球蛋白和鑰孔血藍蛋白。然后，用偶聯的多肽來免疫動物。采集該免疫動物的血清，再按公知的程序，例如免疫親和力層析法加以處理。
本領域技術人員可輕易地生產針對本發明第一方面的多肽的單克隆抗體。應用雜交瘤技術生產單克隆抗體的一般方法已為人所公知(例如，參見Kohler，G.和Milstein，C.，Nature 256495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 472(1983)；Cole等，77-96 in Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.(1985))。
可針對各種性質，即同種型、表位、親和力等，篩選對本發明第一方面的多肽產生的多系列單克隆抗體。單克隆抗體特別用于純化它們所針對的各種多肽。另一方面，編碼感興趣的單克隆抗體的基因可通過例如本領域公知的PCR技術在雜交瘤中分離出來，并可在適當載體中克隆和表達。
還可使用嵌合抗體，其中非人的可變區與人穩定區連接或融合(例如，參見Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，3439(1987))。
可對抗體進行修飾，例如通過使它人源化，以便在某一個體內的免疫原性減弱(參見ones等，Nature，321，522(1986)；Verhoeyen等，Science，239，1534(1988)；Kabat等，J.Immunol.，147，1709(1991)；Queen等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，86，10029(1989)；Gorman等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，88，34181(1991)；以及Hodgson等，Bio/Technology，9，421(1991))。本文所用的術語“人源化抗體”指非人供體抗體的重鏈和/或輕鏈可變區內CDR氨基酸和選定的其它氨基酸已經被人抗體的等同氨基酸所取代的抗體分子。所以，人源化抗體與人抗體極為相近，但具有該供體的抗體結合能力。
另一個選擇是，抗體可以是“雙特異性”抗體，即它是一種有兩個不同抗原結合區的抗體，每一結合區針對不同表位。
可應用噬菌體展示技術選擇基因，所述基因編碼具有與本發明多肽結合的活性的抗體，它們來自篩選用來加工有關抗體的以PCR技術擴增的人淋巴細胞V基因庫，或者天然文庫(McCafferty，J.等，(1990)，Nature 348，552-554；Marks，J.等，(1992)Biotechnology 10，779-783)。這些抗體的親和力也可通過鏈改組加以改善(Clackson，T.等，(1991)Nature 352，624-628)。
以上述技術產生的多克隆抗體或單克隆抗體得到額外應用，因為它們可用作免疫測定法、放射性免疫測定法(RIA)或者酶聯免疫吸附測定法(ELISA)中的試劑。在這些應用中，可使用可分析檢測到的試劑，例如放射性同位素、螢光分子或酶來標記抗體。
本發明第二和第三方面的優選核酸分子是編碼SEO ID NO2、SEO IDNO4、SEO ID NO6、SEO ID NO8、SEO ID NO10、SEO ID NO12、SEO ID NO14和/或SEO ID NO16、SEO ID NO18、INSP052的胞外結構域(SEQ ID NO20和SEQ ID NO22)、SEQ ID NO24、或SEQID NO26所示的多肽序列的那些分子和功能等效多肽，例如INSP052胞外結構域的變體，譬如說含有Ig-結構域的INSP052片段(SEQID NO31)，或者由INSP052胞外結構域或其與一或多個附加多肽序列融合的變體組成的融合蛋白。這些核酸分子可用于本文描述的方法和應用中。本發明的核酸分子最好含有至少n個本文所公開的序列中的連續核苷酸，取決于特定的序列，n是10或以上(例如，12、14、15、18、20、25、30、35、40或以上)。
本發明的核酸分子還包括上述核酸分子的互補序列(例如，用于反義或探測目的)。
本發明的核酸分子可以是RNA形式，如mRNA，或者是DNA形式，包括例如cDNA、合成DNA或基因組DNA。這樣一些核酸分子可通過克隆、化學合成技術或其組合獲得。例如，核酸分子可通過應用諸如固相亞磷酰胺化學合成從基因組或cDNA文庫化學合成，或者從生物體中分離而制備。RNA的產生是運用DNA序列的體內或體外轉錄。
核酸分子可以是雙鏈或單鏈。單鏈DNA可以是編碼鏈，也稱有義鏈，或者它可以是非編碼鏈，也稱反義鏈。
術語“核酸分子”還包括DNA和RNA類似物，例如含有修飾骨架的那些類似物，以及肽核酸(PNA)。本文所用的術語“PNA”指反義分子或反基因試劑，其含有長至少5個核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸與最好以賴氨酸為末端的氨基酸殘基肽骨架連接。該末端賴氨酸使組合物具有溶解性。PNA可被聚乙二醇化，延長它們在細胞內的停留時間，在細胞內它們優先與補體單鏈DNA和RNA結合，并終止轉錄延伸(Nielsen，P.E.等，(1993)Anticancer Drug Des.853-63)。
這些分子還可以有另一個不同序列，因為遺傳密碼簡并性，該不同序列編碼SEO ID NO2、SEO ID NO4、SEO ID NO6、SEO ID NO8、SEO ID NO10、SEO ID NO12、SEO ID NO14和/或SEO ID NO16、SEO ID NO18、INSP052的胞外結構域或其變體、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26或者SEQ ID NO31所示的多肽。這樣一些核酸分子可包括，但不限于，成熟多肽自身的編碼序列；成熟多肽的編碼序列加上附加編碼序列，例如編碼先導序列或分泌序列(如前多肽序列)的序列；成熟多肽的編碼序列，加上或不加上前述附加編碼序列，再加上另外一些非編碼序列，包括非編碼5’和3’序列，例如在轉錄(包括終止信號)、核糖體結合和mRNA穩定性中發揮作用的轉錄非翻譯序列。核酸分子還包括編碼附加氨基酸的附加序列，例如提供附加功能的那些氨基酸。
本發明第二和第三方面的核酸分子也可編碼本發明第一方面的多肽及片段的片段或功能等同物。這樣一種核酸分子可以是天然存在的變體，例如天然存在的等位基因變體，或者該分子可以是非天然存在的變體。核酸分子的非天然存在的變體可通過誘變技術制成，包括適用于核酸分子、細胞或生物體的那些技術。
就此而言，這些變體是通過核苷酸取代、缺失或插入而不同于上述核酸分子的變體。取代、缺失或插入可涉及一或多個核苷酸。變體可在編碼區或非編碼區或者二者內發生變化。編碼區內的變化可產生保守性或非保守性氨基酸取代、缺失或插入。
本發明的核酸分子也可以采用本領域公知的方法為多種原因而進行改造，這些原因包括修飾克隆、加工、和/或基因產物(多肽)的表達。可用來改造核苷酸序列的技術還包括應用隨機斷裂所作的DNA改組、基因片段和合成寡核苷酸的PCR重新裝配。可利用定點誘變插入新的限制位點，改變糖基化模式，修改密碼子偏向，產生剪接變體，引入突變等等。
編碼本發明第一方面的多肽的核酸分子可與異源序列連接，以致該組合核酸分子編碼融合蛋白。這樣一些組合核酸分子包括在本發明第二和第三方面之內。例如，要在肽庫中篩選抑制多肽活性的抑制劑，用這種組合核酸分子表達可被市售抗體識別的融合蛋白是有用的。融合蛋白還可被改造成含有位于本發明多肽的序列與異源蛋白質的序列之間的切割位點，以致該多肽可被切割，并從該異源蛋白質中純化出來。
本發明的核酸分子還包括一些反義分子，它們與編碼本發明的多肽的核酸分子部分互補，因而能與編碼核酸分子雜交。如本領域普通技術人員所知，這些反義分子，例如寡核苷酸，可設計成識別、特異性地結合以及防止編碼本發明多肽的靶核酸的轉錄(例如，參見Cohen，J.S.，Trends in Pharm.Sci.，10，435(1989)，Okano，J.Neurochem.56，560(1991)；O′Connor，J.Neurochem 56，560(1991)；Lee等，Nucleic Acids Res 6，3073(1979)；Cooney等，Science 241，456(1988)；Dervan等，Science 251，1360(1991))。
本文所用的術語“雜交”指兩個核酸分子通過氫鍵相互締合。通常，將一個分子固定于固相支持物上，而另一個分子在溶液中游離。然后，在有利氫鍵鍵合的條件下使兩個分子相互接觸。影響鍵合的因素包括溶劑的類型和體積；反應溫度；雜交時間；攪拌；封閉液相分子與固相支持物非特異性附著的試劑(Denhardt′s試劑或BLOTTO)；分子的濃度；提高分子締合率的化合物的使用(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；雜交后洗滌條件的嚴謹程度(參見上述文獻Sambrook等)。
應用本領域公知的雜交測定法(例如，參見上述文獻Sambrook等)，可檢查一個完全互補分子與靶分子雜交的抑制。遵照Wahl，G.M.和S.L.Berger(1987；Methods Enzymol.152399-407)以及Kimmel，A.R.(1987；MethodsEnzymol.152507-511)的教導，在不同嚴謹程度的條件下，使基本上同源的分子競爭并抑制完全同源的分子與靶分子的結合。
“嚴謹程度”指在雜交反應中與不同的分子締合相比，有利于極度相似的分子締合的條件。高度嚴謹雜交條件定義為42℃下在一溶液中培養過夜，該溶液含有50％甲酰胺、5XSSC(150mM氯化鈉，15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5xDenhardts溶液、10％硫酸葡聚糖和20微克/毫升變性剪切鮭魚精子DNA，然后，約65℃下在0.1X SSC中洗滌過濾器。低度嚴謹條件涉及在35℃下進行的雜交反應(參見上述文獻Sambrook等)。雜交使用的優選條件是高度嚴謹雜交條件。
本發明該方面的優選例子是其全長至少有70％與編碼INSP052和INSP055多肽(SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11和SEQ ID NO13和/或SEQ IDNO15，或SEQ ID NO17、或者圖7所示的核酸序列或圖7所示的核酸序列的編碼部分(即SEQ ID NO19或SEQ ID NO21)、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25))的核酸分子相同的核酸分子以及基本上與這些核酸分子互補的核酸分子。本發明該方面的優選核酸分子含有一區域，該區域的全長至少有80％與SEQ ID NO1所示的SEQ ID NO2編碼序列、SEQ ID NO3所示的SEQ ID NO4編碼序列、SEQ ID NO5所示的SEQ ID NO6編碼序列、SEQ ID NO7所示的SEQ ID NO8編碼序列、SEQ ID NO9所示的SEQ ID NO10編碼序列、SEQ ID NO11所示的SEQ ID NO12編碼序列、SEQ ID NO13所示的SEQ ID NO14編碼序列、SEQ ID NO15所示的SEQ ID NO16編碼序列、SEQ ID NO17所示的SEQ ID NO18編碼序列相同、SEQ ID NO23所示的SEQ ID NO24編碼序列相同、SEQ ID NO25所示的SEQ ID NO26編碼序列相同，或者是它們的一個互補核酸分子。特別優選的核酸是其包括或由以全長計與圖7所示的INSP052胞外結構域(成熟INSP052的胞外結構域或者含有信號肽的INSP052胞外結構域)的編碼序列至少有80％同一性。就此而言，特別優選的是其全長至少有90％，優選至少95％，更好至少98％或99％與所述核酸分子相同的核酸分子。優選的例子是編碼基本上保留與INSP052和INSP055多肽相同的生物功能或活性的多肽的核酸分子。
本發明還提供一種檢測本發明核酸分子的方法，該方法包括以下步驟(a)在雜交條件下，將本發明的核酸探針與生物樣品接觸，形成雙鏈體；以及(b)檢測所形成的任何雙鏈體。
下文另外討論關于本發明可采用的測定法，上述的核酸分子可用作RNA、cDNA或基因組DNA的雜交探針，分離編碼INSP052和INSP055多肽的全長cDNA和基因組克隆，以及分離與編碼該多肽的基因有高度同一性的同源或直向同源基因的cDNA和基因組克隆。
在這點上，可以使用以下技術，其中包括已為本領域技術人員所知的，為了舉例說明討論如下。DNA的測序和分析方法已為人公知，在本領域中可以獲得到，事實上這些方法也用于以下討論的本發明很多實施例中。這些方法可使用酶，例如DNA聚合酶I的克列諾片段測序酶(US BiochemicalCorp，Cleveland，OH)、Taq聚合酶(Perkin Elmer)、耐熱T7聚合酶(Amersham，Chicago，IL)或者這些酶的組合，以及校讀外切核酸酶，例如Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)出售的ELONGASE擴增系統中找到的那些外切核酸酶。優選的測序方法可應用Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton，Reno，NV)、Peltier Thermal Cycler(PTC200；MJ Research，Watertown，MA)和ABI催化劑以及373和377DNA測序儀(Perkin Elmer)等儀器進行自動操作。
一種分離編碼具有與INSP052和INSP055多肽等同功能的多肽的核酸分子的方法是按照本領域公認的標準程序用天然或人工設計的探針探測基因組或cDNA文庫(例如，參見″Current Protocols in Molecular Biology″，Ausubel等(eds)，Greene Publishing Association and John Wiley Interscience，New York，1989，1992)。特別有用的探針含有至少15個，優選至少30個，更好是至少50個鄰接堿基，這些堿基對應于，或者與適當的編碼基因的核酸序列(SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25))互補。使用可分析檢測到的試劑標記這些探針，方便鑒定。有用的試劑包括，但不限于，放射性同位素、螢光染料和能夠催化待檢測產物形成的酶。有了這些探針，本領域普通技術人員就能夠從人、哺乳動物或其它動物來源中分離出感興趣的基因組DNA、cDNA或RNA聚核苷酸編碼蛋白質的互補拷貝，并能夠在這些來源中篩選出有關序列，例如該家族、類型和/或亞型的額外成員。
多數情況下，分離的cDNA序列是不完整的，因為編碼多肽的區域通常在5’端被截短。現時有一些方法可獲得全長cDNA，或者將短cDNA延長。應用部分核苷酸序列和本領域公知的各種方法檢測上游序列，例如啟動子和調控組件，可將這些序列延長。例如，可采用的一種方法是基于快速擴增cDNA末端的方法(RACE；例如參見Frohman等，PNAS USA 85，8998-9002，1988)。最近，MarathonTM technology(Clontech Laboratories Inc.)對這種技術進行了改進，例如使較長cDNA的檢索大大簡化。另一種稍稍不同的技術稱為“限制位點”PCR，它使用通用探針檢索鄰接一已知基因座的未知核酸序列(Sarkar，G.(1993)PCR Methods Applic.2318-322)。以基于已知區域的趨異性引物，也可用反向PCR來擴增或延長序列(Triglia，T.等，(1988)Nucleic Acids Res.168186)。捕捉PCR是可使用的另一種方法，它涉及通過PCR技術擴增鄰接人和酵母人工染色體DNA中一已知序列的DNA片段(Lagerstrom，M.等，(1991)PCR Methods Applic.，1，111-119)。可用來檢索未知序列的另一種方法是Parker，J.D.等描述的方法(1991，Nucleic Acids Res.193055-3060)。另外，人們可使用PCR、嵌套引物和PromoterFinderTM文庫來查看基因組DNA(Clontech，Palo Alto，CA)。這種方法不需要篩選文庫，可用于尋找內含子/外顯子接合。
當篩選全長cDNA時，最好用已經按大小進行選擇包含了較大cDNA的文庫。優選的還有隨機引物文庫，因為它們含有較多含基因5’區的序列。對于寡d(T)文庫不能產生全長cDNA的情形，最好使用隨機引物文庫。基因組文庫可用來將序列延伸進入5’非轉錄調控區。
在本發明一實施例中，本發明的核酸分子可用來進行染色體定位。在這一技術中，核酸分子特異性靶向，并能與單個人染色體的特定位置雜交。對本發明染色體的相關序列作圖譜，是確認那些序列與基因相關性疾病相互關系的重要步驟。一旦將序列與準確染色體位置在圖譜反映出來，就可以將染色體上序列的物理位置與基因圖譜數據關聯起來。這些數據例如可以在人類孟德爾遺傳學數據庫中找到(Johns Hopkins大學韋爾奇醫學庫在線提供)。然后，通過連鎖分析(物理相鄰基因的共同繼承)確定基因與定位在同一個染色體區的疾病之間的關系。這為研究人員用定位克隆或其它基因發現技術檢索疾病基因提供了有價值的信息。一旦通過遺傳連鎖分析粗略確定了疾病或綜合征位于特定基因組區，定位在該區域的任何序列代表相關或調控基因，可作進一步研究。核酸分子還可用來檢測由于正常、載體或染病個體之間移位、反轉等造成染色體位置的差異。
本發明的核酸分子對于組織定位也是有價值的。這些技術通過檢測編碼多肽的mRNA可以確定該多肽在組織中的表達模式。這些技術包括原位雜交技術和核苷酸擴增技術，例如PCR。從研究中獲得的結果可知道生物體中多肽的正常功能。另外，mRNA的正常表達模式與突變基因編碼的mRNA的正常表達模式之間的比較研究為理解突變多肽在疾病中的作用提供了有價值的認知。不適當表達可以是時間、空間或量化。
還可采取基因沉默方法使編碼本發明多肽的基因內源表達下調。一種方法是RNA干擾(Elbashir，SM等，Nature 2001，411，494-498)，可用來使序列特異性翻譯后基因沉默。短dsRNA寡核苷酸在體外合成，并導入細胞中。這些dsRNA寡核苷酸的序列特異性結合引發靶mRNA降解，從而減少或消除靶蛋白質表達。
上述評估基因沉默方法的功效可用TaqMan方法在RNA水平上測量多肽的表達(例如，Western印跡)。
本發明的載體包含本發明的核酸分子，可以是克隆或表達載體。本發明的宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞，它們可用本發明的載體轉化、轉染或轉導。
本發明的多肽可以重組形式制備，方法是在宿主細胞所含的載體內表達它們的編碼核酸分子。這些表達方法已為本領域技術人員公知，很多方法已由上述的Sambrook和Fernandez與Hoeffler的書(1998，eds.″Gene expressionsystems，Using nature for the art of expression″.Academic Press，San Diego，London，Boston，New York，Sydney，Tokyo，Toronto)詳細敘述。
一般而言，可使用適合維持、繁殖或表達核酸分子在一所需宿主內產生多肽的任何系統或載體。應用各種公知的常規技術，例如上述Sambrook中描述的技術，可將適當的核苷酸序列插入一表達系統中。通常，可使編碼基因受控于調控組件，例如啟動子、核糖體結合位點(對于細菌表達)，任選地是操縱子，以便將編碼所希望的多肽的DNA序列轉錄至轉化宿主細胞的RNA內。
例如，適當的表達系統的例子包括染色體系統、附加體系統和病毒衍生系統，包括例如衍生自以下物質的載體細菌質粒、噬菌體、轉位子、酵母附加體、插入組件、酵母染色體組件、病毒例如桿狀病毒、乳多空病毒如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病毒和逆轉錄病毒，或者其組合，例如從質粒和噬菌體遺傳因子所產生的載體，包括粘粒和噬菌粒。人的人工染色體(HACs)也可用來輸送在質粒中所含有和表達的較大DNA片段。
特別適合的表達系統包括微生物，例如用重組噬菌體、質粒或粘粒DNA表達系統轉化的細菌；用酵母表達載體轉化的酵母；用病毒表達載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；用病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒CaMV；煙草花葉病毒TMV)或者用細胞表達載體(例如，Ti或pBR322質粒)轉化的植物細胞系統；或者動物細胞系統。無細胞翻譯系統也可用來產生本發明的多肽。
參照許多標準實驗手冊，例如Davis等(Basic Methods in MolecularBiology(1986))和上述Sambrook等中描述的方法，可將編碼本發明的多肽的核酸分子導入宿主細胞內。特別適合的方法包括磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、轉位、微量注射、陽離子質粒介導的轉染、電穿孔、轉導、劃痕加載、彈導導入或感染(參見上述Sambrook等，1989；Ausubel等，1991；Spector，Goldman & Leinwald，1998)。在真核細胞中，表達系統可以是暫時的(例如附加體)或者永久的(染色體整合)，取決于該系統的需要。
編碼核酸分子可以包括或不包括編碼調控序列例如信號肽或先導序列的序列，有需要的時候，例如將翻譯的多肽分泌到內質網腔、胞質間隙或胞外環境中。這些信號可以與該多肽內源，或者它們可以是異源信號。先導序列可在翻譯后加工中被細菌宿主除去。
除了調控序列之外，希望可以加入能調節與宿主細胞生長有關的多肽表達的調節序列。調節序列的例子是可引起基因的表達對化學和物理刺激，包括調節化合物的存在，或者對各種溫度或代謝條件的應答增大或減少的序列。調節序列是載體的那些非翻譯區，例如增強子、啟動子以及5’和3’非翻譯區。它們與宿主細胞蛋白質相互作用，進行轉錄和翻譯。這些調節序列的強度和特異性可以是不同的。取決于所用的載體系統和宿主，可使用任何數量的適當轉錄和翻譯組件，包括組成型和誘導型啟動子。例如在細菌系統內克隆時，可使用誘導型啟動子，例如Bluescript噬菌粒的雜交lacZ啟動子(Stratagene，LaJolla，CA)或pSportlTM質粒(Gibco BRL)等等。在昆蟲細胞內可用桿狀病毒多角體蛋白啟動子。由植物細胞基因組(例如，熱激、RUBISCO和貯藏蛋白基因)或者植物病毒(例如，病毒啟動子或先導序列)衍生而來的啟動子或增強子可克隆到載體中。哺乳動物細胞系統優選使用哺乳動物基因或哺乳動物病毒的啟動子。如果需要產生含有序列的多個拷貝的細胞系，可使用基于SV40或EBV的載體和一適當選擇性標記物。
構建一個表達載體，以致于使特定核酸編碼序列位于該帶有適當調節序列的載體內，所述編碼序列相對于調節序列的定位和方向使得該編碼序列在該調節序列的“控制”下轉錄，即在調控序列下與DNA分子結合的RNA聚合酶轉錄該編碼序列。在一些情況下，有需要將序列修飾成它可以適當方向附著于調控序列，即維持讀框。
調控序列和其它調節序列可在插入載體之前先連接到核酸編碼序列。另一個選擇是，直接將編碼序列克隆到已經含有調控序列和適當限制位點的表達載體中。
對于長時間高得率地生產重組多肽，最好有穩定的表達。例如，穩定地表達感興趣的多肽的細胞系可以用含有病毒來源復制的表達載體和/或同一個或不同載體上的內源性表達組件和選擇性基因轉化。導入載體之后，允許細胞先在富集培養基中生長1-2天，再轉移到選擇培養基中。選擇性標記物的目的是為選擇帶來抗性，它的存在可以使成功表達導入序列的細胞生長和恢復。穩定轉化的細胞的抗性克隆可應用適合細胞類型的組織培養技術進行增殖。
本領域技術人員已知哺乳動物細胞系可用作表達宿主，而哺乳動物細胞系包括美國典型菌種保藏中心(ATCC)的許多無限增殖化細胞系，包括但不限于，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎(COS)細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、HEK 293細胞、Bowes黑色素瘤細胞和人肝細胞癌(例如Hep G2)細胞以及其它許多細胞系。
桿狀病毒系統中，用于桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統的物質在市場上以試劑盒形式提供，可以購自inter alia、Invitrogen、San Diego CA(“MaxBac”試劑盒)。這些技術對本領域技術人員而言是眾所周知的，在Summers和Smith的文章(Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987))中也有所描述。特別適合該系統使用的宿主細胞包括昆蟲細胞，例如果蠅S2細胞和草地夜蛾Sf9細胞。
本領域已經知道很多植物細胞培養基和全植物遺傳表達系統。合適的植物細胞遺傳表達系統的例子包括美國專利US 5,693,506；US 5,659,122；和US 5,608,143中描述的系統。植物細胞培養基的遺傳表達的另外一些例子在Zenk，Phytochemistry 30，3861-3863(1991)中已有描述。
具體地說，可使用原生質體被分離和培養得到全再生植物的所有植物，以致回收到的全植物含有轉移基因。特別是所有植物可從培養細胞或組織中再生，包括但不限于甘蔗、糖用甜菜、棉花、水果和其它樹木、豆類和蔬菜的所有主要種屬。
特別優選的細菌宿主細胞的例子包括鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌、鏈霉菌和枯草芽孢桿菌細胞。
特別適合真菌表達的宿主細胞的例子包括酵母細胞(例如釀酒酵母)和曲霉菌細胞。
本領域已經知道許多選擇系統，它們都可用來回收轉化細胞系。例如，單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler，M.等，(1977)Cell 11223-32)和腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy，I.等，(1980)Cell 22817-23)基因可分別用在tk-或aprt±細胞中。
另外，選擇的基礎可以是抗代謝物、抗生素或除草劑抗性；例如，二氫葉酸還原酶(DHFR)賦予氨甲蝶呤抗性(Wigler，M.等，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.773567-70)；npt賦予氨基糖苷新霉素和G-418抗性(Colbere-Garapin，F.等，(1981)J.Mol.Biol.1501-14)，als或pat分別賦予綠黃隆和草丁膦乙酰轉移酶抗性。此外，還描述了其它選擇性基因，它們的例子為本領域技術人員所知。
雖然標記基因表達的存在或不存在提示感興趣的基因也是存在的，但它的存在和表達有待確認。例如，如果在一標記基因序列中插入相關的基因，標記基因功能不存在則可以確定含有適當序列的轉化細胞。另一個選擇是，在單個啟動子控制下將標記基因與編碼本發明的多肽的序列串聯放置。標記基因應答誘導或選擇的表達通常也表示串聯基因的表達。
另外，含有編碼本發明的多肽的核酸序列，并表達所述多肽的宿主細胞可通過本領域技術人員公知的各種程序進行鑒定。這些程序包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA雜交和蛋白質生物分析，例如，螢光激活細胞分類術(FACS)或免疫測定技術(例如，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和放射性免疫測定法(RIA))，包括用來檢測和/或定量分析核酸或蛋白質的膜、溶液或芯片技術(參見Hampton，R.等，(1990)Serological Methods，a Laboratory Manual，APS Press，St Paul，MN和Maddox，D.E.等，(1983)J.Exp.Med，158，1211-1216)。
本領域技術人員公知的各種各樣標記和連接技術可用在不同的核酸和氨基酸試驗中。產生標記雜交的裝置或者檢測與編碼本發明的多肽的核酸分子有關的序列的PCR探針包括，寡標記、鎳翻譯、末端標記或使用標記聚核苷酸的PCR擴增。另外，也可將編碼本發明的多肽的序列克隆到載體內，以產生mRNA探針。這些載體是本領域公知的，可通過商業途徑獲得，加入諸如T7、T3或SP6等適當RNA聚合酶和標記核苷酸可在體外合成RNA探針。這些步驟使用市場上供應的各種試劑盒(Pharmacia & Upjohn，(Kalamazoo，MI)；Promega(Madison WI)；和U.S.Biochemical Corp.，Cleveland，OH))進行。
易于檢測的合適報導分子或標記包括放射性核、酶和螢光、化學發光或發色試劑和物質、協同因子、抑制劑、磁性粒子等等。
本發明的核酸分子還可用來制造轉基因動物，特別是嚙齒動物。這些轉基因動物構成本發明的另一方面。這可通過局部修飾體細胞，或者通過種系治療引入遺傳修飾來實現。這些轉基因動物特別適用于制作動物模型，分析作為本發明多肽的調節劑的藥物分子。
從重組細胞培養基中回收和純化多肽的方法是公知的，包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陽離子或陰離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水基相互作用層析法、親和力層析法、羥磷灰石層析法和血凝素層析法。高效液相層析法特別適用于純化。當分離和/或純化期間多肽發生變性時，可應用蛋白質再折疊的公知技術來再產生活性構造。
也可利用特異性載體結構來幫助蛋白質純化，有需要的時候，將編碼本發明的多肽的序列與編碼有利于可溶性蛋白質純化的多肽結構域的核酸序列連接。有利于純化的結構域的例子包括金屬螯合肽，例如允許在固定金屬上純化的肌氨酸-色氨酸組件，允許在固定免疫球蛋白上純化的蛋白A結構域，以及用在FLAGS延伸/親和純化系統(Immunex Corp.，Seattle，WA)中的結構域。為了方便純化，可以采用可切割的接頭序列的內含物，例如在純化結構域與本發明的多肽之間的對XA因子或腸激酶有特異性的序列。一種這樣的表達載體為融合蛋白的表達提供準備，所述融合蛋白含有本發明的多肽，與硫氧還蛋白或腸激酶切割位點前面的多個肌氨酸殘基融合。肌氨酸殘基有利于固定金屬離子親和力層析法(IMAC)的純化，參見Porath，J.等的描述(Prot.Exp.Purif.3263-281，(1992))，而硫氧還蛋白或腸激酶切割位點為從融合蛋白純化多肽提供了一種手段。Kroll，D.J.等對含有融合蛋白的載體進行了討論(1993；DNA Cell Biol.12441-453)。
如果多肽的表達是用在篩選測定中，通常最好是在它表達的宿主細胞表面上產生該多肽。在此情況下，宿主細胞可在用于篩選測定之前，例如用螢光激活細胞分類術(FACS)或免疫測定技術之前收獲。如果多肽分泌到培養基中，可回收該培養基以便回收和純化表達多肽。如果多肽是在細胞內產生，則回收多肽之前必須先溶解細胞。
本發明的多肽可用來篩選各種藥物篩選技術使用的化合物庫。這些化合物可以激活(激動)或抑制(拮抗)本發明多肽的基因的表達水平或活性，構成本發明的另一方面。優選的化合物是能有效地改變編碼本發明第一方面的多肽的天然基因的表達，或者調節本發明第一方面的多肽的活性。
激動劑或拮抗劑化合物可從，例如，細胞制劑、無細胞制劑、化學庫或天然混合產物中分離出來。這些激動劑或拮抗劑可以是天然的或者是經修飾的基質、配體、酶、受體或者結構或功能類似物。關于這些篩選技術的綜述，可參見Coligan等，Current Protocols in Immunology 1(2)Chapter 5(1991)。
最有可能成為良好拮抗劑的化合物是與本發明的多肽結合但在結合后又不會誘導該多肽生物作用的分子。潛在的拮抗劑包括有機小分子、肽、多肽和抗體，它們與本發明的多肽結合，由此抑制或消除它的活性。以這種方式，多肽與正常細胞結合分子的結合可被抑制，從而抑制該多肽的正常生物活性。
用在此篩選技術中的本發明的多肽可以在溶液中游離，附著于固相支持物上，留在細胞表面或位于細胞內。一般而言，這些篩選程序可涉及使用表達與測試化合物接觸的多肽的適當細胞或細胞膜，觀察結合、或功能反應的刺激或抑制。再將與測試化合物接觸的細胞和不接觸測試化合物的對照細胞的功能反應作比較。借助適當檢測系統，這種測定方法可以評估測試化合物是否導致多肽激活產生一個信號。一般情況下，在已知激動劑的存在下分析激活的抑制劑，在測試化合物存在下觀察對激動劑激活的影響。
一種鑒定本發明的多肽的激動劑或拮抗劑化合物的優選方法包括(a)在允許與多肽結合的條件下，將在其表面上表達本發明第一方面的多肽的細胞與待篩選化合物接觸，所述的多肽與能夠在化合物與該多肽結合之后提供可檢測信號的第二成分締合；(b)通過測定化合物與多肽相互作用所產生的信號水平來確定該化合物是否結合和激活或抑制該多肽。
另一種鑒定本發明的多肽的激動劑或拮抗劑化合物的優選方法包括(a)在允許與多肽結合的條件下，將在其表面上表達本發明第一方面的多肽的細胞與待篩選化合物接觸，所述的多肽與能夠在化合物與該多肽結合之后提供可檢測信號的第二成分締合；(b)通過對化合物與多肽相互作用所產生的信號水平與在該化合物不存在下的信號水平作比較來確定該化合物是否結合和激活或抑制該多肽。
在另一優選實施例中，上述的通用方法還包括在多肽的標記或無標記配體存在下對激動劑或拮抗劑進行鑒定。本領域技術人員應當理解，術語“配體”包括與本發明第一方面的多肽特異性結合的任何部分，例如包括抗體或孤獨受體。
在另一實施例中，鑒定本發明的多肽的激動劑或拮抗劑的方法包括在允許結合多肽的條件和候選化合物存在下，測定配體與其表面上帶有本發明的多肽的細胞、或者與含有這樣一種多肽的細胞膜結合的抑制，并測定與該多肽結合的配體數量。能夠引起配體結合減少的化合物就認為是激動劑或拮抗劑。配體最好是帶標記的。
更具體地說，篩選多肽拮抗劑或激動劑化合物的方法包括以下步驟
(a)使標記的配體與在細胞表面上表達本發明的多肽的全細胞，或者與含有本發明的多肽的細胞膜培養，(b)測定與全細胞或細胞膜結合的標記配體數量，(c)在步驟(a)的標記配體和全細胞或者細胞膜的混合物中加入候選化合物，使該混合物達到平衡；(d)測定步驟(c)之后與全細胞或細胞膜結合的標記配體數量；以及(e)比較步驟(b)和(d)中結合的標記配體之差值，將引起步驟(d)的結合減少的化合物看成激動劑或拮抗劑。
可以看到，多肽在上述試驗中以劑量依賴方式調節各種各樣生理和病理過程。所以，本發明多肽的“功能等同物”包括在上述試驗中表現出相同的劑量依賴方式的任一調節活性的多肽。雖然“功能等同物”的劑量依賴活性程度不必與本發明多肽相同，但較佳的“功能等同物”是在給定活性試驗中表現出本發明多肽相似的劑量依賴關系的那些。
上述一些實施例可應用簡單結合試驗，其中測試化合物與帶有多肽的表面的附著用直接或間接與該測試化合物結合的標記檢測，或者可應用涉及與標記競爭物競爭的試驗檢測。另一個實施例采用競爭藥物篩選測定法，其中能夠結合多肽的中和抗體與測試化合物特異性地競爭結合。以此方式可用抗體檢測對多肽有特異性結合親和力的任何測試化合物的存在。
本領域技術人員將能夠設計鑒定本發明多肽的調節劑的試驗。此方面感興趣的是Lokker NA等人在J Biol Chem 1997 Dec 26；272(52)33037-44中的描述，文章記載了一個鑒定拮抗劑的試驗(此試驗為中和抗體)。
也可將試驗設計成檢測加入的測試化合物對細胞內編碼多肽的mRNA產生的作用。例如，ELISA可構建成通過本領域公知的標準方法以單克隆抗體或多克隆抗體測量多肽的分泌或細胞相關水平，這可用來檢索抑制或增強在適當操縱的細胞或組織中產生多肽的化合物。然后，測定多肽與測試化合物之間的結合復合物的形成。
本發明包括的試驗是在過表達或切除檢測中涉及使用本發明的基因和多肽的試驗。這些試驗涉及細胞內這些基因/多肽水平的操縱，以及該操縱事件對被操縱細胞生理的影響的評估。例如，這些實驗揭示與特定基因/多肽有關聯的信號傳導和代謝通道的詳細信息，產生關于與待研究多肽相互作用的多肽同一性的信息，并提供調節相關基因和蛋白質的方法的思路。
可采用另一種藥物篩選技術，它高通量篩選對感興趣的多肽具有適當結合親和力的化合物(參見國際專利申請WO84/03564)。在這一方法中，在固相基質上合成大量不同的小測試化合物，它們再與本發明的多肽反應，洗滌。一種固定多肽的方法是用非中和抗體。以本領域公知的方法可檢測結合多肽。純化的多肽也可直接鋪在板上，用于上述藥物篩選技術中。
通過本領域公知的標準受體結合技術，例如配體結合和交聯試驗，本發明的多肽可用來鑒定膜結合或可溶性受體，其中在配體結合和交聯試驗中，多肽用放射性同位素標記，以化學方法修飾，或者與有利于它的檢測或純化的肽序列融合，并與推定受體來源(例如，細胞組合物、細胞膜、細胞上清液、組織抽提物或體液)一起培育。結合的效率可用生物物理技術，如表面胞質基因共振和光譜測定。結合試驗用于純化和克隆受體，但也可鑒定多肽的激動劑和拮抗劑，這些激動劑和拮抗劑與其受體競爭結合多肽。進行篩選測定的標準方法已為本領域所熟悉。
本發明還包括一種篩選試劑盒，它可用在鑒定上述的激動劑、拮抗劑、配體、受體、基質、酶的方法中。
本發明包括激動劑、拮抗劑、配體、受體、基質和酶以及通過上述方法發現的能調節本發明的多肽的活性或抗原性的其它化合物。
本發明還提供一些藥物組合物，其含有本發明的多肽、核酸、配體或化合物，以及合適的藥物載體。這些組合物適合用作治療或診斷試劑、疫苗、或其它免疫原性組合物，下文將作詳細說明。
根據本文的術語，當組合物中以X+Y的總重量計時至少85％是X，認為含有多肽、核酸、配體或化合物[X]的組合物“基本上不含”雜質[本文以Y表示]。優選X占組合物中X+Y總重量的至少約90％，更好至少約95％、98％或者甚至99％(重量)。
藥物組合物最好含有治療有效量的本發明的多肽、核酸分子、配體或化合物。本文所用的術語“治療有效量”指需要治療、緩解、或預防目標疾病或病癥，或者具有可檢測的治療或預防作用的治療藥劑的用量。任何一種化合物的有效治療劑量最初可在例如腫瘤細胞的細胞培養試驗、或者動物模型通常是小鼠、兔、狗、或豬模型中估計。動物模型還可用來確定適當的濃度范圍和給藥途徑。有了這些信息，就可以確定給予人的有用給藥劑量和途徑。
人受試者的準確有效劑量取決于疾病狀態的嚴重性、受試者的一般健康狀況、受試者的年齡、體重和性別、飲食、給藥的時間和頻率、藥物組合、反應靈敏度，以及治療耐受性/反應。該用量可以常規實驗測定，由醫生判斷。通常，有效劑量從0.01毫克/千克至50毫克/千克，優選從0.05毫克/千克至10毫克/千克。組合物可單獨給予病人，或者與其它藥劑、藥物或激素結合給予。
一種藥物組合物還可含有藥學上可接受的載體，作為治療試劑給予。這些載體包括抗體和其它多肽、基因和其它治療試劑，例如脂質體，只要該載體本身不會誘導產生對接受該組合物的個體有害的抗體，而且載體的給予不會產生過高毒性。合適的載體可以是大的代謝緩慢的大分子，例如蛋白質、聚糖、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和失活病毒顆粒。
還可使用藥學上可接受的鹽，例如無機酸鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等等；以及有機酸鹽，如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等等。Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)對藥學上可接受的載體作了詳盡討論。
治療組合物中藥學上可接受的載體也可含有水、鹽水、甘油和乙醇等液體。另外，這些組合物還可含有輔助物質，例如，濕潤劑或乳化劑、pH緩沖物質等等。這些載體能將藥物組合物配制成供病人攝取的片劑、丸劑、糖衣片、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、懸浮液等等。
一旦配成以后，本發明的組合物可直接給予受試者。接受治療的受試者可以是動物；特別是人受試者。
本發明使用的藥物組合物可以任何途徑給予，包括但不限于，口服、靜脈內、肌內、動脈內、脊髓內、鞘內、心室內、透皮或經皮(例如參見WO98/20734)、皮下、腹腔內、鼻內、腸內、局部、舌下、陰道內或直腸途徑。本發明的藥物組合物也可用基因槍或無針注射器給予。一般將治療組合物制成可注射的液體溶液或懸浮液；也可以制成適合注射前溶解或懸浮于液體介質中的固體形式。
通過注射可將組合物直接輸送到皮下、腹腔內、靜脈內或肌內，或者送到組織間質空間。組合物也可施加在病變部位。劑量治療可分單劑或多劑。
如果本發明的多肽的活性在一特定疾病狀態中是過度的，有多種方法可采用。其中一種方法包括把上述抑制劑化合物(拮抗劑)與藥學上可接受的載體一起給予受試者，抑制劑化合物的量為通過例如阻斷配體、基質、酶、受體的結合，或者抑制第二信號而抑制多肽的功能，從而緩解異常狀況的有效量。這些拮抗劑優選是抗體。這些拮抗劑最好是嵌合抗體和/或人源化抗體，如前所述，可使它們的免疫原性減至最低。
另一種方法是給予保留了對上述配體、基質、酶、受體有結合親和力的多肽的可溶形式。通常，多肽以保留相關部分的片段的形式給予。
在一替換方法中，應用表達封閉技術，例如用內部產生或另外給予的反義核酸分子(如上所述)，抑制編碼多肽的基因表達。設計編碼多肽的基因的調控區、5’區或調節區(信號序列、啟動子、增強子和內含子)的互補序列或反義核酸分子(DNA、RNA或PNA)，可獲得對基因表達的修飾。類似地，用“三螺旋體”堿基成對方法可實現抑制。三螺旋體成對是有用的，這是因為它能引起抑制雙螺旋體充分打開以結合聚合酶、轉錄因子或調節分子的能力。應用三螺旋DNA的治療取得最新進展，在文獻中已有描述(Gee，J.E.等，(1994)InHuber，B.E.and B.I.Carr，Molecular and ImmunologicApproaches，Futura Publishing Co.，Mt.Kisco，NY)。互補序列或反義分子還可設計成防止轉錄子與核糖體結合，從而封閉mRNA的翻譯。這些寡核苷酸可給予，或在體內表達中原位產生。
另外，使用對它的編碼mRNA序列有特異性的核糖體，可防止表達本發明的多肽。核糖體是具有催化活性的天然或合成RNA(例如，參見Usman，N等，Curr.Opin.Struct.Biol(1996)6(4)，527-33)。可設計合成核糖體，在選定位置上特異性切割mRNA，從而防止mRNA翻譯為功能多肽。核糖體通常在RNA分子中找到，可用天然的磷酸核糖骨架和天然堿基合成。另一個選擇是，核糖體可用非天然骨架，例如2’-氧-甲基RNA合成，保護核糖核酸酶免于降解，還可含有經修飾的堿基。
可對RNA分子進行修飾，以增加胞內穩定性和延長半衰期。可能的修飾包括但不限于，在分子的5’和/或3’末端加入側翼序列或在分子的骨架內使用硫代磷酸或2’-氧-甲基而不用磷酸二酯酶連鎖。這一概念對于產生PNA是固有的，可延伸至所有這些分子中，方法是包含非常規堿基，例如肌苷、核苷(queosine)和高修飾鳥苷(butosine)以及乙酰基-、甲基-、硫代-、及類似修飾形式的腺嘌呤、胞苷、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷，它們不易被內源性內切核酸酶識別。
有一些方法治療與本發明的多肽表達不足夠或其活性相關的異常征狀。其中一種方法包括把治療有效量的能激活該多肽的化合物，即上述激動劑給予病人，緩解異常征狀。另外，也可以給予治療量的多肽與適當藥物載體，以恢復多肽的相關生理平衡。
基因療法可用來在受試者體內通過相關細胞內源性產生多肽。基因療法以修正治療基因置換缺陷基因，永久治療多肽的不適當產生。
本發明的基因療法可發生于體內或體外。體外基因療法需要分離和純化病人的細胞，導入治療基因，以及將經基因改造的細胞再引入病人體內。與之相反，體內基因療法不需要分離和純化病人的細胞。
治療基因往往被“包裝”以方便給予病人。基因輸送賦形劑可以是非病毒，例如脂質體，或者復制缺陷型病毒，例如Berkner，K.L.(Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，39-66(1992))所述的腺病毒，或者Muzyczka，N.(Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，97-129(1992)和美國專利US5,252,479所述的腺伴隨病毒(AVV)載體。例如，可對編碼本發明的多肽的核酸分子進行改造，以在復制缺陷型逆轉錄病毒載體中表達。然后，分離這種表達構造體，導入用含有編碼多肽的RNA的逆轉錄病毒質粒載體轉導的包裝細胞內，使該包裝細胞現在能產生含有感興趣的基因的感染病毒粒子。將這些生產細胞給予病人，以體內改造細胞和體內表達多肽(參見“Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches”(納入作為文獻參考)，Human Molecular Genetics(1996)，T Strachan和A PRead，BIOS Scientific Publishers Ltd)。
另一種方法是給予“裸露DNA”，其中治療基因直接注入血流或肌肉組織。
對于本發明的多肽或核酸分子是致病試劑的情形，本發明提出它們可用在疫苗中，產生針對疾病引發劑的抗體。
本發明的疫苗可以是預防性(即預防感染)或者是治療性的(即感染后治療疾病)。這些疫苗包括免疫抗原、免疫原、多肽、蛋白質或核酸，通常與前述藥學上可接受的載體結合，包括本身不會誘導產生對接受該組合物的個體有害的任何載體。這些載體還可用作免疫刺激劑(“輔助劑”)。此外，抗原或免疫原可與細菌類毒素例如來自白喉、破傷風、霍亂、幽門螺桿菌和其它致病原的類毒素偶聯。
因為多肽可以在胃內分解，所以含有多肽的疫苗最好腸胃外給予(例如皮下、肌內、靜脈內、或皮內注射)。適合腸胃外給予的制劑包括無菌水溶液或非水溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使制劑與接受者的血液等滲的溶解物，以及無菌水懸浮液或非水懸浮液，可包括懸浮劑或增稠劑。
本發明的疫苗制劑可制成單劑或多劑容器。例如，密封安瓿和小瓶可儲存于凍干條件下，只要在使用之前加入無菌液體載體。劑量取決于疫苗的比活性，通過常規實驗可輕易測定。
還可通過基因傳送與本發明的多肽結合抗體，例如參見國際專利申請WO 98/55607。
在配制疫苗組合物時也可使用“快速注射”技術(例如見www.powderject.com)。
國際專利申請WO 00/29428描述了許多接種疫苗和疫苗輸送系統的合適方法。
本發明還涉及本發明的核酸分子作為診斷試劑的應用。檢測以本發明的核酸分子為特點，并與功能障礙相關的基因的突變形式提供一種診斷工具，它可增加或限定因為基因的表達不足、過度表達或者空間或時間表達發生改變而引起的疾病或疾病易感性的診斷。通過各種技術可在DNA水平上檢測攜帶基因突變的個體。
用于診斷的核酸分子可從受試者的細胞中獲得，例如從血液、尿、唾液、組織活體或尸體材料中獲得。基因組DNA可直接用作檢測，或者在分析前用PCR、連接酶鏈式反應(LCR)、鏈置換擴增(SDA)或者其它擴增技術酶解擴增(參見Saiki等，Nature，324，163-166(1986)；Bej等，Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.，26，301-334(1991)；Birkenmeyer等，J.Virol.Meth.，35，117-126(1991)；Van Brunt，J.，Bio/Technology，8，291-294(1990))。
在一實施例中，本發明該方面提供一種診斷病人疾病的方法，該方法包括評估編碼本發明的多肽的天然基因的表達水平，并將所述表達水平與對照水平作比較，若該水平與所述對照水平不同，則表示患病。這種方法包括以下步驟(a)在允許本發明的核酸分子和核酸探針形成雜交復合物的嚴謹條件下，將病人的組織樣品與探針接觸；(b)在與步驟(a)相同的條件下，將對照樣品與所述探針接觸；(c)以及檢測所述樣品中是否存在雜交復合物；其中，檢測到病人樣品中雜交復合物的水平與對照樣品中雜交復合物不同，表示患病。
本發明另一方面包括一種診斷方法，其包括以下步驟(a)從待測試疾病的病人中獲得組織樣品；(b)從所述組織樣品中分離本發明的核酸分子；(c)通過檢測與疾病相關的核酸分子是否存在突變，診斷病人疾病。
為了幫助上述方法檢測核酸分子，可包括擴增步驟，例如利用PCR技術。
將擴增產物大小的變化與正常基因型比較，可檢測到缺失或插入。將擴增DNA與本發明的標記RNA，或者與本發明的標記反義DNA序列雜交，可以鑒定點突變。以核糖核酸酶消化或評估熔點溫度的差異，發現完全匹配的序列與錯配的雙鏈體截然不同。病人是否存在突變可這樣檢測將DNA與在嚴謹條件下和該DNA雜交的核酸探針接觸，形成雜交雙鏈分子，該雜交雙鏈分子在對應于與疾病相關的突變的任何部分具有核酸探針鏈的未雜交部分；檢測探針鏈的未雜交部分是否存在即表示該DNA鏈的對應部分存在或不存在與疾病相關的突變。
這樣的診斷特別適用于產前，甚至新生兒測試。
參考基因與“突變體”基因之間的點突變和其它序列差異可通過公知技術鑒定，例如，直接DNA測序或單鏈構象多態性(參見Orita等，Genomics，5，874-879(1989))。例如，測序引物可與改良PCR產生的雙鏈PCR產物或單鏈模板分子一起使用。以使用放射性標記核苷酸的常規程序或者通過使用螢光標記的自動測序程序，進行序列測定。克隆DNA節段也可用作檢測特異性DNA片段的探針。當與PCR結合時該方法的靈敏度大大提高。另外，點突變和其它序列變異，例如多態性，可參照上述方法檢測，例如使用等位基因特異性寡核苷酸對不同于單個核苷酸的序列進行PCR擴增。
在變性試劑存在或不存在下改變DNA片段的凝膠電泳遷移率，或直接對DNA測序都可以檢測到DNA序列的差異(例如Myers等，Science(1985)2301242))。特定位置的序列變化可通過核酸酶保護試驗揭示，例如RNase和S1保護，或者化學切割方法發現(Cotton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)854397-4401)。
除了常規凝膠電泳和DNA測序之外，微小缺失、非整倍性、易位、倒位等突變也可用原位分析加以檢測(例如，參見Keller等，DNA Probes，2ndEd.，Stockton Press，New York，N.Y.，USA(1993))，換言之，可分析細胞內DNA或RNA序列的突變，無需分離或固定在膜上。螢光原位雜交(FISH)是目前最常用的方法，就FISH的綜述已有很多報導(例如，參見Trachuck等，Science，250，559-562(1990)，and Trask等，Trends，Genet.，7，149-154(1991))。
本發明另一實施例中，構建包括本發明核酸分子的寡核苷酸探針陣列，對遺傳變體、突變和多態性進行有效篩選。陣列技術方法是公知的，獲得廣泛應用，可用來解釋分子遺傳方面的各種問題，包括基因表達、遺傳連鎖和遺傳變異性(例如，參見M.Chee等，Science(1996)，Vol 274，pp 610-613)。
在一實施例中，按照PCT申請WO95/11995(Chee等)；Lockhart，D.J.等((1996)Nat.Biotech.141675-1680))；以及Schena，M.等((1996)Proc.Natl.Acad.Sci.9310614-10619))描述的方法制作和使用陣列。寡核苷酸對的范圍從2至1,000,000以上。應用光引導化學法在基質的指定區域上合成低聚物。基質可以是紙、尼龍或其它種類的膜、過濾器、芯片、玻璃載片或其它任何合適的固相支持物。另外，參照PCT申請WO95/251116(Baldeschweiler等)中描述的方法，使用化學偶聯程序和噴墨應用裝置可在基質表面上合成寡核苷酸。另一方面，利用真空系統、熱學、紫外線、機械或化學結合程序，以類似斑點(或狹線)印跡的“柵格”陣列將cDNA片段或寡核苷酸設置和連接于基質表面上。陣列，例如上述的那些陣列，可用人手或現有設備(斑點印跡或狹線印跡裝置)、材料(任何合適的固相支持物)和機器(包括自動儀器)制作，它們可含有8、24、96、384、1536或6144個寡核苷酸，或者2至1,000,000以上之間的任何數目，該數目能夠使陣列有效地應用于市場上買到的儀器中。
除了上述討論的方法之外，通過包括測定受試者樣品中多肽或mRNA水平異常增加或減少的方法可以診斷疾病。采用本領域公知的任何方法可以在RNA水平上測定表達減少或增加，以便對聚核苷酸作定量分析，例如核酸擴增，如PCR、RT-PCR、RNase保護、Northern印跡和其它雜交方法。
可用來確定從宿主獲得的樣品中本發明的多肽水平的測定技術已為本領域技術人員所知，在上文提到的一些文獻中已有討論(包括放射性免疫試驗、競爭結合試驗、Western印跡分析和ELISA試驗)。本發明該方面提供一種診斷方法，其包括以下步驟(a)在適合形成配體-多肽復合物的條件下，將上述一種配體與生物樣品接觸；以及(b)檢測所述復合物。
測定多肽水平的方案，例如ELISA、RIA和FACS還可為診斷多肽表達的變化或異常水平提供基礎。在適合形成復合物的條件下將正常哺乳動物受試者，優選是人的體液或細胞抽提物與針對多肽的抗體結合，確立多肽表達的正常值或標準值。標準復合物形成的數量可用各種方法定量測定，例如光度計裝置。
特異性結合本發明的多肽的抗體可用來診斷以多肽表達為特點的癥狀或疾病，或者用在試驗中監測以本發明的多肽、核酸分子、配體和其它化合物治療的病人。用于診斷目的的抗體可以用上述關于治療所述的相同方法制成。對多肽的診斷分析包括利用抗體和標記檢測人體液或者細胞或組織抽提物的多肽的方法。使用的多肽可以修飾或不作修飾，將它們與報導分子共價或非共價結合加上標記。可以應用本領域已知的各種各樣報導分子，其中一些已在上文作了描述。
將在受試者活體組織獲得的對照樣品和患病樣品中表達的多肽數量與標準值作比較。標準值與受試者值之間的偏差建立診斷疾病的參數。可用診斷分析區分多肽不存在、存在和過度表達，并監測治療干預期間多肽水平的調節。這些分析也可用來評估動物研究、臨床試驗或個體病人的監測治療中特定治療方案的療效。
本發明的一種診斷試劑盒可包括(a)本發明的核酸分子；(b)本發明的多肽；或者(c)本發明的配體。
本發明一方面提供一種診斷試劑盒，該試劑盒可包括第一容器，其含有在嚴謹條件下與本發明的核酸分子雜交的核酸探針；第二容器，其含有用來擴增該核酸分子的引物；以及為方便診斷疾病而使用的該探針和引物的使用說明書。這種試劑盒還可包括裝有消化未雜交RNA的試劑的第三容器。
本發明另一方面也提供一種診斷試劑盒，該試劑盒可包括核酸分子陣列，其中至少一個核酸分子是本發明的核酸分子。
為了檢測本發明的多肽，一種診斷試劑盒可包括一或多種與本發明的多肽結合的抗體；一種用來檢測該抗體與多肽之間結合反應的試劑。
這些試劑盒都可用于診斷疾病或疾病易感性，包括但不限于如下疾病細胞增殖性疾病、自身免疫/炎癥疾病、心血管疾病、神經系統和精神障礙、發育障礙、遺傳病、代謝性疾病、感染和其它病理病癥。這些疾病優選包括腫瘤、癌癥、腦瘤、神經膠質瘤、骨癌、肺癌、乳癌、前列腺癌、結腸癌、血管瘤、骨髓增生性疾病、白血病、血液病、中性白細胞減少癥、血小板減少癥、血管生成障礙、皮膚病、衰老、創傷、燒傷、纖維變性、心血管疾病、再狹窄、心臟病、周邊血管疾病、冠狀動脈病、水腫、血栓栓塞、月經不調、子宮內膜異位、先兆子癇、肺病、COPD、哮喘骨病、腎病、腎小球性腎炎、皮膚疾病、肝病、克勞恩病、胃炎、潰瘍性結腸炎、潰瘍、免疫疾病、自身免疫疾病、關節炎、類風濕關節炎、銀屑病、大皰性表皮松解癥、全身性紅斑性狼瘡、強直性脊椎炎、萊姆病、多發性硬化癥、神經退化、中風、腦/脊髓損傷、阿耳茨海默氏病、柏金森氏癥、運動神經元病、神經肌肉病、HIV、AIDS、細胞肥大病毒感染、真菌感染、視覺障礙、黃斑退化、青光眼、糖尿病性視網膜病、高眼壓及其它涉及含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子的病癥。
以下，將通過舉例說明，特別是結合INSP052和INSP055多肽對本發明的各個方面和實施例進行描述。
應明白，在不脫離本發明的范圍的情況下可以作出各種改變。


圖1(A)全長INSP052多肽序列、成熟分離的INSP052胞外結構域(INSP052EC)、WO04/009834中鑒定的最接近相關序列(SEQIDNO434和SEQIDNO880)的CLUSTALW多重序列對比。(B)INSP052EC與相應的帶有組氨酸標簽的INSP052EC(INSP052EC-6His)和相應的與Fc融合的INSP052EC(INSP052EC-FC)以及與含有Ig結構域的INSP052片段(INSP052Ig2)的CLUSTALW多重序列對比。Fc序列對應于人免疫球蛋白λ重鏈IgG1的恒定區的氨基酸246-477；NCBI Acc.No.CAA75302。下劃線序列表示預測的信號肽。 表示預測的跨膜結構域。“*”表示對比序列之間相同的殘基。“”表示對比序列之間同源殘基。
圖2人外周血單核細胞(hPBMC)與依次稀釋的INSP052EC-6His制劑(以蛋白質制劑的稀釋度表示，見實施例4)混合，以ConA刺激該細胞分泌的TNF-α百分比。兩條曲線(分別加入交叉號或圓點)代表用兩批不同蛋白質獲得的結果。
圖3人外周血單核細胞(hPBMC)與依次稀釋的INSP052EC-6His制劑(以蛋白質制劑的稀釋度表示，見實施例4)混合，以ConA刺激該細胞分泌的IL-4(白介素-4)百分比。兩條曲線(分別加入交叉號或圓點)代表用兩批不同蛋白質獲得的結果。
圖4人外周血單核細胞(hPBMC)與依次稀釋的INSP052EC-6His制劑(以蛋白質制劑的稀釋度表示，見實施例4)混合，以ConA刺激該細胞分泌的IL-2(白介素-2)百分比。兩條曲線(分別加入交叉號或圓點)代表用兩批不同蛋白質獲得的結果。
圖5人外周血單核細胞(hPBMC)與增大量的INSP052EC-6His(以蛋白質濃度(μg/ml)的對數表示)混合，以ConA刺激該細胞分泌IL-5(白介素5；A)和IL-2(白介素-2；B)的抑制。曲線與X/Y軸之間插入的直線表示IC50值。
圖6純化的CD4+T細胞與增大量的INSP052EC-6His(以μg/ml表示)混合，以ConA刺激該細胞分泌IL-5(白介素5；A)和IL-2(白介素-2；B)的抑制。在ConA存在(有)或不存在(無)下以及在ConA和地塞米松(Dex；0.1mg/kg)都存在下比較細胞因子分泌的效果。
圖7用ConA攻擊后8小時(見實施例6)，INSP052EC電遷移的動物(pDEST12.2 INSP052-6HIS)中丙氨酸氨基轉氨酶(ALAT，A)和天冬氨酸氨基轉氨酶(ASAT，B)的血液水平與空載體(pDEST12.2)對照動物和人IL6-電遷移動物(pDEST12.2hIL6-SII)相比有所下降。星號表示下降水平具有統計學意義(星號越多，下降幅度越大)。
圖8在INSP052EC-6His-和hIL6-SII-電遷移的動物中TNF-α與IL-6細胞因子水平(見實施例6和圖7)。
圖9將兩種劑量的INSP052EC-6His給予小鼠后再與ConA接觸所獲得的效果。注射ConA后8小時測量ASAT(A)和ALAT(B)的血液水平(見實施例6)。
圖10先注射INSP052EC-6His再給予LPS對血液中釋放出IL-6(A)或TNF-α(B)的影響。小鼠被分別給予所示濃度的蛋白質、地塞米松(Dex；0.1mg/kg)、或僅注射對照介質(見實施例7)。星號表示下降水平具有統計學意義(見圖7)。
圖11瞬時表達INSP052EC-6His的HEK293細胞對血液中LPS誘導釋放出TNF-α的影響。小鼠被分別給予所示體積的表達INSP052EC-6His的膠囊細胞、或有或無地塞米松(Dex；0.1mg/kg)的對照細胞(HEK)(見實施例7)。星號表示下降水平具有統計學意義(見圖7)。
圖12先注射INSP052EC-6His再給予LPS對血液中釋放出IL-6(A)或TNF-α(B)的影響。小鼠被分別給予所示濃度的蛋白質、地塞米松(Dex；0.1mg/kg)、或僅注射對照介質(見實施例8)。星號表示下降水平具有統計學意義(見圖7)。
具體實施例方式
實施例1INSP052和INSP055序列將SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ IDNO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14和SEQ ID NO16結合所產生的多肽序列代表INSP052的連續外顯子的翻譯，該多肽序列可通過人基因組序列產生。代表INSP055的聚核苷酸和多肽序列SEQ ID NO17和SEQ ID NO18分別是INSP052的小鼠直向基因同源物(orthologue)的聚核苷酸和多肽。可以預測，SEQ ID NO16和SEQ ID NO18分別代表的INSP052和INSP055多肽序列含有信號肽序列和一個跨膜跨越結構域。具體地說，已經在DNA和蛋白質水平上鑒定了胞外結構域的全長序列和成熟序列(SEQ ID NO19-22)。
如WO 03/93316所描述，INSP052全長預測序列編碼VEGF/PDGF受體相關的長416個氨基酸的I型膜蛋白，它屬于免疫球蛋白超家族。推定信號序列由INSP052的氨基酸1-33組成。預測的跨膜TM結構域由INSP052的氨基酸241-263組成。所以，成熟INSP052的胞外結構域由INSP052的氨基酸34-240組成。后一序列與文獻公開的兩個序列SEQIDNO434和SEQIDNO880(WO 04/009834；SEQ ID NO27和28)相似。
INSP052EC的變體(成熟INSP052的胞外結構域；SEQ ID NO22)或其相應的全胞外結構域(SEQ ID NO20)可按以下方法產生將該蛋白質的N-和/或C-端與異源蛋白序列融合，以便當采用重組DNA技術生產時有利于它的產生、純化和穩定性。現有文獻已對融合蛋白的構建、純化、檢測、成熟和使用的基團、配體、接頭的設計以及方法和策略進行了廣泛討論(Nilsson J等，Protein Expr Purif，111-16，1997；“Applications of chimeric genes andhybrid proteins“Methods Enzymol.Vol.326-328，Academic Press，2000)。
這些融合蛋白的其它例子是包括另一種蛋白質的信號肽(如人生長激素或β2-微球蛋白)、純化標簽(如組氨酸標簽或HA標簽)、不同膜結合蛋白的胞外結構域、分泌性蛋白質(如細胞因子或白蛋白等血清蛋白)、起始甲硫氨酸(為的是允許例如在大腸桿菌中直接表達)、含有內肽酶識別位點的接頭區(有利于除去異源蛋白序列)、或者來自人免疫球蛋白的Fc區(圖1B)的那些。
對于INSP052EC融合的一或多個這些序列的選擇與所述重組蛋白的特定用途和/或純化方案有函數關系。例如，可用包含白蛋白序列的融合蛋白，或者如實施例所示用INSP052EC-6HIS(SEQ ID NO29)(一種有利于檢測和純化的組氨酸標簽序列)測試INSP052EC的活性。
另一個選擇是，包含INSP052EC的融合蛋白可按如下方法獲得將該序列與免疫球蛋白結構域恒定區(一個已知可提高重組蛋白質在循環中的穩定性和功效的蛋白質結構域)相連接。通過采用適當的表達載體，使獲得的融合蛋白能夠被哺乳動物細胞(如CHO或HEK293細胞)直接表達，這樣，該融合蛋白可在培養基中分泌。
現有文獻已經公開了產生包含免疫球蛋白片段的融合蛋白的不同策略(WO 91/08298；WO 96/08570；WO 93/22332；WO 04/085478；WO02/66514)。例如，可在一表達載體中克隆編碼成熟INSP052EC的核酸序列，而所述表達載體又與一核酸序列融合，后者的5’端編碼原始INSP052EC信號序列(或任何其它合適的信號序列)，3’端編碼人免疫球蛋白λ重鏈IgG1的恒定區(NCBI Acc.No.CAA75302)(SEQ ID NO30)。得到的載體可用來轉化CHO或HEK293細胞系，并且可選擇一些克隆，它們能穩定地表達和分泌N-末端帶有INSP052EC而C-末端帶有IgG1序列的重組融合蛋白。再用該克隆進行大規模生產并在培養基中提純重組融合蛋白。或者，可使核酸編碼人免疫球蛋白λ重鏈IgG1的恒定區和INSP052EC的位置對換，仍然可以用INSP052的原始信號序列或任何其它合適的信號序列使如此得到的蛋白質表達和分泌。
允許INSP052EC多聚化的其它蛋白質序列是從諸如hCG(WO97/30161)、膠原X(WO 04/33486)、C4BP(WO 04/20639)、Erb蛋白質(WO98/02540)或卷曲螺旋肽(WO 01/00814)等蛋白質分離出來的結構域。
這些融合蛋白所包含的附加序列可以在純化結束時或者有需要時，可通過任何合適的內肽酶/外肽酶在體內被消除。例如，重組蛋白質所包含的接頭序列可遞呈內肽酶(如caspase)的識別位點，以便在體內或體外使所希望的蛋白質與異源序列通過酶解方式分離。另一個選擇是，如果被表達的蛋白質序列不含有起始甲硫氨酸(例如，如果序列僅編碼蛋白質的成熟序列，沒有信號肽)，可將本發明的蛋白質正確地表達在帶有起始甲硫氨酸的宿主細胞內。然后，該附加氨基酸可保留在得到的重組蛋白質內，或者以外肽酶(如甲硫氨酸氨基肽酶)按照已公開的方法將它除去(Van Valkenburgh HA andKahn RA，Methods Enzymol.，344186-193，2002；Ben-Bassat A，Bioprocess Technol.，12147-59，1991)。
實施例2INSP052胞外結構域的克隆按照WO 03/093316描述的方法，用來自人基因組DNA的外顯子組裝件(exon assembly)克隆編碼INSP052的全胞外區(氨基酸1-240)的DNA。然后，使蛋白質表達并純化為組氨酸標簽的融合蛋白(INSP052EC-6His；SEQID NO29)。
實施例3帶His標簽的INSP052胞外結構域(INSP052EC-6His-V1質粒)在哺乳動物細胞中的表達按照WO 03/093316描述的方法，構建帶His標簽的INSP052胞外結構域(INSP052EC-6His-V1)的表達載體、轉染構建體，其中該構建體是用來使表達埃-巴二氏病毒核抗原的人胚胎腎293細胞(HEK293-EBNA，Invitrogen)轉染，以及純化重組蛋白質INSP052EC-6His。再以該蛋白質進行一系列的功能試驗。
實施例4以人PBMC進行的細胞因子表達調節試驗4.1.簡介以下基于細胞的體外試驗測定在有利于純化的組氨酸標簽版本(INSP052EC-6His；見實施例2和3)中表達的INSP052EC(INSP052的克隆胞外結構域)對細胞因子分泌的作用，所述細胞因子的分泌由作用于人外周血單核細胞(hPBMC)的不同刺激物誘導。建立針對于IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-5、IL-4和IL-10的細胞因子珠子陣列(CBA)試驗。具體地說，蛋白質的起始濃度有3種，將3個不同時間點看作3種不同濃度(刺激后24、48和72小時)。
最佳條件是96孔板上每孔100,000個細胞，終體積100μl，在2％甘油(MERCK)中。ConA的最佳濃度是5ng/ml。最佳試驗時間是48小時。細胞因子分泌/表達的抑制劑地塞米松(陽性對照)最佳濃度是10-6M。細胞因子分泌/表達的刺激劑人白介素-18(hIL-18，陰性對照)最佳濃度是100ng/ml。
4.2血沉棕黃層的人PBMC的純化用DMEM(GIBCO)稀釋血沉棕黃層1至2。然后在50ml Falcon試管內的15ml Ficoll層中緩慢加入25ml稀釋的血液，試管離心(2000rpm，20min，室溫，無制動器)。然后收集界面(環)，細胞用25ml DMEM洗滌，然后離心(1200rpm，5min)。這一程序重復三次。由血沉棕黃層獲得大約600×106總細胞。
4.3篩選將80μl 1.25×106細胞/ml用DMEM+2.5％人血清+1％L-谷氨酰胺+1％青霉素-鏈霉素稀釋，然后加入到96孔微滴定板上(NUNC，COSTAR)。
每孔加入10μl(每孔一種條件)蛋白質用PBS+20％甘油稀釋(蛋白質終稀釋濃度為1/10)。以該蛋白質的系列稀釋液重復進行該試驗。每孔(每孔一種條件)再加入10μl 50μg/ml ConA(ConA終濃度為5μg/ml)。
為清楚起見，下表給出實驗設計

STIM表示ConA(5μg/ml)；Prot表示INSP052EC-6His；Dexa是地塞米松；IL-18是人白介素-18。
4.4CBA分析48小時后，收集細胞上清液，運用人Th1/Th2細胞因子CBA試劑盒(Becton-Dickinson)測定人細胞因子。
i)人Th1/Th2混合捕獲珠的制備確定實驗所需的分析試管數目。
混合前，使各捕獲珠懸液強烈旋渦幾秒鐘。在每個分析試驗中，每種捕獲珠取10μl等分試樣，加入到一個標有“混合捕獲珠”的試管內。使捕獲珠混合物徹底旋渦。
ii)測試樣品的制備上清液用試驗稀釋劑(20μl上清液+60μl試驗稀釋劑)稀釋(1∶4)。先把樣品稀釋溶液混合，再將樣品轉移到96孔錐形底微滴定板(Nunc)。
iii)人Th1/Th2細胞因子CBA試驗步驟取50μl稀釋上清液，加入到96孔錐形底微滴定板(Nunc)上。然后加入50μl混合捕獲珠，再加入50μl人Th1/Th2PE檢測試劑。該96孔板室溫培育3小時，避免直接暴露于光中，然后1500rpm離心5分鐘。小心地棄掉上清液。在下一步驟中，每孔加入200μl洗滌緩沖液，二次，然后1500rpm離心5分鐘，小心地棄掉上清液。之后，向每孔加入130μl洗滌緩沖液，重懸捕獲珠沉淀物。最后用流式細胞儀分析樣品。利用CBA應用軟件、活性堿基(Activity Base)和微軟Excel軟件分析數據。
4.5結果如圖2、3和4所示，以兩批不同蛋白質進行實驗，INSP052EC-6His能夠以劑量依賴方式下調ConA刺激hPBMC分泌出細胞因子(如TNF-α、IL-4和IL-2)。這些結果驗證了INSP052EC具有治療抗炎癥和自身免疫疾病的潛在功效。
計算劑量反應對細胞因子分泌的作用(以IC50表示，該濃度是INSP052EC-6His使細胞因子分泌(以pg/ml計)降低至觀察到的最大值的一半所需的濃度)，進行更詳細分析。得到的抑制曲線(例如以IL-5和IL-2所作的實驗，見圖5)表明，INSP052EC-6His在μg/ml濃度范圍是有效的細胞因子拮抗劑，特別是細胞因子分泌和/或表達的抑制劑TNF-α(IC506-10μg/ml)、IFN-γ(IC503-9μg/ml)、IL-2(IC5012-14μg/ml)、IL-4(IC5014μg/ml)、IL-10(IC5010-15μg/ml)和IL-5(IC5018μg/ml)。
實施例5采用人T細胞進行的細胞因子表達調節試驗5.1材料和方法用MACS細胞分離試劑盒(Miltenyl Biotec)按照制造商的指示制備白細胞亞群。參照實施例4所述在血沉棕黃層中分離出hPBMC。小心操作，以確保單細胞懸浮。采用CD4+T細胞分離試劑盒II(產品目錄號130-091-155)制備CD4+T細胞制劑。對PBMC細胞計數，離心10分鐘，重懸于冷凍PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖鹽水pH 7.2，加入了0.5％牛血清白蛋白BSA和2mM EDTA)，懸浮濃度是每毫升2.5×108個細胞(每107個細胞40μl緩沖液)。每107個總細胞加入10μl生物素化的抗體雞尾酒(與試劑盒一起提供)。懸浮液混合均勻，在4-8℃培育10分鐘。每107個細胞加入30μl緩沖液，再按每107個總細胞加入20μl抗生物素化微珠。使懸浮液混合均勻，在4-8℃再培育15分鐘。加入10-20倍標記體積的緩沖液，細胞與緩沖液一起洗滌，300xg離心10分鐘。全部移去上清液，將細胞重懸于500μl緩沖液，至108個細胞。運用autoMACSTM分選器進行磁分離。按照制造商的指示制作autoMACSTM分選器并使其引發。將含有帶磁性標記的細胞的試管放在autoMACSTM分選器內，選擇“去除分選”程序。收集陰性組分(出口“negl”)。該組分代表富集CD4+T細胞。若需要，接著可收集陽性組分(出口“posl”)。該組分代表帶磁性標記的非CD4+T細胞。
按照上文對hPBMC那樣，進行篩選和CBA試驗。
5.2結果用ConA刺激后，在純化的CD4+T細胞中看到INSP052EC-6His導致hPBMC分泌的細胞因子減少。這種對細胞因子分泌的作用與hPBMC測到的結果是一致的，與樣品中加入的蛋白質數量成正比，也比得上常見抗炎化合物導致的減少量(圖6)。
實施例6暴發型肝炎小鼠模型6.1簡介因為已經發現，INSP052EC蛋白質(在重組型式INSP052EC-6His中表達)在體外抑制ConA刺激人外周血單核細胞(hPBMC；見實施例4)以及CD4+T細胞(實施例5)分泌各種細胞因子，所以決定通過電遷移在體內ConA模型中測試INSP052EC的活性。
6.2背景-伴刀豆球蛋白A(ConA)誘導的肝炎毒性肝病是人類的一個全球性健康問題，至今尚未找到對其實施的藥理治療方案。例如，導致肝硬化的活動性慢性肝炎是一種由活化T細胞逐漸破壞肝臟實質細胞的病態。ConA誘導肝中毒是三個小鼠內T細胞依賴性細胞凋亡和壞死性肝損傷實驗模型中之一。用活化抗-CD3單克隆AB或者用超抗原SEB攻擊已被Ga1N(D-半乳糖胺)致敏的小鼠，誘發嚴重的細胞凋亡和繼發性壞死性肝損傷(Kusters S，Gastroenterology.1996 Aug；111(2)462-71)。為未被致敏的小鼠注射T細胞促有絲分裂植物凝集素ConA，也能導致肝細胞凋亡，繼而發展為壞死。ConA誘導全身釋放出TNF-α和IFN-γ以及各種其它細胞因子。TNF-α和IFN-γ是肝損傷的重要介導劑。攻擊后8小時釋放出轉氨酶，表示肝臟已嚴重受損。
已經知道，有幾類細胞參與肝損傷，如CD4T細胞、巨噬細胞和天然殺傷細胞(Kaneko J Exp Med 2000，191，105-114)。抗-CD4抗體阻斷T細胞的活化因而阻止肝損傷(Tiegs等，1992，J Clin Invest 90，196-203)。用針對CD8的單抗預處理小鼠也無法保護肝免受損傷，而消除了巨噬細胞能夠防止誘發肝炎。
為了弄清楚INSP052EC作為含有IgG樣結構域的TNF-α/IL-4細胞因子拮抗劑蛋白質在ConA誘導的肝炎中所起的作用，進行了本研究。已經知道，有幾種細胞因子是誘導ConA誘發型肝損傷或者保護免于ConA誘發型肝損傷的關鍵。例如，TNF-α是注射ConA后產生的第一種細胞因子，而抗TNF-α抗體可保護免于致病(Seino等，2001，Annals of surgery 234，681-688)。IFN-γ似乎也是肝損傷的重要介導劑，這是因為對以ConA治療的動物所測量的血液轉氨酶水平下降，表明抗IFN-γ抗血清對小鼠提供的保護作用相當大(參見Kusters等，同上)。當肝受損后，觀察到自身免疫病或病毒性肝炎病人的IFN-γ產生增多。另外，肝臟中表達IFN-γ的轉基因小鼠也發展為肝損傷，類似于活動性慢性肝炎(Toyonaga等，1994，PNAS 91，614-618)。IFN-γ也可使肝實質細胞發生細胞中毒，這是因為IFN-γ誘體外導小鼠肝實質細胞發生細胞死亡，而TNF-α加速了這一過程(Morita等，1995，Hepatology 21，1585-1593)。
其它分子對ConA模型具有保護作用，已經對這方面作了描述。單獨給予rhIL-6(重組人白介素-6)能完全抑制轉氨酶的釋放(Mizuhara等，1994，J.Exp.Med.179，1529-1537)。
6.3將cDNA電轉移到肌纖維以使感興趣的蛋白質(INSP052EC)全身表達對于體內基因轉移的非病毒性技術中，最簡單、低廉和安全的技術是將質粒DNA直接注射到肌肉再進行電穿孔法。肌纖維具有有絲分裂后性質和壽命長的特點，因此可穩定地表達轉染基因，盡管轉染DNA通常不發生染色體整合(Somiari等，2000，Molecular Therapy 2，178-187)。一些報導已證明，用電穿孔法處理相應的cDNA，可使肌肉產生的蛋白質分泌進入血流中(Aihara H and Miyazaki J，1998，Nature Biotech 16，867-870)。還有人證實了表達肌肉的EPO和IL-18BP在疾病模型中的體內功效(Rizzuto等，2000，Human Gene Therapy 41，1891-1900；Mallat Z等，2001，CirculationResearch 89，E41-45)。
6.4材料和方法6.4.1動物所有研究均選用雄性C57/BL6鼠(8周齡)。一般地，每個實驗組有7只動物。在標準條件和12小時光暗循環中飼養小鼠，隨意提供輻照食物和飲水。
6.4.2肌電轉移6.4.2.1載體的選擇在截然不同的Gateway兼容性pDEST12.2載體中克隆帶StrepII標簽的人IL6(hIL6-SII)和INSP052EC-6His基因，其中蛋白質的表達受CMV啟動子的控制。
6.4.2.2電穿孔方案用氣體(isofluran Baxter，RefZDG9623)麻醉小鼠。切開后肢皮層，施加回聲影像凝膠。在后脛肌注射透明質酸酶(20U，在50μl 0.9％無菌氯化鈉中，Sigma Ref.H3631)。10分鐘后，在同一塊肌肉注射100μg質粒(每腿50μg，在25μl 0.9％無菌氯化鈉中)。進行肌內注射之前制備好在緩沖液PBS-L-谷氨酸酯中的DNA(6mg/ml；L-谷氨酸酯，Sigma P4761)。進行電轉移時，用ElectroSquarePorator BTX ref ECM830給每只腿施加電場，操作條件是兩個圓形電極(直徑0.5mm)、以單極方式相隔1秒施加10次脈沖，每次脈沖75V，20毫秒。
6.4.3ConA模型6.4.3.1ConA靜脈注射和血液取樣8周齡雌性C57/B16小鼠購自IFFA CREDO。靜脈注射18mg/kg ConA(Sigma ref.C7275)，在注射后1.5小時和8小時分別抽取血液樣品。處死動物時，從心臟抽取血液。
6.4.3.2血液樣品中細胞因子和轉氨酶的檢測運用TH1/TH2 CBA試驗測定IL2、IL5、IL4、TNF-α和IFN-γ細胞因子的水平。運用炎癥CBA試驗測定TNF-α、IL-6、MCP1、IFN-α、IL-10和IL-12的水平。運用COBAS儀器(Hitachi)測定轉氨酶(ALAT和ASAT)的血液參數。
6.4.3.3表達人INSP052EC-6His和hIL-6-SII的載體的電轉移第0天，進行pDEST12.2.-INSP052EC、pDEST12.2-hIL-6以及對照空載體的電轉移(電轉移方案見上文)。電轉移后第5天，靜脈注射ConA(18mg/kg)，在兩個時間點(1.5小時和8小時)抽取血液樣品。
6.4.3.4ConA模型中INSP052和IL6蛋白質預處理注射ConA之前30分鐘，皮下注射產生的CHO細胞、重組hIL-6或者產生的HEK293細胞和重組INSP052-6His。
6.5結果我們在上文(見實施例4和5，圖2-6)已表明，表達HEK293細胞的INSP052EC-6His蛋白質能以劑量依賴方式在體外使ConA刺激hPBMC分泌出的TNF-α和IL-4(及其它細胞因子)數量減少。因為這兩種細胞因子對T細胞誘導的ConA誘導型肝炎有重要作用，所以我們在該模型中測試了INSP052EC cDNA和蛋白質。
采用電轉移方法全身輸入INSP052EC-6His后，該蛋白質保護暴發型肝炎小鼠模型免于發生肝損傷。由圖7可見，在ConA攻擊后8小時，INSP052EC-6His電轉移的動物與空載體對照動物相比，轉氨酶水平有所下降。此外，這些動物中的TNF-α和IL-6細胞因子水平也明顯降低(圖8)。請注意，這種作用與用陽性對照載體pDEST12.2hIL-6-SII獲得的作用相似，甚至更重要(圖7和8)。
注射ConA之前先給予純化的INSP052EC-6His重組蛋白質，并測試了它的保護作用。當以皮下方式注射時，在ConA攻擊后8小時后，INSP052EC蛋白質(1mg/kg，或0.3mg/kg)使ASAT和ALAT水平大幅降低(圖9)。
6.6結論我們的實驗已經表明，INSP052EC在ConA刺激的hPBMC試驗中能體外導致諸如TNF-α、IL-4和IL-2等細胞因子的表達和/或分泌下調。另外，在暴發型肝炎體內模型中輸入INSP052EC cDNA能減低TNF-α和m-IL-6血清水平，而且對轉氨酶在血清中的減低有明顯作用，這已經由皮下注射INSP052EC蛋白質證實了。
天冬氨酸氨基轉氨酶(ASAT)和丙氨酸氨基轉氨酶(ALAT)水平的降低可能是由于TNF-α和IL-4水平降低所致。TNF-α和IL-4是重要的細胞因子，在注射ConA后參與誘導肝臟損傷。在此肝炎小鼠模型中，TNF-α主要由肝巨噬細胞(也叫Kupfer細胞)產生，而IL-4由肝(天然殺傷T)NKT細胞產生。抗TNF-α抗體能保護免于致病(Seino等，2001，Annals of surgery 234，681)，抑制NKT細胞產生IL-4也被證實在T細胞介導的小鼠肝炎中保護肝臟(Ajuebor等，2003 J.Immunology 170，5252-9)。
INSP052EC可用于治療自身免疫疾病、病毒性或急性肝病以及酒精性肝衰竭。它治療其它炎癥疾病也是有效的。
實施例7INSP052EC-6His在LPS誘導小鼠釋放細胞因子中的細胞因子表達調節性質7.1簡介在LPS誘導小鼠釋放TNF-α和IL-6的模型中，注射重組蛋白質或者表達INSP052EC-6His的膠囊瞬時轉染HEK293細胞，測試INSP052EC阻止細胞因子在體內釋放的能力。
使表達重組蛋白質的細胞膠囊化，可以弄清楚連續體內給予蛋白質的潛在治療作用，如具有腫瘤抑制功能的蛋白質所示那樣(Visted T等，2003，Hum Gene Ther.，14，1429-40).。
LPS(脂多糖)是革蘭氏陰性細菌外膜的重要組分，其列舉的最好特性是先天識別能力，它通過與CD14和Toll受體4結合可使巨噬細胞或小膠質細胞產生可靠的炎癥反應(Lehnardt S等，2002，J Neurosci.，22，2478-2486)。現有文獻普遍采用LPS來激活各種細胞，譬如說巨噬細胞、小膠質細胞和內皮細胞，特別是與肝病有關的細胞(Jirillo E等，2002，J Endotoxin Res.，8，319-327)。
7.2材料和方法7.2.1表達INSP052EC-6His的瞬時轉染HEK293細胞的膠囊化7.2.1.1細胞的維持將表達埃-巴二氏病毒核抗原的人胚胎腎293細胞(HEK293-EBNA，Invitrogen)維持在不含Ex-cell VPRO血清的培養基懸浮液中(維持培養基，JRH，UK)，所述培養基裝在旋轉燒瓶(Techne，UK)中，加入了4mM L-谷酰胺(Invitrogen)和1ml/L酚紅溶液(0.5％ w/v，溶劑為水，酚紅Sigma，USA)。
7.2.1.2細胞轉染在轉染當日，將細胞離心，重懸于旋轉瓶(DasGip，D)中250mLDMEM/F12(1∶1)培養基，該培養基含有1％ FBS和4ml/l ITS-X補充物(移種培養基，全部來自Invitrogen)，重懸密度為1×106細胞/ml。運用PEI方法以PEIDNA之比為2∶1轉染細胞。將500μg相應的質粒(pDEST12.2-INSP052EC)與1mg PEI(Polysciences，USA)在100mL移種培養基中混合，室溫培育10分鐘。將該混合物加在細胞懸浮液中，37℃培養90分鐘。培育后將細胞懸浮液離心(200xg，10分鐘，4℃)，細胞沉淀重懸于500ml維持培養基中。在潮濕大氣、5％ CO2和37℃條件下培育細胞直至進行膠囊化。
7.2.1.3細胞膠囊化運用Inotech研究膠囊包裝系統(Inotech，CH)對以pDEST12.2-INSP052EC轉染的HEK293EBNA細胞或者未轉染的HEK293EBNA細胞(對照細胞)進行膠囊化，使其成為海藻酸鹽-聚賴氨酸-海藻酸鹽(APA)膠囊。細胞離心(200xg 10分鐘，4℃)并重懸于2ml洗滌緩沖液(全部化學物質來自Inotech，CH)中。向該懸浮液緩慢加入1.5％海藻酸鹽溶液，獲得了細胞終濃度是2.5×106細胞/ml的溶液。將海藻酸鹽-細胞懸浮液充入與膠囊包裝機連接的注射器中(Braun Omnifit，Braun，D)。
按照下列參數進行膠囊化-注射泵275(50ml注射器)或456(20ml注射器)-陽極電壓1.16kV-振動頻率1943Hz-振幅3膠囊化方案如下-聚合緩沖液10分鐘(體積250ml)-聚賴氨酸10分鐘(體積150ml)-洗滌緩沖液1分鐘(體積150ml)-洗滌緩沖液5分鐘(體積150ml)-0.03％海藻酸鹽5分鐘(體積150ml)-洗滌緩沖液1分鐘(體積150ml)-脫聚合緩沖液10分鐘(體積300ml)-洗滌緩沖液1分鐘(體積150ml)-洗滌緩沖液5分鐘(體積150ml)-培養基(Excell-V-Pro)體積100ml全部緩沖液的制備都按照制造商的手冊，在無菌條件下用無菌蒸餾水制成。在膠囊化最后一步中，將膠囊重懸100ml維持培養基中并轉移到一個無菌旋轉瓶(Dasgip，D)。使膠囊在潮濕大氣、5％ CO2和37℃條件下培育，過夜，或者培育至注射給動物。
7.2.2LPS誘導的細胞因子釋放體內模型按照WO98/38179的方法，建立LPS-誘導TNF-α和IL-6釋放的小鼠模型。采用雄性C57/BL6或C3H/HeN小鼠(8周齡；Charles River，France)。一般地，每個實驗組有10只動物。在標準條件和12小時光暗循環中飼養小鼠，隨意提供輻照食物和飲水。
向小鼠皮下注射LPS(O111B4(Sigma，Switzerland)，0.3mg/kg)。90分鐘后，抽取血液樣品，用ELISA試劑盒(R&D Duoset ref.DY206)測量TNF-α。150分鐘后，用市售ELISA試劑盒(R&D Duoset ref.DY206)測量IL-6水平。將參考化合物地塞米松溶解在PBS中，給予LPS之前15分鐘注射地塞米松(0.1mg/kg，皮下)。
從培育器皿中取出含有HEK293細胞(對照細胞或瞬時表達INSP052EC-6His的細胞)的微膠囊懸浮液，在層流凈化器中靜置幾分鐘，讓膠囊沉降。除去澄清上清液，小心地將濃縮膠囊放入注射器內。用0.7mm號針(ref53158.01 Polylabo，CH)給每只小鼠緩慢地注射700μl膠囊。注射膠囊后第3天，注射LPS。
7.3結果兩個給予INSP052EC的模型都證實了，INSP052EC具有減少LPS誘導血液釋放TNF-α或IL-6的能力。
給予LPS之前15分鐘注射INSP052EC-6His能減少LPS誘導釋放IL-6(如果INSP052EC-6His的給予量至少為0.1mg/kg)和TNF-α(如果INSP052EC-6His的給予量至少為1mg/kg)，具有統計學意義，與參考化合物地塞米松相似。以注射了注射溶液(PBS-BSA，含有0.02％甘油)的小鼠為陰性對照(圖10)。
當瞬時表達INSP052EC-6His的HEK293細胞以所示的全部測試膠囊體積注射時，也獲得了類似陽性效果(圖11)。
實施例8INSP052EC-6His在接觸超敏性模型中的性質8.1簡介在半抗原誘導的接觸超敏性行(CHS，一種炎癥皮膚疾病小鼠模型)中測試了INSP052EC。CHS是一種由T細胞介導的皮膚炎癥模型，為過敏性接觸皮炎或牛皮癬等相似炎癥疾病(這些疾病都是與細胞因子過度產生有關的皮膚問題，醫學上仍未得到解決)的成熟模型(Nakae S等，2003，IntImmunol.，15251-260；Gorbachev AV and Fairchild RL，2001，Crit RevImmunol.，21451-72).。
8.2材料和方法使用前才用丙酮/橄欖油(4∶1)稀釋半抗原DNFB(2，4-二硝基氟苯；Sigma Chemical Co.)。用30μl 0.5％ DNFB溶液涂在刮過的背部皮膚上或者未作處理的左邊，使小鼠致敏。5天后攻擊小鼠，即將非刺激劑量10μl0.2％ DNFB加在右耳兩側，并將相同量的溶劑單獨加在左耳上，引發CHS。第6天用卡尺(Mitutoya)測量耳朵厚度。
按下式計算耳朵腫脹((T6-T5)右耳)-((T6-T5)左耳)其中，T6和T5分別代表致敏攻擊后第6天和第5天的耳朵厚度值。為了確保測到的腫脹是由對DNFB特異的炎癥而不是非特異性刺激所引起，每組實驗還包括一只未致敏但受到攻擊的小鼠。
第5天對小鼠作如下處理皮下注射所示數量的INSP052EC-6His、地塞米松(1mg/kg)或僅給予PBS(對照組)。
8.3結果我們表明，INSP052EC以劑量依賴方式明顯地減輕耳朵腫脹，提示白細胞浸潤減少，隨后發生炎癥的機會也減少，所以證明了INSP052EC能夠用來治療T細胞介導的皮膚炎癥，如過敏性接觸皮炎和牛皮癬。
這些實驗清楚地表明，INSP052(INSP052EC)的分離的胞外結構域(同樣地，含有這種蛋白質序列或全長蛋白質的變體或融合蛋白)可用來調節細胞因子活性，特別是用作細胞因子分泌和/或表達的拮抗劑，可以在與先天或后天免疫反應有直接或間接關系的疾病中發揮治療作用。
由被測試的INSP052EC基分子在采用不同細胞的試驗和動物模型中所顯示的抑制活性的范圍確定，使用此類分子可以阻斷細胞因子由于過度或不適當地局部產生而引致的病理-生理作用。通過INSP052EC基分子可以控制與促炎細胞因子延長產生相關的細胞事件，所以這些分子可用來拮抗異常的炎癥狀態，尤其是累及各種組織和器官(例如肝臟、皮膚、肺、中樞神經系統)的自身免疫疾病和炎癥疾病相關的異常狀態，并且為腫瘤、神經系統障礙、心血管疾病和傳染性疾病提供了一個全新治療機會。采用細胞因子試驗，其中抽取自感染了其它疾病的病人的樣品顯示細胞因子過度表達和/或分泌，也可以鑒定INSP052EC基分子的其它臨床應用(Wong CK和LamCW，Adv Clin Chem.2003，371-46；Whiteside TL，Biotechniques，2002，Oct.Suppl4-8，10，12-5)，由此論證了INSP052EC基分子作為細胞因子拮抗劑的治療用途。
序列信息備注對于外顯子-外顯子連接編碼的氨基酸，它們將被指定為more 5’外顯子。
SEQ ID NO 1(INSP052外顯子1核苷酸序列)1ATGAAGAGAG AAAGGGGAGC CCTGTCCAGA GCCTCCAGGG CCCTGCGCCT TGCTCCTTTT61GTCTACCTTC TTCTGATCCA GACAGSEQ ID NO 2(INSP052外顯子1多肽序列)1MKRERGALSR ASRALRLAPF VYLLLIQTDSEQ ID NO 3(INSP052外顯子2核苷酸序列2)1ACCCCCTGGA GGGGGTGAAC ATCACCAGCC CCGTGCGCCT GATCCATGGC ACCGTGGGGA61AGTCGGCTCT GCTTTCTGTG CAGTACAGCA GTACCAGCAG CGACAGGCCT GTAGTGAAGT121GGCAGCTGAA GCGGGACAAG CCAGTGACCG TGGTGCAGTC CATTGGCACA GAGGTCATCG181GCACCCTGCG GCCTGACTAT CGAGACCGTA TCCGACTCTT TGAAAATGGC TCCCTGCTTC241TCAGCGACCT GCAGCTGGCC GATGAGGGCA CCTATGAGGT CGAGATCTCC ATCACCGACG301ACACCTTCAC TGGGGAGAAG ACCATCAACC TTACTGTAGA TGSEQ ID NO 4(INSP052外顯子2蛋白質序列)1PLEGVNITSP VRLIHGTVGK SALLSVQYSS TSSDRPVVKW QLKRDKPVTV VQSIGTEVIG61TLRPDYRDRI RLFENGSLLL SDLQLADEGT YEVEISITDD TFTGEKTINL TVDVSEQ ID NO 5(INSP052外顯子3核苷酸序列)1TGCCCATTTC GAGGCCACAG GTGTTGGTGG CTTCAACCAC TGTGCTGGAG CTCAGCGAGG61CCTTCACCTT GAACTGCTCA CATGAGAATG GCACCAAGCC CAGCTACACC TGGCTGAAGG121ATGGCAAGCC CCTCCTCAAT GACTCGAGAA TGCTCCTGTC CCCCGACCAA AAGGTGCTCA181CCATCACCCG CGTGCTCATG GAGGATGACG ACCTGTACAG CTGCATGGTG GAGAACCCCA241TCAGCCAGGG CCGCAGCCTG CCTGTCAAGA TCACCGTATA CASEQ ID NO 6(INSP052外顯子3多肽序列)1PISRPQVLVA STTVLELSEA FTLNCSHENG TKPSYTWLKD GKPLLNDSRM LLSPDQKVLT61ITRVLMEDDD LYSCMVENPI SQGRSLPVKI TVYRSEQ ID NO 7(INSP052外顯子4核苷酸序列)1GAAGAAGCTC CCTTTACATC ATCTTGTCTA CAGGAGGCAT CTTCCTCCTT GTGACCTTGG61TGACAGTCTG TGCCTGCTGG AAACCCTCCA AAAGSEQ ID NO 8(INSP052外顯子4多肽序列)1RSSLYIILST GGIFLLVTLV TVCACWKPSK RSEQ ID NO 9(INSP052外顯子5核苷酸序列)1GAAACAGAAG AAGCTAGAAA AGCAAAACTC CCTGGAATAC ATGGATCAGA ATGATGACCG
61CCTGAAACCA GAAGSEQ ID NO 10(INSP052外顯子5多肽序列)1KQKKLEKQNS LEYMDQNDDR LKPEASEQ ID NO 11(INSP052外顯子6核苷酸序列)1CAGACACCCT CCCTCGAAGT GGTGAGCAGG AACGGAAGAA CCCCATGGCA CTCTATATCC61TGAAGGACAA GSEQ ID NO 12(INSP052外顯子6多肽序列)1DTLPRSGEQE RKNPMALYIL KDKSEQ ID NO 13(INSP052外顯子7核苷酸序列)1GACTCCCCGG AGACCGAGGA GAACCCGGCC CCGGAGCCTC GAAGCGCGAC GGAGCCCGGC61CCGCCCGGCT ACTCCGTGTC TCCCGCCGTG CCCGGCCGCT CGCCGGGGCT GCCCATCCGC121TCTGCCCGCC GCTACCCGCG CTCCCCAGCG CGCTCCCCAG CCACCGGCCG GACACACTCG181TCGCCGCCCA GGGCCCCGAG CTCGCCCGGC CGCTCGCGCA GCGCCTCGCG CACACTGCGG241ACTGCGGGCG TGCACATAAT CCGCGAGCAA GACGAGGCCG GCCCGGTGGA GATCAGCGCC301TGASEQ ID NO 14(INSP052外顯子7多肽序列)1DSPETEENPA PEPRSATEPG PPGYSVSPAV PGRSPGLPIR SARRYPRSPA RSPATGRTHS61SPPRAPSSPG RSRSASRTLR TAGVHIIREQ DEAGPVEISASEQ ID NO15(INSP052外顯子1，2，3，4，5，6和7組合的核苷酸序列)1ATGAAGAGAG AAAGGGGAGC CCTGTCCAGA GCCTCCAGGG CCCTGCGCCT TGCTCCTTTT61GTCTACCTTC TTCTGATCCA GACAGACCCC CTGGAGGGGG TGAACATCAC CAGCCCCGTG121CGCCTGATCC ATGGCACCGT GGGGAAGTCG GCTCTGCTTT CTGTGCAGTA CAGCAGTACC181AGCAGCGACA GGCCTGTAGT GAAGTGGCAG CTGAAGCGGG ACAAGCCAGT GACCGTGGTG241CAGTCCATTG GCACAGAGGT CATCGGCACC CTGCGGCCTG ACTATCGAGA CCGTATCCGA301CTCTTTGAAA ATGGCTCCCT GCTTCTCAGC GACCTGCAGC TGGCCGATGA GGGCACCTAT361GAGGTCGAGA TCTCCATCAC CGACGACACC TTCACTGGGG AGAAGACCAT CAACCTTACT421GTAGATGTGC CCATTTCGAG GCCACAGGTG TTGGTGGCTT CAACCACTGT GCTGGAGCTC481AGCGAGGCCT TCACCTTGAA CTGCTCACAT GAGAATGGCA CCAAGCCCAG CTACACCTGG541CTGAAGGATG GCAAGCCCCT CCTCAATGAC TCGAGAATGC TCCTGTCCCC CGACCAAAAG601GTGCTCACCA TCACCCGCGT GCTCATGGAG GATGACGACC TGTACAGCTG CATGGTGGAG661AACCCCATCA GCCAGGGCCG CAGCCTGCCT GTCAAGATCA CCGTATACAG AAGAAGCTCC721CTTTACATCA TCTTGTCTAC AGGAGGCATC TTCCTCCTTG TGACCTTGGT GACAGTCTGT781GCCTGCTGGA AACCCTCCAA AAGGAAACAG AAGAAGCTAG AAAAGCAAAA CTCCCTGGAA841TACATGGATC AGAATGATGA CCGCCTGAAA CCAGAAGCAG ACACCCTCCC TCGAAGTGGT901GAGCAGGAAC GGAAGAACCC CATGGCACTC TATATCCTGA AGGACAAGGA CTCCCCGGAG961ACCGAGGAGA ACCCGGCCCC GGAGCCTCGA AGCGCGACGG AGCCCGGCCC GCCCGGCTAC1021TCCGTGTCTC CCGCCGTGCC CGGCCGCTCG CCGGGGCTGC CCATCCGCTC TGCCCGCCGC1081TACCCGCGCT CCCCAGCGCG CTCCCCAGCC ACCGGCCGGA CACACTCGTC GCCGCCCAGG
1141GCCCCGAGCT CGCCCGGCCG CTCGCGCAGC GCCTCGCGCA CACTGCGGAC TGCGGGCGTG1201CACATAATCC GCGAGCAAGA CGAGGCCGGC CCGGTGGAGA TCAGCGCCTG ASEQ ID NO16(INSP052外顯子1，2，3，4，5，6和7組合的多肽序列)1MKRERGALSR ASRALRLAPF VYLLLIQTDP LEGVNITSPV RLIHGTVGKS ALLSVQYSST61SSDRPVVKWQ LKRDKPVTVV QSIGTEVIGT LRPDYRDRIR LFENGSLLLS DLQLADEGTY121EVEISITDDT FTGEKTINLT VDVPISRPQV LVASTTVLEL SEAFTLNCSH ENGTKPSYTW181LKDGKPLLND SRMLLSPDQK VLTITRVLME DDDLYSCMVE NPISQGRSLP VKITVYRRSS241LYIILSTGGI FLLVTLVTVC ACWKPSKRKQ KKLEKQNSLE YMDQNDDRLK PEADTLPRSG301EQERKNPMAL YILKDKDSPE TEENPAPEPR SATEPGPPGY SVSPAVPGRS PGLPIRSARR361YPRSPARSPA TGRTHSSPPR APSSPGRSRS ASRTLRTAGV HIIREQDEAG PVEISASEQ ID NO17(INSP055小鼠病毒性cDNA)1ATGAAGAGAG AAAGGGGAGC CCTGTCAAGA GCCTCCAGGG CTCTGCGCCT CTCTCCTTTT61GTCTACCTGC TTCTCATCCA GCCAGTCCCC CTGGAGGGGG TGAACATCAC CAGCCCAGTA121CGTCTGATCC ACGGCACAGT GGGGAAGTCG GCCCTGCTTT CCGTGCAGTA CAGTAGCACC181AGCAGCGACA AGCCCGTGGT GAAGTGGCAG CTGAAGCGTG ACAAGCCAGT GACCGTGGTG241CAGTCTATAG GCACAGAGGT CATTGGCACT CTGCGGCCTG ACTATCGAGA CCGTATCCGG301CTCTTTGAAA ATGGCTCCTT GCTTCTCAGC GACCTGCAGC TGGCGGATGA GGGAACCTAT361GAAGTGGAGA TTTCCATCAC TGACGACACC TTCACCGGGG AGAAGACCAT CAACCTCACC421GTGGATGTGC CCATTTCAAG GCCGCAGGTA TTAGTGGCTT CAACCACTGT GCTGGAGCTC481AGTGAGGCCT TCACCCTCAA CTGCTCCCAT GAGAATGGCA CCAAGCCTAG CTACACGTGG541CTGAAGGATG GCAAACCCCT CCTCAATGAC TCCCGAATGC TCCTGTCCCC TGACCAAAAG601GTGCTCACCA TCACCCGAGT ACTCATGGAA GATGACGACC TGTACAGCTG TGTGGTGGAG661AACCCCATCA GCCAGGTCCG CAGCCTGCCT GTCAAGATCA CTGTGTATAG AAGAAGCTCC721CTCTATATCA TCTTGTCTAC AGGAGGCATC TTCCTCCTTG TGACCCTGGT GACAGTTTGT781GCCTGCTGGA AACCCTCAAA AAAGTCTAGG AAGAAGAGGA AGTTGGAGAA GCAAAACTCC841TTGGAATACA TGGATCAGAA TGATGACCGC CTAAAATCAG AAGCAGATAC CCTACCCCGA901AGTGGAGAAC AGGAGCGGAA GAACCCAATG GCACTCTATA TCCTGAAGGA TAAGGATTCC961TCAGAGCCAG ATGAAAACCC TGCTACAGAG CCACGGAGCA CCACAGAACC CGGTCCCCCT1021GGCTACTCCG TGTCGCCGCC CGTGCCCGGC CGCTCTCCGG GGCTTCCCAT CCGCTCAGCC1081CGCCGCTACC CGCGCTCCCC AGCACGTTCC CCTGCCACTG GCCGGACGCA CACGTCGCCA1141CCGCGGGCCC CGAGCTCGCC AGGCCGCTCG CGCAGCTCTT CGCGCTCACT GCGGACTGCA1201GGCGTGCAGA GAATCCGGGA GCAGGACGAG TCAGGGCAGG TGGAGATCAG TGCCTGASEQ ID NO18(INSP055小鼠預測蛋白質)1MKRERGALSR ASRALRLSPF VYLLLIQPVP LEGVNITSPV RLIHGTVGKS ALLSVQYSST61SSDKPVVKWQ LKRDKPVTVV QSIGTEVIGT LRPDYRDRIR LFENGSLLLS DLQLADEGTY121EVEISITDDT FTGEKTINLT VDVPISRPQV LVASTTVLEL SEAFTLNCSH ENGTKPSYTW181LKDGKPLLND SRMLLSPDQK VLTITRVLME DDDLYSCVVE NPISQVRSLP VKITVYRRSS241LYIILSTGGI FLLVTLVTVC ACWKPSKKSR KKRKLEKQNS LEYMDQNDDR LKSEADTLPR301SGEQERKNPM ALYILKDKDS SEPDENPATE PRSTTEPGPP GYSVSPPVPG RSPGLPIRSA361RRYPRSPARS PATGRTHTSP PRAPSSPGRS RSSSRSLRTA GVQRIREQDE SGQVEISA
SEQ ID NO19(編碼INSP052胞外結構域的核酸序列)1ATGAAGAGAG AAAGGGGAGC CCTGTCCAGA GCCTCCAGGG CCCTGCGCCT TGCTCCTTTT61GTCTACCTTC TTCTGATCCA GACAGACCCC CTGGAGGGGG TGAACATCAC CAGCCCCGTG121CGCCTGATCC ATGGCACCGT GGGGAAGTCG GCTCTGCTTT CTGTGCAGTA CAGCAGTACC181AGCAGCGACA GGCCTGTAGT GAAGTGGCAG CTGAAGCGGG ACAAGCCAGT GACCGTGGTG241CAGTCCATTG GCACAGAGGT CATCGGCACC CTGCGGCCTG ACTATCGAGA CCGTATCCGA301CTCTTTGAAA ATGGCTCCCT GCTTCTCAGC GACCTGCAGC TGGCCGATGA GGGCACCTAT361GAGGTCGAGA TCTCCATCAC CGACGACACC TTCACTGGGG AGAAGACCAT CAACCTTACT421GTAGATGTGC CCATTTCGAG GCCACAGGTG TTGGTGGCTT CAACCACTGT GCTGGAGCTC481AGCGAGGCCT TCACCTTGAA CTGCTCACAT GAGAATGGCA CCAAGCCCAG CTACACCTGG541CTGAAGGATG GCAAGCCCCT CCTCAATGAC TCGAGAATGC TCCTGTCCCC CGACCAAAAG601GTGCTCACCA TCACCCGCGT GCTCATGGAG GATGACGACC TGTACAGCTG CATGGTGGAG661AACCCCATCA GCCAGGGCCG CAGCCTGCCT GTCAAGATCA CCGTATACAG AAGAAGCTCCSEQ ID NO20(NSP052的胞外結構域)1MKRERGALSR ASRALRLAPF VYLLLIQTDP LEGVNITSPV RLIHGTVGKS ALLSVQYSST61SSDRPVVKWQ LKRDKPVTVV QSIGTEVIGT LRPDYRDRIR LFENGSLLLS DLQLADEGTY121EVEISITDDT FTGEKTINLT VDVPISRPQV LVASTTVLEL SEAFTLNCSH ENGTKPSYTW181LKDGKPLLND SRMLLSPDQK VLTITRVLME DDDLYSCMVE NPISQGRSLP VKITVYRRSSSEQ ID NO21(編碼成熟INSP052胞外結構域的核酸序列)1GTGAACATCA CCAGCCCCGT GCGCCTGATC CATGGCACCG TGGGGAAGTC51GGCTCTGCTT TCTGTGCAGT ACAGCAGTAC CAGCAGCGAC AGGCCTGTAG101TGAAGTGGCA GCTGAAGCGG GACAAGCCAG TGACCGTGGT GCAGTCCATT151GGCACAGAGG TCATCGGCAC CCTGCGGCCT GACTATCGAG ACCGTATCCG201ACTCTTTGAA AATGGCTCCC TGCTTCTCAG CGACCTGCAG CTGGCCGATG251AGGGCACCTA TGAGGTCGAG ATCTCCATCA CCGACGACAC CTTCACTGGG301GAGAAGACCA TCAACCTTAC TGTAGATGTG CCCATTTCGA GGCCACAGGT351GTTGGTGGCT TCAACCACTG TGCTGGAGCT CAGCGAGGCC TTCACCTTGA401ACTGCTCACA TGAGAATGGC ACCAAGCCCA GCTACACCTG GCTGAAGGAT451GGCAAGCCCC TCCTCAATGA CTCGAGAATG CTCCTGTCCC CCGACCAAAA501GGTGCTCACC ATCACCCGCG TGCTCATGGA GGATGACGAC CTGTACAGCT551GCATGGTGGA GAACCCCATC AGCCAGGGCC GCAGCCTGCC TGTCAAGATC601ACCGTATACA GAAGAAGCTC CSEQ ID NO22(成熟INSP052的胞外結構域)1VNITSPVRLI HGTVGKSALL SVQYSSTSSD RPVVKWQLKR DKPVTVVQSI51GTEVIGTLRP DYRDRIRLFE NGSLLLSDLQ LADEGTYEVE ISITDDTFTG101EKTINLTVDV PISRPQVLVA STTVLELSEA FTLNCSHENG TKPSYTWLKD151GKPLLNDSRM LLSPDQKVLT ITRVLMEDDD LYSCMVENPI SQGRSLPVKI201TVYRRSSSEQ ID NO 23(編碼成熟INSP052外顯子2的核苷酸序列)1GTGAACATCA CCAGCCCCGT GCGCCTGATC CATGGCACCG TGGGGAAGTC
51GGCTCTGCTT TCTGTGCAGT ACAGCAGTAC CAGCAGCGAC AGGCCTGTAG101TGAAGTGGCA GCTGAAGCGG GACAAGCCAG TGACCGTGGT GCAGTCCATT151GGCACAGAGG TCATCGGCAC CCTGCGGCCT GACTATCGAG ACCGTATCCG201ACTCTTTGAA AATGGCTCCC TGCTTCTCAG CGACCTGCAG CTGGCCGATG251AGGGCACCTA TGAGGTCGAG ATCTCCATCA CCGACGACAC CTTCACTGGG301GAGAAGACCA TCAACCTTAC TGTAGATGSEQ ID NO 24(成熟INSP052外顯子2的蛋白質序列)1VNITSPVRLI HGTVGKSALL SVQYSSTSSD RPVVKWQLKR DKPVTVVQSI51GTEVIGTLRP DYRDRIRLFE NGSLLLSDLQ LADEGTYEVE ISITDDTFTG101EKTINLTVDVSEQ ID NO25(編碼成熟INSP052多肽的核苷酸序列)1GTGAACATCA CCAGCCCCGT GCGCCTGATC CATGGCACCG TGGGGAAGTC51GGCTCTGCTT TCTGTGCAGT ACAGCAGTAC CAGCAGCGAC AGGCCTGTAG101TGAAGTGGCA GCTGAAGCGG GACAAGCCAG TGACCGTGGT GCAGTCCATT151GGCACAGAGG TCATCGGCAC CCTGCGGCCT GACTATCGAG ACCGTATCCG201ACTCTTTGAA AATGGCTCCC TGCTTCTCAG CGACCTGCAG CTGGCCGATG251AGGGCACCTA TGAGGTCGAG ATCTCCATCA CCGACGACAC CTTCACTGGG301GAGAAGACCA TCAACCTTAC TGTAGATGTG CCCATTTCGA GGCCACAGGT351GTTGGTGGCT TCAACCACTG TGCTGGAGCT CAGCGAGGCC TTCACCTTGA401ACTGCTCACA TGAGAATGGC ACCAAGCCCA GCTACACCTG GCTGAAGGAT451GGCAAGCCCC TCCTCAATGA CTCGAGAATG CTCCTGTCCC CCGACCAAAA501GGTGCTCACC ATCACCCGCG TGCTCATGGA GGATGACGAC CTGTACAGCT551GCATGGTGGA GAACCCCATC AGCCAGGGCC GCAGCCTGCC TGTCAAGATC601ACCGTATACA GAAGAAGCTC CCTTTACATC ATCTTGTCTA CAGGAGGCAT651CTTCCTCCTT GTGACCTTGG TGACAGTCTG TGCCTGCTGG AAACCCTCCA701AAAGGAAACA GAAGAAGCTA GAAAAGCAAA ACTCCCTGGA ATACATGGAT751CAGAATGATG ACCGCCTGAA ACCAGAAGCA GACACCCTCC CTCGAAGTGG801TGAGCAGGAA CGGAAGAACC CCATGGCACT CTATATCCTG AAGGACAAGG851ACTCCCCGGA GACCGAGGAG AACCCGGCCC CGGAGCCTCG AAGCGCGACG901GAGCCCGGCC CGCCCGGCTA CTCCGTGTCT CCCGCCGTGC CCGGCCGCTC951GCCGGGGCTG CCCATCCGCT CTGCCCGCCG CTACCCGCGC TCCCCAGCGC1001GCTCCCCAGC CACCGGCCGG ACACACTCGT CGCCGCCCAG GGCCCCGAGC1051TCGCCCGGCC GCTCGCGCAG CGCCTCGCGC ACACTGCGGA CTGCGGGCGT1101GCACATAATC CGCGAGCAAG ACGAGGCCGG CCCGGTGGAG ATCAGCGCCT1151GASEQ ID NO26(INSP052成熟多肽序列)1VNITSPVRLI HGTVGKSALL SVQYSSTSSD RPVVKWQLKR DKPVTVVQSI51GTEVIGTLRP DYRDRIRLFE NGSLLLSDLQ LADEGTYEVE ISITDDTFTG101EKTINLTVDV PISRPQVLVA STTVLELSEA FTLNCSHENG TKPSYTWLKD151GKPLLNDSRM LLSPDQKVLT ITRVLMEDDD LYSCMVENPI SQGRSLPVKI201TVYRRSSLYI ILSTGGIFLL VTLVTVCACW KPSKRKQKKL EKQNSLEYMD
251QNDDRLKPEA DTLPRSGEQE RKNPMALYIL KDKDSPETEE NPAPEPRSAT301EPGPPGYSVS PAVPGRSPGL PIRSARRYPR SPARSPATGR THSSPPRAPS351SPGRSRSASR TLRTAGVHII REQDEAGPVE ISASEQ ID NO27(SEQIDNO880)1MKRERGALSR ASRALRLAPF VYLLLIQTDP LEGVNITSPV RLIHGTVGKS51ALLSVQYSST SSDRPVVKWQ LKRDKPVTVV QSIGTEVIGT LRPDYRDRIR101LFENGSLLLS DLQLADEGTY EVEISITDDT FTGEKTINLT VDVPISRPQV151LVASTTVLEL SEAFTLNCSH ENGTKPSYTW LKDGKPLLND SRMLLSPDQK201VLTITRVLME DDDLDSCVVE NPINQGRTLP CKITVYKKSS LSSIWLQEAF251SSLGPWSEQ ID NO28(SEQIDNO434)1MKRERGALSR ASRALRLAPF VYLLLIQTDP LEGVNITSPV RLIHGTVGKS51ALLSVQYSST SSDRPVVKWQ LKRDKPVTVV QSIGTEVIGT LRPDYRDRIR101LFENGSLLLS DLQLADEGTY EVEISITDDT FTGEKTINLT VDVPISRPQV151LVASTTVLEL SEAFTLNCSH ENGTKPSYTW LKDGKPLLND SRMLLSPDQK201VLTITRVLME DDDLDSCVVE NPINQGRTLP CKITVYKKSS FYIICLKEAS251SSFGPWSEQ ID NO29(帶組氨酸標簽的成熟INSP052胞外結構域)1VNITSPVRLI HGTVGKSALL SVQYSSTSSD RPVVKWQLKR DKPVTVVQSI51GTEVIGTLRP DYRDRIRLFE NGSLLLSDLQ LADEGTYEVE ISITDDTFTG101EKTINLTVDV PISRPQVLVA STTVLELSEA FTLNCSHENG TKPSYTWLKD151GKPLLNDSRM LLSPDQKVLT ITRVLMEDDD LYSCMVENPI SQGRSLPVKI201TVYRRSSHHH HHHSEQ ID NO30(成熟INSP052胞外結構域的Fc融合子)1VNITSPVRLI HGTVGKSALL SVQYSSTSSD RPVVKWQLKR DKPVTVVQSI51GTEVIGTLRP DYRDRIRLFE NGSLLLSDLQ LADEGTYEVE ISITDDTFTG101EKTINLTVDV PISRPQVLVA STTVLELSEA FTLNCSHENG TKPSYTWLKD151GKPLLNDSRM LLSPDQKVLT ITRVLMEDDD LYSCMVENPI SQGRSLPVKI201TVYRRSSEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE251VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV301LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM351TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS401KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGKSEQ ID NO31(INSP052Ig2)1VRLIHGTVGK SALLSVQYSS TSSDRPVVKW QLKRDKPVTV VQSIGTEVIG51TLRPDYRDRI RLFENGSLLL SDLQLADEGT YEVEISITDD TFTGEKTINL101TVDVPISRPQ VLVASTTVLE LSEAFTLNCS HENGTKPSYT WLKDGKPLLN151DSRMLLSPDQ KVLTITRVLM EDDDLYSCMV ENPISQ
權利要求
1.一種多肽，所述多肽包括或者由兩個序列(a)和(b)組成，其中(a)是與以下物質具有至少90％同一性的氨基酸序列i)如SEQ ID NO20或SEQ ID NO22所示的氨基酸序列；ii)是其片段，該片段具有(i)的多肽的活性；或者iii)是(i)或(ii)的功能等同物；以及(b)是選自以下組內的異源氨基酸序列信號序列、純化標簽、膜結合蛋白質的胞外結構域、分泌蛋白質、起始甲硫氨酸、含有內肽酶識別位點的接頭區、或者來自免疫球蛋白分子的Fc區。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽包括SEQ IDNO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28所示的氨基酸序列。
3.一種多肽，它是權利要求1所述的功能等同物，其特征在于，所述多肽與SEQ ID NO20或SEQ ID NO22所示的氨基酸序列同源，并且具有細胞因子表達和/或分泌拮抗劑的活性。
4.如權利要求3所述的多肽，其特征在于，所述多肽包括或者由SEQID NO29或SEQ ID NO30組成。
5.一種編碼上述權利要求中任一項所述的多肽的純化核酸分子。
6.如權利要求5所述的純化核酸分子，其特征在于，所述純化核酸分子包括SEQ ID NO19、SEQ ID NO21所示的核酸序列，或者是其冗余等同物或片段。
7.一種在高度嚴謹條件下與權利要求5或6所述的核酸分子雜交的純化核酸分子。
8.一種含有權利要求5至7中任一項所述的核酸分子的載體。
9.一種用權利要求8所述的載體轉化的宿主細胞。
10.一種多肽，它包括的氨基酸序列與SEQ ID NO20或SEQ IDNO22所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，用于治療或診斷疾病。
11.如權利要求1至4中任一項所述的多肽、權利要求5至7中任一項所述的核酸分子、權利要求8所述的載體、權利要求9所述的宿主細胞，用于治療或診斷疾病。
12.一種多肽作為細胞因子表達和/或分泌拮抗劑的用途，其中所述多肽包括的氨基酸序列與SEQ ID NO20或SEQ ID NO22所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。
13.如權利要求1至4中任一項所述的多肽、權利要求5至7中任一項所述的核酸分子、權利要求8所述的載體、權利要求9所述的宿主細胞作為細胞因子表達和/或分泌拮抗劑的用途。
14.一種藥物組合物，其特征在于所述組合物含有一種多肽，所述多肽包括的氨基酸序列與SEQ ID NO20或SEQ ID NO22所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。
15.一種藥物組合物，其特征在于所述組合物含有如權利要求1至4中任一項所述的多肽、權利要求5至7中任一項所述的核酸分子、權利要求8所述的載體、權利要求9所述的宿主細胞。
16.如權利要求15所述的藥物組合物，其特征在于所述組合物還含有一種附加治療劑，所述治療劑是細胞因子拮抗劑或者抗炎藥。
17.一種多肽在制備治療自身免疫疾病、病毒性或急性肝病包括酒精性肝臟衰竭、皮膚疾病或炎癥的藥物中的用途，其中所述多肽包括的氨基酸序列與SEQ ID NO20或SEQ ID NO22所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。
18.如權利要求1至4中任一項所述的多肽、權利要求5至7中任一項所述的核酸分子、權利要求8所述的載體、權利要求9所述的宿主細胞在制備治療自身免疫疾病、病毒性或急性肝病包括酒精性肝臟衰竭、皮膚疾病或炎癥的藥物中的用途。
19.i)一種多肽，它包括的氨基酸序列與SEQ ID NO20或SEQ IDNO22所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，以及ii)一種細胞因子拮抗劑或抗炎藥在制備治療自身免疫疾病、病毒性或急性肝病包括酒精性肝臟衰竭、皮膚疾病或炎癥的藥物中的用途。
20.一種多肽在制備給予病人以治療自身免疫疾病、病毒性或急性肝病包括酒精性肝臟衰竭、皮膚疾病或炎癥的藥物中的用途，其中所述多肽包括的氨基酸序列與SEQ ID NO20或SEQ ID NO22所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，所述病人先前已接受了細胞因子拮抗劑或者抗炎藥。
21.一種細胞因子拮抗劑或者抗炎藥在制備給予病人以治療自身免疫疾病、病毒性或急性肝病包括酒精性肝臟衰竭、皮膚疾病或炎癥的藥物中的用途，其中所述病人先前已接受了一種多肽，所述多肽包括的氨基酸序列與SEQ ID NO20或SEQ ID NO22所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。
22.i)如權利要求1至4中任一項所述的多肽、權利要求5至7中任一項所述的核酸分子、權利要求8所述的載體、權利要求9所述的宿主細胞，以及ii)一種細胞因子拮抗劑或抗炎藥在制備治療自身免疫疾病、病毒性或急性肝病包括酒精性肝臟衰竭、皮膚疾病或炎癥的藥物中的用途。
23.如權利要求1至4中任一項所述的多肽、權利要求5至7中任一項所述的核酸分子、權利要求8所述的載體、權利要求9所述的宿主細胞在制備給予病人以治療自身免疫疾病、病毒性或急性肝病包括酒精性肝臟衰竭、皮膚疾病或炎癥的藥物中的用途，其中所述病人先前已接受了細胞因子拮抗劑或者抗炎藥。
24.一種細胞因子拮抗劑或者抗炎藥在制備給予病人以治療自身免疫疾病、病毒性或急性肝病包括酒精性肝臟衰竭、皮膚疾病或炎癥的藥物中的用途，其中所述病人先前已接受了如權利要求1至4中任一項所述的多肽、權利要求5至7中任一項所述的核酸分子、權利要求8所述的載體、權利要求9所述的宿主細胞。
25.一種治療病人疾病的方法，其特征在于所述方法包括把一種多肽給予該病人，所述多肽包括的氨基酸序列與SEQ ID NO20或SEQ IDNO22所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。
26.如權利要求25所述的方法，其特征在于，所述方法還給予一種細胞因子拮抗劑或者抗炎藥。
27.一種治療病人疾病的方法，其特征在于所述方法包括把如權利要求1至4中任一項所述的多肽、權利要求5至7中任一項所述的核酸分子、權利要求8所述的載體、權利要求9所述的宿主細胞或者權利要求14至16中任一項所述的藥物組合物給予該病人。
28.一種鑒定化合物的方法，所述化合物是SEQ ID NO20或SEQ IDNO22的配體，其特征在于所述方法包括將如權利要求1至4中任一項所述的多肽與推斷對所述多肽具有結合親和性的一或多個化合物接觸，以及選擇與所述多肽特異性結合的化合物。
29.一種轉基因非人動物，所述動物已經轉化成表達如權利要求1至4中任一項所述的多肽。
全文摘要
本發明涉及一種蛋白質序列(INSP052EC)在診斷、預防和治療疾病，特別是與細胞因子過度表達和/或分泌相關的疾病中的新用途，所述蛋白質經本發明鑒定為一種含有免疫球蛋白結構域的細胞表面識別分子。
文檔編號A61P1/16GK1901932SQ200480039777
公開日2007年1月24日 申請日期2004年11月12日 優先權日2003年11月12日
發明者R·J·法根, A·R·戴維斯, C·B·菲爾普斯, C·鮑爾, U·博斯切特, Y·奇韋提克 申請人:阿雷斯貿易股份有限公司