專利名稱：血管內皮因子及其拮抗劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一組治療惡性腫瘤及其血管異常增生疾患的生物制品，確切地說它是一組血管形成刺激劑及血管增生抑制劑。
惡性腫瘤嚴重威脅著人類的健康和生命。在過去的50年中，人們始終在不斷求索，力圖尋找出一種有效的治療方法；如某種藥物在體外對靶細胞有殺傷作用，并且在體內也有效。與放射性同位素、化學藥物、生物毒素、酶等偶聯的單克隆抗體或效應抗體等在體外實驗中對腫瘤相關抗原有較高的特異性，但由于其血管通透性、間質擴散系數和液壓傳導率均較高，體內腫瘤細胞對它們的攝取不充分，以及分布不均，限制了這些藥物臨床的應用。造成這些藥劑在實體腫瘤中傳遞不良的生理因素包括血液供給不均、間質壓力升高、間質中的較大的傳輸距離等，從中可看出現有技術雖已提供了多種治療癌癥的方法，但多不盡人意。近年來，研究人員對如何減少抗體異原性反應、增強抗體的穿透能力及克服抗原表達異質性等方面進行了深入的研究，以期明顯提高腫瘤靶細胞對導向藥物的攝取量，最大限度發揮抗體效應。在1973年第三屆癌胚抗原會議上，Folkman首先報告其在Walker256鼠腫瘤細胞中分離出一種活性成分，并認為它是蛋白類的血管形成抑制劑，同時他第一次提出了腫瘤血管形成因子的概念(1973年在第三屆國際癌胚抗原會議Tumor Angiogeneic Factor.TAF)，同時他推測抑制腫瘤血管形成將導致腫瘤生長的抑制。
血管增殖是正常組織生長發育所必須的一個過程，在成年人，除了女性的生殖系統及機體的修復過程發生血管增殖外，其它組織很少發生血管增殖，且血管增殖過程一般較短暫并受機體嚴格的調節。與之相反，在某些病理性疾病中常發生無控制血管形成，如糖尿病、視網膜血管增殖所涉及的血管瘤及實體瘤，研究表明腫瘤細胞在其形成和發展的過程中其本身釋放血管形成因子作用于宿主的血管，以誘導內皮細胞增殖，形成供應腫瘤營養及排泄廢物的腫瘤血管網絡結構。1989年由Ferra等人從牛垂體濾泡星形細胞條件培養液中純化出來一種具有旁分泌功能，并能特異地促進血管內皮細胞增殖與分裂的生長因子-血管內皮生長因子(VEGF)。VEGF是一種內皮細胞特異的有絲分裂素(Ferra，NandHenzel，W.J.，1989，Biophs. Res.Comm，161851-858)。VEGF是一個高度糖基化的堿性蛋白，由兩條24KD的單鏈組成同源二聚體，使用巰基還原劑可使之失去活性，由于mRNA的不同剪切方式使其共有四種形式即VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206，前兩種是可溶性蛋白，后兩種是不溶性蛋白，從細胞中分泌出來后直接與細胞膜和基底膜結合，人體內以VEGF165較為常見。VEGF除了特異地刺激內皮細胞增殖外還具有獨特的促血管通透性的作用，能使注射部位血管內大分子泄露，但無基底膜的破壞和炎細胞的浸潤。血管形成是由血管內皮細胞的增殖、遷移和浸潤等一系列步驟所組成，這些過程由血管形成因子所調節。研究表明絕大多數腫瘤細胞均能分泌血管內皮生長因子，且血管內皮生長因子受體(flt-1，flk-1)都分布在新生腫瘤血管內皮上，而在正常組織血管內皮上沒有或很少有分布。
通過研究證實VEGF分子有如下不同于其它血管形成活性分子的特點1)首先VEGF121及VEGF165是分泌性蛋白，通過旁分泌途徑誘導腫瘤血管內皮細胞的增殖同時促進腫瘤形成；2)VEGF在體內是血管內皮細胞特異的有絲分裂素，而成纖維細胞生長因子(FGFs)和血小板源生長因子(PDGF)的作用是多向性(特異性較低)。3)VEGF在幾個體內模型中均能夠促進血管形成。并且通過研究證實VEGF作為一個旁分泌血管形成調節劑，它能夠導致一個血管增殖的鏈鎖式反應發生，并可以通過它的直接血管形成效應促進腫瘤形成；4)VEGFmRNA在許多血管豐富組織中如腦、心、腎、卵巢及許多腫瘤組織均有表達，從而給我們提供一個客觀證據，VEGF是一個生理及病理血管形成過程中有效的調節劑；5)VEGF區別于其它因子的另一個顯著特點，是其在不引起血管壁破壞情況下，增加血管通透性，引起纖維蛋白原及部分血漿蛋白的泄漏，而纖維蛋白膠的形成又給內皮細胞和腫瘤細胞的生長與遷移提供了一個較為理想的底物及環境。從而說明以VEGF作為導向治療靶具有較大優越性。
目前，國外所制備的抗體主要是以合成VEGFN末端短肽為抗原，這樣就造成其抗原性不完整，而且也不具有天然結構，制備的抗體靶特異性也就不強，限制其應用范圍。
本發明的目的是提供一種VEGF及系列VEGF拮抗劑，以及它們的制備方法，該方法包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體的制備；上述的VEGF拮抗劑與放射性同位素的偶聯方法，所述拮抗劑可以中和VEGF的促進血管形成的作用，并可應用于臨床血管密度較高的腫瘤和視網膜血管增生、風濕性關節炎等癥的治療。
本研究所應用的抗原即血管內皮生長因子是通過現代的最新技術即分子生物學的手段，1)從人胎肝中克隆出人VEGF基因；2)將此基因再定向克隆在原核表達載體；3)經轉化工程菌表達人重組VEGF，再經活性檢測其有人臍靜脈血管內皮細胞增殖活性、雞胚絨毛尿囊膜血管形成活性及增加血管通透性的活性，這樣就完全符合了天然VEGF分子的活性，我們所制備的抗原具有與天然物質一樣的結構，并保持了其結構的完整性，使得我們所制備的抗體特異性更為專一，靶特異性更為專一。通過實驗表明我們所制備的抗體具有中和活性，其不光以腫瘤血管內皮細胞為靶，而且還以腫瘤細胞為靶，這說明我們所制備的抗體具有“雙功能”的效應。
抗體并不局限于多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab片段表達庫所產生的肽段，并且優選那些有中和VEGF活性抗體，應用到疾病的診斷及治療中；獲得中和VEGF活性的抗體是通過如下方法實現的；首先，注射VEGF抗原免疫動物，但不限于兔子、小鼠、大鼠等，根據宿主的種類，使用各種佐劑以增強免疫應答，這些佐劑包括但不限于Freund′s(完全和不完全的佐劑)(Keck.p.j，Hauser.S.D.，Krivi，G.，Sanzo，K.，Warren.，Farber，J.，and Connolly，D.T.(1989)Science 246，1309-1312)、無機凝膠、氫氧化鋁、表面活性物質如溶血卵磷脂、環氧乙烷-環氧丙烷多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、孔嘁血蘭蛋白、二硝基苯酚以及潛在對人體有用的佐劑，如卡介苗(BCG)；VEGF多克隆抗體的獲得是通過人重組VEGF，采用完全或不完全佐劑多次免疫動物，不限于兔、小鼠和大鼠，獲得有結合活性的血清；可通過從傳代細胞的培養物中提取抗VEGF單克隆抗體分子，其中包括提取這些抗體分子的任何技術。但不限于由Kohler and Milstein最早公開的雜交瘤(Hybridoma)技術(Nature，1975 256495-497)，人體細胞雜交瘤技術(Kosberet al.，1983，Immunology Today，472；Cote et al.，1983 Proc.Natl Acad.Sci.，802026-2030)和VEGF雜交瘤技術(Cole et al，1985，MonoconalAnt ibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)獲得有中和活性的抗人血管內皮生長因子單抗并命名為3D3；應用氯氨T法或者Iogdogen法，可標記同位素。
本發明還包括通過使用來自具有編碼與VEGF抗原特異結合的抗體分子基因與編碼有生物活性人源性抗體分子的基因連接后表達的一“嵌合抗體”的技術(Morrisor et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.，816851-6855；Neubergeret al.，Nature，312604-608；Takeda et al.，1985，Nature，314452-454)；本發明包括抗VEGF單鏈抗體，單鏈抗體的制造技術(American Patent 4,946,778)，應用此技術進行VEGF單鏈抗體制備。單鏈抗體就是用分子生物學的手段將鼠源的單克隆抗體的重鏈基因和輕鏈基因連接在一起，以表達一種只編碼抗體重鏈及輕鏈的蛋白；本發明中的小分子抗體，是應用多聚酶鏈反應(PCR)技術，通過所合成的適當引物將重鏈及輕鏈的基因擴增出來，插入表達載體中，測序驗證之后，便可插入適當的表達載體中，在大腸桿菌中表達小分子抗體。
上述所獲得的一系列抗體要經過三個標準來檢測其是否存在中和活性。
首先是VEGF的內皮細胞增殖試驗，離體24小時以內的人臍靜脈內皮細胞培養按楊小平等(人臍靜脈內皮細胞培養及形態觀察，中華心血管雜志1988，16298-299)加以改進，消化時間為8-10分鐘，內皮細胞培養液為RPIM1640，含30％FCS、2mM谷氨酰氨、90ng/ml肝素鈉、1ng/ml氫化考的松、2ng/ml慶大霉素。96孔板以0.01％多聚賴氨酸包被后，加原代臍靜脈內皮細胞，4×10/孔，加入不同濃度的VEGF，每個濃度有三個重復孔。5天后加入3H-TdR，1.0uci/孔，培養6小時后以Beckman液閃儀測其cpm值。人臍靜脈內皮細胞的增殖要隨著拮抗劑量的增加而減少；其次，雞胚絨毛尿囊膜血管形成實驗參考Tayor和Forkman(1982)方法，用PBS配制1.5％甲基纖維素，購買六天雞胚置于5％CO2，38.5℃孵育箱中培養，每天上下翻轉兩次，第九天在無菌條件下，在卵殼開一0.5×1mm2的卵窗，將10μl甲基纖維素與5μl不同濃度的VEGF混合，滴于雞胚絨毛尿囊膜上，24-48小時觀察實驗結果，照相隨時記錄實驗結果，以無VEGF甲基纖維素作為陰性對照。雞胚絨毛尿囊膜血管的增殖數目要隨著拮抗劑量的增加而下降；第三，血管通透性實驗參考Miles方法(Milesaa，J.Physiol 1952118-228)，麻醉豚鼠后切開頸部皮膚，經頸靜脈注射1ml 0.5％(W/V)Enan′s Bluc，5分鐘后在豚鼠背部皮內注射相同體積但(200ul)是不同濃度的VEGF，以PBS作為陰性對照體積為200μl。隨著拮抗劑增加，血管通透性降低。
對符合上述三項要求的抗體，才能確認為此種抗體是有中和活性的。
我們認為采用抗VEGF抗體有如下優點1)從抗原選擇上應尋找對靶細胞有最大選擇性的抗原以獲得特異性更強抗體，由于腫瘤相關抗原異質性等原因，目前研制抗體很難達到如此效應。既然腫瘤連續的浸潤性生長和擴散均依賴于腫瘤的脈管系統，因此，我們選用特異促進脈管系統內皮細胞遷移、增殖的蛋白作為導向治療抗體的抗原決定簇，這種抗原決定簇消除了抗原異質性的弊端，能夠使抗體分布更特異且靶部位攝取量更高，再者由于抗體封閉了VEGF的活性，從而抑制甚至于摧毀腫瘤賴以生存和轉移的脈管系統，使腫瘤細胞喪失生存和轉移的基礎。2)腫瘤血管及組織間液體壓力的增高是構成腫瘤屏障的兩個主要因素，由于VEGF的受體僅位于腫瘤血管內皮細胞上，抗體及其偶聯物特異結合，抑制并摧毀腫瘤血管，從而降低組織間液壓，使抗體更容易向腫瘤核心擴散，提高腫瘤靶對于抗體的攝取量；3)VEGF為大多數腫瘤細胞所分泌，而在正常組織血管內皮上幾乎無VEGF受體(flt-1，flk-1)的表達，從而使抗體靶特異性更強，對正常組織損傷更小。4)宿主血管的長入與質的形成是腫瘤細胞在腫瘤實質內遷移及遠隔轉移的基礎，VEGF促進宿主血管內皮細胞分裂形成新生的腫瘤血管長入腫瘤，同時血管內皮生長因子又是血管通透性因子(VPF)，血管內血漿蛋白原外滲形成腫瘤細胞遷移及轉移所依賴基質及通道，抗VEGF抗體封閉這種效應，抑制腫瘤細胞的轉移；5)本實驗擬在上述實驗基礎上，進行人原性抗體的制備，從而基本上消除異原性反應；6)本實驗抗原及抗體是通過基因工程方法制備，可以大量生產。
實施例1VEGF重組蛋白的誘導、表達及純化1. 小批量的重組蛋白的誘導及表達(1)在含有表達人重組VEGF質粒(VEGF表達載體的構建見

圖1)過夜培養的1ml轉化菌中，加入1ml 45℃預溫的含氨基芐青霉素的LB培養基，42℃300rpm振蕩培養4小時。(2)離心4000rpm 5分鐘，棄上清，各加入50ul水及50ul PAGE樣品液，混勻，100℃水煮5分鐘，上樣，在垂直電泳儀上設置恒流30mA，進行電泳。2. 大批量的重組蛋白的誘導及表達(1)將含有表達人VEGF基因片段的重組表達載體的POP-2136單個菌落，接種于100ml含氨基芐青霉素LB培養基中，30℃擴增至OD600為0.6時，加入100ml 50℃預溫的新配制的培養基，42℃350rpm振蕩培養4小時。(2)離心4000rpm 30分鐘，棄上清。收獲細胞。3. 包涵體制備(1)細菌的裂解按100ml培養液加50ml超聲緩沖液的比例，將大批量誘導的菌體進行超聲處理，超聲條件設置為60W，在冰浴內進行超聲，12分鐘，并間歇進行超聲。(2)包涵體的洗滌超聲后的菌液10000rpm離心15分鐘，棄上清，這時表達產物以包涵體的形式存在于沉淀中。測量包涵體的濕重，按每100mg包涵體用10ml包涵體洗液的比例進行洗滌，用VEGF包涵體洗液將包涵體充分的混勻，10000rpm離心15分鐘，棄上清，洗滌三次。后再用相同體積的0.15mol/LPBS(pH7.4)洗滌兩次。4. 包涵體的變性與復性a在包涵體中加入8M尿素，37℃水浴一小時，離心15000rpm 30分鐘，將上清移至透析袋內(M.W. Cutoff12,000-14,000，SPECTRUM MEDICAL INDUSTRIES，INC.)。b用50mmol/L pH8.0Tris-HCl緩沖液進行稀釋復性。PBS透析，4℃，24小時。5. 制備性SDS-PAGE純化重組蛋白(1)將洗滌后的包涵體用8M尿素、2％SDS及20mmol二巰基乙醇進行變性，混勻，37℃孵育過夜。10000rpm離心30鐘，在上清中加入PAGE樣本緩沖液，37℃孵育一小時。(2)制備3mm厚PAGE板，在電泳槽中加入電泳緩沖液。加樣，設置恒流電泳，電流為25mA。(3)電泳結束后取下膠，將膠置于平皿內，加入4℃0.1M氯化鉀染色，切下目的蛋白帶并將膠切成3×0.5cm2大小，置于透析袋內，加入0.5 PAGE電泳緩沖液。(4)將透析袋置于圓盤電泳洗脫裝置內，加入0.25×PAGE電泳緩沖液，設置恒壓電泳，電壓為300V，洗脫6小時，吸出蛋白液，加入5倍體積的復性液(50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，內含2uM的硫酸銅)，4℃磁力攪拌過夜復性。(5)復性液用0.15M PBS(pH7.4)透析，去除SDS，將收獲的蛋白進行SDS-PAGE分析，用紫外OD280確定蛋白的含量。6. 反相-HPLC純化重組蛋白(1)用SP 2000泵進行驅動，應用日本住友公司Cosmosi14.6×150mm，F09033，5C18-P-300C型層析柱。(2)洗脫條件的設置1-10分鐘入流動相A；10-40分鐘入40％流動相B；40-50分鐘入75％流動相B；50分鐘后入100％流動相B，以線性梯度進行洗脫，洗脫速度為1ml/min。(3)用PE LC 90 Bio紫外分光光度計檢測洗脫下的樣品，用gallenkamp.winosc ribe記錄儀計錄，走紙速度為0.05Aufs。(4)先走一空白梯度，與樣品峰進行對照。(5)用微量注射器加樣100ul，樣品為SDS-PAGE純化后經PAGE分析純度較好呈單一條帶的重組蛋白，樣品真空冷凍干燥后，溶于流動相A，樣品的濃度為250ug/ml。(圖2及圖3為VEGF表達純化的SDS-PAGE分析)四、血管內皮生長因子的活性鑒定1. 內皮細胞增殖實驗a內皮細胞的培養(按揚小平法加以改進)① 取產后24小時以內的新鮮臍帶，置于無菌的PBS溶液中，一般取15-20cm長為佳。② 在臍靜脈內放置一乳膠管并結扎緊，連接輸液器，用注射器吸溫浴后的PBS反復的沖洗數次，直至觀察到從臍帶的另一端流出的為無色透明的液體。③ 從乳膠管的一端向臍靜脈內注入0.125％膠原酶待臍帶的另一端有液體出現后立即用止血鉗夾緊，徐徐的注入充滿血管后，然后用止血鉗夾緊臍帶的另一端。④ 將血管置于37℃溫箱內，消化8-12分鐘。⑤ 吸出含有內皮細胞的消化液，用1ml小牛血清終止消化反應，再用無菌的PBS反復沖洗消化腔，將收集到液體置于無菌離心管中。⑥ 1000rpm離心10分鐘，棄上清用配制好的內皮細胞培養液吹打混勻，制成細胞懸液，接種于培養器皿或96孔板中，置5％CO237℃孵育箱內培養。bVEGF對血管內皮細胞的增殖效應① 以0.01％多聚賴氨酸包被96孔板，使用量按每平方厘米加50ul的溶液計算，室溫下靜止5分鐘后，吸出多余的液體。② 再用滅菌蒸餾水(100ul/mm2)洗滌涂有基質的表面，然后盡量將水份吸凈。③ 用0.125％膠原酶(II型)消化原代培養的細胞6分鐘，用內皮細胞培養液輕柔的吹打細胞，在計數板下計數，稀釋成2×104個/ml，200ul/孔，4×103/孔。④ 培養24小時后，加入不同濃度的過濾后的VEGF，每個濃度有三個平行孔，以未加VEGF的內皮細胞培養液作為陰性對照。4天后加入3H-TdR(上海生物制品研究所)，0.5uci/孔，六小時后用多頭吸樣器收集于濾紙上，Beckman LS-3801型β液閃儀檢測cpm值。(圖4為VEGF對人臍靜脈內皮細胞的增殖影響)2. 雞胚絨毛尿囊膜血管形成實驗① 購買六天雞胚置于5％CO2、38.5℃孵育箱中培養，每天上下翻轉兩次，并用照卵燈觀查雞胚的生長情況。② 第九天在無菌條件下在卵殼空氣腔處開一0.5×1mm2的卵窗，用一無菌的注射器針頭刺破殼膜，然后慢慢滴入生理鹽水，使雞胚絨毛尿囊膜與殼膜分離下沉，用無菌剪刀修整殼膜，在照卵燈觀查雞胚絨毛尿囊膜血管生長情況，后用消過毒的Parafilm封閉卵窗。③ 用1.5％的甲基纖維素10ul與5ul不同濃度的VEGF混合，混勻后滴到雞胚絨毛尿囊膜上，12-48小時觀察實驗結果，照像隨時計錄實驗結果，以無VEGF甲基纖維素作為陰性對照。3. 血管通透性實驗參考Miles方法，麻醉豚鼠后切開頸部皮膚，經頸靜脈注射1ml0.5％(W/V)Evan′sBlue，30分鐘后在豚鼠背部皮內注射不同濃度的VEGF，以PBS作為陰性對照，注射的體積均為200ul，VEGF劑量范圍為10ng-100ng，15分鐘后觀察注射部位已與血漿蛋白結合的Evan′s Blue的泄漏情況。實施例2VEGF抗體的制備、純化與中和活性的測定一、試劑1. VEGF為經原核表達、純化并證實有生物活性的蛋白。2. 不完全佐劑(IFA)羊毛脂12ml(防化學院實驗化工廠)，石臘油(長沙市有機試劑廠)20ml研磨后分裝，高壓滅菌消毒，4℃保存。3. 完全佐劑(CFA)死卡介苗(衛生部北京生物制品研究所)與不完全佐劑混合，抗原與佐劑以等體積的比例相混合，死卡介苗15mg/只/次。4. 正常兔血清及羊血清均采自北京醫科大學第一附屬醫院動物中心。5. 牛血清白蛋白，華美公司。6. 溴化氫活化的Sepharose-CL-4B，Pharmacia公司。7. 二氨基聯苯胺(DAB)，Sigma公司。二、 抗體的制備1. 抗原抗原VEGF由原核表達，制備性SDS-PAGE純化，反相HPLC鑒定，純度較高且有良好的生物活性，濃度為1mg/ml，1-2mg/只/次。2. 動物新西蘭白兔購自北京醫科大學第一附屬醫院動物中心，雄性，4月齡，2.5-3Kg。3. 免疫程序及途徑首次免疫，等體積的VEGF與CFA用電動攪拌器混勻，形成油包水，于兔雙后掌及背部皮內多點注射。四周后第二次加強免疫，IFA與VEGF等體積混合，背部皮內多點注射。之后每隔一個月加強免疫一次，并于加強免疫后第10天取耳血1ml，用免疫雙擴散法測抗體效價。末次免疫10天后以免疫雙擴散法測其效價并用ELISA測抗體有效稀釋度，放血，收集血清。4. 抗體的檢測及收集將收集的血靜置于4℃內，2小時后用玻璃棒沿容器周圍輕輕分離凝血塊，收集析出的血清，-20℃凍存備用。5. 抗體的純化(1)50％飽和硫酸胺沉淀兔血清，PBS透析，最后用交聯緩沖液透析。(2)CNBr-Sepharose-CL-4B活化a稱取CNBr-Sepharose--CL-4B 1g溶于40ml1mmol/L HCl，4℃20分鐘(每克干粉可以溶脹成終體積為3.5ml的膠，而每毫生膠可與5-10mg蛋白進行結合)。b將溶脹好的膠立即置于G4漏斗中抽濾洗滌。c然后立即用交聯緩沖液200ml在G4漏斗中進行抽濾洗滌。(3)將純化及濃縮后的VEGF(1mg/ml)對碳酸交聯緩沖液(PH8.3)透析，透析后測OD280值，按每毫升溶脹的膠與5mg純化的蛋白比進行交聯。(4)置搖床(上下搖)，4℃過夜。離心1000rpm 10分鐘，上清測OD280。計算交聯率，再用5倍體積的交聯緩沖液洗滌。(5)10ml 1M乙醇胺封閉殘留的活性基團，置搖床，室溫2小時。(6)用10ml洗脫液A抽濾洗滌。(7)用10ml交聯緩沖液抽濾洗滌，檢測洗脫后的液體，此時的OD280應小于0.01。(8)用10ml洗脫液C混勻后置搖床輕搖，室溫30分鐘，測洗脫后液體的OD280應小于0.01，用PBS(pH7.4)洗滌膠至中性，加入0.1％NaN3，4℃保存，保存中的VEGF-CNBr-Sepharose-CL-4B，親和層析柱可反復使用。(9)用洗脫液洗滌已制備好的親和層析柱，檢測洗滌后液體的OD280應小于0.01。(10)血清與VEGF-CNBr-Sepharose-CL-4B混合，置搖床上下慢搖，4℃過夜。(11)PBS洗去不相關的蛋白，直至洗脫后液體的OD280小于0.01。(12)洗脫液C洗脫免抗人VEGF抗體，洗脫下的抗體立即用1MTris中和，并立即置PBS透析，分裝、保存。ISA檢測抗體的有效稀釋度并與相同濃度的未純化的血清相對比。6.酶聯免疫吸附試驗檢測抗體的滴度(1)用ELISA鋪板液稀釋純化的VEGF抗原，濃度為10ug/ml，100ul/孔，96孔板，4℃過夜。(2)0.05％Tween-20PBS洗兩次，1％BSA封閉，200ul/孔，室溫一小時。(3)洗滌液洗兩次，加入不同稀釋度的抗血清，每個稀釋度取三個平行孔，50ul/孔，室溫一小時。(4)PBS洗四次，加羊抗兔-HRP，50ul/孔，室溫一小時。(5)PBS洗四次，加底物反應液，200ul/孔，避光顯色，顯色后，加50ul/孔終止液，ELISA READER測OD492nm。三、Western-blot1. SDS-PAGE與前述方法一致。2. 跑完膠，將膠置于轉移緩沖液內浸泡5分鐘，裁剪略小于膠的硝酸纖維素膜及濾紙，硝酸纖維素膜浸在甲醇內3分。3. 膜對陽極，膠對陰級，Bio-Rad轉移電泳儀轉移蛋白，恒壓100V 10℃過夜轉移。4. PBS洗膜兩次，用2％BSA封閉，4℃過夜。5. VEGF抗血清(1∶500稀釋)孵育一小時。6. 0.05％Tween PBS洗四次，加入羊抗兔-HRP(1∶500)，室溫45分鐘。7. 0.05％Tween PBS洗四次，DAB37.5mg，H20220ul，PBS50ml顯色。四、VEGF抗體中和活性的檢測1. VEGF抗體中和VEGF內皮細胞增殖活性(1)應用第一部分內皮細胞活性測定方法進行內皮細胞的培養。(2)內皮細胞鋪于96孔板后，將10ng/mlVEGF與不同濃度已純化的抗體預孵育30分鐘后，將其加入到各孔中，孵育5天，加入3H-TdR，1uci/孔，6小時后用多頭吸樣器將其吸到玻璃濾紙上，β計數儀上進行cpm計數。2. VEGF抗體中和VEGF增強血管通透性的活性應用Miles方法，從頸靜脈注入1ml Evan′s Blue，30分鐘后，在豚鼠皮內注射已預孵育30分鐘100ng的VEGF與不同比例的VEGF抗體的混和液，注射的終體積相同，均為200ul，30分鐘后在注射部位出深淺不同的籃斑(由于染料與血漿蛋白結合后泄漏所致)。實施例3VEGF單克隆抗體的制備1.免疫程序取6-8周齡的Blab/c雌性小鼠6只，基礎免疫7-10天后，不限于皮下及皮內靜脈加強免疫一次，3-4天后用于細胞的融合，免疫時是否采用佐劑和抗原是否需要預處理，依據抗原性的強弱而定。
2.制備免疫小鼠脾細胞3.制備飼養細胞4.復蘇及培養骨髓瘤細胞將細胞從液氮中取出，放入37℃水浴中，用無血清培養液洗滌一次，加入15-20毫升小牛血清培養液，鏡下觀察細胞生長情況，融合前一天，加入飼養細胞。
5.融合按常規配制HAT，及PEG(30-50％，W/V)(1)將1毫升30-50％PEG一滴滴加入細胞團中，30-60秒內加完，并不時輕微的轉動離心管或用于輕輕的彈動離心管。
(2)在不斷的轉動離心管時加入無血清培養液1毫升，30-90秒內加完
(3)于5分鐘內慢慢的加完20毫升無血清培養液。
(4)離心500-1500rpm/M，5-10分鐘，去上清液，在10-20分鐘內加入完全培養液100毫升懸浮，輕輕的混勻。
(5)96孔板中每孔加入50-200ul(6)用5％COy溫箱中培養，加入HAT選擇性培養基(7)融合后的細胞2-3周出現雜交瘤集落(8)待集落長至1/3孔時，應用ELISA法進行抗體檢測。
6.抗體的檢測(1)用純化的VEGF包板，包板緩沖液為碳酸鹽(pH9.6)，VEGF濃度為5ug/ml，50ul/孔，4℃過夜，PBS洗板，用2％BSA封閉，室溫1小時。
(2)含0.05％Tween-20的PBS洗板，收集有雜交瘤細胞集落生長孔的上清，每孔加50ul，每個集落孔有兩個平行孔，室溫反應1小時。
(3)含0.05％Tween-20的PBS液洗板四次，加二抗(羊抗兔辣根過氧化酶1∶1000)，50ul/孔，室溫反應1小時。
(4)含0.05Tween-20的PBS夜洗板，加底物反應液，200ul/孔，避光反應，12.5％硫酸終止反應，200ul/孔。
(5)在ELISA READER上讀OD492值，本組實驗以SP/20的上清作為陰性對照，根據OD值挑選陽性孔，再進一步亞克隆。實施例4
VEGF單鏈抗體的制備一.細胞系主要采用分泌小鼠抗人血管內皮生長因子單克隆抗體3D3的雜交瘤細胞系，此雜交瘤細胞系由本所生化室自建。
二.PCR引物設計MK5 5′-CGGGATCCTCTAGACATTGTGATGACCCAGTCTCCAA-3′MK3 5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTTC(T)ATTTCCAGCTTGGTG(C)C-3′MH5 5′-GGCCGTCGACGTG(C)A(C)AGCTGGTGG(C)AGTCT(A)GG-3′MH3 5′-CCCGAATTCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTC(G)A(G)CCCCAG-3′三.測序引物設計5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3′四.載體與菌株載體PUC19，PGEMI1ZF(+)大腸桿菌XL-BLUE菌株方法(《分子克隆》第二版，7頁)1.總RNA的提取將約2×105-2×108個處于對數生長期的雜交瘤細胞離心，10000-15000rpm/m，棄上清，室溫下10-30分鐘。采用不限于異硫氫酸。Teflon等常規提取RNA的方法，然后同飽和酚攪拌，異丙醇沉淀，10000rpm-15000rpm/M，低溫下離心10-30分鐘，再用75％的乙醇洗滌，溶于用DEPC處理的水中備用。
2.逆轉錄-PCR(RT-PCR)
取5-50ug RNA，50℃-70℃變性3-10分，立即進入低溫。采用常規逆轉錄方法，40-50℃水浴30-90分鐘，100℃水浴5-10分鐘，變性AMV，在此液中加入5′3′PCR引物dNTP MgCl2Taq酶，在DNA熱循環儀上90-96℃，變性30-60秒；40-60℃，退火30-60秒；68-75℃，延伸60-90分鐘，共循環30-38圈進行DNA的擴增。PCR產物氯仿抽提一次，后進行純化。
4.DNA的回收和純化我們采用六種方法回收PCR產物(1)低溶點瓊脂糖法(2)酚凍融法(3)電洗脫法(4)透析帶電洗脫法(5)各種DNA純化的Kit回收載體片段5.PCR擴增產物的克隆純化的PCR產物及載體用相應的酶進行消化，消化的產物純化后，將片段與載體以摩爾比3-5∶1混合于10-20ul連接體系中，14-24℃進行16-24小時連接反應，轉化大腸桿菌，酶切篩選重組子。
6.感受態細胞的制備及轉化挑單個菌落接種于培養液中，37℃培養過夜，將其轉移致10倍體積的培養液中，繼續培養2小時致OD值0.5，4000rpm/M，10-20M，棄上清，將細胞懸浮在50-100MCaCl2，冰浴30-60分鐘，4000rpm/M，5-15M，再用CaCl2懸浮，冰浴中備用。
將連接產物與感受態混合，冰浴30分鐘，30-42℃熱休克3-6分鐘，冰浴2-5分鐘，加入培養液后，30-37℃培養1-2小時，取100-1000ul涂于含芐青霉素的固體培養基上，30-37℃溫箱培養過夜。
7.陽性菌落的篩選挑單個菌落于培養液中過夜培養，常規DNA提取方法提取DNA，用相應的酶進行酶切鑒定。
8.DNA序列的測定DNA序列測定采用雙脫氧方法，按USB產品說明書進行實施，用6-8％的測序膠進行電泳，電泳結束后，將膠平展于烤膠儀，抽干，壓片，暴光24-72小時，讀片。實施例5VEGF嵌合抗體的制備1.CDNA的合成富集5-10×105細胞(產生鼠抗人血管內皮生長因子的雜交瘤細胞)(《分子克隆》第二版，396頁)，PBS洗2-3次，液氮凍存或立即提取，提取RNA的方法與在單鏈抗體中RNA的提取方法相同。
RNA與引物退火50-60℃10-20分鐘，其中VL區應用OligodT為引物，VH區用反意義鏈引物。
退火后模板冰上冷卻，第一條鏈eDNA buffer，及反轉錄酶，40-50℃孵育45-90分鐘，-20℃保存，備PCR用。
PCR反應，與單鏈抗體的PCR反應一樣。
2.亞克隆與測序PCR產物用酚氯仿抽提(1)直接亞克隆于Bluescript-FA(于ECOR V處消化為平末端)(《分子克隆》第二版，280頁)ddTTP利用轉移酶接尾，連接于FA載體中。
(2)將PCR產物用適當的酶切后，克隆在Bluescript載體中。
將上述兩種連接產物轉化感受態菌，鋪氨芐青霉素(+)培養盤，挑克隆，然后酶切鑒定。
對于陽性克隆測序(應用T7DNA聚合酶雙脫氧法測序)。
3.利用突變構建克隆位點(1)將SaLI BamH I人V基因片段(2.5-3.5)從表達載體克隆入ML3mp19中，利用一突變寡聚物在118-119位氨基酸處引入Nhe I位點(《分子克隆》薩姆布盧克J，科學出版社，第二版，176頁)。
(2)構建一含有VH-VL的載體中，其中4.3Kb的含CK的SaI I-BamH I片段克隆于MI3mp19zhong1，在108-109氨基酸處引入BgI II。
(3)為使VL能在剪切后拼接于CK含鼠JK的HindIII片段克隆于M13mp19中，于JK5的3′端引入一Sal I位點。
(4)提供起動子以anti-dalsy1雜交瘤27.44中，起動子的2.2Kb長BamH I片段克隆于MI3mp18中，于-10到-5之間引入ECOR V位點。
4.重組子轉染和篩選用BSPCI消化重組DNA使之線性化，用電打孔或金屬離子沉淀法進行，所用的細胞為非分泌型骨髓瘤細胞。
將轉染的細胞置于96孔板中，1×104/孔。于48小時后加入篩選介質(篩選藥物的濃度依賴于所用的細胞株)12天后對生長的克隆的上清進行ELISA檢測重鏈(H)及輕鏈(L)的分泌。實施例6VEGF拮抗劑的篩選1.用純化的人重組VEGF(純度＞95％)鋪板，用PH9.6碳酸緩沖液作為稀釋液，VEGF的濃度為5-10ug/ml，50-200ul/孔，4℃過夜。
2.以鼠陽性血清作為陽性對照(以1∶1000倍稀釋)，以SP2/0細胞培養液作為陰性對照，50-200ul。同時每孔分別加入多抗、單抗、單鏈、嵌合、小分子肽50-200ul，室溫1小時。
3.用0.05TWEEN-20PBS液反復洗板3-6次，加入羊抗鼠辣根過氧化酶(HRP)，50-200ul/孔，室溫下反應30-60分鐘。
4.用0.05TWEEN-20PBS液反復洗板數次，配制反應底物液，37.5mgOPD+50mlPBS+20ulH2O2，200ul/孔，觀察反應，后用12.5％H2SO4終止反應。實施例7拮抗劑與放射性同位素及毒素的偶聯方法1.應用氯氨T法或Iodogen法(Colcher D.JNucl Med 1987；281924-1925)標記同位素以Iodogen法標記同位素，并經SephadeX G-50純化。
2.應用SPSD等連接劑進行毒素與VEGF抗體的偶聯。實施例8VEGF抗體對原發腫瘤生長的抑制一、動物、細胞及試劑人胃癌細胞株MGC-803由本所傳代培養。S180小鼠肉瘤細胞系由北京市腫瘤研究所藥理室王耐勤教授提供。抗VEGF多抗的制備及純化如前所述。本研究所采用的VEGF抗體均為親和層析純化。裸鼠為Balb/c Nu/nu，6-10周齡，購自北京實驗動物中心。昆明小鼠，6-8周齡，由北京市腫瘤研究所動物室提供。二、VEGF抗體對鼠源性S180肉瘤影響的設計昆明小鼠40只，隨機分為四組，每組10只，在昆明小鼠右腋皮下接種鼠S180肉瘤細胞，每只小鼠接種2×106個細胞/0.2ml，VEGF抗體分成三個劑量組50ug/只/天、100ug/只/天及200ug/只/天。以PBS作陰性對照。接種腫瘤細胞后第二天開始注射抗體，連續注射5天，觸及腫瘤后每隔三天用游標卡尺測量腫瘤的長軸(L)及短軸(W)，以1/2LW2計算腫瘤的體積。14天后處死小鼠，處死后稱小鼠瘤重。(結果見附圖5及附表1)三、VEGF抗體對人胃癌MGC803影響的設計裸鼠14只，隨機分為兩組，每組7只，在右腋皮下接種人胃癌細胞MGC803細胞，每只接種2×106/0.2ml，接種后第二天，腹腔內注射VEGF抗體，200ug/只/天，連續14天，以相同體積的PBS作為陰性對照，觸及腫瘤后每隔三天用游標卡尺測量腫瘤的長軸(L)及短軸(W)，并以1/2LW2計算腫瘤的體積，持續觀察27天處死裸鼠，處死裸鼠稱瘤重。(結果見附圖6及附表2)四、VEGF抗體與131I標記的抗胃癌單克隆抗體3H11聯合應用對胃癌細胞系MGC803裸鼠移殖瘤影響的設計
裸鼠10只，隨機分為兩組，每組5只，右腋皮下接種人胃癌細胞MGC803，每只接種2×106細胞/0.2ml。一組于接種后第一天腹腔內單純注射131I-3H11，150uci/只。另一組在注射131I-3H11的基礎上，從第二天至第15天，腹腔內注射VEGF抗體，200ug/次/天，連續14天。觸及腫瘤后每隔三天用游標卡尺測量腫瘤的長軸(L)及短軸(W)，以1/2LW2計算腫瘤體積。持續觀察36天后處死裸鼠，稱瘤重。(結果見附圖7及附表3)實施例9VEGF抗體對腫瘤轉移的抑制作用一、動物1. 采用6周齡TA2X615F1雌性小鼠，由中國醫科院腫瘤醫院動物室提供。2. 腫瘤細胞來源系一只348日齡雌性津白II型小鼠，其右側乳腺處患一腫物，呈多囊性，取原發瘤，以1∶5生理鹽水稀釋，研磨成懸液，按每只小鼠0.1ml(1×105)，接種于六周齡同源雌鼠右后側皮下進行傳代。經病理檢測證實為小鼠乳腺癌，屬Dunn分類之B型，并命名為IVTA2MA-891。3. 615小鼠自發性肺腺癌肺及淋巴結雙向轉移模型，由中國醫科院腫瘤醫院動物室提供。二、VEGF抗體抑制腫瘤轉移的設計1. 將傳代的腫瘤研磨成懸液后接種于小鼠右后腿皮下，1×105細胞/只，9天后將小鼠隨機分成三組，其中注射VEGF抗體組為7只，正常兔血清(NRS)組為4只，PBS組為8只.2. 于接種腫瘤細胞后第九天開始腹腔內分別注射VEGF抗體、NRS及PBS，其中VEGF抗體200ug/只/天，體積為0.2ml；正常兔血清(NRS)200ug/只/天，體積為0.2ml；PBS0.2ml/只/天，分別連續注射14天，注射停止三天后處死小鼠，稱瘤重、肺重，并檢測肺轉移灶數目及大小(用游標卡尺檢測轉移灶腫瘤的大小)。(結果見附表4及表5)以上生物制品可制備成各種劑型，例如膠囊、片劑、顆粒劑、口服液、注射液、局部制劑等，也可以制備成控釋劑和緩釋劑等。表1.VEGF抗體對鼠S180肉瘤的影響組腫瘤發生率瘤重(g，X±SD)抑制率(％)P值PBS 10/10 1.56±0.2150ug 10/10 1.32±0.23 15.38 ＞0.05100ug10/10 1.21±0.23 22.4 ＞0.05200ug10/10 0.92±0.11 41.0 ＜0.05表2. VEEGF抗體對人胃癌細胞MGC-803裸鼠移殖瘤的影響組腫瘤發生率 瘤重(g，X±SD)抑瘤率(％) P值PBS 7/7 2.81±0.94VEGFAb 6/6 0.68±0.28 76.15 ＜0.01表3. VEGF抗體與3H11抗體聯合應用對人胃癌細胞裸鼠移植瘤的影響組成瘤率 瘤重(g，X+SD)抑制率(％)P值131I-3H114/5 0.25±0.16131I-3H11+Anti-VEGFAb 1/5 0.04±0.08 84＜0.01表4. VEGF抗體對IVTA2MA-891模型肺轉移的影響組 肺轉移率 肺轉移數(個)抑制率(％)P值PBS 8/841.86±11.61正常兔Ig 4/450.75±6.81 ＞0.05VEGF Ab 7/711.29±3.82 73.03 ＜0.01表5. VEGF抗體對IVTA2MA-891模型肺轉移灶大小的影響組 肺轉移率 肺轉移灶直徑大于抑制率(％)P值0.5mm的比例(％)BS8/8 62.09正常兔Ig 4/4 51.16VEGF Ab 7/7 10.13 83.70 P＜0.0權利要求
1.一類治療腫瘤、血管異常增生疾患的生物制品，包括血管內皮生長因子(VEGF)、多克隆抗體、單克隆抗體，嵌合抗體、單鏈抗體，其特征在于VEGF在體內體外均有生物學活性，VEGF拮抗劑體內體外可中和VEGF抗原活性，而且體內可抑制腫瘤的生長和轉移。
2.根據權利要求1所述的VEGF，在體外可明顯刺激內皮細胞的增生，體內可增加血管的通透性及明顯促進血管形成。
3.根據權利要求1所述的一種治療腫瘤、血管異常異常增生疾患的多克隆抗體，其特征在于該抗體可特異地與VEGF抗原結合，體內體外中和VEGF的活性。
4.根據權利要求1所述的一種治療腫瘤、血管異常增生疾患的單克隆抗體，其特征在于可特異地與VEGF抗原結合，體內體外中和VEGF的活性。
5.根據權利要求4所述的單克隆抗體，其特征在于該抗體被連接在細胞毒素上。這種偶聯物能明顯抑制腫瘤生長及轉移。
6.根據權利要求4所述的單克隆抗體，其特征在于該抗體被連接在放射性同位素上，所形成的偶聯物能明顯抑制腫瘤生長及轉移。
7.根據權利要求2、3或4所述的VEGF、多克隆或單克隆抗體，其特征在于它們可用于篩選或用作鑒定VEGF的拮抗劑。
8.根據權利要求3或4所述多克隆或單克隆抗體，其特征在于二者可分別用于鑒定VEGF活性。
9.根據權利要求3所述的單克隆抗體，其特征在于可用于制備VEGF的單鏈抗體，在體內或體外均具有中和抗人VEGF活性的能力。
10.根據權利要求3所述的單克隆抗體，其特征在于可制備VEGF嵌合抗體，在體內或體外均具有中和抗人VEGF活性的能力。
全文摘要
一類治療腫瘤、血管異常增生疾患的生物制品－血管形成及血管增生抑制劑,包括有:多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體,其特征在于VEGF在體內體外均有生物活性,VEGF拮抗劑在體內體外可中和VEGF活性,而且體內可抑制腫瘤生長和轉移,臨床用于治療腫瘤、類風濕性關節炎及牛皮癬等疾病。
文檔編號A61K38/18GK1169317SQ96106550
公開日1998年1月7日 申請日期1996年6月20日 優先權日1996年6月20日
發明者董志偉, 王貴齊, 徐光煒, 湯健 申請人:中國醫學科學院腫瘤研究所