專利名稱：使用連蛋白的拮抗劑防止胰細胞丟失或再生胰細胞的方法
使用連蛋白的拮抗劑防止胰細胞丟失或再生胰細胞的方法 本發明的開發由馬里蘭巴爾的摩的馬里蘭大學支持。這里所描述的發明由來自國立衛生研究院(National Institutes of Health )的基金(DK 66630 和DK48373 )支持。政府擁有某些權利。發明領域本發明提供防止或減緩胰腺P-細胞丟失的材料和方法。進一步地，本 發明還提供再生細胞特別是胰腺(3-細胞的材料和方法。在某些方面，連蛋 白(zonulin)的拮抗劑(例如肽拮抗劑)可用于本發明的實施。發明背景I.腸緊密連接的功能和調節腸上皮代表了在外環境和內環境之間的最大界面(大于 2,000,000cm2 )。細胞間緊密連接("緊密連接，，)功能的保持會防止潛在有 害的環境因素如細菌、病毒、毒素、食物變應原和大分子穿越腸屏障。在 許多影響胃腸道的臨床病癥包括食物變態反應、腸道感染、吸收不良綜 合征和炎癥性腸病中，此功能都受到顯著^5皮壞。緊密連接(tj)或閉鎖小帶(下文中稱為"ZO")是吸收和分泌上皮 細胞的標志之一 (Madara, J!C7/"J"veW.，83:1089-1094(1989)和Madara, Tfex^ooA: o/&cre/oo^ Z)/a〃;zea， Eds. Lebenthal等人，第11章，第125-138 頁(1990)X作為頂部和基底外側隔室之間的屏障，它們選擇性地調節離子 和水溶性溶質通過細胞旁路途徑的被動擴散(Gumbiner， Jm.Ji^jw'o/., 253(CW/尸/^z'o/. 22): C749-C758 (1987))。此屏障保持所有的由與細胞間通 路相關的途徑的活動而產生的梯度(Diamond, P/yw'o/og/W, 20:10-18(1977))。上皮間傳導性的變化通常可歸結于細月包間通路(paracellular pathway ) 的通透性的改變，因為腸細胞質膜的阻力相對較高(Mardara( 1989, 1990), wpra)。 ZO代表了該細胞旁路途徑中的主要屏障，并且通過冷凍蝕刻電子顯微鏡觀察，上皮組織的阻力似乎取決于跨膜蛋白鏈的數目及其在ZO中的復雜性(Madara等人，丄CW/101:2124-2133(1985))。有充分的證據表明，曾被認為是靜止結構的ZO實際上是動態的且易 于適應各種發育環境(Magnuson等人，所o/., 67:214-224 (1978); Revd 等人，Co/d S/ n'wg //flr6or Sym尸.S/o/.， 40:443-455 (1976);和 Schneeberger等人，乂 Ce〃. Sc/. 32:307- 324 (1978))、生理學環境(GiMa 等人，Dev.說o/" 50:142-168 (1976); Madara等人， / Me附6K 5/o/， 100:149-164 (1987); Mazariegos等人， / 98:1865-1877 (1984);和Sardet等人，丄Ce//5/o/.， 80:96-117(1979 )和病理學環境(Milks等人，《/ CW/ 萬/o/" 103:2729-2738 (986)， Nash等人,/"額/.， 59:531-537 (1988);和 Shasby等人，尸/2戸W, 255 (Ce〃尸一o/， 24:C781-C788 (1988))。作為 此適應性的基礎的調節機理目前仍然不完全清楚。然而，4艮明顯，ZO的 組裝是在Ca2+的存在下的細胞相互作用的結果，所述相互作用引發最終導 致ZO成分的有組織的網絡的形成和調節的生化事件的復雜級聯，該網絡 的組成僅被部分表征(Diamond,尸/z;w'o/og/W， 20:10-18 (l977))。最近鑒定 了用于跨膜蛋白鏈的 一個候選物——閉合蛋白(occluden) ( Furuse等人，乂 MewZ^ 5/o/， 87:141-150 (1985))。在膜接觸下的細胞質膜下噬斑中，鑒定了6種蛋白質，但是它們的功 能仍然有待確定(Diamond, wpra )。 ZO-l和ZO-2與未表征的130kD的蛋 白(ZO-3)作為異源二聚體(Gumbiner等人，Proc. iVw/.」c^/. <SW, 88:3460-3464 (1991))存在于對去污劑穩定的復合物中。大部分免疫電鏡研究都精確地將ZO-l定位于膜接觸之下(Stevenson 等人,Mo/ec. Ce〃所oc&w., 83:129- 145 (1988))。另外兩個蛋白，扣帶蛋白 (cingulin ) ( Citi等人，淑臟(London), 333:272-275 (1988))和7H6抗原 (7H6 antigen ) ( Zhong等人，/ CW/所o/., 120:477- 483 (1993))被定位于 離膜更遠的地方并且尚未被克隆。Rabl3， 一個小的GTP結合蛋白最近也 被定位于連接區(Zahraoui等人，/Ce〃說o/., 124:101-115 (1994))。已知其 它的小的GTP結合蛋白用于調控皮層細胞骨架，即，rho調控粘著斑中的 肌動蛋白 -膜黏附(Ridley等人,CW/， 70:389-399 (1992))，且rac調控生 長因子誘導的膜變皺運動(Ridley等人，O//, 70:401-410 (1992))。基于與 在被更好地表征的細胞連接、粘著斑(Guan等人，；\^/we， 358:690-692 (1992))和粘著連接(Tsukita等人，Ce〃所o/., 123:1049-1053 (1993))中的斑塊蛋白的已知功能的類比，已經假定緊密連接相關性的斑塊蛋白涉及 跨細胞膜指導的信號傳導和調控與皮層肌動蛋白細胞骨架連接的信號傳 導。為應付上皮細胞所受到的許多不同的生理學和病理學的^^戰，zo必 須能夠快速、協調地做出應答，這需要復雜調控系統的參與。zo的組裝 及調控涉及的機制的準確表征是目前積極研究的領域。目前有大量證據表明，緊密連接的結構性和功能性的連接存在于肌動蛋白細胞骨架和吸收性細胞的緊密連接復合物之間(Gumbiner等人，w/ ra; Madara等人，swpra;以及Drenchahn等人，/ CW/ 5/o/.， 107:1037-1048 (1988))。肌動蛋白細胞骨架由復雜的微絲網狀結構組成，該網狀結構的精 密幾何結構由肌動蛋白結合蛋白的大型骨架來調控。肌動蛋白結合蛋白的 磷酸化狀態如何調控細胞骨架與細胞質膜連接的一個例子是豆蔻酰化的 富含丙氨酸C激酶底物(下文中稱為"MARCKS")。 MARCKS是一種具 體的蛋白激酶C (下文中稱為"PKC")底物，其與質膜的胞質面結合(Aderem, ￡/^Ww M (UK),第438-443頁(1992))。在其未被磷酸 化的形式中，MARCKS交聯于膜肌動蛋白。所以，經由MARCKS連接于 膜的肌動蛋白網絡結構有可能是相對堅固的(Hartwig等人，A^we， 356:618-622 (1992))。活化的PKC使得從膜上釋放的MARCKS磷酸化(Rosen等人， /五;cp. Med， 172:1211-1215 (1990);和Thelen等人，A^wm, 351:320-322 (1991))。結合于MARCKS的肌動蛋白有可能在空間上與膜分 開且更具可塑性。當MARCKS被去磷酸化時，它返回膜上重新與肌動蛋 白進行交聯(Hartwig等人，和Thelen等人，，ra )。這些數據提示， F-肌動蛋白網絡可能由一種涉及肌動蛋白結合蛋白(MARCKS為其中之 一)的PCK依賴性的磷酸化過程來重排。已經有多種細胞內調控因子顯示出改變tj的功能和/或結構。兩棲類動 物膽嚢(Duffey等人，Wafwe, 204:451-452 (1981))以及金魚(Bakker等人,j附.《/ 尸/2w/0/.， 246:G213-G217 (1984))和鰈(Krasney等人，Prac.,42:1100 (1983))的腸的緊密連接在細胞內cAMp升高時都顯示出增強的 對被動離子流的阻力。而且，將兩棲類動物的膽嚢暴露在Ca^離子載體下 顯示出可增強tj的阻力并誘導在tj結構中的變化(Palant等人， /尸/y^ 。/" 245:C203畫C212 (1983))。另外，由佛波西旨(phorbol ester)導致的PK C活化同時增加了腎(Ellis等人，C. j附. /尸/z;^W, 263 (i ewa/ F/"W五/e"ra/;;fe尸/^w'o/J2):F293-F300 (1992))和腸(Stenson等人，C. Am. / i^拜'o/, 265 (Gastrointest.丄/鄉尸—'o/., 28):G955-G962 (1993))上皮細 胞系的細月包間通透性(paracelluar permeability)。 IL緊密連4妄毒素(Zonula Occludens Toxin)大多數通過缺失編碼霍亂毒素(CT)的"xA基因來構建的霍亂疫苗 候選物都能引發抗體的高應答，但是超過半數的該疫苗仍會產生輕度腹瀉 (Levine等人，/mmw"., 56(1):161國167 (1988))。考慮到在CT缺失的 情況下誘發腹瀉的程度，假設霍亂菌廣Kc/z/erae 產生其它產腸毒素因子， 該產腸毒素因子仍然存在于缺失ctxA序列的菌株中(Levine et al, w/ ra )。 因此，發現了另一種由霍亂菌產生的可導致殘留腹瀉(residual diarrhea ) 的毒素緊密連接毒素(下文中稱為"ZOT，， )( Fasano等人，iVoc. A^/.爿c^/. Sc/., L^4, 88:5242-5246 (1991))。該zo/基因被定位于緊挨著cfcc基因。該 zw基因與ctx基因在霍亂菌林中高百分比的同時存在(Johnson等人，《/ C7/". M/cra6., 31(3):732-733 (1993);和Karasawa等人，F五^S Af/cro6/o/ogy 106:143-146 (1993))提示，在引發霍亂的典型急性脫水性腹瀉中ZOT可 能起協同作用。最近，在其它的腸道病原體中也已經鑒定到了 ZOT基因 (Tschape, ^4s/aw-Pac折c *S>w/7asfww ow T^/zoW /ever of/ er5W麵e〃a^， 47 (Abstr.) (1994))。先前已經發現，當在兔回腸粘膜上測試時，ZOT通過調節細胞間tj 的結構來增加腸通透性(Fasano等人，w/ ra)。已經發現，作為4務飾細胞旁 路途徑的一個結果，腸粘膜的通透性增加。還發現ZOT不影響Na+-葡萄 糖耦聯的主動轉運，無細胞毒性，且不能完全消除穿越上皮層的阻力 (transepithelial resistance ) ( Fasano等人,sw/ ra )。更近期，發現了 ZOT能夠在腸粘膜中可逆地開放tj，并且因此，當將 ZOT與治療試劑如胰島素聯合給藥時，在用于腸藥物遞送如在糖尿病的治 療中的口服劑量的組合物中，會實現所述治療試劑的腸遞送(WO 96/37196; 美國專利5,827,534;美國專利5，665，389;和Fasano等人，C7/". /騰"" 99:1158-1164 (1997):每一文獻的全部內容均引入本文作為參考)。還發現 ZOT能夠在鼻粘膜中可逆地開放tj,并且因此，當將ZOT與治療試劑聯 合給藥時，能夠增強治療試劑的鼻吸收(美國專利5,908,825，該文獻的全 部內容引入本文作為參考)。在以其全部內容引入本文作為參考的美國專利5,864,014中，已經從腸細胞系即CaCo2細胞中鑒定和純化得到了 ZOT受體。進一步地，在以 其全部內容引入本文作為參考的美國專利5,912,323中，已經從人的腸、 心和腦組織中鑒定和純化得到了 ZOT受體。該ZOT受體代表了涉及腸和 鼻的通透性調節的細胞旁路途徑的第 一步。III. 連蛋白(Zonulin)在以其全部內容引入本文作為參考的美國專利5,945,510和5,948,629 中，已經鑒定和提純得到了在免疫上和功能上與ZOT相關的哺乳動物蛋 白以及起到哺乳動物的緊密連接生理調節劑作用的哺乳動物蛋白。這些被 稱為"連蛋白"的哺乳動物蛋白對于增強治療試劑通過腸粘膜和鼻粘膜以 及穿過血腦屏障的緊密連接的吸收上是有用的。IV. 連蛋白的肽拮抗劑連蛋白的肽拮抗劑在1998年8月3日提交的未決美國專利申請No. 09/127,815中^^皮首次鑒定和描述，該申請以其全部內容引入本文作為參考， 其對應于WO 00/07609。連蛋白的肽拮抗劑可與ZOT受體結合，但并不起 到在生理上調節哺乳動物緊密連接的開放的作用。所述肽拮抗劑竟爭性地 抑制ZOT和連蛋白與ZOT受體的結合，從而抑制ZOT和連蛋白在生理上 調節哺乳動物緊密連接的開放的能力。V. 糖尿病I型糖尿病(TIDM )通常稱為胰島素依賴性糖尿病或青少年性糖尿病， 其是胰腺的自身免疫障礙。患者對負責產生胰島素的胰腺P細胞產生免疫 應答。因為p細胞的損傷，胰腺不再能產生激素胰島素。與糖尿病相關的發病率和死亡率是破壞性的。美國糖尿病個體的總數 為1570萬人。其中，100%的I型糖尿病患者和40%的II型糖尿病患者依 賴于胰島素的腸胃外給藥。按年計，與糖尿病直接相關的醫療費用超過400 億美元。另外有140億美元與勞動能力喪失、失業和早夭相關。盡管口服胰島素藥物的遞送策略是許多研究工作的焦點，但是，因為 小腸的生理特性妨礙大分子如胰島素的吸收，其中的大部分都不成功。最近，美國專利公開說明書2005/0067074 Al公開了使用連蛋白的肽 拮抗劑來防止或延遲糖尿病的發作。該公開說明書提示，疾病發展的關鍵 和早期階段在于細胞間通透性的改變，以及細胞間通透性的增加對于向糖 尿病的發展是必需的。阻斷該內源性途徑的連蛋白的肽拮抗劑顯示出可防 止糖尿病的發展。盡管存在該公開說明書的公開內容，本領域中仍然有逆轉該疾病病程的需要，例如通過再生所述的產生胰島素的(3細胞。本發 明滿足了該需要以及其它需要。發明概述在某些實施方案中，本發明提供了一種在有需要的受試者中減緩胰(3 細胞丟失的方法。這樣的方法可以包括給予所述受試者包含連蛋白拮抗劑 的組合物。連蛋白的拮抗劑可以是肽，例如包含Gly Gly Val Leu Val Gin Pro Gly(SEQIDNO: 15)序列的肽。在減緩胰卩細胞丟失的方法中使用的組合 物可以包含除連蛋白拮抗劑外的一種或更多種成分。例如，組合物可以含 有一種或更多種增強細胞生長的因子。適宜的因子包括但不限于生長因維細胞生長因子-2(BFGF:2)、角質細、胞生長因子(KGF)、肝細胞生長因子/ 擴散因子(HGF/SF)、胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)、胰高血糖素樣肽的抑制劑 (exendin-4)、胰島/十二指腸同源框-l(IDX-I)、卩-動物纖維素、激活蛋白 A、轉化生長因子-a(TGF-a)、轉化生長因子-P(TGF-(3)、胃泌素及其組合。 在某些實施方案中，本發明提供了在有需要的受試者中再生胰卩細胞 的方法。這樣的方法可以包括給予所述受試者連蛋白拮抗劑和細胞。連蛋 白的拮抗劑可以是肽，例如包含序列Gly Gly Val Leu Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO: 15)的肽。能夠促進卩細胞再生的任何類型的細胞均可使用。在某 些實施方案中，該細胞可以是分泌生長因子的細胞。在某些實施方案中， 該細胞可以是胰島細胞例如卩細胞。在某些實施方案中，該細胞可以是祖知的方法來優化。在某些實施方案中，所述拮抗劑和所述細胞可以同時給 予，而在其它實施方案中，所述拮抗劑和所述細胞不同時給予，即所述拮 抗劑可以在給予所述細胞之前或之后給予。在一個實施方案中，將所述拮 抗劑在給予所述細胞之前及之后均進行給予。在有需要的受試者中再生胰卩細胞的方法包括向受試者給予連蛋白拮 抗劑和細胞，該方法可以進一步包括給藥增強細胞生長的因子。適宜的因 子包含但不限于生長因子。適宜的生長因子的例子包含但不限于表皮生長 因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子-2(BFGF-2)、角質細胞生長因子 (KGF)、肝細胞生長因子/擴散因子(HGF/SF)、胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)、 毒封斤外泌肽-4 (exendin-4)、胰島/十二指腸同源框-l(IDX-l)、卩-動物纖維素、激活蛋白A、轉化生長因子-a(TGF-a)、轉化生長因子-p(TGF-(3)、胃 泌素及其組合。在某些實施方案中，本發明提供在有需要的受試者中再生胰P細胞的 方法，該方法包括在允許卩細胞復制的條件下向受試者給藥連蛋白的拮抗 劑。連蛋白的拮抗劑可以是肽例如包含序列Gly Gly Val Leu Val Gin Pro Gly(SEQIDNO: 15)的肽。這樣的方法可以進一步包括給予增強細胞生長 的因子。適宜的因子包含但不限于生長因子。適宜的生長因子的例子包括 但不限于表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子-2(BFGF-2)、角 質細胞生長因子(KGF)、肝細胞生長因子/擴散因子(HGF/SF)、胰高血糖素 樣肽-l(GLP-l)、毒蜥外泌肽-4 ( exendin-4 )、胰島/十二指腸同源框 -l(IDX-l)、 (3-動物纖維素、激活蛋白A、轉化生長因子-a(TGF-a)、轉化生 長因子-(3(TGF-p)、胃泌素及其組合。在某些實施方案中，本發明提供在有需要的受試者中再生胰P細胞的 方法，該方法包括向受試者給予連蛋白拮抗劑并向受試者植入細胞。連蛋 白拮抗劑可以是肽，例如包含序列Gly Gly Val Leu Val Gin Pro Gly (SEQ ID在某些實施方案;，'這些細胞可以包含分泌生長因子的細胞。在U些實施 方案中，所述細胞可以是胰島細胞，例如所述細胞可以包括卩細胞。在某 些實施方案中，所述細胞可以包括祖細胞例如干細胞。給予拮抗劑和植入 細胞的時間可以使用本領域技術人員所熟知的方法進行優化。在某些實施 方案中，可在同一時間給予拮抗劑并植入細胞，而在其它實施例中，給予 拮抗劑和植入細胞不同時進行，即所述拮抗劑可以在所述細胞植入之前或 之后給予。在一個實施方案中，將所述拮抗劑在細胞植入之前和之后均給 予。在某些實施方案中，在有需要的受試者中再生胰(3細胞的方法包括向 受試者給予連蛋白拮抗劑并在所述受試者中植入細胞，該方法可以進一步 包括給予增強細胞生長的因子。適宜的因子包含但不限于生長因子。適宜長因子-2(BFGF-2)、角質細、胞生長因子(KGF)、肝細胞生長因子/擴散因子 (HGF/SF)、胰高血糖素樣肽-l(GLP-I)、毒蜥外泌肽-4 (exendin-4)、胰島/ 十二指腸同源框-l(IDX-I)、 p-動物纖維素、激活蛋白A、轉化生長因子 -a(TGF-a)、轉化生長因子-(3(TGF-p)、胃泌素及其組合。在某些實施方案中，可給予因子并同時植入細胞，而在其它實施方案中，給予因子和植入 細胞不同時進行，即所述因子可以在所述細胞才直入之前或之后給予。在一 個實施方案中，將所述因子在細胞植入之前和之后均給予。本發明提供通過給藥化合物來治療自身免疫疾病的方法，所述化合物 防止解剖學屏障通透性的增加。防止解剖學屏障通透性增加的化合物可以 是增加解剖學屏障通透性的常規生理化合物的拮抗劑。用于治療自身免疫疾病的適宜化合物的一個例子為連蛋白拮抗劑。可以用一種防止解剖學屏 瀉、原發性膽汁性肝硬化、IgA腎病、韋格納肉芽腫病、多發性硬化癥、I型糖尿病、類風濕性關節炎、克羅恩病(Crohn's disease )、紅斑狼瘡、橋 本曱狀腺炎(曱狀腺功能減退)、格雷夫斯氏病(Graves'disease,曱狀腺功能 亢進)、自身免疫性肝炎、自身免疫性內耳病、大皰性類天皰瘡、視神經脊 髓炎(德維奇綜合征，Devic's syndrome)、古德帕斯丘綜合征、蘭-伊月幾無 力綜合征癥(LEMS)、自身免疫性淋巴增生性綜合征(ALPS)、副癌綜合征、 多腺體自身免疫綜合征(polyglandular autoimmune syndromes, PGA)和斑 禿。從下文提供的本發明的詳細描述來看，本發明的這些目的以及其它目 的將是明顯的。附圖的簡要說明

圖1顯示從多種人體組織和IgM重鏈中純化得到的連蛋白的N端序 列與ZOT的生物活性片段(氨基酸288-399)的N端序列的比較。圖2顯示與陰性對照相比，將ZOT、連蛋白i、連蛋白h單獨使用(以 填充柱(closed bars)表示)或者與肽拮抗劑FZI/O聯合使用(以無遮蓋 的柱(open bars )表示)聯合或者與FZI/1聯合使用(以陰影柱(shaded bars ) 表示)，對安》文于尤斯室(Ussing chamber)中的兔回腸組織阻力(tissue resistance ) ( Rt)的作用。N等于3-5;承表示p〈0.01。圖3顯示在糖尿病易感性和糖尿病抗性的大鼠腔內連蛋白的濃度 (ng/ml),該濃度是使用夾心ELISA分析來測定的。樣本是通過使用生理 鹽水灌洗腸道來得到的。每一情形中的第一個柱表示糖尿病抗性大鼠 (DR)，第二個柱表示糖尿病易感性動物(DP),第三個柱表示慢性糖尿病大 鼠(CD)。 <9%的糖尿病易感性大鼠未患糖尿病，且大約9%的糖尿病抗性的大鼠發展成糖尿病。圖4顯示了用于本研究的發展為糖尿病的大鼠的百分數。圖5顯示了使用夾心ELISA分析測定的在患糖尿病大鼠中的腔內連蛋 白的濃度(ng/ml)。圖6顯示了糖尿病抗性(DR)大鼠、在尤斯室中測定的未經治療的糖尿 病易感性大鼠(DR-未治療，第二個柱)和以連蛋白肽拮抗劑治療的糖尿病 易感性大鼠(DR-治療，第三個柱)的體外腸通透性。承表示p0.05， **表示 p<0.05且與DR-治療相比pO.OOOl。圖7顯示已發展為糖尿病或未發展為糖尿病的未經治療的糖尿病易 感性大鼠的小腸的體外腸通透性。*表示p<0.4。圖8是顯示異常的緊密連接的通透性如何在I型糖尿病的發生和發展 中起作用的示意圖。圖9顯示了未使用連蛋白抑制劑AT1001治療或使用連蛋白抑制劑 AT1001治療的BBDP大鼠的經蘇木精和曙紅染色的胰腺切片。對于從未 經治療的發生I型糖尿病(T1D)的大鼠(上方組)和經AT1001治療的未發 生T1D的大鼠(下方組)分離的胰腺均進行組織學分析。在左方組(10 倍放大)中由箭頭指示的胰島細胞在右方組中被顯示為更高的放大倍數 (40倍)。未經治療的動物顯示出I型糖尿病(T1D)的典型末期胰島損 傷，而經過治療的動物顯示出無胰島炎的血管周圍炎癥跡象。圖10顯示了未使用連蛋白抑制劑ATIOOI治療和使用連蛋白抑制劑 ATIOOI治療的BBDP大鼠的胰島染色。對于從未經治療的發生T1D的 BBDP大鼠(上方組)和以ATIOOI治療的未發生T1D的大鼠(下方組) 分離的胰腺進行免疫組織學分析。發生T1D的大鼠的胰島顯示出典型的無 胰島素染色的塌陷面(collapsed aspect) (A)以及被保存的產生胰高血糖 素的5細胞群(B)。與之相反，經ATIOOI治療的動物顯示出被保存的胰 島，在該胰島的核心處有可檢測到的產生胰島素的(3細胞(C),且在其邊 緣處有產生胰高血糖素的5細胞(D)。然而，5細胞的染色未顯示出一致 性，偶爾會出現多細胞層(見箭頭)。IO倍放大。圖11顯示了分離自未經治療的發生了 T1D的BBDP大鼠(A組和B 組)以及經ATIOOI治療的未發生T1D的大鼠(C-F組)的胰l^的免疫組 織化學信息。來自于發生了 TID的大鼠的胰島顯示出典型的無胰島素染色 的塌陷面(collapsed aspect) (A)以及被保存的產生胰高血糖素的5細胞群(B)。與之相反，經AT1001治療的動物顯示出其胰島或者未受損傷(C 和D)或是從特征在于產生胰島素的細胞和產生胰高血糖素的細胞(E和 F)之間邊界不規則性的胰島炎損傷中恢復的現象。這些發現與正在發生 的胰島炎的異常終止是相一致的。IO倍放大。圖12顯示了分離自經AT1001治療的未發生T1D的大鼠的胰腺的免 疫組織化學信息。該胰島出現了由顯示出不規則輪廓的胰島內和胰島周圍 的癥痕造成的扭曲。可以看到從胰島炎損傷中恢復的跡象，且所述跡象的 特征在于，在胰島素(A和C)與胰高血糖素(B和D)產生性細胞(E 和F)之間邊界的不規則性。這些發現與正在發生的胰島炎的異常終止相 一致。圖13顯示了以AT-1001治療自身免疫性糖尿病的研究結果。圖13是 將未經治療的動物(》)相對于經治療的動物O)進行比較的以非糖尿病動物 的百分比相對于時間的函數來描繪的無糖尿病存活率圖。使用BB/worDP 大鼠，在血清轉化后開始治療。60%的未經治療的大鼠發生了 T1D,而僅 有35%的經AT1001治療的動物發展為T1D。安慰劑組的T1D平均發病年 齡為85.4±10.4天，而治療組為86.0± 10.3天。起始研究階段用T0表示， 從第120天起用Tl表示。圖14A和14B顯示了以AT-1001治療自身免疫性糖尿病的研究結果。 圖14A和14B是顯示在治療期間內自身抗體變化的柱形圖。圖14A顯示 發生了 T1D的動物中的抗谷氨酸脫羧酶(GAD)抗體。圖14B顯示發生 了 T1D的動物中的抗GAD抗體。圖15A和15B顯示以AT-1001治療自身免疫性糖尿病的研究結果。 圖15A和15B是顯示在治療期間內血清連蛋白水平變化的柱形圖。圖15A 顯示發生了 T1D的動物中的連蛋白水平。圖15B顯示發生了 T1D的動物中 的連蛋白水平。發明詳述如上面所討論的，在各種實施方案中，本發明提供在有需要的受試者 中減緩胰P -細胞的丟失、防止胰P -細胞的丟失和/或再生胰|3 -細胞的材料 和方法，所述材料和方法是通過，尤其是，向需要減緩胰P-細胞的丟失、 防止胰P -細胞的丟失和/或再生胰P -細胞的受試者給予藥學有效量的連 蛋白拮抗劑。 一般地，適合用于本發明的拮抗劑能與緊密連接毒素(ZOT)受體結合，但是并不能在生理上調節哺乳動物緊密連接的開放。在某些實 施方案中，所述連蛋白拮抗劑可以是肽。將術語"拮抗劑，，定義為一種防 止、抑制、減少或逆轉由激動劑(即連蛋白)引起的應答的化合物。在一 個實施方案中，本發明提供在有需要的受試者中減緩胰P-細胞的丟失、防 止胰P -細胞的丟失和/或再生胰P -細胞的材料和方法，所述材料和方法是 通過，尤其是，給予需要減緩胰P-細胞的丟失、防止胰P-細胞的丟失和/ 或再生胰P-細胞的受試者以藥學有效量的連蛋白拮抗劑，其中，所述拮抗 劑能與緊密連接毒素(ZOT)受體結合，但是不能在生理上調節哺乳動物 緊密連接的開放。這里使用的再生胰(3 -細胞是指增加胰(3 -細胞的數目。再生可能需要 將一種或多種細胞引入(如植入)受試者中。細胞(如l3-細胞、干細胞等) 的移植在本領域中是已知的。例如，美國專利No.6,703，017 (在此具體地 將該專利引入本文作為參考，尤其是實施例1-3)公開了移植胰島生成性 干細胞、胰島祖細胞和胰島樣結構。Soon-Shiong等人(/VocA^/A^fi^cz-aS^. 90(12):5843-7， (1993))描述了通過注射經免疫保護的胰島來長期逆轉 糖尿病。干細胞的分離在本領域中是已知的。例如，在美國專利申請公開了朗格漢斯(langerhans )胰島干細胞的分離及其在治療糖尿病中的用 途。再生胰P -細胞還可以包括提供使得已存在于胰腺中的|3 -細胞可以復 制的條件。例如，已經證明，成人胰P-細胞保留了明顯的在體內增殖的能 力，因此，通過提供促進增殖的條件，可以使胰(3-細胞再生(Dor等人， 胸群，429:41 -46 (2002》。在本文中使用的受試者是接受本發明拮抗劑的任何動物如哺乳動物。 受試者包括但不限于人。本實驗已經證明，自身免疫疾病例如I型糖尿病的發生是基于3個因 素1)遺傳易感性；2)滲漏的解剖學屏障；和3)反復的環境損害。使用 本發明的材料和方法有可能通過給予一種或更多種降低一種或更多種解 剖學屏障通透性的化合物來治療自身免疫性疾病。如下所示，拮抗能增強 解剖學屏障通透性的常規生理學化合物活性的化合物的給藥可以用于治療自身免疫性疾病。例如連蛋白是增強解剖學屏障腸上皮的通透性的常規 生理學化合物。通過給予連蛋白拮抗劑，可以維持或降低解剖學屏障的通 透性，從而防止或治療自身免疫性疾病I型糖尿病。滲漏的解剖學屏障導致疾病發生的自身免疫性疾病的例子是I型糖尿 病。不希望束縛于理論，相信異常的腸通透性在I型糖尿病的發病機理中 起重要作用。參考圖8，非自身抗原(正方形和三角形)存在于連蛋白系統(圓圏=連蛋白，細胞上的T形結構為連蛋白受體)失調的受試者的腸 腔(l)中并穿過tj屏障(2-3)。抗原肽結合到存在于APC表面上的HLA 受體(4)。這些肽又被呈遞到T淋巴細胞(5)。在遺傳易感性的個體中， 異常的免疫應答(包括體液免疫應答和細胞介導的免疫應答)(6)導致主 要標靶于帶有I型糖尿病典型的后續性胰島素缺乏的朗格漢斯 (Langherans )胰島(7 )的自身免疫過程。下文提出的證據證明了通過控 制解剖學屏障的通透性，有可能逆轉疾病進程和再生受損害的胰島。因此，本發明提供了通過給予防止解剖學屏障通透性增加的化合物來治療自身免疫性疾病的方法。防止解剖學屏障通透性增加的化合物可以是 增加解剖學屏障通透性的正常生理化合物的拮抗劑。適宜的用于治療自身免疫性疾病的化合物的一個例子是連蛋白拮抗劑。可將連蛋白的任何拮抗劑用于本發明的實施。這里使用的連蛋白拮抗 劑是可與連蛋白受體結合并且防止、抑制、減少或逆轉由連蛋白引發的應 答的任何化合物。例如，本發明的拮抗劑可以包括連蛋白的肽拮抗劑。肽 拮抗劑的例子包括但不限于包含選自如下的氨基酸序列的肽Gly Arg Val Cys Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO:l),Gly Arg Val Cys Val Gin Asp Gly (SEQ ID NO:2),Gly Arg Val Leu Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO:3)，Gly Arg Val Leu Val Gin Asp Gly (SEQ ID NO :4),Gly Arg Leu Cys Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO:5),Gly Arg Leu Cys Val Gin Asp Gly (SEQ ID NO:6),Gly Arg Leu Leu Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO:7),Gly Arg Leu Leu Val Gin Asp Gly (SEQ ID NO:8),Gly Arg Gly Cys Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO:9),Gly Arg Gly Cys Val Gin Asp Gly (SEQ IDNO: 10),Gly Arg Gly Leu Val Gin Pro Gly (SEQ IDNO: 11),Gly Arg Gly Leu Val Gin Asp Gly (SEQ IDNO: 12),Gly Gly Val Cys Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO: 13),Gly Gly Val Cys Val Gin Asp Gly (SEQ ID NO: 14),Gly Gly Val Leu Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO: 15),Gly Gly Val Leu Val Gin Asp Gly (SEQ ID NO: 16),Gly Gly Leu Cys Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO: 17),Gly Gly Leu Cys Val Gin Asp Gly (SEQ ID NO: 18),Gly Gly Leu Leu Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO: 19),Gly Gly Leu Leu Val Gin Asp Gly (SEQ ID NO:20)，Gly Gly Gly Cys Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO:21),Gly Gly Gly Cys Val Gin Asp Gly (SEQ ID NO:22),Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO:23),和Gly Gly Gly Leu Val Gin Asp Gly (SEQ ID NO:24)當拮抗劑為肽時，可使用任何長度的肽。通常，肽拮抗劑的氨基酸長 度的大小范圍可以是約6到約100、約6到約90、約6到約80、約6到 約70、約6到約60、約6到約50、約6到約40、約6到約30、約6到約 25、約6到約20、約6到約15、約6到約14、約6到約13、約6到約12、 約6到約11、約6到約10、約6到約9或約6到約8。本發明的肽拮抗劑 的大小可以是氨基酸長度為約8到約100、約8到約90、約8到約80、約 8到約70、約8到約60、約8到約50、約8到約40、約8到約30、約8 到約25、約8到約20、約8到約15、約8到約14、約8到約13、約8到 約12、約8到約11個或約8到約10個氨基酸。本發明的肽拮抗劑的氨基 酸長度可以是約10到約100、約10到約90、約10到約80、約10到約 70、約10到約60、約10到約50、約10到約40、約10到約30、約10 到約25、約10到約20、約10到約15、約10到14、約10到約13或約 10到約12。本發明的肽拮抗劑的氨基酸長度可以是約12到約100、約12 到約90、約12到約80、約12到約70、約12到約60、約12到約50、約 12到約40、約12到約30、約12到約25、約12到約20、約12到約15 或約10到約14。本發明的肽拮抗劑的氨基酸長度可以是約15到約100、 約15到約90、約15到約80、約15到約70、約15到約60、約15到約 50、約15到約40、約15到約30、約15到約25、約15到約20、約19 到約15、約15到約18或約17到約15個氨基酸。該公4口的^支術例^口4葛述于///g/z尸er/or附a"ce Zi《m'(i C7zrawatograp/z_y o/ 戶印"'cfes朋d /Voto7w: iSe戸ra"o"爿加/戸、Co"/b，a"o"， Eds. Mant等人，C.R.C. Press (1991)中的技術，所述的肽合成儀例如Symphony (Protein Technologies, Inc)，或通過使用DNA重組體技術獲得所述的肽拮抗劑，即 將編碼所述肽的核苷酸序列插入到適宜的表達載體如大腸桿菌或酵母表 達載體中，在各自的宿主細胞中表達并且使用公知的技術從其中純化。可以將所述拮抗劑(如肽拮抗劑)以用于小腸遞送的口服劑型組合物 進行給藥。這樣的用于小腸遞送的口服劑型組合物在本領域中是公知的， 并且通常包括胃耐受性的(gastroresistent )片劑或膠嚢(i em/"gtow'j ■P/jormaceWca/ 5Wewc&s,第16版,Eds. Osol, Mack Publishing Co.,第89 章(1980); Digenis等人，乂尸/z麵.5W.， 83:915-921 (1994); Vantini等人, C7/"/<%z rera; ew"ca, 145:445-451 (1993); Yoshitomi等人，CTze附.5w〃" 40:1902-1卯5 (1992); Thoma等人，尸/wrmaz&, 46:331-336 (1991); Morishita 等人，Z>Mg Z)&s/g" Z)Wveo;, 7:309-319 (1991);以及Lin等人，戶W應固"ca/細.，8:919-924 (1991),每一文獻均全文引入本文作為參 考)。本發明的胃耐受性的片劑或膠嚢優選在腸液中溶解。通過添加如醋酸鄰苯二曱酸纖維素或醋酸對苯二曱酸纖維素，可制成 胃耐受性的片劑。術語"胃耐受性的"是指一種組合物，其在pH小于5 的胃液或者pH小于5的模擬胃液中于60分鐘內釋放的連蛋白效應物小于 該組合物中連蛋白效應物總重的30%。膠嚢是固體劑型，其中所述拮抗劑(如肽拮抗劑)被包封于硬的或軟 的可溶性容器或明膠外殼中。用于制造膠嚢的明膠是從膠原材料通過水解 獲得的。有兩種類型的明膠A型，通過酸處理來源于豬皮；和B型，通 過堿處理獲得自骨頭和動物皮膚。硬明膠膠嚢的使用允許在認為對個體受 試者最佳的精確劑量水平下，在使用單獨的拮抗劑(例如肽拮抗劑)或其 組合間進行選擇。石更明膠月交嚢由兩個部分組成，其中一部分套在(slipping over)另一部分上，因此完全包圍著所述的拮抗劑(例如肽拮抗劑)。這些 膠嚢是通過下述方法填充的將所述拮抗劑(如肽拮抗劑)或含有所述拮 抗劑(如肽拮抗劑)的胃耐受性的珠粒引入所述膠嚢的較長端，而后蓋上 蓋子。硬明膠膠嚢大部分由明膠、FD&C著色劑制成，有時會加入不透明 劑如二氧化鈦。美國藥典(USP )允許用于此目的的明膠含有0.15% ( w/v ) 的二氧化硫從而防止在制造過程中的分解。在本發明的上下文中，用于小腸遞送的口月良劑型組合物還包括液體組 合物，該液體組合物中含有防止所述拮抗劑(如肽拮抗劑)在胃中被胃液嚴重失活的水性緩沖試劑，從而使拮抗劑(如肽拮抗劑)以活性形式到達 小腸。可以用于本發明的這種水性緩沖試劑的例子包括碳酸氬鹽緩沖劑(pH為5.5-8.7,優選約pH7.4 )。當所述口服劑型組合物為液體組合物時，優選將所述組合物剛好在給 藥前制備從而將穩定性問題最小化。在此情況下，可以通過將凍干的拮抗 劑(如肽拮抗劑)溶解于水性的緩沖劑中來制備所述液體組合物。一般地，這里使用的含有連蛋白拮抗劑(如肽拮抗劑)的組合物包含 藥學上有效量的拮抗劑。拮抗劑(如肽拮抗劑)的藥學有效量可以根據例 如個體的病況、年齡、性別和體重的因素而變化。可以調整給藥方案以提 供最佳的治療反應。例如，可以單個丸劑給藥，可以若千分開的劑量按時 間給藥或將所述劑量根據治療狀況的緊急需要的指示來按比例地減少或 增加。特別有利的是，以劑量單位形式來配制腸胃外組合物，從而使給藥 簡化及劑量均一。這里使用的劑量單位形式是指適合作為用于被治療的哺 乳動物受試者的均一劑量的物理上離散的單位，每個單位均含有與所需要 的藥物載體相結合的經計算以產生所期望的治療效果的預定量的活性化 合物。本發明的劑量單位形式的規格取決于且直接依賴于(a)所述活性 化合物的獨特性質及所要取得的特定的治療效果，和(b)在配合這樣的 活性化合物的技術領域中對于個體中的敏感性治療的固有局限性。通常，本發明中使用的拮抗劑化合物的量(例如用于減緩胰P -細胞的 丟失、用于防止胰|3 -細胞的丟失和/或用于再生胰P -細胞)是在約7.5 jiM 到7.5 mM范圍內，優選為約7.5 到0.75 mM。為了在例如腸道或血 液中獲得這樣的最終濃度，在本發明的單一劑量組合物中拮抗劑(例如肽 拮抗劑)的量一般為按每千克受試者體重計約50ng到約10pg、約250 ng 到約10pg、約500ng到約10嗎、約lpg到約10pg、約2pg到約10嗎、 約3jig到約10jag、約4pg到約10pg、約5pg到約10lig、約50ng到約5jig、 約250ng到約5pg、約500ng到約5pg、約lpg到約5jig、約2pg到約5嗎、 約3嗎到約5pg、約4嗎到約5嗎、約50ng到約3pg、約250 ng到約3pg、 約500ng到約3pg、約ljig到約3]ug或約2pg到約3pg。本發明的組合物可以包含一種或更多種藥學上可接受的載體。這里使 用的"藥學上可接受的載體"包含任何及所有生理相容性的溶劑、分散介 質、包衣、抗菌劑和抗真菌試、等滲和吸收延遲劑等。在一個實施方案中， 所述載體適合用于腸胃外給藥。載體可以適合給藥至中樞神經系統(例如脊柱內或腦內)。可選擇地，所述載體可以適合靜脈內、腹腔內或月幾肉內 給藥。在另一個實施方案中，所述載體適合口服給藥。藥學上可接受的載 體包括無菌水溶液或分散體和用于臨時配制無菌可注射溶液或分散體的 無菌粉末。這種用于藥學上活性物質的介質和試劑的使用在本領域中是眾 所周知的。除非任何常規介質或試劑與所述活性化合物不相容，其在本發 明藥物組合物中的使用是被期待的。補充的活性化合物也可以摻入組合物 中。以下的實施例僅僅為說明的目的而提供，并且不以任何方式意在限制 本發明的范圍。實施例1連蛋白的肽拮抗劑考慮到ZOT、人腸內連蛋白(連蛋白i)和人心臟連蛋白(連蛋白h)均作用 于腸(Fasano等人，G"Wrae"化ra/ogy, 112:839 (1997); Fasano等人，乂 C7/". /"ve" 96:710 (1995)和內皮tj,并且所有這三者都具有相似的局部作用 (Fasano等人，(1997),這符合ZOT受體在腸內的分布(Fasano等人，(1997)， 和Fasano等人，(1995), wpra),在1998年8月3日提交的序列號為 09/127,815的美國專利申請中假設這三種分子與相同的受體結合位點相互 作用。因此，對ZOT和人連蛋白的一級氨基酸結構進行了比較從而提供 對涉及腸tj調節的受體-配體相互作用對絕對結構要求的認識。這些分子N 端的分析顯示存在如下共同基序(圖1中框出的氨基酸殘基8-15):非極 性的(腸中為Gly,腦中為Val)、可變的、非極性的、可變的、非極性的、 極性的、可變的、才及性的(Gly)。 8位的Gly、 12位的Val及13位的Gln, 所有這些在ZOT、連蛋白和連蛋白h中是高度保守的(見圖1),這被認為 對于在腸中受體結合功能是關鍵性的。為了證實上述結論，化學合成了合 成八肽Gly Gly Val Leu Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO: 15)(將其命名為 FZI/O,對應于人胎兒連蛋白的第8-15位氨基酸殘基)。接下來，如下所述，將安放于尤斯室中的兔回腸單獨地暴露于100昭的 FZI/O (SEQ ID NO:15)、 100昭的FZI/1 (SEQ ID NO:29)、 1.0昭的 6xHis-ZOT(如在1998年8月3日提交的序列號為09/127,815的美國專利 申請的實施例1中所述的那樣獲得)、l.O):ig的連蛋白j(如在1998年8月 3日提交的序列號為09/127,815的美國專利申請的實施例3中所述的那樣獲得)或1.0昭的連蛋白h (如在1998年8月3日提交的序列號為 09/127,815的美國專利申請的實施例3中所述的那樣獲得)；或者預先將其 暴露于100嗎的FZI/O或FZI/1中20分鐘，此時加入1.0嗎的 6xHis-ZOT、 1.0昭的連蛋白j或1.0嗎的連蛋白h。由Rt-PD/Isc計算得 出ARt，其中PD-電位差，Isc-短路電流。結果在圖2中示出。如圖2所示，FZI/O未誘發Rt的任何顯著變化(與陰性對照相比為 0.5% )(見填充柱)。與此相反，以FZI/O預先處理20分鐘分別4吏得ZOT、 連蛋白i、連蛋白h對Rt的作用降低了 75%、 97°/。和100%(見未遮蓋柱)。 同樣如圖2所示，當使用第二種合成肽(FZI/1, SEQ ID NO:29)時，這種抑 制作用被完全消除(見陰影柱)，所述第二種合成肽是通過將8位的Gly、 12位的Val和13位Gln (參照連蛋白；)用連蛋白b的相應氨基酸殘基(分 別為Val、 Gly和Arg,見SEQ ID NO: 30 )改變來化學合成的。以上結果 證明，在ZOT與連蛋白家族的N末端的8位和15位殘基間存在一種區域 跨越(region spanning ),此種區域跨越對于與耙受體的結合是關鍵性的， 并且在8、 12和13位上的氨基酸殘基決定了這種結合的組織特異性。實施例2糖尿病大鼠模型腸通透性的改變已經顯示出是與糖尿病的發病相關的前期生理變化 之一(Meddings, Jm. J! i^;w'o/， 276:G951-957 (1999))。細胞間轉運和腸通透 性是由細胞內tj經由尚未完全闡明的機制來調節的。連蛋白及其原核細胞類似物ZOT 二者均通過調節tj改變腸通透性。 在此實施例中，首次證實了連蛋白相關的tj損傷涉及糖尿病的發病機理； 以及通過給予連蛋白的肽拮抗劑來預防糖尿病或延緩糖尿病的發病。最初，評估了兩種遺傳品種，即BB/Wor糖尿病易感性(DP)大鼠和 糖尿病抗性(DR)大鼠(Haber等人，J! C"". /騰W" 95:832-837 (1993))，以 確定它們是否呈現出連蛋白腔內分泌和腸通透性的顯著改變。更具體地，處死年齡匹配的DP和DR大鼠(年齡為20，50,75,和>100 天)。將所述大鼠處死后，將25G的針置于回腸腔內，使用林格溶液來進 行灌洗腸道以確定腔內連蛋白的存在。連蛋白濃度是使用如下的夾心酶聯 免疫吸附測定法(ELISA)來評估的將塑料樣i量滴定才反(Costar, Cambridge, MA )以多克隆兔抗ZOT抗體(如在1998年8月3日提交的序列號為09/127,815的美國專利申請的實 施例2中所述的那樣獲得)(稀釋度1:100 )包被，于4。C過夜，用含有0.05% (v/v)吐溫20的PBS洗滌3次，然后在室溫下用300 pl含有0.1% (v/v)吐 溫20的PBS孵育15分鐘來阻斷。接下來，將純化的人腸連蛋白(如在 1998年8月3曰4是交的序列號為09/127,815的美國專利申請的實施例3 中所述的那樣獲得)包被于平板上。通過將連蛋白在含有0.05% (v/v)吐溫20的PBS中稀釋至不同濃度來 得到標準曲線，所述的不同濃度為0.78 ng/ml， 1.56 ng/ml， 3.125 ng/ml， 6.25 ng/ml， 12.5 ng/ml, 25 ng/ml和50 ng/ml。將每一標準濃度的樣本各100 pl或100 (il腸道灌洗樣本用吸量管轉移 至孔中，使用平板搖床在室溫下孵育1小時。使用PBS洗去未被結合的連 蛋白，將所述孔于室溫下與10(^1用堿性磷酸酯偶聯的抗ZOT抗體孵育1 小時。用PBS洗掉未結合的偶聯物，并通過下述方法進行顯色反應首先 加入在0.1 M Tris-HCl (pH 7.3)、 1.0 mM MgCl2、 1.0% (w/v) BSA中1/20000 稀釋的Extra-Avidin (SIGMA, St. Louis， MO) 100^1經過15分鐘，然后將每 一孔用IOOjliI含有1.0 mg/ml對硝基苯基磷酸酯底物(SIGMA, St Louis, MO)的溶液于37。C下孵育30分鐘。使用酶免疫分析讀出器(enzyme immunoassay reader )在405nm處讀耳又吸光度。為了評估ELISA夾心法的批內和批間的精確性，使用來自于含有不同 濃度連蛋白的兩個樣本的連續三天的三個重復數據來計算出變異系數 (CV)。 ELISA夾心法的批間測試得到的CV值為9.8%。批內測試的CV值 為第一天4.2%,第二天3.3%和第三天2.9%。將在腸道灌洗中檢測的連蛋白濃度以ng/mg蛋白表示，并通過暴露表 面積(mm2)來標準化。結果顯示于圖3。如圖3所示，首先觀察到在糖尿病易感性大鼠(年齡為50天)中腔 內連蛋白的4倍增長(第二個柱)。發現腔內連蛋白的增加與腸通透性的 增加相關。這種腔內連蛋白的增加在糖尿病易感大鼠中保持在高水平，且 發現其與向完全的糖尿病的發展相關。值得注意的是，糖尿病易感性大鼠 (年齡為IOO天)的腔內連蛋白沒有增加。這是值得注意的，因為該大鼠 未發展為糖尿病。該大鼠的血糖水平正常。因此，連蛋白與I型糖尿病的 發病機理相關的通透性變化有關。該連蛋白分泌的增加是年齡相關性的， 并可引致糖尿病的發病。接下來，為了證實糖尿病可以通過給藥連蛋白的肽拮抗劑來預防，將獲得自Biomedical Research Models, Inc. (Rutland, MA)的BB/Wor大鼠(年 齡21-26天)隨機分為兩組(每組n = 5),即治療組和對照組。兩組都維 持使用大鼠祠料的標準食語(standard diet of rat chow) (Harlan Teklab Diet #7012)。所有的食物和水都預先進行高壓滅菌。每天供給100ml清水，并 測量日飲水量。治療組接受添加在飲水中的10嗎/ml連蛋白肽拮抗劑 (SEQIDNO : 15)。將大鼠裝在高效空氣過濾器(hepa-filter)籠里。對所述大鼠中的糖尿病診斷如下將大鼠每周稱重兩次。每周使用 OneTouch⑧葡萄糖監測系統(Johnson & Johnson)來測定血糖。每周使用驗 尿試紙條來監測葡萄糖(Diastix⑧)和酮類(Ketositx⑧)(Bayer)。將血糖>250 mg/dl的大鼠禁食過夜，并且將血糖水平>200 mg/dl的大鼠認為是糖尿病 患者。這些規范與由Biomedical Research Models Inc.提供的數據一致。結 果示于圖4。如圖4所示，80%的對照組大鼠(4/5)和40%的經連蛋白肽拮抗劑治 療的大鼠(2/5)在年齡為80天時發生了糖尿病。連蛋白分泌的變化與糖 尿病的發病平4亍。在糖尿病臨床癥狀出現后，將大鼠如下處死用鹽酸氯苯胺麻醉大鼠， 并切割能夠進入心臟的正中切口。將18G針置于心臟，并通過》文血來致死。 然后，如上所述進行連蛋白分析。至于未出現糖尿病的大鼠，所述研究在 年齡為80天時截止。才艮據生物醫學研究模型7>司(Biomedical Research Models, Inc.), 80%的糖尿病易感性大鼠在年齡為80天時出現糖尿病。連 蛋白分析的結果示于圖5。如圖5所示，觀察到未用連蛋白肽拮抗劑治療的患糖尿病大鼠的腔內 連蛋白增加，這與圖3中示出的結果一致。進而，與未發生糖尿病的糖尿 病易感性大鼠(DP-treated)和對照(DP-untreated)大鼠相比，發生糖尿病的 大鼠(DR)的腔內連蛋白增加了 2到4倍。未發生糖尿病的非糖尿病對照 大鼠的連蛋白水平可以忽略，與圖3中示出的連蛋白水平一致。此外，兩 只盡管經過連蛋白肽拮抗劑治療卻發生糖尿病的糖尿病易感性大鼠顯示 出明顯高于:f皮成功治療的大鼠和未經治療的對照大鼠的腔內連蛋白水平。 該連蛋白水平已足以引發發展為糖尿病所需的通透性變化，但是ZOT/連 蛋白受體已凈皮肽拮抗劑有效地阻斷。在糖尿病臨床癥狀出現后，還將處死大鼠的腸組織安放于尤斯室中以評價體外通透性的變化。更具體地，從處死的大鼠中分離得到空腸和回腸的切片(sections), 并將腸內容物清洗干凈。制備每一脅段的6個切片，并置入有機玻璃尤斯 室(0.33cm2開口 )中，連接至電壓鉗裝置(EVC 4000; World Precision Instruments, Saratosa, FL),以新鮮配制的含有53 mM NaCl、 5.0 mM KCl、 30.5 mM Na2S04、 30.5 mM甘露醇、1.69 mM Na2P04、 0.3 mM NaHP04、 1.25 mM CaCl2、 1.1 mM MgCl2和25 mM NaHC03 (pH 7.4)的緩沖液浴洗。 使用連接于恒溫循環泵的水夾套儲器(water-jacketed reservoir)將浴洗溶 液保持在37。C,并向其中通入含95%02和5。/。C02的氣體。測量電位差， 使用如Fasano等人，Prac. iVa". Jcad 5W.， USA, 88:5242-5246 (1991)所描述 的方法來計算短路電流和組織阻力。結果顯示于圖6-7。如體外尤斯室通透性研究所證實的以及圖6所顯示的，所有發展為糖 尿病的大鼠都有腸通透性的增加。糖尿病抗性(DR)大鼠在細胞間通透性 上沒有可察覺到的變化(第一個柱)。未經治療的糖尿病易感性大鼠(DP-未治療的；第二個柱)具有空腸和回腸的細胞間通透性的顯著增加。更重要 的是，使用連蛋白肽拮抗劑治療的糖尿病易感性大鼠(DP-經治療的；第三 個柱)在小腸僅限于空腸的部分，細胞間通透性顯著增加。然而，如圖6與發病機理相關的細胞間通透性的變化限于回腸。而且，如圖6所示，結 腸的通透性無顯著變化，這與連蛋白受體分布的區域性分布一致。通過發生了 (DP-D)或未發生(DP-N)糖尿病的未經治療的糖尿病易感 性大鼠的小腸體外腸通透性的比較，進一步確認了這些結果(圖7)。盡管 未觀察到在DP-D和DP-N大鼠之間的空腸Rt的顯著變化，但是與DP-N 大鼠相比，觀察到DP-D大鼠的回腸粘膜的Rt明顯更低(圖7)。因此，可以得出如下結論(1)所述肽拮抗劑能夠有效地阻斷糖尿病 發生所需的通透性變化；且(2)在那些用所述肽拮抗劑治療的大鼠中， 腔內連蛋白水平比經過治療而未患糖尿病的大鼠高3倍。在經過治療卻發 生了糖尿病的大鼠當中，肽拮抗劑的量可能不足以阻斷足夠數目的、防止 糖尿病必需的ZOT/連蛋白受體。60%的經治療的大鼠未發生糖尿病。在這些大鼠中，所述連蛋白肽拮 抗劑有效地防止了糖尿病發病必需的腸通透性的增加。如圖5所示，經治 療的大鼠的腸連蛋白水平與未治療的對照大鼠是相當的，但是因為連蛋白肽拮抗劑的存在，其小腸的整體通透性不足以改變至引發發展為糖尿病必 需的病理生理變化。有趣的是，如圖5所示， 一只未發生糖尿病的對照動 物具有可以忽略不計的連蛋白水平，進一步支持了連蛋白在糖尿病發病機 理中的作用。因此，BB/Wor大鼠糖尿病發病機理的早期事件涉及連蛋白介導的腸 細胞間通透性的改變。此外，使用連蛋白的肽拮抗劑來抑制連蛋白信號系 統防止了或至少延緩了糖尿病的發病。實施例3J3-細胞的再生使用連蛋白肽拮抗劑AT1001(SEQ ID NO: 15)來治療52-54日齡的糖 尿病易感性大鼠試驗組，同時對與其年齡相當的對照組不予治療。在此時 給予所述拮抗劑，因為這些大鼠在40天時顯示出連蛋白水平的升高且在 50天時可檢測到自身免疫性抗體。這樣，治療開始于糖尿病發病之后。將曰齡為52-54的BBDP動物分為兩組。組1 (11=20)每天在飲用水+ HC03中攝入AT-1001。組2(n-10)攝入飲用水十HC03。在治療階段T0期 內以盲選方式(in a blinded fashion)隨機地選擇動物，使其或接受安慰劑 或在飲水供應中以合成的連蛋白肽抑制劑AT-1001(SEQIDNO: 15)進4亍治 療。在此疾病的末期(空腹血糖> 250 mg/dl )，將發生了 T1D的BBDP大 鼠(安慰劑組中的發病率為60%,平均日齡110天)處死，收集其血液和 組織樣本。將未發生T1D的經AT-1001治療的大鼠在日齡為120天時重新 隨機分為兩組a)停藥階段(drug withdrawal arm), b)繼續用AT-1001治 療；在治療階段Tl ( during treatment arm Tl)中另外的100天里對其繼續 觀察。在研究的開始和結束時檢測血清連蛋白和自身抗體的水平。每天監 測水的攝入，同時每周檢查體重增加和血清葡萄糖水平。空腹血糖> 250 mg/dl的大鼠被認為患糖尿病并且將其在達到糖尿病患病狀態的24小時內 處死。在未經治療的對照組中，10只大鼠中的6只發生了糖尿病而治療組中 的20只大鼠中只有7只發生了糖尿病(圖13)。 120天后，對一半未發生 糖尿病的治療組大鼠停止治療。有1/3的停止治療動物發生了糖尿病，而 繼續治療的動物則無一發生糖尿病。胰腺樣品取自在第52-54天開始治療的動物并進行檢驗。在圖9中示出了組織學檢驗的結果，并且在圖10中示出了免疫組織學檢驗的結果。在發生了糖尿病的動物中，組織學檢驗顯示(3-細胞已經被破壞(圖9，上 方圖片)。相反，來自于未發生糖尿病的動物的樣本中含有(3-細胞，且觀 察到P-細胞再生的跡象(圖9,下方圖片)。為了證實在組織學分析中觀察到的所述細胞的一致性，進行了免疫組 織學檢驗。用特異于胰高血糖素產生性(glucon-producing) 5細胞的抗胰 高血糖素抗體或用特異于胰島素產生性(3細胞的抗胰島素抗體對胰腺進行 順序染色。該分析的結果示于圖10。當使用抗胰島素抗體來染色未經治療 的胰腺時，未^r測到信號。這與T1D中p-細胞的損傷一致。這些細胞用 抗胰高血糖素抗體染色，鑒定了胰高血糖素產生性的5細胞。正常胰島為 條形結構，具有包含5細胞的胰島外側和含有(3-細胞的胰島內側。5細胞 的染色圖像表明胰島因為P-細胞的損傷而發生塌陷(圖IOA和B)。相反， 來自于經治療動物的胰腺顯示出胰島素產生性細胞的存在(圖IOC)。圖 IOD的抗胰高血糖素抗體染色圖像表明該胰島的結構更為正常。圖11和12提供了 (3-細胞再生的證據。圖11示出了對分離自發生了 T1D的未經治療的BBDP大鼠(圖片A和B )和未發生T1D的經AT-1001 治療的大鼠(圖片C-F)的胰腺進行免疫組織化學分析的結果。來自于發 生了 T1D的大鼠的胰島顯示出典型的無胰島素染色的塌陷面(A)和保留 下來的胰高血糖素產生性5細胞群(B)。相反，經AT1001治療的動物顯 示出其胰島或者未被損傷(C和D)或是顯示出從特征在于在胰島素和胰 高血糖素產生性細胞之間的邊界不規則性的胰島炎損傷中恢復的跡象(E 和F)。圖12顯示了更高放大倍數的圖IIE和IIF。由于損傷后(3-細胞的 再生，發生5細胞對胰島的滲入(圖12D)。在臨床前自身免疫階段，對BBDP大鼠連蛋白途徑的阻斷顯著降低了 T1D的發展，最長至日齡205天(治療后150天)。T1D發病率的這種降 低是與經AT1001治療后抗谷氨酸脫羧酶(GAD)抗體的顯著降低相關的 (圖14)。在研究期間，AT1001治療不影響血清連蛋白水平(圖15)。停 止AT1001治療后，33。/。的動物T1D發病。與顯示出T1D典型的末期^1夷島 損傷的未經治療的大鼠相比，經AT1001治療的BBDP大鼠顯示出正常的 胰島組織學或者其胰島顯示出從胰島炎中恢復的跡象。總之，這些數據提 示，即使自身免疫過程已經開始，AT1001仍然能夠中止和恢復BBDP大 鼠中的胰島損傷。雖然已經參照具體的實施方式詳細地描述了本發明，但對于本領域的 普通技術人員而言顯而易見的是，可對本發明做出各種變化和修改而不背 離本發明的精神和范圍。
權利要求
1. 一種在有需要的受試者中減緩胰β-細胞的丟失的方法，該方法包括向所述受試者給予含有連蛋白拮抗劑的組合物。
2. 根據權利要求1的方法，其中所述組合物進一步含有增強細胞生 長的因子。
3. 根據權利要求2的方法，其中所述因子為生長因子。
4. 根據權利要求2的方法，其中所述因子選自表皮生長因子(EGF)、 ^喊性成纖維細胞生長因子-2(BFGF-2)、角質細胞生長因子(KGF)、肝細胞 生長因子/擴散因子(HGF/SF)、胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)、毒蜥外泌肽-4、 胰島/十二指腸同源框-l(IDX-l)、 P-動物纖維素、激活蛋白A、轉化生長因 子-a(TGF-a)、轉化生長因子-(3(TGF-(3)、胃泌素及其組合。
5. —種在有需要的受試者中再生胰P-細胞的方法，該方法包括向 所述受試者給予連蛋白拮抗劑和細胞。
6. 根據權利要求5的方法，其中所述細胞為胰島細胞。
7. 根據權利要求5的方法，其中所述細胞為(3-細胞。
8. 根據權利要求5的方法，其中所述細胞為干細胞。
9. 根據權利要求5的方法，其中將所述拮抗劑和所述細胞同時給予。
10. 根據權利要求5的方法，其中將所述拮抗劑和所述細胞不同時給予。
11. 根據權利要求5的方法，該方法進一步包括給予增強細胞生長的 因子。
12. 根據權利要求11的方法，其中所述因子為生長因子。
13. 根據權利要求12的方法，其中所述因子選自表皮生長因子(EGF)、 堿性成纖維細胞生長因子-2(BFGF-2)、角質細胞生長因子(KGF)、肝細胞 生長因子/擴散因子(HGF/SF)、胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)、毒蜥外泌肽-4、 胰島/十二指腸同源框-l(IDX-l)、 (3-動物纖維素、激活蛋白A、轉化生長因 子-a(TGF-a)、轉化生長因子-卩(TGF-p)、胃泌素及其組合。
14. 一種在有需要的受試者中再生胰(3-細胞的方法，該方法包括在 允許P-細胞復制的條件下，給予所述受試者連蛋白拮抗劑。
15. 根據權利要求14的方法，該方法進一步包括給予增強細胞生長的因子。
16. 根據權利要求14的方法，其中所述因子為生長因子。
17. 根據權利要求14的方法，其中所述因子選自表皮生長因子(EGF)、 堿性成纖維細胞生長因子-2(BFGF-2)、角質細胞生長因子(KGF)、肝細胞 生長因子/擴散因子(HGF/SF)、胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)、毒蜥外泌肽-4、 胰島/十二指腸同源框-l(IDX-l)、 (3-動物纖維素、激活蛋白A、轉化生長因 子-a(TGF-a)、轉化生長因子-(3(TGF-(3)、胃泌素及其組合。
18. —種在有需要的受試者中再生胰e-細胞的方法，該方法包括向 所述受試者給予連蛋白拮抗劑和向所述受試者中植入細胞。
19. 根據權利要求18的方法，其中所述細胞為胰島細胞。
20. 根據權利要求18的方法，其中所述細胞為(3 -細胞。
21. 根據權利要求18的方法，其中所述細胞為干細胞。
22. 根據權利要求18的方法，其中將所述拮抗劑在植入所述細胞之前 給予所述受試者。
23. 根據權利要求18的方法，其中將所述拮抗劑在植入所述細胞之后 給予所述受試者。
24. 根據權利要求18的方法，其中將所述拮抗劑在植入所述細胞之前 和之后均給予所述受試者。
25. 根據權利要求18的方法，該方法進一步包括給予增強細胞生長的 因子。
26. 根據權利要求18的方法，其中所述因子為生長因子。
27. 根據權利要求18的方法，其中所述因子選自表皮生長因子(EGF)、 堿性成纖維細胞生長因子-2(BFGF-2)、角質細胞生長因子(KGF)、肝細胞 生長因子/擴散因子(HGF/SF)、胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)、毒蜥外泌肽-4、 胰島/十二指腸同源框-l(IDX-l)、 (3-動物纖維素、激活蛋白A、轉化生長因 子-a(TGF-a)、轉化生長因子-卩(TGF-卩)、胃泌素及其組合。
28. 根據權利要求25的方法，其中將所述因子在植入所述細胞之前給 予所述受試者。
29. 根據權利要求25的方法，其中將所述因子在植入所述細胞之后給 予所述受試者。
30. 根據權利要求25的方法，其中將所述因子在植入所述細胞之前和 之后均給予所述受試者。
31. —種治療自身免疫性疾病的方法，該方法包括給予防止解剖學 屏障的通透性增加的化合物。
32. 根據權利要求31的方法，其中所述防止解剖學屏障的通透性增加 的化合物是增加解剖學屏障通透性的正常的生理學化合物的拮抗劑。
33. 根據權利要求31的方法，其中所述化合物是連蛋白拮抗劑。
34. 根據權利要求33的方法，其中所述連蛋白拮抗劑包括SEQ ID NO:15。
35. 根據權利要求31的方法，其中所述化合物選自SEQ IDs 1-24。
全文摘要
本發明提供用于治療糖尿病的材料和方法。使用本發明的材料和方法，可以減緩和/或防止胰β-細胞的丟失。而且，可以將本發明的材料和方法用于再生胰β-細胞。
文檔編號A61K38/00GK101242851SQ200680029544
公開日2008年8月13日 申請日期2006年6月9日 優先權日2005年6月9日
發明者A·法薩諾, A·薩博恩, B·佩特森 申請人:馬里蘭巴爾的摩大學;Alba治療公司