攜載水溶性小肽的麥胚凝集素修飾的聚合物納米粒及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥物制劑領域，具體涉及載水溶性小肽的用于鼻腔給藥的麥胚凝集素 (wheat germ agglutinin,WGA)修飾的聚合物納米粒及其制備方法和應用，所述的水溶性 小肽是NR2B9c，相對分子量為977Da。
【背景技術】
[0002] 腦卒中是危害人類健康的常見病和多發病，具有發病率高、致殘率高、死亡率高和 復發率高的特點。腦卒中主要分為缺血性和出血性腦卒中兩大類，其中缺血性腦卒中為最 常見的類型，占全部腦卒中的80%左右。然而，臨床上除早期使用溶栓藥對缺血性腦卒中有 效外，迄今仍缺乏療效明確的治療藥物。因此，進行缺血性腦卒中治療藥物的研究具有十分 重要的意義。
[0003] N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate ,NMDA)受體是中樞神經系統非常重 要的一類興奮性氨基酸受體，其所介導的神經興奮性毒性在缺血性腦損傷中起到非常關鍵 的作用。腦卒中后，NMDA受體過度激活，引發大量的Ca 2+內流，從而觸發了興奮性毒性，通過 與NMDA受體偶聯的突觸后密集區蛋白-95(postsynaptic density-95,PSD-95)將信號傳遞 給神經元型一氧化氮合成酶（neuronal nitric oxide synthase，nN0S)，形成匪DA受體-PSD-95-nN0S三元復合物，進而引起nNOS的超常活化，催化產生過量的一氧化氮（nitric oxide，NO )，最終導致神經元死亡。因此，在缺血性腦卒中的治療中，NMDA受體拮抗劑、突觸 后鈣離子阻斷劑和nNOS拮抗劑都曾被寄予希望，但由于三者分別阻斷了 NMDA受體和nNOS的 正常生理功能而未能在臨床上取得成功，在抑制興奮性通路中的上下游分子均無效的情況 下，如何能既阻斷NMDA受體所介導的興奮性毒性，又不干擾匪DA受體的正常生理功能呢？ NMDA受體與PSD-95的解偶聯成為缺血性腦卒中治療藥物研究的新靶點。
[0004] 2002年Aarts M等人在Science上發表的文章中提出了一個針對匪DA受體亞型 NR2B羧基端的9個氨基酸殘基的多肽NR2B9c(KLSSIESDV)，NR2B9c可與PSD-95特異性地結 合，從而解除NMDA受體與PSD-95的偶聯，阻斷引起神經興奮性毒性的下游信號傳導，但不影 響NMDA受體的正常生理功能。嚙齒類動物和類似于人類的靈長類動物實驗結果均表明在腦 卒中發生后一個合理的時間窗內給予NR2B9C，可產生長期的神經保護作用，而且副作用小， 因此NR2B9C多肽極有可能成為一種經臨床驗證有效的腦卒中治療藥物。
[0005] 由于在血液和腦組織之間存在一種被稱為血腦屏障的機體天然生理防御結構，這 使得大多數外源性物質不能有效進入腦部發揮生物效應，基本上超過98%的小分子藥物不 能通過血腦屏障，而100%的大分子藥物，包括多肽、重組蛋白、基因治療相關藥物等都無法 有效穿過血腦屏障。NR2B9c作為一種水溶性多肽自然也無例外。目前有關NR2B9c的研究中， 采用的均為靜脈注射融合蛋白Tat-NR2B9c，即將NR2B9c與來自于HIV的轉導肽Tat進行偶 聯。Tat能將與之相連的肽段或蛋白質跨膜轉運進入各種組織和細胞，由Tat攜帶NR2B9C雖 然可以有效的透過血腦屏障，但仍存在如下缺點：① Tat攜帶NR2B9C可進入人體各種組織和 細胞，體內分布無選擇性。②融合蛋白應用于人類疾病的治療還有許多需要考慮的問題，尤 其是安全性方面尚不明確。源自HIV的細胞穿膜肽Tat雖然已不具感染性，但此蛋白轉導域 為病毒相關蛋白的核定位序列。Tat用于攜載藥物對人進行治療時，其對人類基因表達的潛 在影響以及可能帶來的毒副作用目前還知之甚少，有待進一步研究。例如有文獻報道稱細 胞穿膜肽Tat(48-60)單獨使用即可明顯降低促分裂素原活化蛋白激酶mRNA表達水平。③卒 中治療的時間窗非常關鍵，越早接受治療效果越好，而Tat-NR2B9c設計為靜脈注射給藥，必 須由專業醫護人員操作，使用不便。因此，在NR2B9c治療缺血性腦卒中的研究中，如何安全 高效遞送NR2B9c入腦是亟需解決的一個關鍵問題。
[0006] 鼻腔給藥是一種實用的無創性腦部遞藥方式，其安全、有效、便捷，經鼻給藥后，藥 物和載體可繞過血腦屏障通過嗅區粘膜上的嗅神經途徑和三叉神經途徑直達中樞神經系 統，入腦迅速，全身吸收相對減少，副作用較小。鼻腦通路的存在雖然為NR2B9C等多肽蛋白 類藥物避開血腦屏障經鼻腔直接入腦提供了可能，但像NR2B9C這類水溶性多肽，由于受到 鼻腔內的代謝酶降解和鼻纖毛清除等因素限制，致使進入腦部的藥量很低，無法達到臨床 上的有效劑量。具有良好生物降解性和生物安全性的聚合物聚乙二醇（polyethylene glycol ,PEG)-聚乳酸羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co_glycolic acid)，PLGA)所制備的 聚合物納米粒穩定性好，能有效防止藥物在體內的降解，提高藥物穩定性。但在鼻腔停留時 間短、且缺乏對主要吸收部位嗅區粘膜的選擇性，進入腦部能力依然有限。

【發明內容】

[0007] 為了解決上述問題，本發明的目的是提供攜載水溶性小肽的麥胚凝集素修飾的聚 合物納米粒及其制備方法，為水溶性小肽NR2B9C治療缺血性腦卒中提供一種安全有效的腦 部遞藥方法。
[0008] 為了實現上述發明目的，本發明采用了以下技術方案：
[0009] 攜載水溶性小肽的麥胚凝集素修飾的聚合物納米粒，所述的水溶性小肽是 NR2B9c，所述的聚合物是馬來酰亞胺聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物(Mal-PEG-PLGA)和 單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物(mPEG-PLGA)的混合物，所述的聚合物納米粒采 用復乳法制備；該納米粒的平均粒徑為140nm，分布均勻，呈淡藍色乳光，Zeta電位約為-23mV，包封率在50 %左右，載藥量在11 %左右。
[0010]攜載水溶性小肽的麥胚凝集素修飾的聚合物納米粒的制備方法，步驟如下：
[0011] (1)、內水相的制備：將NR2B9c溶解于水中，獲得濃度為0-35mg/ml且大于0的 NR2B9c水溶液，備用；內水相體積為50-200yL;
[0012] (2)、油相的制備：將馬來酰亞胺聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物（Mal-PEG- PLGA)(便于在納米粒上接枝WGA和控制接枝比例，馬來酰亞胺聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共 聚物與相應的單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物中PLGA端PLA: PGA的比例相等， PLGA端的分子量也相等，聚合物合成過程中單甲氧基聚乙二醇分子量為2000,馬來酰亞胺 聚乙二醇分子量為3500)和單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物(mPEG-PLGA)(質量 比1:9)溶于油相二氯甲烷中，所得聚合物濃度為15-20mg/ml，備用;Mal-PEG-PLGA和mPEG-PLGA的PLGA端中 PLA: PGA的比例以及PLGA端的分子量(Mff)為：50: 50，28000、50:50，38000、 75:25,38000;較佳型號是PLA:PGA 50:50MW 38000,較佳濃度是20mg/ml;
[0013] (3)、W/0初乳的制備：按照1: 5的體積比將內水相加入到油相中，超聲得到W/0初 乳；
[0014] (4)、W/0/W復乳的制備：按照3: 5的體積比，將W/0初乳加入含有乳化劑的外水相 中，超聲得到W/0/W復乳；
[0015] 外水相為l%-1.5w/v%的膽酸鈉溶液，膽酸鈉發揮乳化劑作用；
[0016] (5)聚合物納米粒的制備：按照1: 5的體積比，將W/0/W復乳分散到擴散相溶液 (0.5w/v%的膽酸鈉）中，攪拌均勻，擴散相溶液中加入巰基化WGA，低速攪拌孵育4小時，減 壓旋蒸除有機溶劑，置超濾離心管中冷凍離心(4500rpmX30min，4°C)，即得WGA修飾的聚合 物納米粒。
[0017]攜載水溶性小肽的麥胚凝集素修飾的聚合物納米粒經鼻腔給藥提高腦部藥物濃 度，治療腦卒中的用途。
[0018]發明人構建了攜載水溶性多肽類藥物NR2B9c的鼻用麥胚凝集素 （wheat germ agglutinin，WGA)修飾的聚合物納米粒，制得的納米粒(nanoparticles，NPs)為類球形粒 子，外觀圓整，粒徑小，包封率約為50%，載藥量約為11 %。采用WGA修飾納米粒是利用WGA可 與鼻腔嗅區粘膜上選擇性高表達的糖基N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine, GlcNAc)特異性結合，促進細胞對納米粒的內吞和轉運，同時WGA還能夠調節上皮細胞的通 透性，抑制蛋白分解酶活性，且其毒性和免疫原性都很小，從而延長聚合物納米粒在嗅區粘 膜上的滯留時間，提高嗅區粘膜對聚合物納米粒的攝取率，選擇性地遞送更多的NR2B9C入 腦，增強其對缺血性腦卒中的預防和治療效果，降低全身性的毒副作用。
【附圖說明】
[0019]圖 1 是所得納米粒的電鏡圖；其中，（A)NR2B9c-NPs (B)NR2B9c-WGA-NPs。
【具體實施方式】
[0020]下面結合【具體實施方式】對本發明做進一步的詳細說明。
[0021] -、本發明所采用的實驗材料如下：SD大鼠，購自南京醫科大學實驗動物中心； NR2B9c原料藥(純度2 95%，上海吉爾生化有限公司）;Mal-PEG(MW3500，北京鍵凱技術有限 公司）；mPEG(MW2000，Sigma-Aldrich ,American); WGA(MW36000，Medicago，Sweden); 2-iminothiolane hydrochloride(2-1T，Sigma-Aldrich，美國）；5，5 二硫代雙（2-硝基苯甲 酸）（DTNB，Sigma-Aldrich，美國）。
[0022] 二、聚合物納米粒的制備過程
[0023] 1、疏基化WGA的制備[Chen J，Zhang C，Liu Q，Shao X，Feng C，Shen Y，Zhang Q， Jiang X.Solanum tuberosum lectin-conjugated PLGA nanoparticles for nose to brain delivery.Journal ofDrug Targeting.J Drug Target 2012,20(2):174-184.]:精 密稱取WGA，溶解于0.15mol/l的硼酸鈉溶液(pH8.0)中，按WGA與2-IT摩爾比為l :60加入2-IT溶液，室溫低速攪拌l小時，過葡聚糖凝膠G25層析柱，洗脫除去小分子雜質，收集蛋白組 分。
[0024] 2、復乳(W/0/W)法制備WGA修飾的納米粒
[0025] 將內水相加入到含有聚合材料Mal-PEG-PLGA和mPEG-PLGA(質量比1:9)的二氯甲 烷中，超聲得到w/ο初乳；
[0026] 將得到的初乳加入含有乳化劑的外水相中，超聲得到W/0/W復乳；
[0027] 將復乳分散到擴散相溶液中，攪拌均勻，擴散相溶液中加入巰基化WGA(馬來酰亞 胺聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物和巰基化WGA的質量比為5 :1 )，低速攪拌孵育，減壓旋 蒸除有機溶劑，置超濾離心管中冷凍離心(4500rpmX 30min，4°C)，即得WGA修飾的聚合物納 米粒。
[0028]當內水相是含有NR2B9c的水溶液時，獲得WGA修飾載NR2B9c納米粒，當內水相是水 時，制得空白納米粒。
[0029] 三、性能檢測：
[0030] 1、包封率和載藥量的測定
[0031] 載藥納米粒的包封率(entrapment efficiency，EE%)和載藥量(drug loading, DL%)，見公式（1)，（2):
[0032] (I