一種菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法，屬于植物成分檢測【技術領域】。該方法對檢測用紅細胞懸液進行了細胞定量，同時利用已知濃度的菜豆植物凝集素作為標準品繪制凝血活性濃度標準曲線，進而計算出菜豆植物凝集素凝血活性濃度，從而對菜豆植物凝集素凝血活性進行定量。
【專利說明】一種菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物成分檢測【技術領域】，具體涉及一種菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法。
【背景技術】
[0002]菜豆中含有的植物凝集素是引起菜豆食物中毒的有毒物質之一，尤其是鮮菜豆豆莢，常常因烹飪不當造成中毒事件的發生。菜豆中毒是多因素的，其中最重要的因素是由于菜豆中的凝集素可與紅細胞表面特異糖基識別并專一性結合在紅細胞表面形成許多交叉的“橋”，使紅細胞發生凝集，進而引起機體的整體反應。不同菜豆品種中植物凝集素的含量不盡相同，因此可用紅細胞凝集法來檢測菜豆中植物凝集素活性，對指導人們選擇植物凝集素活性較低的菜豆品種種植和使用提供依據。
[0003]紅細胞凝集法是目前應用最為廣泛的植物凝集素檢測方法。該方法利用天然的、酶處理的、戊二醛固定的兔、羊、人等動物紅細胞，配制成一定濃度的紅細胞懸液，將凝集素溶液經過倍比稀釋后加入等體積紅細胞懸液，在一定條件下靜置一段時間后利用肉眼觀察和比色法進行活性判定。
[0004]現有的測定凝集素活性的方法主要分為兩大類:一類以觀察血細胞凝集效果的定性分析，如V形酶標板法，平板法，試管法等等；另一類是以分光光度計及酶標儀測定的特定波長下的吸光度的半定量分析方法。這些方法存在以下缺點:(1)只能進行定性或半定量測定；(2)配制標準紅細胞懸液方法不一，多用體積百分數來表示，重現性差；(3)確定讀取終點時間的隨意性較大，有的有肉眼觀察結果，主觀性大，結果誤差也大，精確度低；(4)測定方法多種多樣，測得的結果千差萬別，無法進行比較。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是為解決上述問題而提供了一種高通量定量檢測菜豆植物凝集素凝血活性的方法。
[0006]本發明所采用的技術方案是:
[0007]—種菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法，所述方法包括以下步驟:
[0008]( I)對檢測用紅細胞懸液進行細胞定量；
[0009](2)用已知濃度的菜豆植物凝膠素作為標準品繪制凝血活性濃度標準曲線；
[0010](3)計算出菜豆植物凝集素凝血活性濃度。
[0011]進一步地，所述步驟(I)具體為:
[0012](A)采集新鮮兔血置于5%?10%枸櫞酸鈉抗凝劑中，與4倍體積阿氏(Alsever’ s)液混勻后置于4°C冰箱保存備用；
[0013](B)將步驟(A)得到的新鮮兔血與生理鹽水按5:8的比例緩慢混勻，800?IOOOrpm離心10分鐘，收集沉淀；
[0014](C)重復上述步驟洗滌紅細胞，至上清液顏色近乎透明后，按紅細胞體積配成20%的紅細胞懸液。
[0015](D)取步驟(C)得到的紅細胞懸液經生理鹽水稀釋后計數紅細胞，并調整紅細胞濃度為5 X IO7個/ml-5 X IO8個/ml，4°C冰箱保存備用。
[0016]優選地，所述步驟(A)中得到的新鮮兔血保存備用不得超過14天。
[0017]進一步地,所述步驟(2)具體為:
[0018](a)在酶標板上，將已知濃度的菜豆植物凝集素標準品二倍稀釋六個稀釋度；
[0019](b)向上述酶標板各孔加入已定量的紅細胞懸液，混合均勻，并靜置10分鐘，在酶標儀450nm處讀取吸光值，繪制菜豆植物凝集素凝血活性濃度標準曲線。
[0020]更進一步地，所述步驟(a)中，菜豆植物凝集素標準品的濃度為lmg/ml，二倍稀釋六個稀釋度為 lmg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml 和 0.03125mg/ml。
[0021]進一步地,所述步驟(3)具體為:
[0022]( I )將新鮮菜豆植物洗凈擦干后稱重，置于研缽中，加入質量體積比為1:1的生理鹽水，于冰上研碎；
[0023](II)將步驟(I )得到的菜豆植物在4°C下，8000rpm，離心lOmin，取上清液；
[0024](III)將步驟(II)得到的上清液靜置5分鐘后，再次取上清液，得到菜豆植物凝集素浸提液；
[0025](IV)在酶標板上，將步驟(III)得到的菜豆植物凝集素浸提液二倍稀釋三個稀釋度；
[0026](V)向上述酶標板各孔加入步驟(I)得到的紅細胞懸液，混合均勻，并靜置10分鐘，在酶標儀450nm處讀取吸光值，將該值代入步驟(2)得到的菜豆植物凝集素凝血活性濃度標準曲線的公式中，計算得到菜豆植物凝集素凝血活性濃度。
[0027]優選地，所述菜豆植物為菜豆豆莢或豆粒。
[0028]優選地，所述酶標板為96孔。
[0029]本發明具有以下優點:
[0030]該檢測方法步驟簡單，利用該方法可以對菜豆植物進行高通量定量的凝集素凝血活性檢測；制備出的紅細胞懸液進行了細胞定量，可保證各批次間測定結果的相對一致；同時檢測出的結果更加精確，誤差度小，測定出的結果可以進行互相比較。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為實施例中菜豆植物凝集素標準品測定曲線圖。
【具體實施方式】
[0032]下面結合附圖和實施方式對本發明做進一步詳細的說明。
[0033]( I)制備標準紅細胞懸液及測定標準曲線:
[0034]1.用心臟采血法采集新鮮兔血2ml，置于300ul的8%枸櫞酸鈉抗凝劑中，再與8mlAlsever’s液混勻后置于4°C冰箱保存備用(2周內紅細胞正常，超過2周，紅細胞出現溶血現象)。
[0035]2.取用Alsever’s液保存的新鮮兔血2.5ml，與生理鹽水按5:8的比例緩慢混勻，800-1000rpm離心10分鐘，收集紅細胞沉淀。[0036]3.重復上述步驟洗滌紅細胞五次后，上清液顏色完全透明，再根據紅細胞沉淀的體積配成20%的紅細胞懸液。
[0037]4.取IOOul上述紅細胞懸液用生理鹽水稀釋10倍后，取稀釋后的紅細胞懸液IOOul，再稀釋10倍，然后取15ul經兩次稀釋后的紅細胞懸液計數紅細胞數量，調整紅細胞濃度為 5 X IO7 個 /ml-5 X IO8 個 /ml。
[0038]5.在96孔酶標板上加入IOOul的lmg/ml菜豆植物凝集素標準品，并做二倍稀釋6個稀釋度，滴加不同濃度(5 X IO7個/ml、I X IO8個/ml、2 X IO8個/ml、4X IO8個/mDlOul紅細胞懸液，觀察凝血情況，并測定450nm處的吸光值。
[0039]參照圖1，結果顯示紅細胞濃度為2 X IO8個/ml時，凝血反應速度適中，根據450nm處的吸光值做出的標準曲線的線性相關系數大于0.99。
[0040](2)菜豆植物凝集素浸提液的制備
[0041]1.新鮮菜豆豆莢或豆粒洗凈擦干后稱重，置于研缽中，加入質量體積比為1:1的生理鹽水，于冰上研碎。
[0042]2.在 4°C下,8000r/min 離心 IOmin,取上清液。
[0043]3.靜置5分鐘后，再次取上清液，即為菜豆植物凝集素浸提液。
[0044](3)菜豆植物凝集素活性濃度測定
[0045]1.在96孔酶標板上，加入58種不同品種的菜豆豆莢浸提液各
[0046]IOOul。
[0047]2.向各孔中加入2 X IO8個/ml的紅細胞懸液IOul，混合均勻，靜置10分鐘，在酶標儀450nm處讀取吸光值，將該值代入標準曲線的公式進行菜豆植物凝集素凝血活性濃度的計算，公式如圖1所示。
[0048]對于凝集素含量較高，超出標準曲線測定范圍的15種菜豆豆莢浸提液，用生理鹽水進行二倍稀釋3個濃度梯度，每孔lOOul，再向各孔中加入2X IO8個/ml的紅細胞懸液10ul，混合均勻，靜置10分鐘，在酶標儀450nm處讀取吸光值，取吸光值位于標準曲線內的數值代入標準曲線的公式進行菜豆植物凝集素凝血活性濃度的計算。
[0049]最后所應說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。
【權利要求】
1.一種菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)對檢測用紅細胞懸液進行細胞定量； (2)用已知濃度的菜豆植物凝膠素作為標準品繪制凝血活性濃度標準曲線； (3)計算出菜豆植物凝集素凝血活性濃度。
2.根據權利要求1所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)具體為: (A)采集新鮮兔血置于5%~10%枸櫞酸鈉抗凝劑中，與4倍體積阿氏液混勻后置于4°C冰箱保存備用； (B)將步驟(A)得到的新鮮兔血與生理鹽水按5:8的比例緩慢混勻，800~1000rpm離心10分鐘，收集沉淀； (C)重復上述步驟洗滌紅細胞，至上清液顏色近乎透明后，按紅細胞體積配成20%的紅細胞懸液。 (D)取步驟(C)得到的紅細胞懸液經生理鹽水稀釋后計數紅細胞，并調整紅細胞濃度為5 X IO7個/ml-5 X IO8個/ml，4°C冰箱保存備用。
3.根據權利要求2所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法，其特征在于，所述步驟(A)中得到的新鮮兔血保存備用不得超過14天。`
4.根據權利要求1所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)具體為: Ca)在酶標板上，將已知濃度的菜豆植物凝集素標準品二倍稀釋六個稀釋度； (b)向上述酶標板各孔加入已定量的紅細胞懸液，混合均勻，并靜置10分鐘，在酶標儀450nm處讀取吸光值，繪制菜豆植物凝集素凝血活性濃度標準曲線。
5.根據權利要求4所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法，其特征在于，所述步驟(a)中，菜豆植物凝集素標準品的濃度為lmg/ml，二倍稀釋六個稀釋度為lmg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml 和 0.03125mg/ml。
6.根據權利要求1所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)具體為: (I)將新鮮菜豆植物洗凈擦干后稱重，置于研缽中，加入質量體積比為1:1的生理鹽水，于冰上研碎； (II)將步驟(I)得到的菜豆植物在4°C下，8000rpm，離心lOmin，取上清液； (III)將步驟(II)得到的上清液靜置5分鐘后，再次取上清液，得到菜豆植物凝集素浸提液； (IV)在酶標板上，將步驟(III)得到的菜豆植物凝集素浸提液二倍稀釋三個稀釋度； (V)向上述酶標板各孔加入步驟(1)得到的紅細胞懸液，混合均勻，并靜置10分鐘，在酶標儀450nm處讀取吸光值，將該值代入步驟(2)得到的菜豆植物凝集素凝血活性濃度標準曲線的公式中，計算得到菜豆植物凝集素凝血活性濃度。
7.根據權利要求6所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法，其特征在于，所述菜豆植物為菜豆豆莢或豆粒。
8.根據權利要求4或6所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法，其特征在于，所述酶標板為 96孔。
【文檔編號】G01N21/33GK103558176SQ201310532286
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月31日 優先權日:2013年10月31日
【發明者】李佳楠, 陳禪友, 潘磊 申請人:江漢大學