專利名稱：：抗人p-選擇素凝集素-表皮生長因子功能域的人源單克隆抗體及其雜交瘤細胞株的制作方法
技術領域：
：本發明涉及轉基因
技術領域：
，特別涉及一種抗人P-選擇素凝集素-表皮生長因子(P-selectin-lectin-EGF，PsL-EGF)功能域的人源單克隆抗體及產生該抗體的雜交瘤細胞株。
背景技術：
：P-選擇素(P-sdectin)是一種分子量為140kD的I型膜糖蛋白，定位于血小板的a顆粒和內皮細胞Weibel-Palade小體內，全長由789個氮基酸殘基組成。其N末端730個氨基酸構成胞外區，包括l個凝集素(Lectin)結構域、1個表皮生長因子(EGF)結構域和9個補體調節蛋白重復序列(SCR)結構域；C末端24個氨基酸構成跨膜區。此外35個氨基酸構成胞漿短尾(JohnstonGI,CookRQMcEverRP.CloningofGMP-140,agranulemembraneproteinofplateletsandendothelium:sequencesimilaritytoproteinsinvolvedincelladhesionandinflammation.Ce〃，1989，56(6):1033—1044)。P-選擇素屬細胞黏附分子的選擇素家族，其作為血小板/內皮細胞活化的標志和黏附受體，可介導白細胞與活化內皮細胞等最初黏附，是啟動炎癥反應并維持炎癥狀態的重要成分。其正常情況下不表達或低表達，受到炎癥、損傷等因素刺激后可顯著表達，且原先不表達的臟器也出現表達，故P-選擇素參與免疫炎癥損傷、血栓形成及腫瘤轉移等多種病理生理過程，其過度或持續表達可成為某些臟器病變的標志，與諸多臨床疾病有十分密切的關系。實驗表明，抑制其表達及其細胞黏附作用已取得良好的抗炎、抗腫瘤轉移等防治效果。在本申請人的專利號為ZL200310108522.5的中國專利中，公開了針對抗P-選擇素lectin-EGF(L-EGF)功能域的鼠源單克隆抗體(PsL-EGFmAb)及其制備方法(包括雜交瘤細胞)和應用。試驗數據表明PsL-EGFmAb較P-選擇素全長單抗更具有抗黏附/抗炎靶向抑制效應，且對L-，E-選擇素也有黏附抑制作用，以及對機體細胞免疫功能無明顯抑制且有調節效應；進一步利用腎缺血再灌注損傷大鼠模型證明該單抗能有效抑制P-選擇素表達及其介導的白細胞黏附聚集，減輕腎組織病理損傷，改善腎功能，且基本不影響機體正常免疫防御功能。然而，鼠源性單抗應用于人體存在著免疫學和藥理學兩方面的問題主要表現為鼠抗半衰期短，不能有效激發適當的抗體依賴的細胞毒效應和補體依賴的細胞毒效應，以及人抗鼠抗體反應等，限制了該鼠源單抗藥物在臨床的開發和利用。
發明內容本發明要解決的技術問題即是上述課題，提供一種抗人P-選擇素凝集素-表皮生長因子功能域的人源單克隆抗體及其制備方法，尤其是產生該單克隆抗體的特定雜交瘤細胞株。本發明選用現有能產生人源單克隆抗體的轉基因小鼠來制備本發明的人源單抗。該轉基因小鼠系采用人工文庫制備整合含人免疫球蛋白(Ig)位點，同時敲除內源性Ig位點，并以人Ig基因取代小鼠Ig基因，經重排后表達完全人源的特異性抗體。具體來說，本發明選用攜有人Igji、IgK和IgX基因，且鼠源IgH和IgK鏈表達失活，而稱為五特征鼠,(NicholsonIC，ZouX，PopovAV,efa/.AntibodyRepertoiresofFour-andFive-FeatureTranslocusMiceCarryingHumanImmunoglobulinHeavyChainandkandXLightChainYeastArtificialChromosomes.TheJournalofImmunology,1999，163(12):6898-6906)的轉基因小鼠。由于本研究的目的基因片段PsL-EGF僅474bp，表達的蛋白分子量比較小，抗原性較弱，而實驗抗體制備所用的轉基因小鼠免疫應答能力較弱，需要選擇合適的載體構建融合蛋白以增強免疫原性；考慮到谷胱甘肽轉移酶(Glutathione-S-Transferase，GST)對一些蛋白的融合表達具有較好的可溶性和較高的表達量，而谷胱甘肽固化于瓊脂糖形成的親和層析樹脂對GST及其融合蛋白的純化效率很高。因此，本發明首先利用特異引物，通過PCR擴增目的基因片段PsL-EGF，將其連接到pGEMT-easy載體，用EcoRI和SalI雙酶切后構建入pGEX-5X-l載體(含有GST)，從而構建了pGEX-PsL-EGF重組質粒。后者經測序驗證后轉化大腸桿菌BL21，經異丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達了GST-PsL-EGF融合蛋白。該融合蛋白經純化后作為抗原免疫轉基因小鼠，應用雜交瘤技術，篩選陽性克隆，制備腹水及獲得目的抗體一一特異性抗人P-選擇素L-EGF功能域的人源單克隆抗體。上述雜交瘤技術包括皮下皮內注射和腹腔注射兩種免疫方法交替進行，免疫轉基因小鼠，將其脾細胞作為免疫細胞與小鼠的骨髓瘤細胞SP2/0融合。而后通過間接ELISA篩選陽性克隆，獲得l株可穩定分泌抗PsL-EGF功能域單抗的人源單抗雜交瘤細胞株PsL-EGFmAb-2，其亞型為IgM，輕鏈為A型，該人源單抗雜交瘤細胞株PsL-EGFmAb-2已于2006年10月26日保藏于中國典型培養物保藏中心，獲得保藏號為CCTCCNO:C200634。對本發明所獲單抗的特性進行了鑒定與檢測，結果表明該單克隆抗體為人源單抗(IgM，X型)，并具有良好的特異性和穩定性。抗PsL-EGF人源單克隆抗體的成功制備，為進一步將其應用于人類疾病的特異性抗黏附治療研究奠定了基礎，并更具有潛在的臨床應用價值。本發明的人源單抗雜交瘤細胞株PsL-EGFmAb-2已于2006年10月26日保藏在位于中國武漢大學(郵編為430072)內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，獲得保藏號為CCTCCNO:C200634。圖1為pGEX-PsL-EGF重組質粒的構建及酶切鑒定的電泳圖譜，Ml:DL2,000Marker;M2:DL15000Marker;A:PCR擴增PsL曙EGF片段；B:PsL-EGF-pEGMT-easy重組質粒；C:EcoRI、SalI雙酶切PsL-EGF-pEGMT-easy重組質粒；D:pGEX垂5X-l質粒；E:EcoRI、SalI雙酶切pGEX-5X-l質粒；F:pGEX-PsL-EGF重組質粒；G:EcoRI、SalI雙酶切pGEX-PsL-EGF重組質粒。圖2為pGEX-PsL-EGF載體構建示意圖。圖3為GST-PsL-EGF融合蛋白表達與純化的SDS-:PAGE檢測圖譜，A:IPTG誘導前的菌液；B:IPTG誘導后的培養液；C:破菌后上清；D:破菌后沉淀；E:尿素純化的GST-PsL-EGF蛋白；F:丙酮純化的GST-PsL-EGF蛋白；M:蛋白Marker。圖4為His-PsL-EGF和GST蛋白純化后行SDS-PAGE凝膠電泳結果，M:蛋白Marker;A:His-PsL-EGF蛋白；B:GST蛋白。圖5為本發明雜交瘤細胞株的染色體分析結果。圖6為RT-PCR鑒定人源抗體結果，1以人淋巴細胞cDNA為模板；2以雜交瘤細胞株CCTCCNO:C200634的cDNA為模板；3以鼠淋巴細胞cDNA為模板。圖7為抗PsL-EGF人源單克隆抗體IgMFc段測序結果。圖8為ELISA鑒定免疫血清(A)和本發明雜交瘤細胞上清液(B)中的抗體結果。圖9為Westernblot鑒定免疫血清(A)和本發明雜交瘤細胞上清(B)中的抗體結果。躺錯誠在下面的實施例中進一步說明本發明，但并不限制本發明的范圍。下面所述實施例中的材料為1、質粒、菌株及主要制劑五.co//DH5a，XLI-Blue菌株為GBICO公司產品，￡.co/z'BL-21(DE3)菌株、pGEX-5X-l質粒為PharmaciaBiotech公司產品；限制性內切酶(EcoRl、Sail)為TaKaRa公司產品、T4DNA連接酶、TaqPlusDNA聚合酶、pGEM-Teasy載體連接試劑盒、dNTP均為Promega公司產品；DNAmarkerDL2000為NEB公司產品，RT-PCR試劑盒為Invitrogen公司產品；QIAquickGelExtractionKit、質粒小抽試劑盒、PCR產物回收試劑盒、N產-NTAsuperflow樹脂均為Qiagen公司產品；GlutathioneSepharose4B親和層析柱為BD公司產品；RNA抽提液Trizol、逆轉錄試劑盒、RPMI-1640培養基、胎牛血清、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、PEG、HAT、HT均為GibcoBRL公司產品；rhP-sdectin/Fcchimera為R&D公司產品；HRP標記的羊抗人IgM(p鏈)抗體為ProtolresearchInc公司產品；HRP標記的羊抗人k鏈抗體、HRP標記的羊抗人X鏈抗體為bethyl公司產品；乙醇、苯酚、氯仿、異戊醇、甲醛、戊二醛、IPTG(異丙基-e-D硫代半乳糖苷)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫蘇糖醇(DTT)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等其他常規試劑均為市售進口或國產分析純。2、動物與細胞株6-8周齡Balb/c小鼠，雌性，20-25g/只，購自中科院上海動物實驗中心；實驗前于本院動物房專人飼養l周:，正常飲食；小鼠骨髓瘤細胞SP2/0取自上海市免疫學研究所；轉基因小鼠(五特征鼠)購自上海轉基因研究中心。3、自配試劑1)LB培養液Peptone10g酵母抽提液5g氯化鈉10g溶于蒸餾水，用NaOH調pH至7.0，定容至1000ml，高壓滅菌12ir，20min。若做平板，則加入15g瓊脂粉，高壓滅菌121'C，20min。若做LB-Amp培養液或平板，高壓滅菌后，待培養基冷至50'C左右再加入氨節青霉素(Amp)至終濃度為50ug/ml。2)2xYT培養基Tryptone16g，YeastExtract10g，NaCl5g，加蒸餾水至1L,用5mol/LNaOH調pH7.0，高壓蒸汽滅菌(1.034xl05Pa)20min，置4。C冰箱備用。3)TAE電泳緩沖液(50x儲存液)48.4gTris堿，:U.42ml冰乙酸，20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)，定容至1000ml。4)DNA凝膠加樣緩沖液0.25%溴酚蘭，40%(W/V)蔗糖水溶液。5)EB(10mg/ml):O.OlgEB粉末溶于lml蒸餾水中，室溫避光保存。6)SDS-PAGE電泳緩沖液(50x儲存液)48.4gTris堿，11.42ml冰乙酸，20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)，定容至1000ml。7)2XSDS上樣緩沖液1MTris-HCl(pH6.8)2.5ml腦SDS4ml甘油2ml蒸餾水1.5ml溴酚藍0.1%DTT0.015g共10ml8)5%積層膠(兩塊板)蒸餾水2.7ml30%凝膠儲存液0.67ml0.5MTris-HCl(pH6.8)0.5ml10%SDS40ul10%過硫酸銨(AP)40ulTEMED4ul后二者最后加。9)12%分離膠(兩塊板)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>TEMED4ul后二者最后加。10)電泳緩沖液Tris3g甘氨酸(氨基乙酸)14.4gSDSlg溶于蒸餾水定容至1000ml，4'C保存。11)考馬斯亮藍脫色液甲醇40ml乙酸10ml蒸餾水50ml12)考馬斯亮藍染色液即在脫色液中加入0."/。考馬斯亮藍R250。13)RPMI-1640-20培養液將RPMI1640補充20%滅活胎牛血清，加抗生素(青霉素100IU/ml、鏈霉素100ug/ml)，谷氨酰胺(200mmol/L)及丙酮酸鈉(10Ommol/L)配成完全培養液。14)1640-HAT培養液98mlRPMI-1640-20培養液中加入50xHAT2ml。15)50%PEG:PEG1500以lg/管分管，高壓滅菌冷卻后置4'C保存，臨用前加等體積RPMI-1640培養液混合。16)10%二甲亞砜(DMSO)凍存液RPMI1640中加入10%DMSO。臨用前新鮮配置，或置于4"C冰箱(避光)備用，保存l個月左右。17)包被液(0.05M碳酸緩沖液，pH9.6)碳酸鈉1.59g碳酸氫鈉2.93g雙蒸水1000ml18)洗滌液(O.O證BS-T，pH7.2)磷酸氫二鈉2.579g磷酸二氫鈉0.4369g氯化鈉8.5gTween-200.5ml溶于水定容至1000ml，4"C保存。19)稀釋緩沖液(含1。/。BSA的0.02MPBS緩沖液，pH7.4)氯化鉀0.2g磷酸二氫鉀0.2g磷酸氫二鈉.12H202.9g氯化鈉8.0g雙蒸水1000ml臨用前加"/。BSA。20)底物液A液0.1mol/l檸檬酸溶液B液0.2mol/lNa2HP04溶液臨用前取A液5ml和B液5ml混合加入鄰苯二胺(OPD)4mg，待充分溶解后加入30%112022.5ul，即成底物工作液。21)轉移緩沖液Tris3g甘氨酸(氨基乙酸)14.4g溶于水至1000ml，fC保存。22)麗春紅S染色液麗春紅S2g三氯乙酸30g磺基水楊酸30g溶于水至l000ml，使用時按1:9稀釋，可反復使用。23)10XRNA電泳緩沖液(MOPS0.2mol/L，EDTA0.01mol/L，NaAC0.05mol/L混勻后用2mol/L氫氧化鈉調節pH至7.0，臨用時以DEPC-H20稀釋)。24)RNA上樣緩沖液(成分有100。/6甲酰胺0.5ml、37^甲醛0.2ml、10X電泳緩沖液0.1ml、溴酚蘭0.06ml，臨用時配制)。4、His-PsL-EGF蛋白的表達與純化根據上述專利CN200310108522.5實施例1-4制備純化，結果如圖4所示。5、GST蛋白的表達與純化將pGEX-5X-l質粒轉化入BL21表達菌中，次日取單克隆加入5ml含氨芐青霉素的LB培養液，37°C，250rpm振搖過夜。次日將此菌液加入500ml含氨芐青霉素的2xYT培養基，37°C，250rpm振搖至OD6oo值達0.6-0.8，隨后加入0.4mMIPTG誘導表達特異蛋白，28。C表達5h后收集菌液。GST蛋白純化過程簡述如下將上述菌液置4t:，8000rpm離心5min，棄上清液，于沉淀中加入lxPBS40ml，振蕩使其充分混懸，分小批量置超聲破碎儀中破碎細菌，直至呈半透明狀，加入終濃度為1X的TritonX-100,置振蕩器振蕩30min，4°C，8000rpm離心15min，棄沉淀，將上清液加于預制的GlutathioneSepharose4B親和層析柱，循環上樣3次，lxPBS50ml洗滌后，加入洗脫液，靜置10min后，收集流出液，按每管lml收集、編號。取部分樣品進行SDS-PAGE電泳，剩余部分-2(TC保存備用，結果如圖4所示。實施例lPCR擴增以pET42b-PsL-EGF質粒(即pET42b(+)-L-E質粒，參見專禾廿CN200310108522.5)為模板，用引物進行PCR擴增得到人P-選擇素Lectin--EGF區域474bp片段。1、引物設計根據GenBank(登錄號M25322)中人P-選擇素lectin-EGF功能域的mRNA序列設計一對引物并結合載體的多克隆酶切位點，在上、下游引物5'端分別加入限制性內切酶位點，引物序列如下，下劃線部分為EcoRI和SalI酶切位點，引物由上海生工生物公司合成。上游5，CGTGAATTCTGGACTTATCATTACAGCAC3，EcoRI下游5，TTCGTCGACCTCTCTCACGTATTCACATTCT3，Sail2、PCRpET42b-PsL-EGF質粒lulprimer(25pmol/ul)lul95°C5min10xbuffer5ul94°Clmin，10腿ol/ldNTP2ul68。C45s>30次循環ddH2038ul72°Clmin」TagDNApolymeraselul72。ClOmi.ri總體積50ul3、PCR產物電泳取上述產物于1%瓊脂糖凝膠(含0.5ug/ul溴化乙錠)中進行電泳分析，100V,30min，紫外燈下觀察PCR產物染色條帶，結果表明擴增片段的大小與預期的474bp相符，結果如圖1的A泳道所示。4、PCR產物純化用QIAGENquick-spinPCR純化試劑盒回收PCR產物，具體過程詳見試劑盒說明。實施例2PsL-EGF-pEGMT-easy重組質粒的構建將PsL-EGF片段用EcoRI和SalI雙酶切，將酶切產物連入經同樣酶切的pGEMT-Easy載體，得到PsL-EGF-pEGMT-easy重組質粒。轉化五.co//DH5a感受態細胞，涂布于含有氨芐青霉素和IPTG/X-Gal(異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚-p-半乳糖苷)的選擇性LB培養皿中，于37t:培養過夜。挑取白色單克隆，接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養基，37°C，250rpm振搖過夜。提取質粒并進行EcoRl和SalI酶切電泳鑒定，可得大小兩個片段，證明含有正確的插入片段，結果如圖1的C泳道所示。實施例3pGEX-PsL-EGF重組質粒的構建將實施例2所得重組質粒PsL-EGF-pEGMT-easy進行EcoRI和SalI酶切后得到的小片段進行割膠純化回收后，與EcoRI、Sall雙酶切后的pGEX-5X-l質粒得到的大片段pGEX片段(如圖1的E泳道所示)連接，獲得pGEX-PsL-EGF重組質粒(如圖1的F泳道所示，構建過程如圖2所示)。轉化Eo^'XLI-Blue感受態細胞，涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上，37。C倒置培養過夜。挑取白色單克隆，提取質粒并進行EcoRI和SalI酶切電泳鑒定，可得大小兩個片段，小片段約474bp，證明含有正確的插入片段，結果如圖l的G泳道所示。再將小片段經PE3700測序儀進行測序，測序后用BLAST軟件將所測序列與GenBank中的序列進行比對，結果一致，說明所構建的重組質粒正確。實施例4目的蛋白質GST-PsL-EGF的表達與純化將鑒定正確的重組質粒pGEX-PsL-EGF轉化入表達菌種BL21(DE3)得到基因工程菌五.co/!'BL21(DE3)/pGEX-PsL-EGF。將基因工程菌Eco/!'BL21(DE3)/pGEX-PsL-EGF接種于5mlLB培養液中，37。C活化過夜，次日將上述菌液以1%比例接種于500ml含氨芐青霉素的2xYT培養基中，25°C，250rpm振搖3-4h，使其00600值達0.5-0.8，取lml菌液作為誘導表達前的對照，其余菌液加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L，誘導3h后收集菌體。收集菌液離心后，lxPBS洗滌菌體3次，BufferA(Tris-base50mM，EDTA0.5mM，NaCl50mM，甘油5%，DTT5mM)重懸菌體，冰浴中超聲破碎菌體至清亮(400W，每次5s，間歇12s，共超聲20次)，4°C，8000rpm離心15min，棄上清液，再用BufferA洗滌沉淀2-3次，于沉淀中加入8M的尿素室溫靜置30min至2h使其緩慢溶解，用濾紙濾除不溶物質。溶液加入樣品緩沖液混勻后行SDS-PAGE凝膠電泳，使用特殊樣品梳，使一次上樣體積可達lml左右，電泳結束后將蛋白質標準品和小部分樣品所在的凝膠切下，用考馬斯亮藍染色，以確定目的蛋白的位置，其余凝膠浸入冰冷的0.25MKC1溶液中染色，2-3min后即可見白色蛋白條帶，將目的蛋白所在位置的條帶切下，用去離子水浸洗15min，再洗滌2次，搗碎凝膠條用Elute溶液(0.1MSDS，50mMTris-HClpH7.9，O.lmMEDTA，5mMDTT,0.2MNaCl)浸泡，4"C過夜，次日8000rpm離心20min，取上清液加入4倍體積的丙酮(-20。C預冷)，-20°0放置411后，4°C,8000rpm離心20min，棄上清液，沉淀用8M尿素溶解后-20。C保存，即為電泳級純化的GST-PsL-EGF蛋白，結果如圖3所示。實施例5動物免疫(1)免疫前抗原的處理取適量純化后的GST-PsL,EGF融合蛋白，行12%SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結束后將凝膠浸入冰冷的0.25MKC1溶液中染色，切下白色條帶，用去離子水浸洗15min，再洗滌2次，搗碎凝膠條使其成懸液狀待用。(2)免疫方法皮下皮內注射和腹腔注射交替進行。皮下皮內注射即分別于轉基因小鼠兩側腳掌皮下注射上述抗原O.Olml，剩余部分分別注射于腿部、背部皮下及皮內。腹腔注射劑量不大于0.5ml。(3)免疫劑量及間隔時間每次每只小鼠免疫100pg上述抗原，初次免疫后，每隔2-3周加強免疫一次，加強免疫后第7d自小鼠眼眶內眥取血測效價，加強免疫后第20d，由尾靜脈注射抗原溶液100-150ug/只，3-5d內進行細胞融合。實施例6細胞融合、篩選及克隆化1、細胞準備1)脾細胞制備將實施例5中加強免疫后的轉基因小鼠摘除眼球取血后脫頸處死，收集血液以分離血清作陽性對照。另將上述處死小鼠浸于75%乙醇5min后，腹部朝上置于超凈臺上，在無菌條件下分離出脾臟，沖去血液及剝離周圍結締組織，然后將脾臟裝入100目尼龍網袋中，置于盛有10mlRPMI-1640培養液的無菌培養皿中，用鑷子隔網袋研磨脾細胞至成單細胞懸液，再用少量RPMI-1640培養液沖洗網袋后，將脾細胞懸液移入50ml離心管中，用RPMI-1640培養液洗滌兩次后懸浮于RPMI-1640培養液中進行細胞計數。2)飼養細胞制備融合前一日取一只轉基因小鼠脫頸處死，浸于75%乙醇5min后，腹部朝上置于超凈臺上，用兩把鑷子于小鼠腹中部向上下方撕開小鼠皮膚，用無菌鑷子提起腹部的同時將預制的1640-HAT培養液注入小鼠腹腔內，回抽腹腔內液體行細胞計數，用1640-HAT培養液調整細胞濃度為2xl05/ml，然后按每孔100ul將詞養細胞液滴加到96孔細胞培養板中，將培養板置于5%<:02,37X:培養箱中培養。3)骨髓瘤細胞制備常規方法復蘇骨髓瘤細胞SP2/0,加入RPMI-1640-20培養液后置于5%C02，37。C培養箱中培養。細胞融合前按1:3傳代一次，并于融合前一日細胞換液，且融合當天應以細胞處于對數生長期為宜。融合前用吸管將細胞輕輕吹落，收集于50ml離心管中，室溫1000rpm離心5min，移出上清液，將沉淀懸浮于RPMI..1640培養液中行細胞計數。2、細胞融合將上述制備的脾細胞和骨髓瘤細胞以10:1的比例混合于50ml離心管中，1000rpm離心5min，用RPMI-1640培養液洗滌2次，移出上清液后在手心輕輕敲打試管底部，使細胞團塊松勻后，置37'C水浴中緩慢加入lml50%PEG，邊加邊緩慢攪拌，而后在水浴中靜置1.5min,5min內按速度由慢到快加入RPMI-1640培養液10ml，然后補加該培養液至40ml，輕輕轉動試管，使之均勻混合，1000rpm離心5min，棄上清液,取少量1640-HAT培養液將細胞團塊輕輕吹散，再加入適量1640-HAT培養液充分稀釋，按100ul/孔加到已鋪有飼養細胞的96孔培養板中，置于37'C，5%<:02培養箱培養。期間經常觀察細胞生長情況，及時補液和換液。3、陽性克隆的篩選當雜交瘤細胞生長狀態良好，占孔底25-50%左右時，采用間接ELISA法篩選陽性克隆。1)包板將His-PsL-EGF蛋白用包被液稀釋至5ug/ml，按每孔100ul加入酶標板，置4"C冰箱過夜。2)封閉酶標板洗滌3次后，每孔加入封閉液300ul，置37i:封閉lh。3)加樣同上洗滌后，按每孔100ul加入雜交瘤細胞上清液、1:IOO稀釋的轉基因小鼠免疫血清(陽性對照)及RPMI-1640培養液(陰性對照)，置37x:孵箱溫育ih。4)加酶標二抗同上洗漆后拍干，分別加入l:5000稀釋的HRP標記的羊抗人IgM(p鏈)抗體，每孔100ul，置37-C孵箱溫育lh。5)顯色同上洗滌后拍干，每孔加入顯色液100ul，加樣結束后，用封板膜封板，置37卩顯色15-20min，加入50ul2mol/L硫酸溶液終止顯色，于酶標儀波長490nm處讀取吸光值，以0049()值大于陰性對照的2倍為陽性。對酶標板陽性孔所對應的細胞孔換新鮮培養液，培養l-2d后用5ug/mlP-選擇素標準蛋白(rhP-selectin/Fcchimera)包板再予檢測。以0049()值大于陰性孔2倍以上者進行克隆化培養。4、雜交瘤細胞的克隆化采用有限稀釋法進行克隆化。1)克隆當天制備飼養細胞，接種96孔板內，100ul/孔(2X10V孔)。2)陽性細胞從培養板內輕輕沖洗下，計數。3)用培養液連續稀釋細胞懸液成10個細胞/ml接種加有飼養細胞的96孔板內，100ul/孔。4)10天左右，雜交瘤細胞集落長至孔底25-50%左右時，開始測定上清中抗體活性。5)測得有抗體活性的陽性細胞孔時，再克隆，共進行4次。經上述重復進行ELISA篩選及亞克隆，最后篩選出1株能穩定分泌抗P-選擇素Lectin-EGF單抗的雜交瘤細胞株，命名為人源單抗雜交瘤細胞株PsL-EGFmAb-2，該細胞株已于2006年10月26日保藏于中國典型培養物保藏中心，獲得保藏號為CCTCCNO:C200634。實施例7雜交瘤細胞的染色體分析采用秋水仙素法進行染色體分析，用以鑒定所篩選的細胞株。1)加秋水仙素前24-48h將雜交瘤細胞株CCTCCNO:C200634傳代。2)在培養液中加入終濃度為0.02-0.05ug/ml的秋水仙素，繼續培養2.5-3h，收集細胞，1000rpm離心10min，棄上清液。3)加入己預溫至37。C的0.075mol/LKCl溶液2ml，將細胞懸勻，37。C水浴15-20min。4)于懸液中緩慢加入100ul新鮮配制的固定液(甲醇與冰醋酸3:l混合)，混勻后室溫靜置15min，然后1000rpm離心10min，棄上清液。5)加入固定液lml,將細胞懸勻，室溫靜置15-20min，然后1000rpm離心10min，棄上清液。6)重復操作一次，吸去上清液，根據細胞壓積留下200-400ul固定液，將細胞懸勻后，吸取細胞懸液l-2滴，滴于剛從冰水中取出的載玻片，在火焰上過數次使細胞平鋪于載玻片上，自然晾干。7)用新鮮配制的10。/。Giemsa染液染色30min，自來水漂洗去除染液，自然晾干。8)鏡檢選擇染色體分散好，無重疊，無失散的細胞進行觀察分析。經雜交瘤細胞染色體分析結果顯示，染色體數目達90條左右且較集中，多數為端部著絲點染色體，還出現少數有中部或亞中部著絲點的標記染色體(如圖5所示)。實施例8單抗輕鏈類型的鑒定采用間接ELISA法檢測所篩選的雜交瘤細胞分泌的單抗輕鏈類型。1)P選擇素標準蛋白(rhP-sdectin/Fcchimera)以每孑L0.5ug包被酶標板，置4"C過夜。2)封閉液37"C封閉lh，洗滌。3)分K鏈、X鏈兩組，每組設6個復孔，分別加入雜交瘤細胞株CCTCCNO:C200634上清液100ul。陰性對照兩孔，分別加入封閉液和PBS100ul。陽性對照兩孔，分別加入免疫血清100ul，37r孵育lh,洗滌。4)于K鏈、人鏈兩組分別加入羊抗人K鏈、X鏈單抗(各6復孔)100ul，陰性對照和陽性對照孔均加入適當稀釋的羊抗人IgM(p鏈)抗體100ul，37'C孵育lh,洗滌。5)每孔加入OPD顯色液100ul，加樣結束后，用封板膜封板，置37'C顯色15-20min，加入50ul2mol/L硫酸溶液終止顯色，于酶標儀波長490nm處讀取吸光值。間接ELISA法結果顯示，本研究篩選的雜交瘤細胞株分泌的單抗輕鏈為i型(表l)。表l單抗輕鏈類型的鑒定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實施例9人源抗體的鑒定雜交瘤細胞株CCTCCNO:C200634抽提的mRNA進行逆轉錄后，根據GenBank中人IgMFc段的mRNA序列設計引物，引物序列為上游5，-CAGTCCCCGGCAGATTCAG-3，下游5，-CTTCGCCATTCTGGCGG-3，以上述cDNA為模板進行PCR擴增，同時以人淋巴細胞為陽性對照，鼠(Balb/c鼠)淋巴細胞為陰性對照。對PCR產物進行測序，用以鑒定所篩選的單克隆抗體。PCR結果顯示，在人淋巴細胞和雜交瘤細胞株CCTCCNO:C200634中可擴增出人IgMFc段，擴增片段長度為380bp，但在鼠淋巴細胞中不能擴增出同樣的片段(如圖6所示)。對雜交瘤細胞株CCTCCNO:C200634擴增的PCR產物進行純化后，再經PE3700測序儀進行測序，測序結果與上述PCR結果相符，結果如圖7所示。實施例IO單抗特異性的檢測1、ELISA法1)分別用GST-PsL-EGF、His-PsL-EGF、GST三種蛋白各5ug/ml包板，4'C過夜；2)酶標板洗滌3次后拍干，每孔加入封閉液300ul，置37。C封閉lh;3)酶標板洗滌3次后拍干，每孔加入雜交瘤細胞株CCTCCNO:C200634上清液或轉基因小鼠的免疫血清(對照)100ul，37T:溫孵lh;4)酶標板洗滌3次后拍干，加入HRP標記的羊抗人IgM(p鏈)抗體，100u1/孔，37。C溫孵lh;5)酶標板洗滌3次后拍干，加入OPD顯色液100ul/孔，加樣結束后，用封板膜封板，37。C顯色15-20min，2mol/L硫酸50ul/孔終止顯色，于酶標儀波長490nm處測定各孔的吸收值。ELISA檢測發現，轉基因小鼠的免疫血清與His-PsL-EGF和GST蛋白均能發生作用(圖8的A所示)；但雜交瘤細胞株CCTCCNO:C200634上清液僅與His-PsL-EGF蛋白發生作用，而與GST蛋白無反應，結果如圖8的B所示。2、Westernblot于His-PsL-EGF、GST蛋白溶液加入等體積2xSDS凝膠加樣緩沖液，沸水中煮5min后上樣行12。/。SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結束后，用半千轉移儀將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白轉移至硝酸纖維素膜。轉移完畢后，用膜封閉液室溫封閉2h，加入雜交瘤細胞株CCTCCNO:C200634上清液4"過夜，次日膜洗滌液洗滌3次，每次15min，加入l:2000稀釋的HRP標記的抗人IgM(p鏈)抗體室溫反應2h，膜洗滌液洗滌3次，每次15min，在膜上滴加ECL液，經壓片、顯影、定影后洗片讀取結果。同法，將His-PsL-EGF、GST溶液上樣，以適當稀釋的轉基因小鼠免疫血清(對照)作為一抗進行反應，壓片讀取結果。Western-blot結果顯示，轉基因小鼠的免疫血清均能與His-PsL-EGF融合蛋白和GST蛋白反應，血清中存在抗PsL-EGF功能域和抗GST蛋白的抗體，也存在針對大腸桿菌中其他雜蛋白的抗體(圖9的A所示)。雜交瘤細胞株CCTCCNO:C200634上清液僅能與His-PsL-EGF蛋白發生反應，而與GST蛋白無反應，表明本發明所獲得的單克隆抗體能與PsL-EGF抗原特異結合，結果如圖9的B所示。權利要求1、一種由雜交瘤細胞株CCTCCNOC200634分泌的單克隆抗體，其是能特異性地抗人P-選擇素凝集素-表皮生長因子功能域的人源單克隆抗體。2、一種保藏號為CCTCCNO:C200634的雜交瘤細胞株。全文摘要本發明提供一種能特異性地抗人P-選擇素凝集素-表皮生長因子功能域的人源單克隆抗體，以及產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞株。本發明的單抗更適用于人體的針對P-選擇素的抗黏附調節與治療。文檔編號C07K16/18GK101186649SQ20061011848公開日2008年5月28日申請日期2006年11月17日優先權日2006年11月17日發明者同周申請人:上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院