一種測定大豆凝集素凝集活性的微膠珠elisa試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物成分檢測技術領域，具體設及一種測定大豆凝集素凝集活性的微 膠珠化ISA試劑盒。
【背景技術】
[0002] 大豆種質資源豐富，蛋白質含量較高且氨基酸比例較平衡，是動物優質的植物性 蛋白質飼料來源。但是大豆中含有多種抗營養因子，包括膜蛋白酶抑制因子、凝集素、異黃 酬、抗原蛋白等。該些抗營養因子通過干擾動物對營養物質的消化、吸收和代謝等多種方式 危害人和動物尤其是幼齡動物的生長和健康。大豆凝集素是大豆中主要的抗營養因子之 一，在成熟種子中約占大豆蛋白總含量的10%，其含量在一定程度上抑制了大豆的廣泛應 用，因此建立大豆凝集素活性的靈敏、快速的檢測方法引起研究者的關注。
[0003] 現有的大豆凝集素檢測方法，按照檢測目的不同可W分為兩類，一是檢測免疫學 活性的免疫化學分析方法，二是檢測凝集活性的兔血凝抑制實驗W及功能性化ISA方法。 最為成熟的凝集活性檢測方法是兔血凝抑制實驗，其優點是檢測設備簡單，價格低廉，缺點 是測定結果不宜觀察（需要一定的經驗才能判斷準確）、檢測準確性低、重復性差W及需要 新鮮的兔紅細胞。基于上述缺點，張海泉等建立了功能性化ISA方法，W提高檢測的準確 性，但是檢測的重復性仍然較差，而且需要準備新鮮的兔紅細胞外殼給實際檢測帶來了極 大不便。因此本申請建立了全新的微膠珠化ISA方法替代W往采用的兔血凝抑制實驗實驗 和功能性化ISA方法。

【發明內容】

[0004] 本發明針對現有技術存在的缺陷，目的在于提供一種測定大豆凝集素凝集活性的 微膠珠化ISA試劑盒，本發明利用共價鍵將大豆凝集素與凝集相關的特異性結合物連接至 膠珠上，從而獲得了耐酸，耐堿，耐鹽，能夠穩定保存的化ISA固相載體，可W替代W往采用 的兔血凝抑制實驗和功能性化ISA方法。
[0005] 本發明具體通過W下技術方案實現：
[0006] 一種測定大豆凝集素凝集活性的微膠珠化ISA試劑盒，包括：
[0007] 1)保存于濃度為20 %酒精中的微凝膠；
[000引 2)大豆凝集素抗體（凍干粉）；
[0009] 3)抗體稀釋劑PBST;
[0010] 4)有篩板的小管；
[0011] 5)辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG抗體；
[001引 6)終止液（11. 1血濃硫酸，88. 9血水）。
[001引本發明所述的微凝膠通過W下方法制備；1)將瓊脂糖配制成4%的溶液，利用噴 射方法制得瓊脂糖凝膠珠，利用柱管式分流裝置進行分級得到微膠株；2)取11ml瓊脂糖微 膠株用500ml蒸饋水洗漆，抽干加15ml0. 8moVI的化OH，4ml環氧氯丙烷，20mg棚氨化鋼， 在水浴搖床上25°C輕搖她，用冰水清洗活化凝膠，真空抽去多余的環氧氯丙烷；3)取半乳 糖溶于pH9. 00. 25M碳酸鋼緩沖液制成半乳糖溶液，將半乳糖溶液與洗凈的凝膠混合，在搖 床上振蕩，25°C偶聯20小時，用20倍微球體積的生理鹽水清洗微球，將清洗后的微球置于 4C保持，待用。
[0014] 本發明所述的大豆凝集素抗體為多克隆抗體的凍干粉。
[00巧]所述的抗體稀釋劑為；9g化Cl，2.9g化2冊〇4,0.3gNa&PO"定容至1000血，加0. 5血吐溫20。
[0016] 所述的終止液為；11. 1血濃硫酸和88. 9血水配置得到。
[0017] 本發明所述的試劑盒報包括大豆凝集素標準品。
[001引本發明所述的試劑盒的通過W下步驟進行檢測：
[0019] 1)微凝膠置于1ml有篩板的小管，將待測樣品滴到有微凝膠的小管中，解育化，用 稀釋劑沖洗；
[0020] 2)加入用稀釋劑稀釋抗大豆凝集素抗體，在37°C溫箱內培養化后，用稀釋劑沖 洗；
[0021] 3)在小管加入辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG抗體，在37°C溫箱內培養化，用稀 釋劑沖洗；
[0022] 4)加入底物培養lOmin后，滴加終止液，反應終止，測490皿處光密度值。
[0023] 所述的大豆凝集素抗體與稀釋劑的稀釋比例為l:800v/v。
[0024] 所述加入的辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG抗體用稀釋劑稀釋1000倍。
[0025] 本發明的有益效果為：本發明利用共價鍵將大豆凝集素與凝集相關的特異性結合 物連接至膠珠上，從而獲得了耐酸，耐堿，耐鹽，能夠穩定保存的化ISA固相載體，可W替代 W往采用的兔血凝抑制實驗和功能性化ISA方法，全新的微膠珠化ISA方法解決了W往方 法存在的弊端。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合實施例對本發明做進一步的說明，W下所述，僅是對本發明的較佳實施 例而已，并非對本發明做其他形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示 的技術內容加W變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發明方案內容，依據本發明 的技術實質對W下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發明的保護范圍內。 [0027] 實施例1
[002引 1)瓊脂糖微膠株的制備：將瓊脂糖配制成4%的溶液后，利用噴射方法制得瓊脂 糖凝膠珠，利用柱管式分流裝置進行分級得到微膠株。
[0029] 2)微膠株的活化：取11ml瓊脂糖微膠株用500ml蒸饋水洗漆，放在G3漏斗中抽 干加15ml0. 8mol/l的PM)H，4ml環氧氯丙烷，20mg棚氨化鋼。在水浴搖床上25°C輕搖她。 用大量的冰水清洗活化凝膠，真空抽去多余的環氧氯丙烷。
[0030] 3)大豆凝集素特異性配基的偶聯；取半乳糖溶于pH9. 00. 25M碳酸鋼緩沖液制 成半乳糖溶液；將半乳糖溶液與洗凈的凝膠混合，在搖床上振蕩，25°C偶聯20小時；用 0. 5mol/L的磯酸鋼溶液（pH7. 5)清洗微球2次。用Imol/LNaCl溶液和0. 05mol/L磯酸鋼 溶液（pH7.W清洗微球兩次。加10倍體積的lOOmmol/L己醇胺（PH7. 5)，室溫下解育化或 4°C過夜，輕輕搖勻。PBS洗2次。
[0031] 4)標準品的制備與鑒定
[00扣]大豆凝集素粗提液的制備；將48g脫脂豆粉溶于500血0. 9 %的化C1 (pH7. 2)中， 磁力攬拌器攬拌約兩個小時后，離屯、取上清液，用0. 45ym濾膜過濾，（大約500血）W備上 樣。
[003引分離提純；平衡；將柱子用0. 9%的化C1平衡兩個柱床體積（約200血）。上樣； 將上述粗提液上樣（兩個多小時），注意；瓶內大約剩10mlW內就可W換生理鹽水洗，防 止柱子干。洗雜蛋白；上樣后，用0.9%的化C1 (抑7.2)洗脫雜蛋白，至基線。洗脫凝集 素；換用0. 3M半乳糖洗脫凝集素，并用自動收集器收集洗脫液，直至基線，換用0. 9 %的 化Cl(pH7. 2)再平衡。
[0034] 透析與濃縮；將部分收集器的試管中的液體倒入透析袋中，并用透析夾夾好，放入 含有0. 9%的化C1的溶液中透析。可用磁力攬拌器攬拌每半小時換液，約3-4次即可。后 用聚己二醇濃縮。濃縮后將液體倒入50ml離屯、管中，測0D280和0D260的值，放入-20°C凍 存。
[0035] 純度檢測：經SDS-PAGE檢測，得到大豆凝集素標準品達到99% W上的純度。
[0036] 5)大豆凝集素抗血清的制備；健康雄性兔子=只，購自吉林省公主嶺，動物許可 證號；，要求年齡、胎次、體重（約2.化g)。分別免疫大豆凝集素標品。飼養階段在吉林農 業大學動物科技學院動物室進行。采用甲醒熏蒸方式消毒兔舍，待異味完全釋放后再進兔 子，保持室內干凈，空氣清新。兔子單籠飼養，自由采食、飲水。日糧配置參考GB14924-94 實驗動物營養需要及飼養成分表（中國飼料數據庫，1994年修訂版）制訂，且每日補飼胡蘿 h、綠菜葉等。
[0037] 抗原；親和層析方法提純的大豆凝集素。
[003引試劑；弗氏完全佐劑（均購自鼎國公司），弗氏不完全佐劑；腎上腺素（購自吉林 農業大學獸醫院）。
[0039] 器材與儀器；Gk88B旋禍混合器（江蘇海口牒麟醫用儀器廠），微量移液器。
[0040] 疫苗的制備；首次免疫用油佐劑苗的制備；首次采用弗氏完全佐劑疫苗。取等量 的凝集素與弗氏完全佐劑混合，利用旋禍混合器使其乳化完全即可。
[0041] 加強免疫用油佐劑苗的制備；制備方法同上，所用佐劑為弗氏不完全佐劑。
[0042] 免疫方法；
[0043] 首次免疫，足內側上皮消毒后，注射完全佐劑疫苗，選兩個位點，每點0.5ml;加強 免疫，首免后14天，背