專利名稱：一種麥胚凝集素的制備方法及其在抑制乳腺癌活性中的應用的制作方法
技術領域：
一種麥胚凝集素的制備方法及其在抑制乳腺癌活性中的應用，屬于小麥副產品精深加工技術領域。
背景技術：
小麥胚是小麥加工的副產物，每年產量在200多萬噸以上，這是一項頗為可觀的資源，值得開發和利用。麥胚凝集素(Wheat Germ Agglutinin，WGA)是一種高度保守性的甲殼素結合凝集素，WGA在谷物中的含量雖然很少，但是具有多種重要的生物學活性，尤其是抑癌活性。但長期以來，我國麥胚加工僅處于一種滿足人、畜營養的初級加工狀態，加工產品結構單一，綜合利用水平低，深加工水平遠遠低于發達國家。
以麥胚作為原料，通過鹽析、熱處理和親和層析方法制備麥胚凝集素，麥胚凝集素作為一種具有獨特性能的淀粉產品在食品、日化等行業可以進一步開發利用，這樣可提高麥胚的綜合利用價值和小麥加工業的經濟效益。但其制備工藝還可進一步改進，其應用還有待進一步開發。
發明內容
本發明的目的是提供一種麥胚凝集素的制備方法，所得麥胚凝集素具有較高的紅細胞凝集活性及乳腺癌細胞增殖抑制活性。
本發明的技術方案先將麥胚進行初粉碎成麥胚粗粉，再將麥胚粗粉進行脫脂、細粉碎、超聲強化酸提、鹽析、熱處理、超濾、親和層析，將具有紅細胞凝集活性的組分透析脫鹽，冷凍干燥即為麥胚凝集素。
(1)麥胚原料的粉碎原料粉碎后的粒徑越小，后續的脫脂和酸提就越徹底，粕中殘留的麥胚凝集素越少。所以要將原料先粗粉碎，要求過20目篩網，然后再細粉碎。
(2)脫脂用石油醚、預冷丙酮各兩次脫脂，要求麥胚中殘脂不超過2％。
(3)溶劑揮發于室溫下放置48小時至察覺不到溶劑氣味。
(4)細粉碎脫脂后的麥胚粗粉進一步粉碎，要求過60目篩。
(5)超聲強化酸液浸提細粉碎后的麥胚粉加甲酸溶液，甲酸溶液濃度為0.3～0.5M，麥胚粉與甲酸溶液的質量比控制為1∶9～1∶11，超聲強度為30W/cm2，于室溫下提取0.5～1.5小時。
料液比麥胚粉與酸的質量比例為1∶10左右，加酸量增加雖然可提高麥胚凝集素的提取率，但同時也會增加后續鹽析的難度，因此比較適宜的料液比不宜過高。
超聲強度超聲強度為30W/cm2左右，超聲強度增加雖然可提高麥胚凝集素的速度和提取率，但同時也會影響WGA結構及活性，因此比較適宜的超聲強度不宜過高。
提取時間在提取時間0.5～1.5h之間提取液的總活力較高，而總蛋白質較低，所以選取的提取時間在此范圍內為宜。
甲酸濃度在甲酸濃度0.3～0.5mol/L之間總活力較高，而總蛋白質較低，所以選取的甲酸濃度在此范圍內為宜。
(6)離心除沉淀于4℃，25000g條件下離心20分鐘，保留上清液。
(7)鹽析用硫酸銨40％飽和度鹽析，4℃過夜，然后于4℃，25000g離心20分鐘，保留沉淀；沉淀總活力隨著硫酸銨飽和度的增大而增加，當硫酸銨濃度升至40％左右時，沉淀總活力達到最大值，此后基本保持這一數值。而總蛋白隨著硫酸銨飽和度的增大而持續增加。為了兼顧提取WGA的純度和得率，選用40％的硫酸銨飽和度沉淀WGA。
(8)選擇性熱處理將硫酸銨分級后的沉淀溶于水，于65℃熱處理10min，然后于4℃，25000g離心20min除去沉淀物，可最大限度除去雜蛋白，而麥胚凝集素活性損失最低。保留上清液。
(9)超濾脫鹽、除雜蛋白、對緩沖液平衡。
WGA分子量為17～25kD之間，因此用分子截留值為50kD的中空纖維超濾管進行超濾，超濾壓力為0.2Mpa，除去分子質量較大的雜蛋白；透過液再用分子截留值為10kD的中空纖維超濾管進行超濾，超濾壓力為0.3Mpa，10kD的超濾過程重復一次，除去分子質量較小的雜蛋白，同時完成脫鹽、對緩沖液平衡。當超濾濃縮至截流液為100mL/kg麥胚時，加入5倍量pH7.8的3M脲-0.05MTris-HCl緩沖液，繼續超濾濃縮至截流液為100mL/kg麥胚，整個超濾過程均在常溫下進行。
(10)部分水解甲殼素親和層析選用層析柱L∶D為30∶1左右，規格為2.6×70cm，洗脫流速30mL/h，上樣濃度40mg/mL。先將甲殼素部分水解裝柱片狀甲殼素烘干、磨碎成粉后，依次用0.05mol/L HCl溶液、0.05mol/L NaHCO3溶液于常溫下分別處理15min，再用0.01mol/L HCl溶液于95℃恒溫條件下保溫2h，然后用1mol/L NaOH溶液調pH至中性，用蒸餾水洗滌除去溶液中的鹽，處理后的甲殼素對pH7.8的3M脲-0.05M Tris-HCl緩沖液平衡后裝柱；將(9)中最后得到的超濾截流濃縮液上樣，先用pH7.8的3M脲-0.05M Tris-HCl緩沖液洗脫雜蛋白，然后用3M脲-0.5M HCOOH洗脫麥胚凝集素，檢測洗脫液的A280nm，分部收集，保留有紅細胞凝集活性的組分。
(11)透析脫鹽及冷凍干燥將得到的有紅細胞凝集活性的組分依次在室溫條件下對流水透析、在4℃條件下對去離子水透析，至透過液中加入1％AgNO3溶液不出現沉淀，然后冷凍干燥得到麥胚凝集素。
本發明的麥胚凝集素制備方法，其特點是采用超聲強化提取技術提高提取速度和提取率，采用超濾技術同時實現脫鹽、除雜蛋白和對緩沖液平衡。
本發明方法制備的麥胚凝集素在抑制乳腺癌活性中的應用，麥胚凝集素對大鼠乳腺癌細胞株MCF-7、胰島素依賴型人乳腺癌細胞株MCF-7有增殖抑制作用，最大抑制率均出現于加藥72小時后，在2.5～80μg/mL劑量范圍內，當劑量高于20μg/mL時，對于SHZ在加藥24小時后全部死亡，10μg/mL劑量的最大抑制率達到50％；而對于MCF-7，80μg/mL劑量的最大抑制率為34％。
本發明的有益效果采用本發明方法生產的麥胚凝集素純度、得率高，工藝效率較高。本發明工藝設計科學合理，操作簡便易行，對環境無污染，為利用麥胚凝集素開發抑癌藥物提供了研究基礎，可提高麥胚深加工利用價值和相關產業的經濟效益。
圖1麥胚凝集素制備工藝流程示意圖。
圖2WGA對MCF-7的增殖抑制作用。
圖3WGA對SHZ的增殖抑制作用。
具體實施例方式
實施例1取新鮮小麥胚500g，磨碎過20目篩，2L預冷石油醚(bp 40-60℃)脫脂兩次，2L預冷丙酮脫脂兩次，室溫下使溶劑自然揮發至氣味消失。磨碎后過60目篩，用9倍0.5M甲酸溶液，超聲強度30W/cm2，室溫下攪拌提取0.5h，然后于4℃，25000g離心20min。上清液用硫酸銨40％飽和度鹽析，4℃過夜，4℃，25000g離心20min。沉淀溶于500mL水，65℃，10min熱處理，4℃，25000g離心20min，去除沉淀物，得到上清液。上清液超濾先用2.5cm×20cm，分子截留值為50kD的中空纖維超濾管進行超濾，超濾壓力為0.2MPa；透過液再用分子截留值為10kD的中空纖維超濾管進行超濾脫鹽，超濾壓力為0.3MPa，重復一次，當超濾濃縮至截流液為50mL時，加入5倍量pH7.8的3M脲-0.05M Tris-HCl緩沖液，繼續超濾濃縮至50mL，整個超濾過程均在常溫下進行。親合層析，柱規格為2.6×70cm，洗脫流速30mL/h，得到的有紅細胞凝集活性的組分依次在室溫條件下對流水透析、在4℃條件下對去離子水透析，至透過中加入1％AgNO3溶液不出現沉淀，然后冷凍干燥得到成品麥胚凝集素。
實施例2取新鮮小麥胚500g，磨碎過20目篩，2L預冷石油醚(bp 40-60℃)脫脂兩次，2L預冷丙酮脫脂兩次，室溫下使溶劑自然揮發至氣味消失。磨碎后過60目篩，用11倍0.3M甲酸溶液，超聲強度30W/cm2，室溫下攪拌提取1.5h，然后于4℃，25000g離心20min。上清液用硫酸銨40％飽和度鹽析，4℃過夜，4℃，25000g離心20min。沉淀溶于500mL水，65℃，10min熱處理，4℃，25000g離心20min，去除沉淀物，得到上清液。上清液超濾先用2.5cm×20cm，分子截留值為50kD的中空纖維超濾管進行超濾，超濾壓力為0.2MPa；透過液再用分子截留值為10kD的中空纖維超濾管進行超濾脫鹽，超濾壓力為0.3MPa，重復一次，當超濾濃縮至截流液為50mL時，加入5倍量pH7.8的3M脲-0.05M Tris-HCl緩沖液，繼續超濾濃縮至50mL，整個超濾過程均在常溫下進行。親合層析，柱規格為2.6×70cm，洗脫流速30mL/h，得到的有紅細胞凝集活性的組分依次在室溫條件下對流水透析、在4℃條件下對去離子水透析，至透過中加入1％AgNO3溶液不出現沉淀，然后冷凍干燥得到成品麥胚凝集素。
權利要求
1.一種麥胚凝集素的制備方法，其特征是先將麥胚作為原料進行初粉碎成麥胚粗粉，再將麥胚粗粉進行脫脂、細粉碎、超聲強化酸提、鹽析、熱處理、超濾、親和層析，將具有紅細胞凝集活性的組分透析脫鹽，冷凍干燥即為麥胚凝集素；(1)原料粉碎原料麥胚進行初粉碎成麥胚粗粉，要求過20目篩；(2)脫脂分別用石油醚、預冷丙酮各兩次脫脂，要求麥胚中殘脂不超過2％；(3)溶劑揮發于室溫下放置48小時至察覺不到溶劑氣味；(4)細粉碎脫脂后的麥胚粗粉進一步粉碎，要求過60目篩；(5)超聲強化酸液浸提細粉碎后的麥胚粉加甲酸溶液，甲酸溶液濃度為0.3～0.5M，麥胚粉與甲酸溶液的質量比控制為1∶9～1∶11，超聲強度為30W/cm2，于室溫下提取0.5～1.5小時；(6)離心除沉淀于4℃，25000g條件下離心20分鐘，保留上清液；(7)鹽析用硫酸銨40％飽和度鹽析，4℃過夜，然后于4℃，25000g離心20分鐘，保留沉淀；(8)熱處理沉淀溶于水，用水量為1L/kg麥胚，65℃水浴處理10分鐘，然后于4℃，25000g條件下離心20分鐘，保留上清液；(9)超濾(8)中得到的上清液先用分子截留值為50kD的中空纖維超濾管進行超濾，超濾壓力為0.2MPa；透過液再用分子截留值為10kD的中空纖維超濾管進行超濾脫鹽，超濾壓力為0.3MPa，10kD的超濾過程重復一次，當超濾濃縮至截流液為100mL/kg麥胚時，加入5倍量pH7.8的3M脲-0.05M Tris-HCl緩沖液，繼續超濾濃縮至截流液為100mL/kg麥胚，整個超濾過程均在常溫下進行；(10)親和層析先將甲殼素部分水解裝柱片狀甲殼素烘干、磨碎成粉后，依次用0.05mol/L HCl溶液、0.05mol/L NaHCO3溶液于常溫下分別處理15分鐘，再用0.01mol/L HCl溶液于95℃恒溫條件下保溫2小時，然后用1mol/LNaOH溶液調pH至中性，用蒸餾水洗滌除去溶液中的鹽，處理后的甲殼素對pH7.8的3M脲-0.05M Tris-HCl緩沖液平衡后裝柱；將(9)中最后得到的超濾截流濃縮液上樣，先用pH7.8的3M脲-0.05M Tris-HCl緩沖液洗脫雜蛋白，然后用3M脲-0.5M HCOOH洗脫麥胚凝集素，檢測洗脫液的A280nm，分部收集，保留有紅細胞凝集活性的組分；(11)透析脫鹽及冷凍干燥將得到的有紅細胞凝集活性的組分依次在室溫條件下對流水透析、在4℃條件下對去離子水透析，至透過液中加入1％AgNO3溶液不出現沉淀，然后冷凍干燥得到麥胚凝集素。
2.根據權利要求1所述麥胚凝集素的制備方法，其特征是采用超聲強化提取技術提高提取速度和提取率，采用超濾技術同時實現脫鹽、除雜蛋白和對緩沖液平衡。
3.用權利要求1所述方法制備的麥胚凝集素在抑制乳腺癌活性中的應用，其特征是麥胚凝集素對大鼠乳腺癌細胞株SHZ、胰島素依賴型人乳腺癌細胞株MCF-7有增殖抑制作用，最大抑制率均出現于加藥72小時后，在2.5～80μg/mL劑量范圍內，當劑量高于20μg/mL時，對于SHZ在加藥24小時后全部死亡，10μg/mL劑量的最大抑制率達到50％；而對于MCF-7，80μg/mL劑量的最大抑制率為34％。
全文摘要
一種麥胚凝集素的制備方法及其在抑制乳腺癌活性中的應用，屬于小麥副產品精深加工技術領域。本發明以麥胚為原料，經粉碎、脫脂、細粉碎、超聲強化酸提、鹽析、熱處理、超濾、親和層析，將具有紅細胞凝集活性的組分脫鹽后凍干即為麥胚凝集素(WGA)。通過細胞培養試驗確定WGA對大鼠乳腺癌細胞株SHZ、胰島素依賴型人乳腺癌細胞株MCF－7的增殖均具有抑制作用。本發明工藝設計科學合理，操作簡便易行，對環境無污染，為利用麥胚凝集素開發抑癌藥物提供了研究基礎，可提高麥胚深加工利用價值和相關產業的經濟效益。
文檔編號C07K1/00GK1948337SQ200610097429
公開日2007年4月18日 申請日期2006年11月8日 優先權日2006年11月8日
發明者單良, 姚惠源, 張暉, 陳正行 申請人:江南大學