專利名稱：凝集素的新用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及凝集素的新用途，特別是涉及凝集素在制備維持皮膚干/祖細胞處于G0/G1靜息期藥物中的應用。
背景技術：
皮膚覆蓋在人體表面，是機體重要的保護屏障，因此皮膚健康十分重要，但是，在日常生活中，皮膚會不可避免的受到多種損傷。
迄今為止，放射治療仍是腫瘤的主要治療手段之一，隨著放射治療學的進展，射線對正常組織的損傷已經成為不可忽視的問題。放射性皮膚損傷不僅給患者帶來痛苦，也影響腫瘤的治療效果和預后，因此預防和治療放射性皮膚損傷已引起了多方重視。陽光中有大量的紫外線，紫外線對人類的生活和生物的生長有很大影響。人們在陽光下曝曬不僅會引起皮膚過敏反應，甚至會引發皮膚癌。在日常生活中，電磁輻射無處不在，如計算機、電視機、手機和微波爐等家用電器在使用時就會產生大量的電磁輻射。皮膚如果長期暴露在超過安全劑量的輻射下，細胞就會被大面積殺傷或殺死，從而造成不同程度的皮膚損傷。
凝集素(Lectin)是植物體內的一類蛋白質或糖蛋白，與細胞表面蛋白或脂類復合物中的單糖或寡糖具有高度特異的結合能力，而且這種結合具有可逆性。自1988年Stillmark發現豆類種子提取物對動物紅細胞具有凝集作用以來(Boyd WC.Specific agglutination and hemolysis by plant extracts.Rev Hematol.1955；10(2)428-429)，越來越多的凝集素得到開發利用，如刀豆凝集素(Concanavalin ensifomis agglutinin，ConA)、菜豆凝集素(Phaseolus vulgarisagglutinin，PHA)、美洲商陸、麥胚凝集素(Wheat germ agglut inin，WGA)、mestletoe凝集素等。研究表明，許多植物凝集素都能作為動物細胞信號轉導的外源刺激因子，在各種生理反應中發揮作用。植物產生的凝集素則在分子間識別過程中起到重要作用(Moore JG，Fuchs CA，Hieklin DJ，et al.A new red kidney beanlectin called FRIL specifically stimulates proliferation of 3T3 fibroblaststransfected with the Flk2/Flt3 receptor.Blood，1997，901366a；Colucci G，Moore JG，Feldman M，Chrispeels MJ.cDNA cloning of FRIL，a lectin fromDolichos lablab，that preserves hematopoietic progenitors in suspensionculture.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(2)646-650；Kollet O，Moore.JG，Aviram R，et al.The plant lectin FRIL supports prolonged in vitromaintenance of quiescent human cord blood CD34(+)CD38(-/low)/SCIDrepopulating stem cells.Exp Hematol，2000，28(6)726-736)。

發明內容
本發明的目的是提供凝集素的新用途，即在制備維持皮膚干/祖細胞處于G0/G1靜息期藥物中的應用。
所述凝集素為植物凝集素，包括眉豆凝集素FRIL、刀豆凝集素ConA、菜豆凝集素PHA、美洲商陸和麥胚凝集素WGA等。
實驗證明，植物凝集素對皮膚干/祖細胞的生長和增殖具有抑制作用，可體外維持表皮干細胞處于G0/G1靜息期，因此，可以凝集素為活性成分制備成預防和/或治療放射性皮膚損傷的藥物。
需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的輔料，所述輔料包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、吸收促進劑、表面活性劑、潤滑劑或穩定劑等。
該藥物可以制成膏劑、乳劑、粉劑等適于外用的藥物形式，其中，膏劑為優選的劑型。
上述藥物在使用時可直接涂抹于皮膚受傷部位，一般1-3天換藥1次，6-12天為一個療程。
本發明提供了一種凝集素的新用途，即在制備維持皮膚干/祖細胞處于G0/G1靜息期藥物中的應用。實驗證明，植物凝集素對皮膚干/祖細胞的生長和增殖具有抑制作用，可以體外維持表皮干細胞長期處于G0-G1期即靜息期，處于靜息期的細胞受輻射損傷的程度最低，因此可從根本上對表皮干細胞起到保護作用，最大程度的避免放療損傷其受各種輻射損傷，動物實驗結果也表明凝集素試驗組治療放射性皮膚損傷的顯效率高達百分之百，治愈率平均也在75％以上，且安全，無任何毒、副作用，因此，可以凝集素為活性成分制備成預防和/或治療放射性皮膚損傷的藥物。本發明將在制備預防和/或治療放射性皮膚損傷的藥物及相關研究中發揮重要作用，應用前景廣闊。
下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。


圖1為PCR擴增的眉豆凝集素FRIL基因序列和氨基酸序列測序結果圖2為提取并純化的眉豆凝集素FRIL的15％SDS-PAGE檢測結果圖3為眉豆凝集素FRIL對表皮干細胞生長和增殖的影響的MTT法檢測結果
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。所用引物合成及序列測定工作均由上海博亞公司完成。
實施例1、眉豆凝集素FRIL提取、純化及其編碼基因的克隆與活性檢測一、眉豆凝集素FRIL基因的克隆用Omega Bio2tek公司的EaZy Nucleic Acid(E.Z.N.A)植物RNA提取試劑盒提取眉豆(Dolichos lablab，購自中國農業科學院)新生豆苗的總RNA。以提取的眉豆(Dolichos lablab)總RNA為模板，用RNA PCR試劑盒(Ver.211，AMV公司)反轉錄合成其cDNA，再以此cDNA為模板，在引物P15’-CGTCACAGAACGCCTCTTGTAA-3’和P25’-CGCATGTTTCCCAGTAAGGTTA-3’的引導下PCR擴增眉豆凝集素FRIL(Flt 3receptor2interacting lectin)基因。50μl PCR反應體系為4μl cDNA(100ng/μl)，引物P1和P2(10μM)各1μl，4μl dNTPs(2.5mM)，1μl Ex Taq DNA聚合酶(TakaRa公司，5u/μl)，5μl 10×PCR緩沖液，38μl滅菌水。PCR反應條件為先94℃ 30s；然后59℃30s，72℃45s，共35個循環；最后72℃7min。反應結束后，對PCR擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果獲得了819bp的DNA片段，回收并純化該目的片段，將其克隆至載體pMD-18T(TakaRa公司)中，測序，測序結果表明擴增片段具有序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列，由819個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-816位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列的蛋白質。本發明擴增的FRIL基因有3個堿基的突變，導致其編碼蛋白也相應有3個氨基酸殘基突變，但通過蛋白質成熟過程的剪接、修飾，其終產物可能與已有的FRIL氨基酸殘基序列相一致。
二、眉豆凝集素FRIL提取、純化眉豆凝集素FRIL可用下述方法提取并純化稱取50g眉豆(Dolichos lablab)干種子，研磨成粉，以5倍體積Tris緩沖液(50mmol/L Tris·HCl，1mmol/L MgCl2，1mmol/L CaCl2，pH8.0)勻漿，4℃平衡4小時以上，然后4℃、20000rpm離心20min，取上清，用冰醋酸調pH值至4.0，再用相同條件高速離心，取上清，用40％NaOH調pH值至8.0，相同條件高速離心取上清，上清即眉豆凝集素FRIL粗提液。利用凝集素對特定糖基高親和力的特性對眉豆凝集素FRIL粗提液進行親和層析純化，具體方法為將粗提液用PEG6000(Sigma公司)濃縮至原來的1/10體積后，用Tris緩沖液平衡的親和層析柱(用親和層析介質(mannose-Sepharose matrix，Pharmacia公司)填充)純化，4℃反應5小時(4小時以上)，眉豆凝集素FRIL可與親和層析介質結合，接著用Tris緩沖液洗滌至沒有蛋白流出，再用200mmol/L α-甲基α-D-甘露糖苷(Sigma公司)洗脫，得到眉豆凝集素FRIL純溶液。對純化的眉豆凝集素FRIL進行15％SDS-PAGE檢測，結果如圖2所示，在10kD-25kD范圍內有5條明顯的條帶，正是所分離的植物凝集素的5個亞基(1個β亞基和4個α亞基)(Colucci G，MooreJ G，Feldman M，et al.cDNA cloning of FRIL，a lect in from Dolichos lablab，that preserves hematopoietic progenitors in suspension culture.Proc NatlAcad Sci USA，1999，96(2)646-650)，與預期結果相符。再對純化蛋白用491A蛋白質序列分析儀進行N端前5個氨基酸殘基測序(軍事醫學科學院儀器中心色譜實驗室完成)，測序結果如表1所示，在檢測的范圍內與文獻(Colucci G，MooreJ G，Feldman M，et al.cDNA cloning of FRIL，a lect in from Dolichos lablab，that preserves hematopoietic progenitors in suspension culture.Proc NatlAcad Sci USA，1999，96(2)646-650)中報道的序列相同，但α2亞基還出現N端缺失一個氨基酸殘基的組分。對純化的眉豆凝集素FRIL用BECKMAN2COULTERDU640核酸&蛋白質分析儀定量，每50g干眉豆大約可獲得粗提FRIL蛋白約118g，純FRIL蛋白約27mg，用小管分裝，-80℃凍存。
表1 本發明眉豆凝集素FRIL凝集素部分亞基的N端氨基酸序列

三、凝集素活性測定檢測步驟二獲得的經純化的眉豆凝集素FRIL的活性，具體方法為抽取家兔耳緣靜脈血，采集紅細胞(采集方法參見文獻孫冊，朱政，莫慶漢.凝集素.北京科學出版社，1986.20)，用生理鹽水配成2％紅細胞懸液。在V型凝血板上，將步驟二獲得的眉豆凝集素FRIL用PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，4.3mmol/LNa2HPO4·7H2O，1.4mmol/L KH2PO4，pH7.3)倍比稀釋(1∶2)，每孔加25μL，再加入2％新鮮紅細胞懸液25μL，振蕩搖勻后，25℃放置1-2小時，肉眼觀察，無凝集現象時紅細胞沉積在V型孔底部呈大紅點狀，有凝集現象時呈網狀不下沉。結果顯示，純化的眉豆凝集素FRIL在稀釋到約300ng/mL仍具有凝集活性，表明步驟二提取自眉豆的蛋白確實是一種具有凝集紅細胞活性的植物凝集素，并設定該濃度(300ng/mL)為一個凝血單位。
四、糖抑制試驗將6種糖saecharose(蔗糖)、maltose(麥芽糖)、α-D-mannose(α-D-甘露糖)、glucose(葡萄糖)、α-methyl α-D-mannoside(α甲基α-D甘露糖苷)、3-0 α-D-mannose(3-0α-D甘露糖)配成濃度為1mol/L的溶液，在V型凝血板上用PBS按1∶10的梯度倍比稀釋，每孔加25μl，再往各孔添加3個凝血單位的步驟二獲得的眉豆凝集素FRIL 25μl，以及2％新鮮紅細胞懸液50μl，25℃放置1-2小時，肉眼觀察抑制結果，能與紅細胞競爭結合眉豆凝集素FRIL的糖將導致紅細胞的沉積。結果如表2所示，眉豆凝集素FRIL與α-D-甘露糖有很高的親和性，也正是利用這一特性對其進行親和層析純化的。
表2 眉豆凝集素FRIL與部分糖的抑制試驗結果

實施例2、檢測凝集素對表皮干細胞生長和增殖的影響首先檢測眉豆凝集素FRIL對表皮干細胞生長和增殖的影響，具體方法為用0.25％胰蛋白酶消化培養的人表皮干細胞(獲得及培養方法參見李劍，戴育成.無血清培養條件下人表皮干細胞的生物學特性研究.中華燒傷雜志，2005，(04))，用含10％胎牛血清的DF12培養液(Sigma公司產品，Cat#D0547)配成單細胞懸液，按每孔4000個細胞比例接種于96孔培養板，每孔體積200ul，在37℃、CO2培養箱中共培養6天。每天取出6孔細胞進行MTT比色試驗，其中3孔為試驗組(每天加入眉豆凝集素FRIL 4ul/mL)，另外3孔為對照組(無添加物)。3天后，取出6孔細胞后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL Amresco)20ul，37℃繼續孵育4小時，終止培養，然后小心吸棄孔內培養上清液，每孔加入150ul DMSO，振蕩10分鐘，最好在酶聯免疫監測儀上測定490nm波長下各孔的光吸收值，記錄結果。結果如圖3所示，與對照組(Control)相比，試驗組曲線呈下降趨勢，表明眉豆凝集素FRIL有明顯的抑止表皮干細胞生長和增殖的作用。
此外，還用上述相同方法檢測了其它凝集素ConA、PHA、美洲商陸、WGA、mestletoe(上述凝集素均購自Sigma公司)對表皮干細胞生長和增殖的影響，與對照組相比，凝集素試驗組的細胞OD490nm值均呈下降趨勢，進一步證明凝集素有明顯的抑止表皮干細胞生長和增殖的作用。
實施例3、檢測凝集素對表皮干細胞細胞周期的影響檢測眉豆凝集素FRIL對表皮干細胞細胞周期的影響，具體方法為用含10％胎牛血清的DF12培養液培養人表皮干細胞，并將相同條件下培養的細胞分為試驗組和對照組，試驗組為眉豆凝集素FRIL組(每天加入眉豆凝集素FRIL 4ul/mL)，對照組(無添加物)，培養3天后用0.25％胰蛋白酶消化細胞，1200rpm離心5min收集待測定細胞，用PBS洗一次，再用含3％胎牛血清的70％乙醇(PSB配制)重懸細胞，-20℃固定24小時后，1200rpm離心5min沉淀細胞，用PBS洗一次，棄上清，向細胞沉淀中加入10μl 10mg/mL RNase A，用PBS補充體積至100μl，37℃消化30min，用PBS補充體積至450μl，加入50μl 500μg/mL PI(購自北京寶賽生物技術有限公司)，4℃避光標記30min，最后進行流式細胞儀檢測。結果如表3所示，與對照組相比，眉豆凝集素FRIL的G0/G1期細胞比例均高于對照組，表明眉豆凝集素FRIL能夠維持更高比例的表皮干細胞處于G0/G1期，表明眉豆凝集素FRIL具有維持表皮干細胞處于G0/G1靜息期的作用。
表3 眉豆凝集素對表皮干細胞細胞周期影響的流式細胞儀檢測結果

此外，還用上述相同方法檢測了其它凝集素ConA、PHA、美洲商陸、WGA、mestletoe等對表皮干細胞細胞周期的影響，與對照組相比，凝集素試驗組處于G0/G1期的細胞比例更高，進一步證明凝集素具有維持表皮干細胞處于G0/G1靜息期的作用，可制備成預防和/或治療放射性皮膚損傷的藥物。
實施例4、療效實驗以眉豆凝集素FRIL為例，檢測凝集素對放射性皮膚損傷的療效，具體方法為采用小鼠放射損傷模型，Balb/c小鼠(購自軍事醫學科學院，80只，體重16-18g，8-12周，分為空白對照組(20只)及實驗組(60只)，實驗組小鼠再分成3個小組(每組20只)，劑量6.0Gy/只，劑量率0.68Gy/min，60Co射線對3個小組小鼠分別照射3.0Gy(輕度損傷組)、6.0Gy(中度損傷組)、12Gy(重度損傷組)至不同程度的皮膚損傷，對照組大鼠也用相同的劑量照射，對實驗組大鼠的照射損傷部位進行清潔后，涂抹濃度2.5mg/mL的眉豆凝集素FRIL，每天一次，對照組不給藥，對給藥部位進行觀察，并對治療效果進行統計。統計結果如表4和表5所示，表明用眉豆凝集素FRIL治療放射性皮膚損傷的顯效率高達百分之百，治愈率也在80％以上，而對照組皮膚損傷程度則愈發嚴重，且用藥安全，無任何毒、副作用，可用于制備預防和/或治療放射性皮膚損傷的藥物。
表4 顯效率及治愈率統計結果

表5 治愈時間統計結果

此外，還用上述相同方法檢測了其它凝集素ConA、PHA、美洲商陸、WGA、mestletoe等對預防和/或治療放射性皮膚損傷的療效，與對照組相比，凝集素試驗組治療放射性皮膚損傷的顯效率高達百分之百，治愈率平均也在75％以上，且用藥安全，無任何毒、副作用，可用于制備預防和/或治療放射性皮膚損傷的藥物。
序列表<160>2<210>1<211>819<212>DNA<213>扁豆屬扁豆種(Dolichos lablab L.[Lablab vulgaris Savi])<400>1atgtttccca gtaaggttaa gtcagcacag tcattgtcat ttagtttcac caagtttgat 60cctaaccaag aggatcttat cttccaaggt catgccactt ctacaaacaa tgtcttacaa120ctcaccaagt tagacagtgc aggaaaccct gtgagttcta gtgcgggaag agtgttatat180tctgcaccat tgcgcctttg ggaagactct gcggtattga caagctttga caccattatc240aactttgaaa tctcaacacc ttacacttct cgtatagctg atggcttggc cttcttcatt300gcaccacctg actctgtcat cagttatcat ggtggttttc ttggactctt tcccaacgca360aacactctca acaactcttc cacctctgaa aaccaaacca ccactaaggc tgcatcaagc420aacgttgttg ctgttgaatt tgacacctat cttaatcccg attatggtga tccaaactac480atacacatcg gaattgacgt caactctatt agatccaagg taactgctaa gtgggactgg540caaaatggga aaatagccac tgcacacatt agctataact ctgtctctaa aagactatct600gttactactt attatcctgg gagtaaacct gcgactctct cctatgatat tgagttacat660acagtgcttc ctgaatgggt cagagtaggg ttatctgctt caactggaca agataaagaa720agaaataccg ttcactcatg gtctttcact tcaagcttgt ggaccaatgt ggcgaagaag780gagaatgaaa acaagtatat tacaagaggc gttctgtga 819<210>2<211>272<212>PRT<213>扁豆屬扁豆種(Dolichos lablabL.[Lablab vulgaris Savi])<400>2
Met Phe Pro Ser Lys Val Lys Ser Ala Gln Ser Leu Ser Phe Ser Phe1 5 10 15Thr Lys Phe Asp Pro Asn Gln Glu Asp Leu Ile Phe Gln Gly His Ala20 25 30Thr Ser Thr Asn Asn Val Leu Gln Leu Thr Lys Leu Asp Ser Ala Gly35 40 45Asn Pro Val Ser Ser Ser Ala Gly Arg Val Leu Tyr Ser Ala Pro Leu50 55 60Arg Leu Trp Glu Asp Ser Ala Val Leu Thr Ser Phe Asp Thr Ile Ile65 70 75 80Asn Phe Glu Ile Ser Thr Pro Tyr Thr Ser Arg Ile Ala Asp Gly Leu85 90 95Ala Phe Phe Ile Ala Pro Pro Asp Ser Val Ile Ser Tyr His Gly Gly100 105 110Phe Leu Gly Leu Phe Pro Asn Ala Asn Thr Leu Asn Asn Ser Ser Thr115 120 125Ser Glu Asn Gln Thr Thr Thr Lys Ala Ala Ser Ser Asn Val Val Ala130 135 140Val Glu Phe Asp Thr Tyr Leu Asn Pro Asp Tyr Gly Asp Pro Asn Tyr145 150 155 160Ile His Ile Gly Ile Asp Val Asn Ser Ile Arg Ser Lys Val Thr Ala165 170 175Lys Trp Asp Trp Gln Asn Gly Lys Ile Ala Thr Ala His Ile Ser Tyr180 185 190Asn Ser Val Ser Lys Arg Leu Ser Val Thr Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser195 200 205Lys Pro Ala Thr Leu Ser Tyr Asp Ile Glu Leu His Thr Val Leu Pro210 215 220Glu Trp Val Arg Val Gly Leu Ser Ala Ser Thr Gly Gln Asp Lys Glu225 230 235 240Arg Asn Thr Val His Ser Trp Ser Phe Thr Ser Ser Leu Trp Thr Asn245 250 255
Val Ala Lys Lys Glu Asn Glu Asn Lys Tyr Ile Thr Arg Gly Val Leu260 265 270
權利要求
1.凝集素在制備維持皮膚干/祖細胞處于G0/G1靜息期藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述凝集素為植物凝集素。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述植物凝集素為眉豆凝集素FRIL、刀豆凝集素ConA、菜豆凝集素PHA、美洲商陸或麥胚凝集素WGA。
4.根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述植物凝集素為眉豆凝集素FRIL。
5.根據權利要求1-4任一項所述的應用，其特征在于所述藥物為預防和/或治療放射性皮膚損傷的藥物。
全文摘要
本發明公開了一種凝集素的新用途，即在制備維持皮膚干/祖細胞處于G0/G1靜息期藥物中的應用。實驗證明，植物凝集素對皮膚干/祖細胞的生長和增殖具有抑制作用，可體外維持表皮干細胞處于G0/G1靜息期，因此，可以凝集素為活性成分制備成預防和/或治療放射性皮膚損傷的藥物。本發明將在制備預防和/或治療放射性皮膚損傷的藥物及相關研究中發揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號A61P17/00GK101020045SQ20071006492
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月29日 優先權日2007年3月29日
發明者裴雪濤, 師偉, 陳琳, 呂洋王, 王韞芳, 白慈賢, 南雪, 施雙雙, 管利東 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所