一種雞白痢染色凝集抗原及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于獸醫診斷技術領域，尤其涉及一種雞白痢染色凝集抗原及其制備方法 和應用。
【背景技術】
[0002] 雞白痢是嚴重危害養雞業健康發展的重要疾病之一，可造成雛雞較高的發病死亡 率，以及成年雞生產性能降低。經蛋傳播是該病的主要途徑，因而對種雞及其所產的蛋有計 劃地進行檢測，淘汰陽性雞，培育無白痢種雞群，切斷垂直傳播途徑，是控制該病的關鍵所 在。國內外對種雞雞白痢的凈化方法主要采取全血或血清玻板凝集試驗，發現陽性雞及時 淘汰，直至全群的陽性率不超過0. 1%為止。雖然我國已有用于檢測雞白痢的平板染色抗 原產品如"雞白痢、雞傷寒多價染色平板凝集試驗抗原"，但該抗原在實際應用中存在敏感 度低、診斷速度慢、凝集圖像不夠清晰等缺陷，導致檢測后的種雞群不能達到徹底凈化的目 標，給養殖者造成了嚴重的經濟損失。

【發明內容】

[0003] 本發明的目的在于提供一種雞白痢染色凝集抗原及其制備方法，該抗原由雞白痢 沙門氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905制成，用于在雞白痢檢測試劑中的用途。
[0004] 本發明具體通過以下技術方案實現： 一種雞白痢染色凝集抗原，該抗原由雞白痢沙門氏菌SP7220、SP7701、SP8441和 SP9905制成。雞白痢沙門氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905是從歷年來收集、保存的 500余株自然病例所分離的雞白痢沙門氏菌菌種中，經多年反復篩選驗證后獲得的4株抗 原性好、變異率低的雞白痢沙門氏菌菌種。
[0005]雞白痢沙門氏菌 SP7220 (Salmonella pullorum SP7220)、SP7701 (Salmonella pullorum SP7701)、SP8441(Salmonella pullorum SP8441)、SP9905(Salmonella pullorum SP9905)已于2014年10月15日在中國典型培養物保藏中心（中國.武漢.武漢大學）保 藏，名稱及鑒別特征：雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum)，株號：SP7220,保藏編號： CCTCC N0.M 2014476;雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum)，株號：SP7701，保藏編號： CCTCC N0.M 2014475;雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum)，株號：SP8441，保藏編號： CCTCC N0.M 2014477;雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum)，株號：SP9905,保藏編號： CCTCC NO. M 2014478。
[0006] 本發明提供了雞白痢染色凝集抗原的制備方法，包括如下具體步驟： 1) 種子菌液的制備：將雞白痢沙門氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905菌種分別經 液體培養基復蘇繁殖后，接種固體平板培養基，37°C培養22h，挑選典型菌落接種固體斜面 培養基，37°C培養24h后用液體培養基洗下菌苔，再接種固體扁瓶培養基，37°C培養24h后 用液體培養基洗下菌苔檢驗合格后作為種子菌液； 2) 細菌培養：將種子菌液按培養基體積的4. 0%接種固體扁瓶培養基，經37°C培養48h 后取出，用含有0.3%福爾馬林生理鹽水洗下菌苔，經滅菌紗布過濾后收集菌液，置4°C過 夜滅活； 3)抗原制備：將滅活菌液經4000r/min離心15min去上清，用0. 2%福爾馬林生理鹽水 重新懸浮菌泥，將4個抗原生產菌種按比濁度調整菌液濃度至每毫升1. 2 X 101(ICFU，充分混 勻，用2. 0%結晶紫溶液按體積比1 :10加入上述菌液中，間隔2h后再加一次，加入后充分 混勻，于37°C放置24h充分染色后，無菌分裝制成雞白痢染色凝集抗原。
[0007] 本發明所述的液體培養基組成為：牛肉湯500ml、豬胃消化液500ml、甘油12. 0ml、 硫代硫酸鈉5. 0g、檸檬酸鈉3. 0g、硫酸錳0. 5g、硫酸鎂0. 4g、硫酸亞鐵0. lg、磷酸氫二鉀 3. 5g、海藻糖12. 0g、水解乳蛋白5. 0g。所述的固體培養基通過液體培養基中加入1. 5%的 純化瓊脂粉制成。
[0008] 本發明方法所述的雞白痢染色凝集抗原含有的細菌濃度為每毫升1.OX101(ICFU， 其中含有雞白痢沙門氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905的細菌數量分別為40 %、25 %、 20% 和 15%。
[0009] 本發明還提供了上述雞白痢染色凝集抗原在雞白痢檢測試劑中的用途。
[0010] 本發明還要求保護上述雞白痢沙門氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905。
[0011] 本發明的有益效果為：本發明工藝方法簡單合理、科學、生產穩定，成本低廉，選用 的雞白痢染色凝集抗原生產菌種抗原性好、變異率低，制成的雞白痢染色凝集抗原產品具 有敏感性高、特異性強、診斷快速、凝集圖像清晰的優點。
【具體實施方式】
[0012] 下面結合實施例對本發明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發明的較佳實施 例而已，并非對本發明做其他形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示 的技術內容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發明方案內容，依據本發明 的技術實質對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發明的保護范圍內。
[0013] 實施例1。
[0014] 1)分離純化與染色鏡檢 雞白痢沙門氏菌SP9905株于1999年5月從江蘇省揚州市某雞場的11月齡狼山雞盲 腸內容物中分離所得。其具體分離方法為：無菌采集盲腸內容物加入亞硒酸鹽胱氨酸增菌 液中37 °C過夜培養，再接種麥康凱瓊脂37 °C培養24小時，挑取直徑為0. 5mm-l. 0mm、灰白色 透明、表面光滑的菌落，接種于馬丁瓊脂培養基，37°C培養24小時。將純培養后的細菌進行 革蘭氏染色鏡檢，然后用光學顯微鏡觀察，呈兩端稍圓的細長桿菌。
[0015] 雞白痢沙門氏菌SP8441株于1984年12月從北京市某雞場的6月齡白來航蛋雞 輸卵管中分離所得。其具體分離方法為：無菌剪取輸卵管一小段加入營養肉湯中37°C過夜 培養，再接種于馬丁瓊脂培養基，37°C培養24小時。挑取直徑為1. Omm-2. 0_、灰白色透明、 表面光滑的菌落，接種于馬丁瓊脂培養基，37°C培養24小時。將純培養后的細菌進行革蘭 氏染色鏡檢，然后用光學顯微鏡觀察，呈兩端稍圓的細長桿菌。
[0016] 雞白痢沙門氏菌SP7701株于1977年2月從江蘇省揚州市某雞場死亡的白洛克雛 雞肝臟中分離所得。其具體分離方法為：無菌采集死亡雛雞的肝臟置營養肉湯中37°C過夜 培養后，再接種于馬丁瓊脂培養基，37°C培養24小時。挑取直徑為1. Omm-2. 0_、灰白色透 明、表面光滑的菌落，接種于馬丁瓊脂培養基，37°C培養24小時。將純培養后的細菌進行革 蘭氏染色鏡檢，然后用光學顯微鏡觀察，呈兩端稍圓的細長桿菌。
[0017]雞白痢沙門氏菌SP7220株于1972年11月從山東省青島市某雞場死亡的白來航 雛雞肝臟中分離所得。其具體分離方法為：無菌采集死亡雛雞的肝臟置營養肉湯中37°C過 夜培養后，再接種于馬丁瓊脂培養基，37°C培養24小時。挑取直徑為1. Omm-2. 0_、灰白色 透明、表面光滑的菌落，接種于馬丁瓊脂培養基，37°C培養24小時。將純培養后的細菌進行 革蘭氏染色鏡檢，然后用光學顯微鏡觀察，呈兩端稍圓的細長桿菌。
[0018] 2)生化鑒定 從馬丁瓊脂平板上挑取菌落，進行生化鑒定試驗。微量生化鑒定管購自杭州微生物試 劑有限公司，按照說明書進行操作。結果菌株的各項生化指標（見表1)均符合雞白痢沙門 氏菌生化特性。
[0019] 表1雞白痢沙門氏菌生化鑒定結果
【主權項】
1. 一種雞白痢染色凝集抗原，其特征在于：由雞白痢沙門氏菌SP7220、SP7701、SP8441 和SP9905制成，所述的雞白痢沙門氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905均已于2014年 10月15日在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號分別為：CCTCCNO.M2014476、CCTCC NO.M2014475、CCTCCNO.M2014477、CCTCCNO.M2014478。
2. 根據權利要求1所述的一種雞白痢染色凝集抗原，其特征在于：所述的雞白痢染 色凝集抗原含有的細菌濃度為每毫升I.OXIOltlCFU,其中含有雞白痢沙門氏菌SP7220、 SP7701、SP8441 和SP9905 的細菌數量分別為 40%、25%、20% 和 15%。
3. -種雞白痢染色凝集抗原的制備方法，其特征在于包括如下具體步驟： 1) 種子菌液的制備：將雞白痢沙門氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905菌種分別經 液體培養基復蘇繁殖后，接種固體平板培養基，37°C培養22h，挑選典型菌落接種固體斜面 培養基，37°C培養24h后用液體培養基洗下菌苔，再接種固體扁瓶培養基，37°C培養24h后 用液體培養基洗下菌苔檢驗合格后作為種子菌液； 2) 細菌培養：將種子菌液按培養基體積的4. 0%接種固體扁瓶培養基，經37°C培養48h 后取出，用含有0. 3%福爾馬林生理鹽水洗下菌苔，經滅菌紗布過濾后收集菌液，置4°C過夜 滅活； 抗原制備：將滅活菌液經4000r/min離心15min去上清，用0. 2%福爾馬林生理鹽水重 新懸浮菌泥，將4個抗原生產菌種按比濁度調整菌液濃度至每毫升I. 2XIOltlCFU的菌液濃 度后充分混勻，用2. 0%結晶紫溶液按體積比I: 10加入上述菌液中，間隔2h后再加一次，加 入后充分混勻，于37°C放置24h充分染色后，無菌分裝制成雞白痢染色凝集抗原。
4. 根據權利要求3所述的一種雞白痢染色凝集抗原的制備方法，其特征在于： 所述的液體培養基組成為：牛肉湯500ml、豬胃消化液500ml、甘油12. 0ml、硫代硫酸鈉
5. 〇g、檸檬酸鈉3. 0g、硫酸錳0. 5g、硫酸鎂0. 4g、硫酸亞鐵0.lg、磷酸氫二鉀3. 5g、海藻糖 12. 0g、水解乳蛋白5.Og;所述的固體培養基通過液體培養基中加入1. 5%的純化瓊脂粉制 成。
5. 權利要求1所述的雞白痢染色凝集抗原在雞白痢檢測試劑中的應用。
6. 權利要求1所述的雞白痢沙門氏菌SP7220。
7. 權利要求1所述的雞白痢沙門氏菌SP7701。
8. 權利要求1所述的雞白痢沙門氏菌SP8441。
9. 權利要求1所述的雞白痢沙門氏菌SP9905。
【專利摘要】本發明公開了一種雞白痢染色凝集抗原及其制備方法和應用，屬于獸醫診斷技術領域。該抗原是將雞白痢沙門氏菌菌種SP7220、SP7701、SP8441和SP9905分別復蘇傳代后制成種子菌液，再將種子菌液接種固體培養基增殖，經福爾馬林滅活后，通過比濁法調整菌液濃度，最后加入結晶紫溶液染色后充分混勻分裝即制成雞白痢凝集抗原。本發明工藝方法簡單合理、科學、生產穩定，成本低廉，選用的雞白痢染色凝集抗原生產菌種抗原性好、變異率低，制成的雞白痢染色凝集抗原產品具有敏感性高、特異性強、診斷快速、凝集圖像清晰的優點，是一種較為理想的檢測雞白痢的染色凝集抗原。CCTCC NO:M2015CCTCC NO:M2015CCTCC NO:M2015CCTCC NO:M2015
【IPC分類】G01N33-569, C12N1-20, C12R1-42
【公開號】CN104789500
【申請號】CN201510158394
【發明人】龔建森, 許明, 苗晉鋒, 張笛, 顧蓓蓓, 朱春紅, 竇新紅, 劉學賢, 徐步, 童海兵, 鄒劍敏
【申請人】江蘇省家禽科學研究所
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年4月3日