專利名稱：一種麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，是一種麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑及其制備方法。
背景技術：
隨著生活方式城市化進程的加快，哮喘患病率逐漸增高，這無疑將帶來巨大的經濟和社會負擔。昔奈酸沙美特羅是一種長效腎上腺素受體激動劑，也是一個具有抗炎活性的支氣管擴張藥物，對夜間哮喘病患者具有較好的治療作用，作為平喘、抗炎的首選藥物， 它是近20多年來在哮喘治療方面的首次重大突破，主要用于治療哮喘病、慢性支氣管炎和慢性阻塞性肺病。目前臨床上常用的是一種昔奈酸沙美特羅氣霧劑(昔奈酸沙美特羅氣霧劑哈爾濱匯利藥業有限公司)，其以吸入方式給藥，藥物吸入體內后，在肺部的保留與沉積量有限， 昔奈酸沙美特羅無法濃集于肺部發揮療效，且給藥間隔時間短，給藥劑量大，容易產生毒副作用，對于在夜間發作或病情加重的哮喘病人非常不利。用納米粒作藥物載體，具有藥物包封率高、緩釋藥物等優勢。殼聚糖是甲殼素經脫乙酰化處理而得到的一種帶正電荷的親水性多糖，具有良好的生物相容性、可生物降解性和生物黏附特性，殼聚糖納米粒已被廣泛作為藥物載體。殼聚糖納米粒的常見制備方法有沉淀法、共價交聯法、離子交聯法和乳化溶劑擴散揮發法等，其中離子交聯法(詳見=Zheng AP, Wang JC, Lu WL,et al. Thymopentin-Ioaded pH-sensitive chitosan nanoparticles for oral administration !preparation, characterization, and pharmacodynamics. J Nanosci Nanotechnol，2006，6 (9-10) :2936-2944.)是利用無毒副作用的多聚磷酸鈉對殼聚糖進行離子誘導凝膠化而制備納米粒的一種方法，該反應條件溫和，不使用任何有機溶劑。但至今未見將昔奈酸沙美特羅制備成納米粒制劑的報道。凝集素是一種非免疫源性的糖蛋白或糖特異體，特別是源于麥胚的植物性麥胚凝集素幾乎無免疫原性。凝集素可選擇性識別細胞膜表面糖分子或受體樣結構，從而同糖基化生物膜結合，因此，凝集素修飾的藥物載體系統可經細胞黏附作用介導，有利于突破上皮生物膜屏障(詳見=(I)Lis H，Sharon N. Lectins as molecules and as tools [J]. Annual Review of Biochemistry，1986，55 :35-67. (2)Ezpeleta I，Arangoa MA, Irache JM, et al. Preparation of Ulex europaeus lectin—gliadin nanoparticle conjugates and their interaction with gastrointestinal mucus[J]. Int J Pharm, 1999,191 :25-32. (3)Sharma A，Sharma S，Khuller GK.Lectin-functionalized poly(lactide-co-glycolide)nanoparticles as oral/aerosolized antitubercular drug carriers for treatment of tuberculosis[J]. J Antimicrob Chemother，2004，54 : 761-766. (4)Fei YB, Li FQ, Li L，et al. Lectin-modified transmucosal microspheres drug delivery system [J]. Pharm Care&Ites (藥學服務與研究)，2010，10 :142-145.)。

發明內容
本發明的目的是提供一種具有長效、控釋、靶向及時辰藥理調控作用的麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑。本發明以三聚磷酸鈉為交聯劑，采用離子交聯法制備昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒；并利用肺泡上皮存在特異性糖受體N-乙酰葡萄糖胺的特點，將昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒進行麥胚凝集素化修飾，制成麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒，以便通過麥胚凝集素同肺泡上皮的特異性糖受體N-乙酰葡萄糖胺結合，使昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒具有導向肺泡膜的靶向性。本發明制劑的制備方法如下一、組分與配比
昔奈酸沙美特羅 l~500mg殼聚糖 IOO-IOOOmg三聚磷酸鈉20~300mg 麥胚凝集素 0.1~40mg優選
昔奈酸沙美特羅 10~200mg殼聚糖200~500mg 三聚磷酸鈉 40-150mg麥胚凝集素 4~20mg二、制備步驟1)制備殼聚糖溶液按配比將殼聚糖分散于適量0.05 (ν/ν)稀醋酸水溶液(優選0. 1 0.5% (ν/ν)稀醋酸水溶液)中，隔夜溶脹，制成殼聚糖溶液；2)制備三聚磷酸鈉溶液按配比將三聚磷酸鈉溶于適量蒸餾水中，混勻即得三聚磷酸鈉溶液；3)制備昔奈酸沙美特羅溶液在40°C左右加熱的條件下，按配比將昔奈酸沙美特羅溶于適量乙醇中，得到昔奈酸沙美特羅溶液；4)按配比將幻中的昔奈酸沙美特羅溶液分散于2、中的三聚磷酸鈉溶液中，制成含昔奈酸沙美特羅的三聚磷酸鈉溶液；或者，按配比將幻中的昔奈酸沙美特羅溶液分散于1)中的殼聚糖溶液中，制成含昔奈酸沙美特羅的殼聚糖溶液；5)制備昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒膠體液
在持續磁力攪拌下，按配比將幻中的三聚磷酸鈉溶液緩慢滴加于4)中的含昔奈酸沙美特羅的殼聚糖溶液中，反應10分鐘，即得昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒膠體液；或者，在持續磁力攪拌下，按配比將4)中的含昔奈酸沙美特羅的三聚磷酸鈉溶液緩慢滴加于1)中的殼聚糖溶液中，反應10分鐘，即得昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒膠體液；上述制得的為昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑(其未經麥胚凝集素修飾)；6)活化昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒的表面氨基按配比向幻中的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒膠體液中加入適量0. 1 (ν/ ν)戊二醛水溶液(優選0. 2 0. 5% (ν/ν)戊二醛水溶液)，混合振搖使昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒的表面氨基活化，用磷酸鹽緩沖液(ρΗ 7.4)分離未反應的戊二醛，高速離心后棄去上清液中多余的戊二醛(以防止其交聯凝集素)，得表面氨基已活化的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒膠體液；7)制備麥胚凝集素溶液按配比將麥胚凝集素溶于適量磷酸鹽緩沖液(ρΗ 7. 4)中，得到麥胚凝集素溶液；8)制備麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑將7)中的麥胚凝集素溶液加入到6)中的表面氨基已活化的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒膠體液中，漩渦混勻，在室溫下共孵育M小時，高速離心后棄去上清液中未結合的麥胚凝集素，即得麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑。本方法還可以用于其他藥物的麥胚凝集素修飾的殼聚糖納米粒制劑的制備。經激光粒度分析儀檢測，本發明制備的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒粒徑范圍為 200 300nm，透射電鏡結果顯示納米粒外觀圓整規則。體外糖結合試驗結果表明，本發明制得的麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒具有導向肺泡膜的優勢，從而可減少給藥劑量，降低毒副作用；藥物的緩釋使藥物在肺部維持的有效濃度時間長，增強治療效果。本發明制劑可用于制備治療哮喘病、慢性支氣管炎或慢性阻塞性肺病的藥物。
具體實施例方式現結合實施例，對本發明作詳細描述實施例1制備麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑1)將殼聚糖150mg溶于IOOmL 0. 2%的稀醋酸水溶液中，得殼聚糖溶液；2)在40°C加熱的條件下，將5mg昔奈酸沙美特羅(武漢易泰科技有限公司，下同) 溶于Iml無水乙醇中，得昔奈酸沙美特羅的乙醇溶液；3)將25mg三聚磷酸鈉溶于15ml蒸餾水中，并向其中加入昔奈酸沙美特羅的乙醇溶液，得含昔奈酸沙美特羅的三聚磷酸鈉溶液；4)在600轉/分鐘的持續磁力攪拌下，將含昔奈酸沙美特羅的三聚磷酸鈉溶液緩慢滴加于殼聚糖溶液中，持續攪拌10分鐘，即得昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒膠體液；5)向昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒膠體液中加入:3ml 0. 1% (ν/ν)的戊二醛水溶液，振搖混合6小時，以活化殼聚糖納米粒表面的氨基，然后用磷酸鹽緩沖液(ρΗ 7. 4，下同)分離未反應的戊二醛，高速離心(10000rpm，30分鐘，下同)并棄去上清液中多余的戊
6)取麥胚凝集素(wheat germ agglutinin，Medicago，下同)2mg，溶于 ImL磷酸鹽緩沖液(PH 7. 4，下同)中，將該麥胚凝集素溶液加入到上述表面氨基活化后的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒膠體液中，漩渦混勻，于室溫條件下孵育M小時，高速離心(lOOOOrpm， 30分鐘，下同)后棄去上清液中未結合的麥胚凝集素，收集下層的膠體液，即得麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑。實施例2制備麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑1)將殼聚糖500mg溶于IOOmL 0. 5%的稀醋酸水溶液中，得殼聚糖溶液；2)在40°C加熱的條件下，將50mg昔奈酸沙美特羅溶于2ml無水乙醇中，得昔奈酸沙美特羅的乙醇溶液，并將其加入殼聚糖溶液中，得含昔奈酸沙美特羅的殼聚糖溶液；3)將IOOmg三聚磷酸鈉溶于15ml蒸餾水中，得三聚磷酸鈉溶液；4)在600轉/分鐘的持續磁力攪拌下，將三聚磷酸鈉溶液緩慢滴加于含昔奈酸沙美特羅的殼聚糖溶液中，持續攪拌10分鐘，即得昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒膠體液；5)向昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒膠體液中加入:3ml 0.3% (ν/ν)的戊二醛水溶液，振搖混合6小時，以活化殼聚糖納米粒表面的氨基，然后用磷酸鹽緩沖液分離未反應的戊二醛，高速離心并棄去上清液中多余的戊二醛；6)取麥胚凝集素10mg，溶于2mL磷酸鹽緩沖液中，將該麥胚凝集素溶液加入到上述表面氨基活化后的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒膠體液中，漩渦混勻，于室溫條件下孵育M小時，高速離心后棄去上清液中未結合的麥胚凝集素，收集下層的膠體液，即得麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑。實施例3制備麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑1)將殼聚糖900mg溶于IOOmL 0. 8%的稀醋酸水溶液中，得殼聚糖溶液；2)在40°C加熱的條件下，將300mg昔奈酸沙美特羅溶于20ml無水乙醇中，得昔奈酸沙美特羅的乙醇溶液；3)將200mg三聚磷酸鈉溶于15ml蒸餾水中，并向其中加入昔奈酸沙美特羅的乙醇溶液，得含昔奈酸沙美特羅的三聚磷酸鈉溶液；4)在600轉/分鐘的持續磁力攪拌下，將含昔奈酸沙美特羅的三聚磷酸鈉溶液緩慢滴加于殼聚糖溶液中，持續攪拌10分鐘，即得昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒膠體液；5)向昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒膠體液中加入:3ml 0.6% (ν/ν)的戊二醛水溶液，振搖混合6小時，以活化殼聚糖納米粒表面的氨基，然后用磷酸鹽緩沖液分離未反應的戊二醛，高速離心并棄去上清液中多余的戊二醛；6)取麥胚凝集素30mg，溶于3mL磷酸鹽緩沖液中，將該麥胚凝集素溶液加入到上述表面氨基活化后的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒膠體液中，漩渦混勻，于室溫條件下孵育M小時，高速離心后棄去上清液中未結合的麥胚凝集素，收集下層的膠體液，即得麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑。體外釋藥試驗將實施例2制備的麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑與昔奈酸沙美特羅原藥進行體外釋藥時間的對比實驗，實驗過程如下1)將一定量的麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑和昔奈酸沙美特羅原藥分別于透析袋中，兩端扎緊，分別置于兩個具塞廣口瓶中；
2)向上述兩個具塞廣口瓶中分別加入IOOml 0. 5%十二烷基硫酸鈉溶液(w/v)作為釋放介質，于37°C恒溫搖床上振蕩，轉速為120r · mirT1 ；3)分別于511^11、151^11、301^11、111、211、411、611、811、1011、1211和 18h 定時取樣，每次取樣1ml，補加同體積上述釋放介質；4)將各取樣液分別經0. 22 μ m微孔濾膜過濾，取續濾液高效液相色譜進樣，由標準曲線計算昔奈酸沙美特羅濃度，得到藥物累計釋放度。體外釋藥試驗結果昔奈酸沙美特羅原藥4h的體外累計釋藥百分數為72. 62%， 12h時達到94. 31%，有效作用時間為12h ；而本發明制得的麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒4h的體外累計釋藥百分數為51. 05%,18h時達到89. 16%，有效作用時間可達到18h以上。表明本發明制得的麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒具有明顯的緩釋效果。實施例1和3制備的納米粒制劑實驗方法同上，結果基本相一致。體夕卜釋藥實驗方法詳見:Lin AH, Liu YM, Ping QN. Free amino groups on the surface of chitosan nanoparticles and its characteristics[J]. Acta Pharm Sin( 學學報)，2007,42 :323-328o體外糖結合試驗將實施例2制備的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑與麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑進行體外糖結合的對比實驗，牛頌下腺粘蛋白可以與凝集素結合，以牛頌下腺粘蛋白為底物，在昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑和麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑分別與底物牛頌下腺粘蛋白共孵育一定時間后，分別測定其對牛頌下腺粘蛋白的結合率；再加入競爭抑制劑N-乙酰葡萄糖胺，共孵育一定時間后，再次分別測定兩種制劑與牛頌下腺粘蛋白的結合率，通過加入N-乙酰葡萄糖胺前后麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑與底物牛頌下腺粘蛋白結合率的變化來說明麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑具有與N-乙酰葡萄糖胺結合的特異性。實驗過程如下1)分別將昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑5ml和麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑5ml，與含200 μ g的牛頌下腺粘蛋白的磷酸鹽緩沖液Iml室溫共孵育3h，離心(lOOOOrpm, 15min)后取上清液；2)采用凝膠色譜分析法(詳見Usui S, Mizuno Τ, Okazaki Μ, et al. Evaluation of a gel-permeation high-performance liquid chromatography for determining triglyceride levels in serum major lipoproteins, compared with the u 1 tracentrifugation/precipitation method [J]. Clin Biochem, 2009,42 :114-117.) 貝Ij 定上清液中未結合的牛頌下腺粘蛋白量，根據測定值和加入總量的差值，計算上述兩份制劑對牛頌下腺粘蛋白的結合率，結果昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒同牛頌下腺粘蛋白的結合率為55%，麥胚凝集素修飾后的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒同牛頌下腺粘蛋白的結合率為88. 32% ；3)再向上述兩份制劑中各加入10 μ mol N-乙酰葡萄糖胺，經漩渦混勻，放置汕使結合反應達平衡；4)離心(lOOOOrpm，15min)后，采用凝膠色譜分析法再次測定上清液中未結合的牛頌下腺粘蛋白量，根據測定值和加入總量的差值，計算上述兩份制劑對牛頌下腺粘蛋白的結合率，結果昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒同牛頌下腺粘蛋白的結合率為M%，麥胚凝集素修飾后的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒同牛頌下腺粘蛋白的結合率為63. 86%。實驗結果表明加入N-乙酰葡萄糖胺后，昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒同牛頌下腺粘蛋白的結合率與不加N-乙酰葡萄糖胺時同牛頌下腺粘蛋白的結合率相比幾乎沒有變化，而麥胚凝集素修飾后的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒同牛頌下腺粘蛋白的結合率較不加N-乙酰葡萄糖胺時同牛頌下腺粘蛋白的結合率顯著下降，由88. 32%降至63. 86%，說明麥胚凝集素修飾后的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒可以與加入的N-乙酰葡萄糖胺結合， 表明麥胚凝集素同牛頌下腺粘蛋白的結合作用可以被N-乙酰葡萄糖胺競爭抑制，反映出麥胚凝集素修飾后的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒對N-乙酰葡萄糖胺的糖結合特異性， 所以麥胚凝集素修飾后的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒可富集于肺泡膜，從而達到靶向肺部的效果。實施例1和3制備的納米粒制劑實驗方法同上，結果基本相一致。本發明制備工藝簡單，經麥胚凝集素修飾后的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑可以與肺泡上皮特異性糖受體N-乙酰葡萄糖胺結合，促進藥物在肺泡膜的聚集，從而達到靶向肺部的效果，提高藥物生物利用度，減少給藥劑量，降低毒副作用。
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權利要求
1. 一種麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑，組分與配比如下
2.按權利要求1所述的麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑，其特征在于組分與配比如下
3.權利要求1或2所述麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑的制備方法，步驟如下1)制備殼聚糖溶液按配比將殼聚糖分散于0.05 (ν/ν)稀醋酸水溶液中，隔夜溶脹，制成殼聚糖溶液；2)制備三聚磷酸鈉溶液按配比將三聚磷酸鈉溶于適量蒸餾水中，混勻即得三聚磷酸鈉溶液；3)制備昔奈酸沙美特羅溶液在加熱的條件下，按配比將昔奈酸沙美特羅溶于適量乙醇中，得到昔奈酸沙美特羅溶液；4)按配比將昔奈酸沙美特羅溶液分散于幻中，制成含昔奈酸沙美特羅的多聚磷酸鈉溶液；或者，按配比將昔奈酸沙美特羅溶液分散于1)中，制成含昔奈酸沙美特羅的殼聚糖溶液；5)制備昔奈酸沙美特羅的殼聚糖納米粒膠體液在持續磁力攪拌下，按配比將幻溶液緩慢滴加于4)中的含昔奈酸沙美特羅的殼聚糖溶液中，反應10分鐘，即得昔奈酸沙美特羅的殼聚糖納米粒膠體液；或者，在持續磁力攪拌下，按配比將4)中的含昔奈酸沙美特羅的多聚磷酸鈉溶液滴加入1)液中，反應10分鐘，即得昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒膠體液；6)活化昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒的表面氨基按配比向幻中制得納米粒膠體液中加入適量0. 1 (ν/ν)戊二醛水溶液，混合振搖使殼聚糖納米粒的表面氨基活化，用磷酸鹽緩沖液分離未反應的戊二醛，高速離心后棄去上清液中多余的戊二醛，得表面氨基已活化的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒膠體液；7)制備麥胚凝集素溶液昔奈酸沙美特羅殼聚糖三聚磷酸鈉麥胚凝集素20~300mg 0.1~40mgl~500mg IOO-IOOOmg昔奈酸沙美特羅殼聚糖三聚磷酸鈉麥胚凝集素10~200mg 200~500mg 40-150mg 4~20mg按配比將麥胚凝集素溶于磷酸鹽緩沖液中，得到麥胚凝集素溶液； 8)制備麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑將麥胚凝集素溶液加入上述表面氨基已活化的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒膠體液中，漩渦混勻，在室溫下共孵育M小時，高速離心后棄去上清液中未結合的凝集素，即得麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑。
4.按權利要求3所述的麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑的制備方法，其特征在于制備殼聚糖溶液時將殼聚糖分散于0. 1 0. 5% (ν/ν)稀醋酸水溶液中， 活化昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒的表面氨基時，戊二醛水溶液的濃度為0. 2 0. 5% (ν/ν) O
5.權利要求1或2所述麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑在制備治療哮喘病、慢性支氣管炎或慢性阻塞性肺病藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及醫藥技術領域，是一種麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒制劑及其制備方法。本發明采用離子交聯法制備昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒；并利用肺泡上皮存在特異性糖受體N-乙酰葡萄糖胺的特點，制成麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒，以便通過麥胚凝集素同肺泡上皮的特異性糖受體N-乙酰葡萄糖胺結合，使昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒具有導向肺泡膜的靶向性。體外糖結合試驗結果表明，麥胚凝集素修飾的昔奈酸沙美特羅殼聚糖納米粒具有導向肺泡膜的優勢，從而可減少給藥劑量，降低毒副作用；藥物的緩釋使藥物在肺部維持的有效濃度時間長，增強治療效果。本發明制劑可用于制備治療哮喘病、慢性支氣管炎或慢性阻塞性肺病的藥物。
文檔編號A61K47/48GK102406615SQ20111036176
公開日2012年4月11日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者李鳳前, 李慧, 畢娟, 錢之光 申請人:上海市第八人民醫院