專利名稱:凝集素及其用途的制作方法
技術領域:
本發明涉及化合物、其發現方法及其治療和研究用途。具體地,本發明提供了抗病毒和抗微生物的凝集素化合物及其使用方法。
背景技術:
獲得性免疫缺陷綜合征或后天免疫缺陷綜合征(AIDS或Aids)是由在人中的人免疫缺陷病毒(HIV)(參見例如,Marx,J. L. (1982) Science 217(4560) :618-621 ;通過引用整體并入本文)以及在其他物種中的類似病毒(SIV、FIV、等)引起的對免疫系統的特定損害所導致的癥狀和感染的總稱。病癥晚期使個體容易發生機會感染和腫瘤。盡管存在延緩病毒進展的針對AIDS和HIV的治療,但是已知沒有治愈。HIV通過粘膜或血流與含有HIV的體液直接接觸而傳播,所述體液例如血液、精液、陰道液、尿道球腺液和乳汁。這種傳播可以通過肛交、陰道性交或口交、輸血、污染的注射針頭、懷孕、分娩或母乳喂養期間的母嬰交換或者與上述體液之一的其他接觸的形式發生。在沒有抗逆轉錄病毒療法時,從HIV感染發展成AIDS的中值時間是9至10年,并且發生AIDS之后的中值存活時間只有9. 2個月(參見例如,Morgan等,(2002) AIDS 16(4)597-632 ;通過引用整體并入本文)。高度活性抗逆轉錄病毒療法的使用延長了發展成AIDS的中值時間和中值存活時間。目前沒有針對HIV或AIDS的疫苗或治愈療法。唯一已知的預防方法是基于避免與病毒接觸,或者如果做不到這點,則在非常明顯的接觸之后立即進行抗逆轉錄病毒治療,稱為接觸后預防(PEP)。PEP具有非常苛刻的四周劑量方案。它還具有非常令人厭惡的副作用,包括腹瀉、不適、惡心和疲勞。需要用于治療HIV和AIDS的改良方法。發明概述本發明涉及化合物、其發現方法及其治療和研究用途。具體地,本發明提供了抗病毒和抗微生物的凝集素化合物及其使用方法。在一些實施方案中,本發明提供了具有降低的或低的促有絲分裂性的抗病毒凝集素化合物及其使用方法。在一些實施方案中,本發明提供了包含BanLec多肽(例如,變體BanLec多肽)(例如,以分離的或純化的形式)的組合物,其中所述BanLec多肽表現出抗病毒活性但是表現出相對于野生型BanLec降低的促有絲分裂活性(例如,相對于野生型BanLec或其他凝集素,促有絲分裂活性降低至少10%、至少20%、至少50%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%等)。在一些實施方案中,例如,BanLec多肽是SEQ ID NO:1-3所描述的多肽,或者由SEQ ID NO :4-6所描述的核酸或其他適合的核酸序列編碼。在一些實施方案中,BanLec多肽在位置84包含從野生型的突變。在一些實施方案中,例如,組氨酸84被突變為蘇氨酸(H84T)、絲氨酸(H84S)或甲硫氨酸(H84M)。在一些實施方案中,例如,BanLec多肽是SEQ ID NO 7所描述的多肽,或者由SEQ ID NO 8所描述的核酸或其他適合的核酸序列編碼。在一些實施方案中,BanLec多肽在位置83包含從野生型的突變。在一些實施方案中,例如,酪氨酸83被突變為纈氨酸(Y83V)。在一些實施方案中,BanLec多肽包含Y83V突變或H84T、H84S和H84M的一個或多個。在一些實施方案中,本發明提供了抗病毒、抗微生物和/或抗菌的組合物。在一些實施方案中,本文提供的組合物是全身的、區域的、局部的等(例如,局部抗病毒組合物)。本發明的實施方案提供了包含編碼BanLec多肽的核酸的表達載體(例如,包含純化標簽)以及包含所述表達載體的宿主細胞。在一些實施方案中,本發明提供了預防病毒(例如,HIV)、細菌(例如,幽門螺桿菌(helobacter pilori))和/或寄生蟲(例如,嬰兒利什曼原蟲(Leshmania infantum))感染的方法,包括使疑似包含病毒、細菌或寄生蟲的表面與前述組合物接觸。在一些實施方案中,本發明提供了治療被診斷有病毒感染(例如,HIV)、細菌感染(例如,幽門螺桿菌)和/或寄生蟲感染(例如,嬰兒利什曼原蟲)的 受治療者的方法,包括向受治療者施用前述組合物。在一些實施方案中,本發明提供了治療或預防病毒感染的組合物和方法,所述病毒包括但不限于HIV、HCV、登革病毒、馬堡病毒(Marburg virus)、依波拉病毒(Ebola virus)、西尼羅河病毒(West Nile virus)、巨細胞病毒、皰疹病毒(例如,8型)、冠狀病毒(例如,SARS)和麻疹病毒。在一些實施方案中,本發明提供了治療或預防細菌感染的組合物和方法,所述細菌包括但不限于結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻風分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、牛分支桿菌(Mycobacteriumbovis)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)(例如,血清型 3 和14)、幽門螺桿菌和乳酸桿菌(Lactobacillus spp)。在一些實施方案中,本發明提供了治療或預防寄生蟲感染的組合物和方法,所述寄生蟲包括但不限于嬰兒利什曼原蟲、皮氏利什曼原蟲(Leshmania pifanoi)、墨西哥利什曼原蟲(Leshmania mexicana)和曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)寄生蟲。在一些實施方案中,本發明提供了治療或預防真菌感染的組合物和方法,所述真菌包括但不限于煙曲霉(Aspergillus fumigatus)和白色念珠菌(Candida albicans)。在一些實施方案中,本發明提供了治療或預防其表面具有甘露糖的任何微生物的感染的組合物和方法。在一些實施方案中,本發明的組合物(例如,BanLec和/或BanLec突變體)與微生物表面上的甘露結合糖。在一些實施方案中,本發明提供了治療或預防與DC-SIGN受體相互作用的微生物的感染的組合物和方法。附圖簡述
圖1顯示了 H84T的促有絲分裂活性。圖2顯示了突變體H84S、H84M、H84Y和H84A的促有絲分裂活性。圖3顯示了天然BanLec和重組BanLec的抗HIV-1活性的比較。在HIV-1分離株YU2 (A)或90CF402(B)感染之前30分鐘,向TZM_bl細胞添加從香蕉果實分離的天然BanLec或從大腸桿菌分離的重組BanLec。病毒孵育后48小時,通過測量熒光素酶活性來定量感染。(C)BanLec與其他凝集素的促有絲分裂活性比較。圖4顯示H84T的性質。(A)H84T與rBanLec的促有絲分裂活性比較。(B)如通過流式細胞術測量的,在BanLec或H84T BanLec存在下⑶4T細胞上活化標記⑶69的誘導。(C)通過Banlec和H84TBanlec誘導細胞因子/趨化因子。(D)H84T保留抗HIV-1活性。圖5顯示重組BanLec的表達。重組BanLec的純化的考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE凝膠。凝膠泳道如下加樣1 :分子量標準,2 :含有重組BanLec的裂解物,3 :柱負載穿流,4 :25mM咪唑洗滌,5 :第一次250mM咪唑洗脫,6 :第二次250mM咪唑洗脫,7 :香蕉來源的BanLec,8 :用于細胞裂解步驟的溶菌酶蛋白。圖6顯示BanLec抑制含有共有亞型B和亞型C包膜的HIV-1。圖7顯示BanLec和BanLec H84T的三維晶體結構的比較。圖8顯示與α -甲基D-甘露糖苷結合時,BanLec WT與Η84Τ的結構運動的差異。(Α.)未結合的BanLec (插入,WT和Η84Τ的重疊)和(B.)在α -甲基D-甘露糖苷存在下(插入,WT和Η84Τ的重疊)的1Η-15Ν HSQC光譜的峰強度相關性。
圖9顯示了變體BanLec肽的序列。定義為了方便理解本發明,以下定義了許多術語和短語。如本文使用的,術語“受治療者”指將通過本發明的實施方案的方法治療的生物。此類生物優選地包括但不限于哺乳動物(例如,鼠、猴、馬、牛、豬、犬、貓等),并且最優選地包括人。在本發明上下文中,術語“受治療者”一般指將接受或已經接受針對特征為微生物感染或者微生物感染風險的病癥的治療(例如,施用本發明的肽和任選一種或多種其他藥劑)的個體。如本文使用的,術語“診斷”指通過其體征和癥狀(例如,抵抗傳統療法)或者遺傳分析、生理分析、組織分析、診斷測定(例如,針對微生物感染)等識別疾病。如本文使用的,術語“體外”指人工環境以及發生在人工環境中的過程或反應。體外環境包括但不限于試管和細胞培養物。術語"體內"指天然環境(例如,動物或細胞)和發生在天然環境中的過程或反應。如本文使用的,術語“宿主細胞”指無論是位于體外還是體內的任何真核或原核細胞(例如,哺乳動物細胞、禽細胞、兩棲動物細胞、植物細胞、魚細胞和昆蟲細胞)。如本文使用的,術語"細胞培養物"指細胞的任何體外培養物。該術語包括連續傳代細胞系(例如,具有不變的表型)、原代細胞培養物、有限細胞系(例如,非轉化的細胞)和體外維持的任何其他細胞群,包括卵母細胞和胚胎。如本文使用的,術語“有效量”指足以實現有益或期望結果的治療劑(例如,本發明的肽)的量。有效量可以通過一個或多個施用、應用或劑量來施用,并且不意圖限于特定的制劑或施用途徑。如本文使用的,術語“聯合施用”指向受治療者施用至少兩種藥劑(例如,本發明的肽)或療法。在一些實施方案中,兩種或多種藥劑/療法的聯合施用是共時的。在一些實施方案中,第一藥劑/療法在第二藥劑/療法之前施用。本領域技術人員理解,使用的各種藥劑/療法的制劑和/或施用途徑可以變化。本領域技術人員可以容易地確定聯合施用的適當劑量。在一些實施方案中,當聯合施用藥劑/療法時,各藥劑/療法以低于適合它們單獨施用時的劑量施用。因此,在其中藥劑/療法的聯合施用降低已知潛在有害(例如,毒性)藥劑的必需劑量的實施方案中特別需要聯合施用。如本文使用的,術語“毒性”指與施用毒劑之前的相同細胞或組織相比,對細胞或組織的任何傷害或有害效應。如本文使用的,術語“藥物組合物”指活性劑與惰性或活性載體的組合,使得組合物特別適合體內、體內或離體的診斷或治療用途。如本文使用的,術語“藥學可接受的載體”指任何標準的藥物載體,例如磷酸鹽緩沖的鹽水溶液、水、乳狀液(例如,油/水或水/油乳狀液)和各種類型的潤濕劑。組合物還可以包含穩定劑和防腐劑。有關載體、穩定劑和佐劑的實例(參見例如,Martin,Remington' sPharmaceutical Sciences,第 15 版,Mack Publ. Co. , Easton,PA[1975])。如本文使用的,術語“樣本”以其最廣泛的含義使用。樣本可以包括細胞、組織或從細胞(例如,微生物)分離的液體、核酸或多肽等。如本文使用的,術語"純化的"或"純化"指從樣本去除不想要的組分。如本文使用的,術語"基本上純化的"指至少60%、優選75%和最優選90%或更多沒有通常與之相伴的其他組分。如本文使用的,術語“調節”指化合物(例如,本發明的化合物)影響(例如,殺傷或防止生長)微生物的活性。"氨基酸序列"和諸如"多肽"或"蛋白質"的術語不意味著將氨基酸序列限于與所提蛋白質分子有關的完全天然的氨基酸序列。如本文使用的,術語"天然蛋白質"指不含由載體序列編碼的氨基酸殘基的蛋白質;即,天然蛋白質僅含有該蛋白質天然存在時存在的那些氨基酸。天然蛋白質可以通過重組方式產生,或者可以從天然存在的來源分離。如本文使用的,當提及蛋白質(如在"給定蛋白質的一部分"中)時,術語"蛋白質"指該蛋白質的片段。片段大小范圍可以從4個氨基酸殘基至完整氨基酸序列減去I個
氨基酸。
術語“測試化合物”指可用于治療或預防身體功能的疾病、不健康狀態、病態或疾患或者以其他方式改變樣本(例如,微生物感染)的生理或細胞狀態的任何化學實體、藥劑、藥物等。測試化合物包括已知和可能的治療化合物。可以通過利用本發明的篩選方法來確定測試化合物是治療性的。“已知的治療化合物”指已經顯示(例如,通過動物試驗或之前施用給人的經驗)在這種治療或預防中有效的治療化合物。發明詳述本發明涉及化合物、其發現方法及其治療和研究用途。具體地,本發明提供了抗病毒和抗微生物的凝集素化合物及其使用方法。稱為BanLec的凝集素分離自香蕉(小果野蕉(Musa acuminate)品種)的成熟果實,以分子量大約30kDa的二聚體存在。它是木菠蘿相關凝集素家族(jacalinrelatedlectin family)的成員,并且可以識別高甘露醇結構。該家族凝集素的特征為存在由三個希臘鑰匙(Greek Key)轉角基序構成的β _棱柱I結構。希臘鑰匙I和2都參與結合糖類,并且含有GXXXD結合基序,而鑰匙3不含有該結合基序。然而,該環可以幫助配體結合并決定凝集素特異性。BanLec具有許多使它有望發展成為殺菌劑組分的性質,包括高穩定性、廣譜的抗HIV活性和在大腸桿菌中生成的能力。此外,BanLec已經被許多人經常食用,并且這可以導致口服耐受性,證據是報道的IgG4抗體對BanLec的反應(致耐受性的)。已經顯示BanLec作為抗HIV治療劑或殺菌劑(例如,陰道或直腸殺菌劑)的組分具有治療效用。然而,存在有關凝集素的促有絲分裂活性和炎性活性的安全性顧慮。在本發明的實施方案發展期間,通過產生BanLec變體H84T而解決了這些顧慮,H84T保留了抗HIV-1活性但展示了非常明顯降低的促有絲分裂活性和促炎活性。BanLec是HIV感染的有效抑制劑,其顯著減少一系列HIV-1分離株的復制(Swanson等,J. Biol. Chem. 285 :8646(2010);通過引用整體并入本文)。本發明實施方案發展期間進行的實驗證明了 BanLec活性。本發明的實施方案提供了改變的BanLec序列(例如,SEQ ID NO :1_6)或其活性片段。改變BanLec的氨基酸序列以降低其促有絲分裂活性,同時維持有效的抗HIV活性。通過使用可商購的定點誘變試劑盒,將突變引入含有編碼BanLec的DNA序列的表達載體。通過DNA測序證實突變,并表達和純化得到的突變體。然后測試純化的突變體的促有絲分裂活性。
因此,在一些實施方案中,本發明提供了其中促有絲分裂性已經與抗HIV性質分開的凝集素。本發明使用BanLec凝集素示例說明。然而,本發明不限于BanLec。本發明的實施方案提供了具有降低或消除的促有絲分裂性同時保留有用的治療性質的其他凝集素(例如,來自其他物種)。本發明不限于本文描述的BanLec突變體(例如,SEQ ID NO :1_8)。導致促有絲分裂性降低或減少同時保留抗病毒性質的任何突變包括在本發明范圍內。在一些實施方案中,本發明提供了表現出相對于野生型BanLec降低的促有絲分裂活性的變體BanLec多肽(例如,相對于野生型BanLec或其他凝集素,促有絲分裂活性降低至少10%、至少20%、至少50%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%等)。本文描述的突變體BanLec凝集素可用于多種應用。例如,在一些實施方案中,非促有絲分裂的BanLec多肽(例如,SEQ ID NO 1-3)可用于治療病毒感染(例如,HIV)的治療組合物。在一些實施方案中,非促有絲分裂的BanLec多肽用于與已知的HIV治療劑組合(例如,作為治療性混合物的部分)。本領域普通技術人員熟知如何配制這種治療性混合物。在一些實施方案中,將BanLec組合物(例如,SEQ ID NO :1_3和7)用作局部抗病毒組合物的組分(例如,以殺傷HIV并因此預防感染)。例如,在一些實施方案中,BanLec (例如,通過SEQ ID NO :1_3和7所描述的那些)包含在制劑中用作陰道抗病毒劑(例如,與含有或疑似含有HIV的體液(例如,精液)接觸之前或之后使用)。在一些實施方案中,使用包含BanLec的抗病毒制劑來處理避孕套、性用具或可能與含有HIV或其他致病病毒的體液接觸的其他物體。本發明不限于HIV的治療或殺傷。因為BanLec通過與病毒包膜上的糖結合而抑制病毒復制,它可用于預防或治療人、動物和植物的其他病毒感染。在一些實施方案中,本文描述的組合物不限于抗病毒應用。在一些實施方案中,組合物可用作抗微生物、抗細菌、抗寄生蟲和抗真菌劑。例如,在一些實施方案中,本發明提供了治療或預防病毒感染的組合物和方法,所述病毒包括但不限于HIV、HCV、登革病毒、馬堡病毒、依波拉病毒、西尼羅河病毒、巨細胞病毒、皰疫病毒(例如,8型)、冠狀病毒(例如,SARS)和麻疫病毒。在一些實施方案中,本發明提供了治療或預防細菌感染的組合物和方法,所述細菌包括但不限于結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、牛分支桿菌、肺炎鏈球菌(例如,血清型3和14)、幽門螺桿菌和乳酸桿菌。在一些實施方案中,本發明提供了治療或預防寄生蟲感染的組合物和方法,所述寄生蟲包括但不限于嬰兒利什曼原蟲、皮氏利什曼原蟲、墨西哥利什曼原蟲和曼氏血吸蟲寄生蟲。在一些實施方案中,本發明提供了治療或預防真菌感染的組合物和方法,所述真菌包括但不限于煙曲霉和白色念珠菌。在一些實施方案中,組合物可用于治療涉及呈遞適當表面糖(例如,甘露糖)的生物的感染。在一些實施方案中,組合物不限于表面應用。在一些實施方案中,通過藥物領域技術人員理解的適當遞送途徑(例如,靜脈內、口服、局部等)施用組合物。本發明的實施方案還提供了藥物組合物(例如,包含上述治療劑的一種或多種)。本發明的藥物組合物可以多種方式施 用,取決于希望局部治療還是全身治療以及待治療的區域。施用可以是局部的(包括眼睛和粘膜,包括陰道和直腸遞送)、肺部(例如,通過吸入或吹入粉末或氣溶膠,包括通過噴霧器;氣管內、鼻內、表皮和透皮)、口服或胃腸外。胃腸外施用包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注;或顱內,例如,鞘內或心室內施用。用于局部施用(例如,至組織、傷口、器官等)的藥物組合物和制劑可以包括透皮貼片、軟膏、洗劑、乳霜、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉末。常規藥物載體、水性、粉末或油性基底、增稠劑等可能是必要或所需的。口服施用的組合物和制劑包括粉末或顆粒、水或非水介質中的懸浮液或溶液、膠囊、小袋或片劑。增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可能是需要的。用于胃腸外、鞘內或心室內施用的組合物和制劑可以包括無菌水溶液,其還可以含有緩沖劑、稀釋劑和其他適當添加劑,例如但不限于滲透增強劑、載體化合物和其他藥學上可接受的載體或賦形劑。本發明的藥物組合物包括但不限于溶液、乳液和含有脂質體的制劑。這些組合物可以從多種組分產生,包括但不限于預制液體、自乳化固體和自乳化半固體。可以常規以單位劑量形式存在的本發明藥物組合物可以根據制藥行業熟知的常規技術制備。此類技術包括使活性成分與藥物載體或賦形劑結合的步驟。一般而言,通過使活性成分與液體載體或細碎固體載體或兩者均勻且緊密地結合,然后如果必要則使產物成形,來制備制劑。本發明組合物還可以包含常規存在于藥物組合物中的其他佐劑組分。因此,例如,組合物可以含有其他相容的藥物活性材料,例如止癢劑、止血劑、局部麻醉劑或抗炎劑,或者可以含有用于物理上配制本發明組合物的各種劑型的其他材料,例如染料、調味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩定劑。然而,此類材料在添加時不應該不當地干擾本發明組合物的組分的生物活性。制劑可以被滅菌,并且如果需要可以與不會有害地與制劑的活性劑相互作用的輔助劑混合,所述輔助劑例如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩沖劑、著色劑、香料和/或芳香物質等。給藥取決于待治療的疾病狀態或病癥的嚴重程度和響應性,療程持續數天至數月,或者直至實現治愈或者實現疾病狀態的減輕。在一些實施方案中,以一個或多個療程施用治療,其中每個療程包括每天一個或多個劑量,持續數天(例如,1、2、3、4、5、6)或數周(例如,1、2或3周等)。在一些實施方案中,療程被相繼施用(例如,療程間沒有間隔),而在其他實施方案中,療程之間提供了 I或多日、周或月的間隔。在一些實施方案中,在進行或維持基礎上提供治療(例如,提供多個療程,有或沒有不定時段的間隔)。最佳給藥方案可以從患者體內藥物累積的測量值來計算。主治醫師可以容易地確定最佳劑量、給藥方法和重復率。在一些實施方案中,劑量從O. 01 μ g至IOOg每kg體重,并且可以每天、每周、每月或每年給予一次或多次。治療醫師可以基于藥物在體液或組織中測量的停留時間和濃度來估計給藥的重復率。實驗提供以下實施例以證明和進一步示例說明本發明的某些優選實施方案和方面,并且不應被解釋為限制其范圍。
實施例1為了確定BanLec的抗HIV活性,將不同濃度的凝集素在與各種HIV-1分離株感染之前與TZM-bl指示細胞孵育。考察了 BanLec抑制幾種不同的HIV-1分離株的能力。病毒克隆81A-4和NL(AD8)都是NL4-3的衍生物,其中一部分包膜與分別來自R5 HIV-1分離株BaL或ADA的包膜區交換。81A-4和NL(AD8)利用CCR5作為細胞共受體(R5嗜性),而NL4-3利用CXCR4作為細胞共受體(X4嗜性)。這些分離株允許評估不同HIV-1包膜對BanLec的敏感性,同時保持NL4-3病毒組分的其余部分不變。還評估了雙嗜性分離株89. 6對BanLec的易感性。觀察到針對不同嗜性的病毒分離株以低納摩爾范圍內計算的IC5tl值的劑量依賴性的病毒感染抑制。還使用HIV-1指示細胞系MAG1-CCR5進一步證實了 BanLec的抗HIV活性。利用該細胞系,測定了 BanLec抑制實驗室適應的分離株BaL(R5)和Bru(X4)以及原代分離株ASM44 (R5X4)和ASM 54 (R5X4)感染的能力,并且確定全部受BanLec抑制。R5嗜性病毒是性傳播HIV-1中發現的主要形式。為了確定BanLec是否能夠抑制來自不同進化枝的其他原代分離株,測試了 BanLec對具有源自亞型B和C的原代分離株的包膜的假型HIV-1的抑制。這些亞型常見于北美洲和中美洲(亞型B)和非洲和印度的部分(亞型C)。觀察到BanLec對病毒復制的有效的亞納摩爾濃度抑制。噬菌體易感于HIV-1感染并且可以變成不能被高活性抗逆轉錄病毒療法清除的病毒貯庫。陰道噬菌體在HIV-1致病中的作用還沒有被完全表征,但最近證據指示,這些細胞容許HIV-1感染。測定了 BanLec抑制MDM的HIV-1感染的能力。經15天的時段,納摩爾濃度的BanLec抑制了 MDM中的HIV復制。而且,如通過在第15天進行的MTT測定所測定的,BanLec對細胞活力無影響;因此,該影響不是由于細胞毒性。當BanLec在培養上清液中保持7天而沒有改變培養基或添加額外凝集素時,BanLec對HIV-1復制抑制的IC5tl值是9. 72nM,證明37°C下BanLec在長期培養體系中保持為有效且穩定的抑制劑。測試了 BanLec阻止PBL中的HIV-1細胞進入的能力。預計BanLec與HIV-1包膜上存在的高甘露糖結構結合,防止進入并由此防止感染。如果是這樣,當細胞在BanLec存在下接觸HIV-1時,應該檢測到很少或沒有早期HIV-1逆轉錄的強終止DNA產物。在不同濃度BanLec存在下將PBL與HIV-1 Bru分離株孵育。作為陽性對照和用于比較,平行進行了使用凝集素GNA的類似實驗。使用實時PCR檢測強終止DNA,強終止DNA是可以在病毒進入之后、在病毒脫殼發生之前早期檢測的逆轉錄產物。通過用DNA酶I處理來去除病毒原液中可能已經存在的強終止DNA,以消除逆轉錄產物的假檢測。以低凝集素濃度的BanLec處理導致強終止DNA的明顯減少,指示BanLec除了抑制MDM中的病毒復制外,還阻止PBL中的HIV-1感染。而且,這種抑制在早期復制事件之前的步驟、在病毒進入的水平上發生。已知BanLec與甘露糖結合,并且 因此假設BanLec結合糖基化gpl20包膜蛋白上存在的高甘露糖結構并且阻止HIV-1進入細胞。使用基于BanLec的ELISA來測量糖基化HIV-1 gpl20與BanLec的結合。觀察到BanLec以濃度依賴性方式與gpl20結合。而且,已知的BanLec配體甲基- a -D甘露吡喃糖苷以濃度依賴性方式抑制這種結合。因為HIV-1包膜蛋白上高密度的糖類殘基,高濃度的甲基- a -D甘露吡喃糖配體是競爭與gpl20結合所需的。使用基于ELISA的測定來測定BanLec阻止單克隆抗體2G12結合的能力。2G12識別對于抗體識別而言關鍵的位置Asn-295、-332和-392 (位置編號具有HXB2參考序列)處的N連接糖基化結構簇。發現,用BanLec預處理gpl20以劑量依賴方式抑制了 2G12的識別,指示BanLec能夠與由高甘露糖結構組成的該抗體表位結合。為了進一步考察BanLec在病毒生命周期的哪個階段抑制HIV-1感染,測試了BanLec抑制附著后的HIV-1感染的能力。為此,測試了 BanLec是否能夠抑制已經與細胞結合但由于溫度限制而未能完成融合的HIV-1。在附著后測定中觀察到HIV-1附著抑制劑CD4-1gG2的抑制活性的大大減少,而結合的病毒依然對融合抑制劑T-20基本上完全易感。這證明在16°C發生病毒附著而非融合。CCR5結合抑制劑maraviroc和BanLec都主要是通過抑制HIV-1附著而阻止病毒復制,但是各自對病毒融合具有適度影響。改變BanLec的氨基酸序列以降低其促有絲分裂活性,同時維持有效的抗HIV活性。通過使用可商購的定點誘變試劑盒而將突變引入含有編碼BanLec的DNA序列的表達載體。通過DNA測序證實了突變,并且表達并純化得到的突變體。然后測試純化的突變體的促有絲分裂活性。還測試了突變體的抗HIV活性并與野生型形式的活性比較。在用含有共有的亞型C包膜的假型HIV-1感染之前,用不同濃度的野生型或突變體形式的BanLec預處理TZM_bl細胞。通過測量響應感染而產生的報告基因活性來定量感染。通過非線性回歸測定突變體和野生型序列的IC5tl值。用突變體的IC5tl值除以野生型BanLec蛋白的IC5tl,測定了突變體的抗HIV活性的倍減。通過將BanLec的位置84的氨基酸組氨酸突變為氨基酸蘇氨酸(H84T)、絲氨酸(H84S)或甲硫氨酸(H84M)而實現了促有絲分裂活性的降低(圖1&2)。并非所有突變導致該表型;用丙氨酸(H84A)或酪氨酸(H84Y)取代組氨酸84不導致促有絲分裂活性的減少。突變體H84T、H84S和H84M的抗HIV活性減少,但是他們保持納摩爾范圍內的有效的IC5tl值。此外,抗HIV活性的倍減明顯小于促有絲分裂活性的減少(表I)。圖1顯示了 H84T的促有絲分裂活性。通過測量外周血淋巴細胞(PBL)的增殖來評估促有絲分裂活性。從健康供體分離PBL。將細胞與不同濃度的凝集素或作為對照的PBS孵育。細胞被孵育3天,并且然后向培養物添加BrdU。增殖細胞加入BrdU,并且然后通過抗BrdU ELISA定量。對于定量,將促有絲分裂活性表示為刺激指數。這是治療樣本除以PBS治療對照的值。通常,如果刺激指數大于3 (下虛線)則認為凝集素是促有絲分裂的。然而,觀察到了 griffithsin超過3的值。因為已經報道了這是非促有絲分裂的,10被用作截止值,因為griffithsin在除一例以外的所有情況下未超過該閾值。rBanLec代表克隆的野生型BanLec,而H84T代表其中組氨酸84已變為蘇氨酸的克隆的BanLec。圖2顯示了突變體H84S、H84M、H84Y和H84A的促有絲分裂活性。如圖1所述,評價了促有絲分裂活性。rBanLec代表克隆的野生型BanLec,而H84S、H84M、H84Y和H84A分別代表其中組氨酸84已變為絲氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸或丙氨酸的克隆的BanLec。表I提供示例性BanLec突變體的抗病毒活性和促有絲分裂活性的總結。表I =BanLec突變體的抗HIV活性和促有絲分裂活性的總結
權利要求
1.一種包含變體BanLec多肽的組合物,其中所述變體BanLec多肽表現出抗病毒或抗微生物活性,并且其中所述BanLec多肽表現出相對于野生型BanLec多肽降低的促有絲分裂活性。
2.根據權利要求1所述的組合物,其中所述變體BanLec多肽選自由SEQID N0:l_3組成的組。
3.根據權利要求1所述的組合物,其中所述變體BanLec多肽由選自由SEQID NO :4_6組成的組的核酸編碼。
4.根據權利要求1所述的組合物,其中所述變體BanLec多肽具有SEQID NO 7的氨基酸序列。
5.根據權利要求1所述的組合物,其中所述變體BanLec多肽由SEQID NO :8的核酸編碼。
6.根據權利要求1所述的組合物,其中所述組合物是抗病毒、抗微生物、抗真菌和/或抗寄生蟲的藥物組合物。
7.根據權利要求1所述的組合物,其中所述組合物治療或預防呈遞表面甘露糖的微生物的感染。
8.一種治療和/或預防微生物感染的方法,所述方法包括施用根據權利要求1所述的組合物。
9.根據權利要求8所述的方法,其中所述組合物是局部施用的。
10.根據權利要求8所述的方法,其中所述組合物全身地治療和/或預防所述感染。
11.根據權利要求8所述的方法,其中所述感染由包含表面甘露糖的微生物引起。
12.根據權利要求11所述的方法,其中所述微生物是病毒、細菌、寄生蟲或真菌。
13.根據權利要求12所述的方法,其中所述病毒是HIV。
14.根據權利要求11所述的方法,其中將所述組合物施用給被診斷有感染的受治療者。
15.根據權利要求11所述的方法,其中將所述組合物施用給處于感染風險的受治療者。
16.根據權利要求11所述的方法,其中將所述組合物施用給疑似有感染的受治療者。
17.—種表達載體,其包含編碼根據權利要求1所述的組合物的核酸。
18.根據權利要求17所述的表達載體,其中所述表達載體還包含蛋白質純化標簽。
19.一種宿主細胞,其包含根據權利要求18所述的表達載體。
全文摘要
本發明涉及化合物、其發現方法及其治療和研究用途。具體地,本發明提供了從香蕉分離的抗病毒和抗微生物的凝集素化合物(BanLec)。這些化合物具有低的促有絲分裂性和促炎活性同時保持抗HIV-1活性。
文檔編號C07K14/47GK103025756SQ201180029440
公開日2013年4月3日 申請日期2011年4月11日 優先權日2010年4月14日
發明者D.馬科維奇, M.斯萬森, I.戈德斯坦, H.溫特 申請人:密執安大學評議會