專利名稱：白細胞凝集素及其應用的制作方法
白細胞凝集素及其應用本發明涉及多肽即凝集素、其編碼核酸序列和針對多肽的抗體，以及它們在各種醫學應用中的用途。細胞免疫防御系統是在微生物和寄生蟲的挑戰中存活的關鍵。該系統對于處理癌發生中、病毒感染后和自體免疫疾病中的不正常細胞來說，也是最為相關的。細胞間識別是這些功能的核心，但是對這些現象的起源本身的了解十分貧乏。在原始有性生物群億萬年的趨異變化后，必須進化出能確保性細胞的物種特異性識別(“受精”)的基因。否則，有性物種的存活率將受到威脅。進化出了幾種細胞識別分子。當在寒武紀生物群侵入陸地生境時，這種干燥的生境越來越有利于將有性受精限制于庇坊環境， 使物種混雜的機會降低。因此，用于物種特異性配子識別的基因將趨于變得多余，并因此能夠在進化中自由獲得新的功能。一種明顯的新功能是生物體辨別其自己(自身)細胞與外來(非自身)細胞的能力。已經提出，這種機制為細胞免疫系統的起源提供了一種合理的解釋，否則這種現象很難解釋。這種由先天免疫提供的辨別能力(Medzhitov & Janeway, 1997, Cell, 91 (3), P295-298)對于多細胞生物體防止其被寄生蟲和微生物蠶食來說是必需的。系統辨別“自身”與“非自身”的機能障礙，可能形成了某些自體免疫疾病的基礎。被稱為自體免疫的錯誤定向的免疫應答，由自身抗體或與宿主抗原反應的T淋巴細胞的存在而證實。盡管它通常是無害的并可能是脊椎動物生命的普遍現象，但自體免疫能夠引起廣范圍的被稱為自體免疫疾病的人類疾病。自體免疫作為人類疾病的原因這一概念是相對新的，并且直到20世紀50和60年代還未被醫學思想的主流所接受。自體免疫疾病被定義為其中發生了從良性自體免疫到病原性自體免疫的發展的疾病。這種發展由遺傳影響和環境觸發物兩者所決定。自體免疫疾病是對健康的重大威脅。有超過八十種疾病由自體免疫引起。它們對女性特別有威脅；約75%的患者是女性。在高達65歲的所有年齡組中，自體免疫疾病是女性中的十大死因之一。自體免疫疾病影響身體的許多不同部位，包括皮膚(例如斑禿、大皰性類天皰瘡、 后天性大皰性表皮松解、落葉性天皰瘡、尋常性天皰瘡、白癜風，牛皮癬和痤瘡)、腎臟(例如IgA腎病)、血液(例如再生障礙性貧血、自體免疫性溶血性貧血、特發性血小板減少性紫癜和惡性貧血)、關節(例如強直性脊柱炎)、肌肉(例如多肌炎/皮肌炎)、耳(例如自體免疫性聽力喪失和美尼爾綜合征)、眼(例如角膜侵蝕性潰瘍，賴特綜合征和Vogt-小柳-原田病)、心臟(例如自體免疫性心肌炎、Churg-Strauss綜合征、巨細胞動脈炎、川崎病、結節性多動脈炎、多發性大動脈炎和韋格納肉芽腫)、內分泌系統(例如阿狄森氏病、自體免疫性甲狀旁腺機能減退、自體免疫性垂體炎、自體免疫性卵巢炎、自體免疫性睪丸炎、 格雷夫斯病、橋本甲狀腺炎、1型多腺體自體免疫綜合征(PAS-I)、2型多腺體自體免疫綜合征(PAS-2)、3型多腺體自體免疫綜合征(PAS 3)和1型糖尿病)、胃腸系統(例如自體免疫性肝炎、乳糜瀉、炎癥性腸病和原發性膽汁性肝硬化)、神經系統(例如慢性炎癥性脫髓鞘性多發性神經病、格林-巴利綜合征、多發性硬化癥和重癥肌無力)，或者可能系統地影響身體(例如抗磷脂綜合征、自體免疫性淋巴細胞增生、自體免疫性多內分泌病、白塞氏病、 肺出血-腎炎綜合征、類風濕關節炎、結節病、硬皮病、干燥綜合征和系統性紅斑狼瘡)。自體免疫疾病能夠攻擊身體的任何部分，因此癥狀廣泛變化，并且診斷和治療通常是困難的。除非正確診斷和治療，否則某些自體免疫疾病可能威脅生命。慢性自體免疫病癥例如類風濕關節炎使患者變跛，并且也對患者的家庭產生重負。某些類型的眼色素層炎可能導致眼盲。疾病例如硬皮病需要巧妙、終生的治療。其他自體免疫疾病包括格雷夫斯病和慢性甲狀腺炎，如果正確診斷，可以成功地治療，但是因為它們發病輕微而常常被錯過。炎癥是一種正常的過程，在該過程中身體的白細胞和化學物質保護身體抵抗感染和外來物例如細菌和病毒。然而，在某些疾病中，身體的免疫系統在沒有外來物抗擊時的不恰當地引發炎性響應。因此，炎癥在自體免疫疾病中常見，但不是所有炎性病癥都是自體免疫性應答。炎性疾病也可以由廣泛的各種直接攻擊身體的因子引起，例如微生物(病毒和真菌)、細菌毒素、某些藥劑(抗生素和抗炎性留族化合物)以及化學試劑(膽鹽、有毒家用化工產品)。與炎癥有關的疾病包括關節炎(其是描述關節中炎癥的通用術語)、心臟的炎癥(心肌炎)、將空氣運輸到肺的小管的炎癥(其可以引起哮喘發作)、腎臟的炎癥(腎炎)和大腸的炎癥(結腸炎)。胃腸炎性病癥是特別重要的(例如胃部炎性疾病(例如胃潰瘍、十二指腸潰瘍和胃炎)和腸道炎性疾病(包括克羅恩病、炎癥性腸病、熱帶性和非熱帶性口炎性腹瀉、傳染性腸炎、結腸炎、潰瘍性結腸炎、假膜性結腸炎、憩室炎以及過敏性和放射性炎性疾病)。胃腸炎性疾病的特征是炎癥，特別是出現浮腫、特征性炎性細胞(即白細胞、組織細胞和巨噬細胞)，以及在某些情況下出現表面上皮的壞死和潰瘍。已知這些炎性疾病由廣泛的各種因子引起，所述因子存在于胃腸道中，已知攻擊其表面，產生炎性疾病響應。這些因子包括微生物(病毒和真菌)、細菌毒素、某些藥劑(抗生素和抗炎性留族化合物)以及化學試劑(膽鹽、有毒家用化工產品)。事實上，胃酸本身能攻擊胃黏膜并產生炎性狀態。目前使用的用于治療炎癥的藥物包括非甾族抗炎藥(NSAID，例如阿司匹林、布洛芬或萘普生)、皮質類固醇(例如強的松)、抗瘧疾藥物(例如羥基氯喹)和其他藥物例如甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、來氟米特、抗TNF藥物、環磷酰胺和霉酚酸。某些胃腸疾病、特別是胃病，可以通過抑制引起炎癥的胃酸分泌，例如通過中和酸的效應(例如給藥解酸劑)或通過給藥有效抑制胃酸分泌的藥劑，來進行治療。受損的皮膚易受感染，并可能難看和/或引起疼痛或不適。某些傷口類型在正常生理條件下對愈合有抗性，例如慢性潰瘍。任何修復受損皮膚、特別是修復傷口的藥物解決方法都是非常需要的。對于適合以最小的副作用治療自體免疫和炎性病癥和疾病或皮膚損傷的治療方法，仍存在需求。在對可能參與真核生物進化的過程進行了多年研究之后，本發明人鑒定到一種新的蛋白質(在本文中也稱為白細胞凝集素(leukolectin))，其不僅存在于配子和合子中， 而且也存在于早期胚胎中(在被稱為Iectocyte的特化細胞中)以及血細胞的個體發生過程中，并且最后存在于白細胞中。該蛋白最初在魚中鑒定到并從其中純化(參見實施例)。該蛋白具有255個氨基酸。這是凝集素的前肽形式，其包含19個氨基酸的N-端肽，這表明它靶向溶酶體以便晚些時候分泌(即進入到卵周空間中)。利用凝集素的氨基酸序列能夠開發表位特異性抗體，取決于所分析的組織，其反過來使得能夠鑒定到蛋白的許多個)上的同種型(圖幻。已經從鮭魚分離到至少兩個mRNA (參見實施例11)，其包含少量序列差異，在多肽水平上僅產生7個改變(

圖17)。截短形式的蛋白也已經從鮭魚白細胞(參見SEQ ID NO 2)和斑馬魚中分離到，在斑馬魚中已經鑒定到分泌形式(如上所述，用sLL表示)和截短形式，所述截短形式從N-端失去前32 個氨基酸，用tLL表示(參見實施例9)。該蛋白與任何已知蛋白幾乎沒有相似性，顯示出與任何已知蛋白的總相似性低于 50%。在小結構域中觀察到與鱟凝集素(tachylolectin)的一些相似性。相關蛋白已經在各種動物中鑒定到，包括斑馬魚、鱈魚、虹鱒魚、異體住囊蟲 (Oikopleura dioica)，還有雞和人類。它們的cDNA被鑒定(參見實施例)，并被發現是極端保守的。在已經研究過的物種中編碼的蛋白顯示出低于4%的變化。這表明這些蛋白具有必不可少的功能。到目前為止還沒有報道在任何生物體中有序列相似的基因。使用針對各個外顯子或內含子的探針，已經確立只有一個外顯子與兩種已報道的其他蛋白的一部分具有少量相似性，這兩種蛋白與本文描述的分子實體完全不同。重要的是，這個新基因特異性表達在人類白細胞中，盡管不能在已發表的人類基因組序列中找到該基因。該基因只有非常短的區段可以被檢測到，但遍布在多個人類染色體中(參見實施例)。這個謎題的解答到目前為止還未找到。最后，已發現該分子實體被細胞分泌，其與蛋白的前肽形式同一。天然和重組形式的基因產物兩者都已分離到。令人吃驚地發現，這些蛋白對特別是皮膚的自體免疫和炎性病癥以及其他皮膚病癥具有顯著效應。盡管不希望受到理論的束縛，但據信白細胞凝集素與特異性受體結合，啟動人體的正常和固有的愈合過程。從觀察到的效應，我們提出白細胞凝集素參與細胞免疫的正常過程。在許多疾病狀態下白細胞凝集素似乎丟失，使得將其作為藥物導入觸發了免疫系統在面對各種激惹出現外來細胞(微生物、寄生蟲)和“自身”的改變細胞時所正常執行的其他防御性應答，這可能將白細胞凝集素與自體免疫疾病的病因相聯系，即這樣的病癥可能由缺乏足夠的白細胞凝集素引起。人類白細胞含有并表達極其保守的白細胞凝集素蛋白。到現在為止，這些蛋白在血細胞中還是未知蛋白。白細胞凝集素看來是鱟凝集素家族蛋白的新成員。在第一方面，本發明提供了多肽，其包含序列號1-8任一個中顯示的氨基酸序列， 或與所述序列至少50%同一的序列，或任何所述序列的部分。“多肽”在本文中是指具有優選超過50、100、150、200或250個殘基和/或少于 500、400、300、200或100個殘基或從中選擇的范圍的分子。本文中指稱的“部分”優選包含它所源自的序列的至少30、40、50、60、70、80、90、100、150、200個或以上的氨基酸。所述部
分可以從序列的中間或N-端或C-端部分獲得。優選情況下，所述部分從N-末端、例如從多肽的前50、100或150個殘基獲得。優選情況包括所述多肽的截短，例如除去信號肽或天然存在的變體中不存在的部分。優選的截短發生在N-末端，并且長度為1至50例如1至10,20,30或40，或5至40例如10至；35個殘基。優選情況下，所述序列與它所比較的序列至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、 97、98 或 99% 同一。可以通過例如使用SWISS-PR0T蛋白質序列數據庫，使用帶有可變pamfactor的 FASTA ρ印-cmp，并將間隙生成罰分(gap creation penalty)設置為12.0，間隙延伸罰分 (gap extension penalty)設置為4. 0，窗口為2個氨基酸，來確定序列同一性。優選情況下所述比較在全長序列上進行，但是可以在較小的比較窗口上進行，例如少于200、100或 50個連續的氨基酸。優選情況下，這種序列同一性相關多肽與所列舉的序列號中顯示的多肽在功能上等價。這些功能上等價的多肽可以采用下面顯示的衍生物的形式。同樣，具有序列號中顯示序列的多肽可以如下所述進行修飾，而不影響多肽的序列。此外，本文中描述的“部分，，可能是功能等價物。優選情況下，這些部分滿足本文中提到的同一性條件(相對于可比較區域來說)。正如在本文中提到的，為了實現“功能等價”，多肽相對于親代分子(即其所源自的分子，例如通過氨基酸取代)在執行醫療功能方面可以顯示出某些降低的效能，但優選同樣有效或更加有效。因此，功能等價物是指有效治療本文中提到的疾病，即減輕患者的一種或多種癥狀例如炎癥或后文中所述的皮膚外觀的多肽。這可以通過以定性或定量方式比較衍生多肽相對于其所源自的多肽的效應，例如通過執行在實施例中提到的體內分析，來測試。當定量結果可用時，衍生物的有效性為親代多肽的至少30、50、70或90%。可選地， 可以執行體外測試，例如通過分析與樹突狀細胞的結合或對體外細胞培養物的影響。與天然存在的蛋白相關或從其衍生的功能等價的蛋白，可以通過利用單個或多個氨基酸取代、添加和/或缺失(只要它們滿足上面提到的序列同一性要求即可)以修飾天然氨基酸但不破壞分子的功能，來獲得。優選情況下，天然序列具有少于20個取代、添加或缺失，例如少于10、5、4、3、2或1個這樣的修飾。這些蛋白由通過一個或多個堿基的適當取代、添加和/或缺失所產生的“功能上等價的核酸分子”編碼。優選的功能等價物是“添加”變體，其中產生了包含與親代多肽融合的其他蛋白或多肽的氨基和/或羧基端融合蛋白或多肽。特別優選的功能等價變體是天然生物學變化形式(例如等位基因變體或物種內或可選不同屬例如植物、動物或細菌中的地理變化形式)，以及使用已知技術制備的衍生物。例如，可以通過化學合成或采取重組體形式，使用已知的定點突變技術包括核酸的缺失、隨機誘變或酶切割和/或連接，來生產編碼功能等價蛋白的核酸分子。本發明還提供了編碼所述多肽的核苷酸序列。因此，在優選情況下，本發明提供了在序列號9-15任一個中顯示的核苷酸序列， 與所述序列至少50%同一的序列，或在6x SSC/50%甲酰胺和室溫的非嚴緊結合條件下、并且在高嚴緊條件例如SSC、65°C下清洗時與所述序列雜交的序列，或與任何上述序列互補的序列，或其部分，其中SSC = 0. 15M NaCl,0. 015M檸檬酸鈉，pH 7. 2。優選情況下，所述核酸分子編碼前文中顯示的多肽。“核酸分子”在本文中是指優選具有150、300、450、600或750個以上的堿基和/或少于1500、1200、900、600或300個堿基或從中選擇的范圍的分子。上面所指的“部分”優選包含它所源自的序列的至少90、120、150、180、210、240、270、300、450或600個核苷酸堿
基。優選情況下，所述部分編碼前文中所述的N-端、中段或C-端肽。正如上面涉及多肽時所討論的，在優選情況下考慮到導致從所列舉多肽的N-末端除去殘基的截短。在編碼核苷酸序列中，相對于本文提出的序列，所述截短的長度優選為1至150、例如1至30、60、90或 120，或13至120例如28至105個堿基。優選情況下，所述序列與它所比較的序列至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、 97、98 或 99% 同一。可以通過例如使用GCG軟件包的FASTA搜索，使用缺省值和可變pamfactor，并將間隙生成罰分(gap creation penalty)設置為12.0，間隙延伸罰分(gap extension penalty)設置為4. 0，窗口為6個核苷酸，來確定序列同一性。優選情況下，這些序列同一性相關或雜交核酸分子與所列舉的序列號中顯示的核酸分子在功能上等價。這些功能等價的核酸分子可以采取下面顯示的衍生物的形式，并且如果它們編碼的多肽根據上文中描述的測試被認為是功能等價的，則所述衍生物被認為是功能等價的。優選的功能等價物是編碼上面提出的優選多肽的等價物，例如編碼在不同于本文提到的特定分子的屬或種中所發現的多肽的核酸分子。此外，本文中描述的“部分”可能是功能等價物。優選情況下，這些部分滿足本文中提到的同一性(相對于可比較區域來說)或雜交條件。本發明的核酸分子可以是單鏈或雙鏈DNA、cDNA或RNA，優選為DNA，并包括如上所述的簡并的、基本上同一的和雜交的序列。然而，理想情況下分子是DNA或cDNA。如上所述的多肽包括通過例如不影響多肽序列的化學修飾、包括去糖基化或糖基化進行修飾的多肽。這樣的多肽可以通過不影響功能性的多肽的合成/分離后修飾，例如特定殘基的某種糖基化、甲基化等，來制備。本發明的多肽可以采取肽模擬物的形式，其可以被看作其中多肽的功能特點被保留、但是存在于不同背景例如非肽結構中的衍生物。這樣的肽模擬物已被成功開發，并用于其它特定醫學應用中。肽模擬物、特別是非肽類分子，可以通過各種方法來產生，所述方法包括基于構象的藥物設計、篩選、集中文庫設計和經典藥物化學。不僅可以使用非天然氨基酸或其他有機結構單元的寡聚體，而且可以通過本技術領域已知的方法使用糖類、雜環或大環化合物以及包含提供分子靜電表面的結構性元件和構象、模擬肽的三維構象的相同性質的任何有機分子。因此，肽模擬物可以具有與肽骨架非常少的或沒有相似性。肽模擬物可以包含全合成的非肽形式(例如基于具有適合取代基的糖骨架)，或者可以保留它所基于的肽的一個或多個元件，例如通過衍生一個或多個氨基酸或用可選非肽組分代替一個或多個氨基酸。類似肽的模板包括假肽和環肽。可以將被認為對于肽的功能來說多余的結構元件最小化以便只保留支架功能，或者在適合時將所述結構元件移除。當肽模擬物保留一個或多個肽元件、即一個以上氨基酸時，這些氨基酸可以用非標準氨基酸或其結構類似物代替。也可以將保留在序列中的氨基酸進行衍生或修飾(例如標記、糖基化或甲基化)，只要本發明的多肽的功能性質得到保留即可。肽模擬物被稱為 “可衍生自”某個多肽序列。此時，它意味著肽模擬物參照所確定的多肽序列設計，使得它保留了多肽對于其功能來說必需的結構特征。這可以是多肽的特定側鏈或結構的氫鍵形成潛力。這些特征可以由非肽組分或一個或多個氨基酸殘基提供，或者連接多肽的所述氨基酸殘基的鍵可以被修飾，以便改進多肽的某些功能例如穩定性或蛋白酶抗性，同時保留多肽對于其功能來說必需的結構特征。可以使用的非標準或結構類似氨基酸的實例有D-氨基酸、酰胺電子等排體(例如 N-甲基酰胺、tetro-inverse酰胺、硫代酰胺、硫酯、膦酸酯、酮亞甲基、羥基亞甲基、氟代乙烯基、(E)-乙烯基、亞甲基氨基、亞甲基硫代或烷烴)、L-N_甲基氨基酸、D-α -甲基氨基酸、 D-N-甲基氨基酸。非常規氨基酸的實例列于表1中。表 權利要求
1.一種多肽，所述多肽包含序列號1-8任一個中顯示的氨基酸序列，或與所述序列有至少50%同一性的序列，或任一所述序列的一部分。
2.—種核酸分子，所述核酸分子包含序列號9-15任一個中顯示的核苷酸序列，與所述序列有至少50%同一性的序列，或在室溫和6xSSC/50%甲酰胺的非嚴緊結合條件下、并且在高嚴緊條件例如^ SSC和65°C下清洗時與所述序列雜交的序列，或與任一上述序列互補的序列，或其一部分，其中SSC = 0. 15M NaCl，0. 015M檸檬酸鈉，pH 7.2。
3.一種載體，優選為表達載體，所述載體包含權利要求2中限定的核酸分子。
4.一種用于制備權利要求3的重組核酸分子的方法，所述方法包含將權利要求2中限定的核酸分子插入到載體核酸中。
5.一種用于制備權利要求1中的多肽的方法，所述方法包含將含有權利要求2中限定的核酸分子的宿主細胞在使所述多肽表達的條件下培養，并回收由此產生的所述分子。
6.一種多肽，所述多肽從權利要求5的方法獲得。
7.一種宿主細胞，所述宿主細胞含有權利要求1的多肽或權利要求2的核酸分子。
8.一種抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段與權利要求1的多肽特異性結合。
9.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權利要求1中限定的多肽、權利要求2中限定的核酸分子或權利要求8中限定的抗體，以及一種或多種可藥用賦形劑和/或稀釋劑。
10.權利要求9的組合物，其用于治療中。
11.一種用于治療或預防動物自體免疫病癥、炎性病癥或受損皮膚的方法，其中向所述動物給藥一項或多項前述權利要求中描述的多肽、核酸分子、抗體或藥物組合物。
12.—項或多項前述權利要求的多肽、核酸分子、抗體或藥物組合物在制備治療或預防動物自體免疫病癥、炎性病癥或受損皮膚的藥物中的應用。
13.—項或多項前述權利要求的多肽、核酸分子、抗體或藥物組合物，用于治療或預防動物的自體免疫病癥、炎性病癥或受損皮膚。
14.權利要求11至13任一項的方法、應用、多肽、核酸分子、抗體或藥物組合物，其中所述待治療或預防的病癥是皮膚的自體免疫或炎性病癥或受損皮膚，其中所述多肽、核酸分子、抗體或組合物優選局部給藥于皮膚。
15.權利要求14的方法、應用、多肽、核酸分子、抗體或藥物組合物，其中所述待治療或預防的病癥是瘡、潰瘍、濕疹、痤瘡、牛皮癬、胃腸炎癥(優選為克羅恩病、潰瘍性結腸炎和其他慢性炎癥)、牙齦炎、口腔和食管的炎癥或受損皮膚。
16.權利要求15的方法、應用、多肽、核酸分子、抗體或藥物組合物，其中所述受損皮膚過敏或紅腫、凍裂、曬傷、被輻射、熱損傷或者是創傷。
17.—種產品，所述產品包含在一項或多項前述權利要求中限定的一種或多種多肽、核酸分子或抗體和一種或多種其他活性成分作為復合制劑，用于同時、分別或相繼使用在人類或動物的治療中。
18.權利要求11至17任一項的方法、應用、多肽、核酸分子、抗體、藥物組合物或產品， 其中所述動物是哺乳動物，優選為人類。
全文摘要
本發明涉及一種被描述為凝集素的多肽、其編碼核酸序列和針對多肽的抗體以及它們在各種醫學應用中的用途，特別是在動物中治療或預防自體免疫病癥、炎性病癥或受損皮膚。
文檔編號C07K14/47GK102203127SQ200980143206
公開日2011年9月28日 申請日期2009年10月29日 優先權日2008年10月29日
發明者米盧舍·米夫塔里, 貝恩特·斯·沃瑟爾 申請人:盧科萊特公司