檢測谷蛋白敏感性和其區分于乳糜瀉的方法和裝置制造方法
【專利摘要】抗體被用作生物標記來輔助區分谷蛋白免疫反應性和敏感性、無癥狀乳糜瀉、克羅恩氏病和其它腸相關的病理與典型的乳糜瀉。在一類實施方式中，測試來自人類或其它動物的血清、唾液或其它樣品的針對以下的抗體：(a)小麥抗原；(b)麥醇溶蛋白抗原；和(c)麥胚凝集素、谷嗎啡、麥谷蛋白、脫去酰氨基的麥谷蛋白、強啡肽原和強啡肽中的一個或多個。測試結果被認為特別有意思，其中小麥抗原和麥醇溶蛋白抗原均選自α-麥醇溶蛋白33聚體、α-麥醇溶蛋白17聚體、γ-麥醇溶蛋白15聚體、ω-麥醇溶蛋白17聚體和麥谷蛋白21聚體。測試板和試劑盒可有利地測試α-麥醇溶蛋白、γ-麥醇溶蛋白、ω-麥醇溶蛋白、麥谷蛋白、麥胚凝集素、谷嗎啡、強啡肽原、轉谷氨酰胺酶-2、轉谷氨酰胺酶-3、轉谷氨酰胺酶-6、和結合麥醇溶蛋白的轉谷氨酰胺酶中至少三、五、七個或所有的抗原。
【專利說明】檢測谷蛋白敏感性和其區分于乳糜瀉的方法和裝置
[0001]相關申請
[0002]本申請要求2011年I月20日提交的美國臨時申請號61/434，501的權益，其以其全部通過引用被并入本文。
發明領域
[0003]本發明涉及幫助診斷腸相關疾病和病理一包括至少谷蛋白免疫反應性和敏感性、無癥狀乳糜?寫(silent celiac disease)和克羅恩氏病-的方法和試劑盒。
[0004]發明背景
[0005]小麥過敏、乳糜瀉和谷蛋白敏感性是由攝入小麥醇溶蛋白而觸發的三種不同的狀況(1、2)。在這些狀 況中，對谷蛋白的反應是由細胞和體液免疫應答介導的，導致呈現不同的疾病復合癥狀。例如，在小麥過敏中，麥醇溶蛋白肽的特定序列在肥大細胞和嗜堿粒細胞表面上交聯兩個IgE分子，觸發釋放介質，如組胺和白三烯類(3)。
[0006]本文討論的這些和所有其它外源性材料以其全部通過引用被并入。當并入的參考文獻中術語的定義或使用與本文提供的該術語的定義不一致或相反時，應用本文提供的該術語的定義，而不應用參考文獻中該術語的定義。
[0007]乳糜灣(celiac disease,⑶)是這樣的自身免疫狀況,其具有已知的遺傳組成和環境觸發物，如麥醇溶蛋白肽。CD影響1-2%的一般人群。遍及本申請，除非上下文指示相反，本文列出的所有范圍應該被解釋為包含他們的端點，開放式范圍應該被解釋包括商業上實用的值。類似地，值的所有列表應該被認為包括中間的值，除非上下文指示相反。
[0008]用于確定診斷這種病癥的標記是抗天然的、脫去酰氨基的麥醇溶蛋白肽的IgA和IgA抗組織轉谷胺酰氨酶(tTg)自身抗體。與⑶相比，谷蛋白敏感性(GS)影響多達30%的人口(4)。根據Sapone et al (5、6) 2010和2011年發表的兩篇文章，GS中的癥狀可類似與CD或小麥過敏相關的一些胃腸癥狀，但是強調的是對谷蛋白敏感性的客觀診斷試驗目前缺失(5、6)。雖然正在研究與GS相比CD中的固有免疫應答，但是研究人員發現與固有免疫相關的TLR1、TLR2和TLR4在粘膜的GS而不是在⑶中升高，而獲得性免疫的生物標記如IFN-g、IL-21和IL-17A在⑶而不是GS中的粘膜組織中表達。他們認為用高侵襲性和將需要活組織檢查的方法測量的toll樣受體和IFN-Y、IL-21和IL-17A的結果將能夠使他們區分CD和GS(5、6)。對谷蛋白的速發型超敏感性是IgE介導的，而對谷蛋白的遲發型超敏感性是抗體——(IgG、IgA)和T細胞介導的反應，其被稱作乳糜瀉或具有腸病的谷蛋白敏感性(7)。在缺乏抗tTg的IgG和IgA的情況下，升高的抗各種小麥抗原和肽的IgG和IgA指示抗小麥肽的粘膜免疫耐受的缺失和谷蛋白敏感性的發展(7)。由于小麥抗原和人組織之間的抗原性相似性，⑶和GS均可以導致多種自身免疫狀況，包括I型糖尿病、關節炎、甲狀腺炎，和甚至神經自身免疫狀況如谷蛋白共濟失調和多發性硬化(8-10)。
[0009]應當理解，術語“患者”指在專業的衛生保健護理下的人。然而，更廣義地，本文公開的新的試驗方案和分析可以應用于非患者的人，和可遭受乳糜瀉、谷蛋白敏感性和腸相關的自身免疫的任何其它動物。[0010]雖然GS患者，與⑶患者相似，不能耐受谷蛋白并可發展相同或相似的胃腸癥狀，但是在GS中，這種免疫反應沒有引起小腸損害(5、6)。GS中誘導腸損害的這種缺乏和⑶與遺傳標記HLA DQ2/DQ8加小腸損害的關聯使CD的診斷比GS容易得多。GS中不太嚴重的臨床現象(picture)、tTg自身抗體的缺少,和許多臨床醫生對升高的抗各種小麥蛋白和肽的IgG和IgA自身抗體的重要性的不考慮使GS成為非常危險的病癥。這是因為血液中IgG和/或IgA抗體長時間存留，連同炎癥級聯的誘導物可導致成熟(全面的，full-blown)的自身免疫。如果是這種情況，那么由于產生的組織損害的嚴重性，即使執行無谷蛋白的飲食也不能幫助逆轉由抗不同的小麥抗原和肽的IgG和IgA抗體誘導的自身免疫反應過程。
[0011]乳糜瀉和谷蛋白免疫反應性/敏感性之間的比較顯示在圖1中。根據該模型，如果兩名兒童——一名具有陰性遺傳組成(HLA DQ2/DQ8_)，另一名具有陽性遺傳組成(HLA
DQ2/DQ8+)-都暴露于環境因素，如輪狀病毒、細菌內毒素,和一些藥物或它們的協同效
應，那么結果可以是兩名兒童的粘膜免疫耐受都破壞。針對麥醇溶蛋白的粘膜免疫耐受性的誘導導致抗天然的小麥蛋白和肽的IgA和/或IgG的產生，這是在兩個為HLA DQ2/DQ81PHLA DQ2/DQ8+的個體中谷蛋白敏感性啟動的下一個步驟。
[0012]然而，在具有陽性遺傳組成的個體中，抗麥醇溶蛋白的IgG和IgA抗體連同炎癥的生物標記可以激活tTg，誘導對絨毛的損傷，和導致絨毛萎縮。特定麥醇溶蛋白肽的脫酰氨導致在它和tTg之間形成復合物；抗原遞呈細胞將該復合物呈現給T細胞和B細胞導致抗tTg、脫去酰氨基的麥醇溶蛋白和麥醇溶蛋白-tTg復合物的IgA或IgG的產生。這些抗體的形成和它們在血液中的檢測是CD的標志，其是在1-2%的人群中檢測到的這種遺傳狀況。如果CD未被處理，那么結果將是自身免疫和癌癥。
[0013]相比較，在HLA DQ2/DQ8陰性的個體中，免疫耐受的這種破壞和伴隨的抗天然小麥蛋白和肽的IgA和/或IgG的產生可以激活炎性級聯。然而，在缺乏tTg激活的情況下，絨毛萎縮不發生。而且，麥醇溶蛋白肽沒有經歷脫酰氨，因此產生只針對天然小麥和麥醇溶蛋白肽的IgG和IgA抗體。
[0014]通過連續暴露于小麥抗原和連續的粘膜免疫耐受，小麥抗原和反應抗體形成可怕的免疫復合物聯合，導致嚴重的谷蛋白免疫反應性和敏感性。這種免疫反應性和敏感性是在多達30%的人群中檢測到非遺傳狀況。如果這種病癥未被檢查到，那么延長暴露于抗小麥抗原、肽的IgG和IgA和它們與不同組織抗原的交叉反應可導致多種自身免疫疾病。因此，即使在缺少CD的情況下，GS可仍然為攻擊不同器官的其它谷蛋白相關的自身抗體提供生產性環境。
[0015]而且，不含谷蛋白的飲食通常只推薦給符合CD診斷標準，而不是谷蛋白免疫反應性和敏感性診斷標準的那些人。不幸的是，其使許多谷蛋白敏感的人們不必要地遭受置他們于并發癥的危險中的非常嚴重的癥狀、可用無谷蛋白飲食解決的狀況，如果他們才知道的話。
[0016]因此，需要新的范例用于在各種腸相關的疾病——包括谷蛋白反應性和敏感性、無癥狀乳糜瀉、乳糜瀉和腸相關的自身免疫一之間輔助診斷和區分。
[0017]發明簡述
[0018]本發明的發明主題提供儀器、系統和方法，其中抗體用作生物標記來輔助診斷谷蛋白免疫反應性和敏感性、無癥狀乳糜瀉、克羅恩氏病和其它腸相關病理。[0019]在本發明的某些方面中，檢測來自人或其它動物的全血、血清、唾液或其它樣品中針對以下抗原的抗體:(a)小麥抗原；(b)麥醇溶蛋白抗原；和(C)麥胚凝集素、谷嗎啡(gluteomorphin)、麥谷蛋白、脫去酰氨基的麥谷蛋白、強啡肽原和強啡肽中的一種或多種。
[0020]檢測結果可以有利地用來幫助區分來自乳糜瀉的谷蛋白免疫反應性或敏感性，特別是小麥抗原被脫酰氨，麥醇溶蛋白抗原選自α -麥醇溶蛋白33聚體、α -麥醇溶蛋白-17聚體、Y-麥醇溶蛋白15聚體、ω-麥醇溶蛋白17聚體和麥谷蛋白21聚體。
[0021]本發明的某些方面，檢測來自人或其它動物的全血、血清、唾液或其它樣品中針對以下抗原的一個或多個的抗體:Y-麥醇溶蛋白或其肽如Y-麥醇溶蛋白15聚體、ω-麥醇溶蛋白或其肽如ω-麥醇溶蛋白-17聚體、麥胚凝集素、谷嗎啡、麥谷蛋白或其肽如麥谷蛋白21聚體、脫去酰氨基的麥谷蛋白或其肽、強啡肽原和強啡肽。
[0022]本發明的某些方面，針對抗體進行檢測和/或分析檢測結果，該抗體輔助區分相對于顯著癥狀的(典型的)乳糜瀉、克羅恩氏病和慢性免疫激活的谷蛋白免疫反應性和/或敏感性、無癥狀或非典型乳糜瀉。特定目的測試的測試板和試劑盒檢測針對以下抗原中至少對3、5、7個或所有的抗體:α-麥醇溶蛋白、Y-麥醇溶蛋白、ω-麥醇溶蛋白、麥谷蛋白、麥胚凝集素、谷嗎啡、強啡肽原、轉谷胺酰氨酶和結合麥醇溶蛋白的轉谷胺酰氨酶(麥醇溶蛋白-轉谷胺酰氨酶復合物)。
[0023]本發明的某些方面，特定目的的試驗和試驗試劑盒允許檢測針對以下抗原中的IgA和/或IgG抗體:一種或多種小麥抗原、α -麥醇溶蛋白或一個或多個其肽如α -麥醇溶蛋白33聚體和/或α-麥醇溶蛋白17聚體、Y-麥醇溶蛋白或一個或多個其肽如Y-麥醇溶蛋白15聚體、ω-麥醇溶蛋白或一個或多個其肽如ω-麥醇溶蛋白17聚體、麥胚凝集素、阿片樣肽如谷嗎啡、強啡肽原和/或強啡肽中的一個或多個、麥谷蛋白或一個或多個其肽如麥谷蛋白21聚體、脫去酰氨基的麥谷蛋白或一個或多個其肽、麥醇溶蛋白-轉谷胺酰氨酶復合物、或其組合。
[0024]本發明的某些方面，抗體的檢測可以用免疫測定完成，包括但不限于，ELISA測定、RIA測定、膠乳凝集反應、珠測定、蛋白質組學測定和本領域普通技術人員已知的其它免疫測定。
[0025]本發明的發明主題的各種目的、特征、方面和優點從以下優選實施方式連同附圖——其中同樣的數字表示同樣的組分——的詳細描述將變的更明顯。
[0026]附圖簡述
[0027]圖1是顯示乳糜瀉(右手列出)和谷蛋白免疫反應性/敏感性(左手列出)之間區別的示意圖，如本文所考慮的。
[0028]圖2是顯示具有12種不同抗原和肽的12個不同排的樣品微孔板布局的圖示。
[0029]圖3是顯示樣品排微孔板布局的圖示，通過該微孔板測量針對來自小麥和相關組織抗原的12種不同抗原或肽(抗原或肽段是透明的)的IgG和IgA。
[0030]圖4是顯示樣品排微孔板布局的圖示，通過該微孔板利用用于質量控制目的的每周一次的陰性和陽性對照(抗原或肽段是透明的)測量IgG和IgA。
[0031]圖5是根據現有技術(17)使用tTg和各種抗原針對乳糜瀉的抗體檢測方案的圖
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[0032]圖6是根據現有技術(17)使用脫去酰氨基的麥醇溶蛋白肽針對對乳糜瀉的檢測方案的圖示。
[0033]圖7是根據本發明某些方面使用小麥抗原和肽的所有組成部分針對乳糜瀉、谷蛋白免疫反應性/敏感性和自身免疫的建議檢測方案的圖示。
[0034]發明詳述
[0035]根據本發明的某些方面，抗體用作生物標記來輔助診斷和區分如與抵抗許多小麥抗原和肽的典型乳糜瀉相反的谷蛋白免疫反應性和敏感性、無癥狀乳糜瀉、克羅恩氏病和其它腸相關的病理。
[0036]在本發明的某些方面，檢測體液的針對以下抗原中的一種或多種的免疫球蛋白G (IgG)和/或免疫球蛋白A (IgA)抗體:全麥抗原；α-麥醇溶蛋白或一個或多個其肽；Y -麥醇溶蛋白蛋白或一個或多個其肽；ω-麥醇溶蛋白或一個或多個其肽；麥谷蛋白或一個或多個其肽；一個或多個阿片樣肽；麥醇溶蛋白-轉谷氨酰胺酶復合物(麥醇溶蛋白結合到轉谷氨酰胺酶)；轉谷氨酰胺酶；麥胚凝集素；和其組合。
[0037]在本發明的某些方面，全麥抗原是脫去酰氨基的和可通過組合水溶性和醇溶性全麥蛋白來制備。α-麥醇溶蛋白或一個或多個其肽包括α-麥醇溶蛋白33聚體和/或α -麥醇溶蛋白-17聚體，考慮其它的α-麥醇溶蛋白肽。Y-麥醇溶蛋白或一個或多個其肽包括Y-麥醇溶蛋白15聚體，考慮其它的Y-麥醇溶蛋白肽。ω-麥醇溶蛋白或一個或多個其肽包括ω-麥醇溶蛋白17聚體，考慮其它的ω-麥醇溶蛋白肽。麥谷蛋白或一個或多個其肽包括麥谷蛋白21聚體，考慮其它的麥谷蛋白肽。一個或多個阿片樣肽包括外啡肽(exorphin)——包括谷嗎啡、強啡肽原和/或強啡肽，考慮其它的外啡肽。
[0038]在本發明的某些方面，檢測來自人或其它動物的全血、血清、唾液或其它體液樣品的針對以下抗原的抗體:a)小麥抗原；b)麥醇溶蛋白抗原；和(C)麥胚凝集素、谷嗎啡、麥谷蛋白、脫去酰氨基的麥谷蛋白、強啡肽原和強啡肽中的一個或多個。檢測結果被認為特別有趣，其中小麥抗原被脫去酰氨基，麥醇溶蛋白抗原選自α-麥醇溶蛋白33聚體、α-麥醇溶蛋白17聚體、Y-麥醇溶蛋白15聚體、ω-麥醇溶蛋白17聚體和麥谷蛋白21聚體。測試板和試劑盒可有利地檢測α-麥醇溶蛋白、Y-麥醇溶蛋白、ω-麥醇溶蛋白、麥谷蛋白、麥胚凝集素、谷嗎啡、強啡肽原、轉谷氨酰胺酶、和結合麥醇溶蛋白的轉谷氨酰胺酶中的至少
3、5、7種或所有抗原。
[0039]在本發明的某些方面，特定目的的測定和測定試劑盒允許檢測針對以下抗原的IgA和/或IgG抗體:一種或多種小麥抗原、α -麥醇溶蛋白或一個或多個其肽例如α -麥醇溶蛋白33聚體和/或α-麥醇溶蛋白17聚體、Y-麥醇溶蛋白或一個或多個其肽例如Y-麥醇溶蛋白15聚體、ω-麥醇溶蛋白或一個或多個其肽如ω-麥醇溶蛋白17聚體、麥胚凝集素、阿片樣肽如以下的一個或多個:谷嗎啡，強啡肽原和/或強啡肽、麥谷蛋白或一個或多個其肽如麥谷蛋白21聚體、脫去酰氨基的麥谷蛋白或一個或多個其肽、麥醇溶蛋白-轉谷氨酰胺酶復合物、或其組合。
[0040]本發明的某些方面，抗體的檢測可以用免疫測定完成，包括但不限于，ELISA測定、RIA測定、膠乳凝集反應、珠測定、蛋白質組學測定和本領域普通技術人員已知的其它免疫測定。
[0041]下面是測定、它們的應用和關于一些測試患者的分析的示例性描述。雖然與本文描述的那些相似或相等的其它材料和方法可用于本發明的實施或測試，但是現在在測定的示例性描述中描述優選的方法和材料以進一步說明本發明。
[0042]實施例1
[0043]ELISA測定(酶聯免疫吸附測定)
[0044]A.材料和方法——板和樣品制備:
[0045]小麥抗原和肽。全麥抗原通過混合水溶性和醇溶性蛋白來制備。不同的麥醇溶蛋白肽——包括α-麥醇溶蛋白33聚體、17聚體、Y-麥醇溶蛋白15聚體、ω-麥醇溶蛋白17聚體、谷嗎啡、強啡肽原、轉谷氨酰胺酶、和結合到轉谷氨酰胺酶的麥醇溶蛋白、谷氨酸脫羧酶(GAD-65)高壓液相色譜級,通過Bio-Synthesis Inc (Lewisville, TX)來合成。麥胚凝集素(WGA)購自 Sigma/Aldrich (Saint Louis, MO)。
[0046]將抗原和肽以1.0mg/mL的濃度溶解于甲醇，然后在0.1M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液pH9.5中1:100稀釋，向聚苯乙烯平底ELISA板的每孔中加入50 μ I。
[0047]將ELISA板于4°C溫育過夜，然后用200 μ I含有0.05%吐溫20 (ρΗ7.4)的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水(Tris-buffered saline, TBS)洗三次。通過加入200mL2%牛血清蛋白(BSA)的TBS防止免疫球蛋白的非特異性結合，并于4°C溫育過夜。洗平板并在質量控制后保存在4°C直到使用。
[0048]酶結合物包括:親和純化的抗體磷酸酶標記的羊抗人IgG (JacksonImmunoResearch, Cat#109-055_008)、親和純化的抗體憐酸酶標記的羊抗人IgA (Jackson ImmunoResearch, Cat#109-055-011)。
[0049]如本文進一步描述的包括在方法中的其它另外的試劑和材料包括:磷酸鹽緩沖鹽水粉末(Sigma, Cat#P3813-10PAK)、牛血清白蛋白(Biocell, Cat#3203_00)、疊氮化鈉(Sigma, Cat#S-2002)、吐溫 20 (Sigma, Cat#P1379_1000ML)、甘油(Sigma, Cat#G5516-500ML)、氫氧化鈉(Sigma, Cat#S_5881)、氯化鎂(Sigma, Cat#8266)、二乙醇胺(Sigma, Cat#D-8885)、1.0N 鹽酸溶液(Sigma, Cat#H3162)、5mg 底物片劑:p_NPP(對硝基苯磷酸鹽)(Sigma, Cat#S-0942)和蒸餾水(D.H2O)。
[0050]制備微孔板并用期望數目的小麥相關抗原和/或肽包被。在下面的實例中，將12種不同的小麥相關抗原和肽包被在微孔板上。將校準物、陽性對照和稀釋的患者樣本加入到孔中，并且識別不同的小麥抗原的自身抗體在第一溫育期間結合。清洗孔以去除所有未結合的蛋白質之后，純化的堿性磷酸酶標記的兔抗人IgG/IgA未結合的結合物通過進一步的清洗步驟而去除。
[0051]用對硝基苯磷酸鹽(PNPP)底物使結合的結合物可見，該底物產生黃色反應產物，其強度與樣品中自身抗體濃度成比例。每孔加入氫氧化鈉來終止反應。在405nm讀取顏色強度。
[0052]純紅色蓋(plain red top)或紅黃蓋(red tiger top) (SST管)用于樣品采集，雖然在某些方面，考慮針對該測定的其它樣品采集裝置。
[0053]利用無菌靜脈穿刺技術采集血液樣品，并且利用標準程序獲得血清。在某些方面，優選最少約50 μ I血清用于測定，其因此對應約0.5ml或更多血液。
[0054]B.試駘測定稈序
[0055]現在討論輔助診斷和檢測谷蛋白免疫反應性和敏感性、無癥狀乳糜瀉、克羅恩氏病和其它腸相關的病理的IgG和/或IgA抗體陣列的分析程序。在一些方面，允許所有試劑在試驗測定開始前達到室溫。試驗測定程序包括用預望數目和類型的小麥相關抗原和/或肽制備期望數目的包被的孔或板。一旦微量滴定孔制備好，就利用多道移液器將約100 μ 11:100稀釋的對照校準物加入到如圖3所示的A排和B排微孔板中。將約100 μ 11:100稀釋的患者測試樣品，在這里是血清，加到針對臨床樣本I的C排和D排、針對臨床樣品2的E排和F排、針對臨床樣品3的G排和H排的復孔中。
[0056]在單獨的板上，以雙份進行與臨床樣本相似定期的陰性和陽性對照，如圖4所示。
[0057]然后將平板在室溫溫育60分鐘。溫育后，將孔排空并利用ELISA清洗器用PBS洗4次。將約100 μ I最佳稀釋的堿性磷酸酶標記的羊抗人IgA加入到IgA板或以最佳稀釋將約100 μ I酶標記的IgG加入到IgG板中。
[0058]然后將各自平板于室溫溫育30-60分鐘。結合溫育結束前約10分鐘，通過用5ml底物緩沖液混合5mg對硝基苯基磷酸鹽片劑，充分混合直到片劑完全溶解而制備底物溶液。重復利用ELISA清洗器用PBS洗4次。然后，將約100 μ I底物溶液加到每孔中。然后將平板于室溫溫育30分鐘，避免任何的直接陽光暴露。通過加入約50 μ I的3Ν NaOH來終止反應。使用微孔板讀數器以空白孔為背景，在405nm讀取孔的顏色強度，記錄校準物、對照和未知樣品的吸光度。
[0059]C.結果的計算
[0060]板在405nm讀數獲得光密度值(0D405)之后，將陰性對照的平均OD、陽性對照的平均OD和每個臨床樣本的平均OD除以A排和B排上校準物的平均OD以獲得各自的指數值(IV)0
[0061]通過將每個雙份樣品的平均OD除以校準物對照值的平均OD(例如，將孔Cl和Dl的平均OD除以孔Al和BI的平均0D，將孔C2和D2的平均OD除以孔A2和B2的平均0D，將孔C3和D3的平均OD除以孔A3和B3的平均OD等等)來計算針對12種不同抗原的每種抗體的指數值(IV)。
[0062]然后將結果與建立的參考范圍進行比較。
【權利要求】
1.測試來自動物的樣品的方法，包括: 測量源自所述樣品的第一部分與小麥抗原結合的第一信號； 測量源自所述樣品的第二部分與麥醇溶蛋白抗原結合的第二信號；和 測量源自所述樣品的第三部分與選自以下的抗原結合的第三信號:(I)麥胚凝集素；(2)谷嗎啡；(3)麥谷蛋白；(4)脫去酰氨基的麥谷蛋白；(5)強啡肽原；和(6)強啡肽。
2.權利要求1所述的方法，其中所述樣品包括血清。
3.權利要求1所述的方法，其中所述樣品包括唾液。
4.權利要求1所述的方法，其中所述小麥抗原選自α-麥醇溶蛋白33聚體、α-麥醇溶蛋白17聚體、Y-麥醇溶蛋白15聚體、ω-麥醇溶蛋白17聚體和麥谷蛋白21聚體。
5.權利要求4所述的方法，其中所述小麥抗原中的至少一種是脫去酰氨基的。
6.權利要求1所述的方法，其中所述動物是人。
7.利用從分析獲自人的樣品獲得的試驗結果，進行輔助區分乳糜瀉與(a)谷蛋白免疫反應性和敏感性和(b)與谷蛋白免疫反應性/敏感性和自身免疫相關的診斷的確定的方法，包括: 測試或得到所測試樣品的抗脫去酰氨基的α -麥醇溶蛋白33聚體或轉谷氨酰胺酶-2的IgA ;和 測試或得到所測試樣品的抗脫去酰氨基的麥谷蛋白21聚體的IgA。
8.權利要求7所述的方法，進一步包括測試或得到所測試樣品指示無癥狀乳糜瀉的血清學模式，其中: 抗α -麥醇溶蛋白33聚體、脫去酰氨基的α -麥醇溶蛋白33聚體、α -麥醇溶蛋白25聚體、α-麥醇溶蛋白18聚體、α-麥醇溶蛋白17聚體、Y-麥醇溶蛋白15聚體、ω-麥醇溶蛋白17聚體、麥谷蛋白、脫去酰氨基的麥谷蛋白、谷嗎啡、強啡肽原和麥胚凝集素的至少一種陽性的IgA和IgG試驗至少之一；和 抗轉谷氨酰胺酶-2陰性的IgA和IgG試驗，和抗轉谷氨酰胺酶-3和轉谷氨酰胺酶-6的至少一種陽性的IgA和IgG試驗至少之一。
9.權利要求7所述的方法，進一步包括測試或獲得所測試樣品指示谷蛋白免疫反應性和敏感性的血清學模式，其中: 抗α-麥醇溶蛋白、Y-麥醇溶蛋白、ω-麥醇溶蛋白、麥谷蛋白、脫去酰氨基的麥谷蛋白、谷嗎啡和麥胚凝集素至少一種陽性的IgA和IgG試驗至少之一；和 抗脫去酰氨基的α-麥醇溶蛋白、脫去酰氨基的麥谷蛋白或轉谷氨酰胺酶-2陰性的IgA和IgG試驗。
10.權利要求7所述的方法，進一步包括測試或獲得所測試樣品指示與谷蛋白免疫反應性/敏感性和自身免疫相關的診斷的血清學模式，其中: 抗天然α-麥醇溶蛋白、Y-麥醇溶蛋白、ω-麥醇溶蛋白、麥谷蛋白、脫去酰氨基的麥谷蛋白、谷嗎啡和麥胚凝集素的至少一種陽性的IgA和IgG試驗至少之一； 對谷氨酸脫羧酶和小腦組織的至少一種陽性的IgG、IgA和IgM試驗至少之一；和 抗脫去酰氨基的α-麥醇溶蛋白、脫去酰氨基的麥谷蛋白或轉谷氨酰胺酶陰性的IgA試驗。
11.篩選患者中IgG和IgA抗體的至少一種存在的方法，包括:獲得來自測量第一、第二和第三信號的試驗結果，其中所述第一信號來自所述樣品的第一部分與小麥抗原的結合，所述第二信號來自所述樣品的第二部分與麥醇溶蛋白抗原的結合；和所述第三信號來自所述樣品的第三部分與選自以下的抗原的結合:(I)麥胚凝集素；⑵谷嗎啡；⑶麥谷蛋白；⑷脫去酰氨基的麥谷蛋白；(5)強啡肽原；和(6)強啡肽；和 利用權利要求1所述的試驗結果來查明所述患者是否具有所述抗體。
12.權利要求11所述的方法，其中所述抗體結合小麥和麥醇溶蛋白肽。
13.權利要求11所述的方法，其中所述抗體結合小麥的醇溶性和/或水溶性組分，和所述麥醇溶蛋白抗原選自α -麥醇溶蛋白33聚體、α -麥醇溶蛋白17聚體、Y-麥醇溶蛋白15聚體、O-麥醇溶蛋白17聚體、和麥谷蛋白21聚體。
14.權利要求11所述的方法，進一步包括利用所述試驗結果輔助查明是否所述患者是否具有乳糜瀉。
15.權利要求14所述的方法，進一步包括從測試所述樣品針對α-麥醇溶蛋白、Y-麥醇溶蛋白、ω-麥醇溶蛋白、麥谷蛋白、麥胚凝集素、谷嗎啡、強啡肽原、轉谷氨酰胺酶和結合麥醇溶蛋白的轉谷氨酰胺酶的至少五種抗體獲得結果。
16.權利要求11所述的方法，進一步包括利用所述試驗結果來輔助區分所述患者是否具有與明顯癥狀的乳糜瀉相反的無癥狀或非典型的乳糜瀉。
17.權利要求16所述的方法，進一步包括從測試所述樣品針對α-麥醇溶蛋白、Y-麥醇溶蛋白、ω-麥醇溶蛋白、麥谷蛋白、麥胚凝集素、谷嗎啡、強啡肽原、轉谷氨酰胺酶、和結合麥醇溶蛋白的轉谷氨酰胺酶的至少五種抗體獲得結果。
18.權利要求1所 述的方法，進一步包括利用所述試驗結果來輔助查明所述患者是否具有谷蛋白免疫反應性和敏感性和自身免疫的至少一種。
19.權利要求18所述的方法，進一步包括從測試所述樣品針對α-麥醇溶蛋白、Y-麥醇溶蛋白、ω-麥醇溶蛋白、麥谷蛋白、麥胚凝集素、谷嗎啡、強啡肽原、轉谷氨酰胺酶、和結合麥醇溶蛋白的轉谷氨酰胺酶的至少五種抗體獲得結果。
20.權利要求1所述的方法，進一步包括利用所述結果來輔助查明所述患者是否具有克羅恩氏病和慢性免疫激活的至少一種。
21.權利要求20所述的方法，進一步包括從測試所述樣品針對α-麥醇溶蛋白、Y-麥醇溶蛋白、ω-麥醇溶蛋白、麥谷蛋白、麥胚凝集素、谷嗎啡、強啡肽原、轉谷氨酰胺酶、和結合麥醇溶蛋白的轉谷氨酰胺酶的至少五種抗體獲得結果。
22.篩選患者中IgG和/或IgA抗體存在的方法，包括提供或獲得來自測量信號的試驗結果，所述信號來自患者的抗體與以下的結合:(a) α -麥醇溶蛋白和轉谷氨酰胺酶的至少一種,和(b)小麥的水溶性和醇溶性組分、麥胚凝集素、ω-麥醇溶蛋白和Y-麥醇溶蛋白、麥谷蛋白、谷嗎啡、和結合麥醇溶蛋白的轉谷氨酰胺酶的至少一種；和利用權利要求1所述的試驗結果來查明所述患者是否具有所述抗體。
23.測試板，其含有至少三種結合的測試物質,所述測試物質選自由小麥的水溶性和醇溶性組分、α-麥醇溶蛋白33聚體、α-麥醇溶蛋白17聚體、Y -麥醇溶蛋白15聚體、ω-麥醇溶蛋白17聚體、麥谷蛋白21聚體、谷嗎啡16聚體、強啡肽原、結合麥醇溶蛋白的轉谷氨酰胺酶、和麥胚凝集素組成的清單。
24.權利要求23所述的測試板，其含有所述結合的測試物質的至少五種。
25.權利要求23所述的測試板，其含有所述結合的測試物質的至少七種。
26.權利要求23所述的測試板，其含有所述結合的測試物質的每一種。
27.測試試劑盒，其包括權利要求23所述的測試板，和利用所述測試板來測量IgG和/或IgA抗體的說 明書。
【文檔編號】G01N33/53GK103430025SQ201280014219
【公開日】2013年12月4日 申請日期:2012年1月19日 優先權日:2011年1月20日
【發明者】A·沃佳達尼 申請人:免疫科學實驗室公司