西蘭苔凝集素的制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供西蘭苔凝集素的制備方法與應用，首先采用磷酸緩沖液浸提，硫酸銨沉淀，離心透析，再使用離子交換色譜SephadexA-52和凝膠色譜葡聚糖凝膠SephadexG-75柱分離純化，得到純化的西蘭苔凝集素BL。本發明得到的西蘭苔凝集素具有抗菌活性和抗腫瘤活性。癌細胞相比，西蘭臺凝集素對正常細胞的毒性小。因而，本發明得到的西蘭苔凝集素有利于功能食品、醫藥和其它領域的開發利用。
【專利說明】西蘭苔凝集素的制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及西蘭苔凝集素的制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]西蘭苔，又稱小小西蘭花、蘆筍型青花菜、青花筍，屬十字花科蕓薹屬，由兩種甘藍類蔬菜西蘭花與芥藍雜交選育而成，因主要以肥嫩的花苔供食而得名。西蘭花與芥藍是蔬菜中公認的“抗癌”能手，而西蘭苔集中了兩者的優良性狀，因此抗癌物質含量極高，同時還含有豐富的維生素A、B、E。據美國權威機構檢測，其抗癌物質含量比普通蔬菜高出五到十倍，其抗腫瘤物質種類也多。
[0003]凝集素(Lectin)是指一種糖蛋白或結合糖的蛋白，廣泛存在于各種植物、無脊椎動物和高等動物中。大多數凝集素存在于植物的成熟種子中，但在葉、莖和根等組織器官中也有發現，它最大的特點是能夠識別糖蛋白和糖脂，特別是細胞膜中復雜的糖鏈結構。凝集素對糖基的結合具有特異性，這可通過糖抑制試驗進行研究，此特異性取決于凝集素中糖基結合位點的大小、形狀、糖鏈中決定簇的位置等。
[0004]凝集素具有細胞凝集能力，不僅能凝集紅細胞，還能凝集腫瘤細胞，淋巴細胞，精子，細菌等。此外，凝集素還能識別并結合細菌、腫瘤細胞表面的糖結構，從而抑制它們的生長。鑒于凝集素的諸多功能，它被廣泛應用于病原菌的防治，癌癥的治療，細胞的分型，含糖基生物大分子的檢測等方面。
[0005]近年來，國內外對凝集素的研究很多，越來越多的凝集素被發現，凝集素的生物學功能備受關注。但是西蘭苔是一種新型蔬菜，目前國內外對西蘭苔凝集素的分離純化與應用尚未有報道。

【發明內容】

[0006]為拓展西蘭苔在食品和生物醫學領域的應用，大幅提高這種新型蔬菜的附加值，本發明的目的是提供西蘭苔凝集素的制備方法與應用。
[0007]為實現本發明目的，采用如下技術方案:
[0008](I)將西蘭苔粉碎 后加入緩沖溶液調節pH值，低溫保存，過濾，取濾液離心后取上清液，鹽析，低溫保存后離心去沉淀，將沉淀溶解透析冷凍干燥得到西蘭苔凝集素粗品；
[0009](2)取步驟(1)所得西蘭苔凝集素粗品溶解于緩沖液，離子交換層析，并梯度洗脫，收集第一個蛋白峰凍干保存，得到西蘭苔凝集素樣品；
[0010](3)取步驟(2)得到的西蘭苔凝集素樣品溶解于緩沖液中，再進行凝膠色譜葡聚糖凝膠Sephadex G_75分離純化，梯度洗脫，收集第一個蛋白峰凍干保存，得到西蘭苔凝集素。
[0011]西蘭苔凝集素的制備方法，具體步驟如下:
[0012](I)將西蘭苔洗凈，切碎，凍干后粉粹，得到干粉，準確稱取干粉10~100g，加入100~500ml緩沖液，置于冰箱中，過濾，濾液離心后收集上清液，將上清液在攪拌條件下加入硫酸銨晶體至飽和度為10%~90%，冰箱中過夜，離心取沉淀，將沉淀加入蒸餾水溶解后，置于透析袋中進行透析，24h之后冷凍干燥，即為西蘭苔凝集素粗品；
[0013](2)稱取步驟(1)得到的西蘭苔凝集素粗品50~300mg，溶解于0.5~5ml，pH為6~9的Tris-HCl緩沖液，用DEAE Sephadex A-52離子交換層析，并用NaCl溶液梯度洗脫，調節流速為0.5ml/min，每管收集8min，收集具有凝血活性的第一個蛋白峰凍干保存，得到
西蘭苔凝集素樣品；
[0014](3)稱取步驟(2)得到的西蘭苔凝集素樣品10~200mg溶于0.5~5ml pH為6~9的Tris-HCl緩沖液中，再進行凝膠色譜葡聚糖凝膠Sephadex G_75分離純化,再用NaCl溶液梯度洗脫，調節流速為0.5ml/min,每管收集8min,收集具有凝血活性的第一個蛋白峰凍干保存，得到純化的西蘭苔凝集素BL ；。
[0015]上述方法中，步驟(1)中所述緩沖液為磷酸緩沖液，pH=6~9 ;所述離心的離心溫度為4~8°C，轉速為3000 ~10000r/min，離心時間10~60min。
[0016]上述方法中，步驟(2)中所述梯度洗脫為用濃度為0.lmol/L~lmol/L的NaCl溶液，洗脫5次；所述NaCl溶液的溶劑為Tris-HCl緩沖液；所述Tris-HCl緩沖液pH6~9。
[0017]上述方法中，步驟(3)所述梯度洗脫為用濃度為lmol/L~3mol/L的NaCl溶液，洗脫5次；所述溶液溶劑為Tris-HCl緩沖液；所述Tris-HCl緩沖液pH6~9。
[0018]上述方法中，所述西蘭苔凝集素BL具有抗菌活性和抗腫瘤活性。
[0019]西蘭苔凝集素應用于抗菌功能食品或抗腫瘤醫藥的制備。
[0020]與現有技術相比，本發明具有如下技術效果和優點:
[0021]本發明得到的西蘭苔凝集素BL分子量約為27KDa，糖含量為7.6%，最小凝血濃度為4μg/ml，具有D-甘露糖和阿拉伯糖結合位點。更重要的是，BL具有下述抗菌活性和抗腫瘤活性:(I)對各種細菌的50%抑制濃度(IC5tl)分別為:綠膿桿菌173.58μ g/ml，痢疾桿菌158.32 μ g/ml,金黃色葡萄球菌486.33 μ g/ml,大腸桿菌228.77 μ g/ml，幽門螺桿菌143.95 μ g/ml0對各種癌細胞和正常肝細胞的50%抑制濃度(IC5tl)分別為:胃癌細胞SGC-7901215.85 μ g/ml，乳腺癌細胞 MCF-7350.93 μ g/ml，肝癌細胞 H印G2178.82 μ g/ml，正常肝細胞L02924.35 μ g/ml.說明與癌細胞相比，西蘭臺凝集素對正常細胞的毒性小。因而本發明得到的西蘭苔凝集素有利于功能食品、醫藥和其它領域的開發利用。
[0022]附圖表說明
[0023]圖1為實施例1中西蘭苔凝集素(活性組分LI)離子交換色譜DEAE-52柱層析洗脫曲線；
[0024]圖2為實施例1中西蘭苔凝集素BL凝膠色譜葡聚糖凝膠S印hadexG-75柱層析洗脫曲線；
[0025]圖3為實施例1所制備的西蘭苔凝集素BL的SDS-PAGE圖。
[0026]圖4為實施例1所制備的西蘭苔凝集素BL的抗菌活性圖。
[0027]圖5為實施例1所制備的西蘭苔凝集素BL的抗癌活性圖。
【具體實施方式】
[0028]以下結合附圖和實例對本發明的具體實施作進一步說明，但本發明的實施和保護范圍不限于此。
[0029]實施例1[0030]西蘭苔凝集素的制備方法，步驟如下:
[0031]( I)將新鮮的西蘭苔洗凈，切碎，凍干后粉粹，得到干粉，準確稱取干粉60g，加入300ml pH為6的磷酸緩沖液，置于4°C冰箱中24h，用三層紗布過濾，濾液離心后收集上清液，將上清液置于磁力攪拌器上，緩慢加入硫酸銨晶體至飽和度為70%，4°C冰箱中過夜，離心棄上清，將沉淀加入適量的蒸餾水進行溶解，置于透析袋中進行透析，24h之后冷凍干燥，即為凝集素粗品。
[0032](2)稱取步驟(1)得到的凝集素粗品200mg，加2ml pH為6的Tris-HCl緩沖液溶解，用DEAE Sephadex A-52離子交換層析，并用NaCl溶液梯度洗脫，即用濃度為0.6mol/L的NaCl溶液洗脫5次；所述NaCl溶液的溶劑為pH=7Tris-HCl緩沖液，調節流速為0.5ml/min，每管收集8min，經洗脫分離收集，得到3個不同的組分，分離效果如圖1所示。凝血試驗表明，組分I (LI)具有較高凝集活性，收集具有凝血活性的第一個蛋白峰LI凍干保存。
[0033](3)稱取步驟(2)得到的凝集素樣品IOOmg溶于2.5ml pH為6的Tris-HCl緩沖液中，再進行凝膠色譜葡聚糖凝膠S印hadex G-75分離純化。再用NaCl溶液梯度洗脫，SP用濃度為1.5mol/L的NaCl溶液洗脫5次；所述NaCl溶液的溶劑為pH=6的Tris-HCl緩沖液，調節流速為0.5ml/min,每管收集8min,Ll經SephadexG_75分子篩層析后，得到兩個不同的組分(如圖2)，凝血試驗表明只有第一個組分(BL)具有凝血活性。收集具有凝血活性的第一個蛋白峰BL凍干保存，得到純化的西蘭苔凝集素BL。將BL進行SDS-PAGE檢測發現只有一條帶(如圖3)，說明BL是單一物質，即西蘭苔凝集素，其分子量約為27KDa。
[0034]基于新鮮雞血的凝血活性表明(表1)，在PH7-8時，凝血活性最強為4 μ g/ml.糖抑制試驗表明(表2)，除在蔗糖溶液中BL的凝集活性無變化外，在其他糖溶液中均有所下降，其中在D-甘露糖和阿拉伯糖溶液中下降幅度最大，說明這兩種糖能夠與紅細胞競爭性結合BL，由此表明BL上這兩種糖的結合位點較多。
[0035]對西蘭苔凝集素進行抗菌活性(平板培養法)和抗腫瘤活性檢測(MTT檢測法)，結果表明，(I)不同濃度的西蘭苔凝集素(0.0625~0.5mg/mL)對各種細菌的抑制率呈現劑量效應關系(圖4)，50%抑制濃度(IC5tl)分別為:綠膿桿菌173.58μ8/πι1，痢疾桿菌158.32 μ g/ml,金黃色葡萄球菌486.33 μ g/ml,大腸桿菌228.77 μ g/ml,幽門螺桿菌143.95 μ g/ml0 (2)不同濃度的西蘭苔凝集素(0.0625~0.5mg/mL)對各種癌細胞和正常肝細胞的抑制率呈現劑量效應關系(圖5)，50%抑制濃度(IC5tl)分別為:胃癌細胞SGC-7901215.85 μ g/ml,乳腺癌細胞 MCF-7350.93 μ g/ml,肝癌細胞 H印G2178.82 μ g/ml,正常肝細胞L02924.35μ g/ml。與癌細胞相比，西蘭臺凝集素對正常細胞的毒性小。
[0036]表1西蘭苔凝集素BL的凝血活性
[0037]
【權利要求】
1.西蘭苔凝集素的制備方法，其特征在于，所述制備方法為: (1)將西蘭苔粉碎后加入緩沖溶液調節PH值，低溫保存，過濾，取濾液離心后取上清液，鹽析，低溫保存后離心去沉淀，將沉淀溶解透析冷凍干燥得到西蘭苔凝集素粗品； (2)取步驟(1)所得西蘭苔凝集素粗品溶解于緩沖液，離子交換層析，并梯度洗脫，收集第一個蛋白峰凍干保存，得到西蘭苔凝集素樣品； (3)取步驟(2)得到的西蘭苔凝集素樣品溶解于緩沖液中，再進行凝膠色譜葡聚糖凝膠Sephadex G-75分離純化，梯度洗脫，收集第一個蛋白峰凍干保存，得到西蘭苔凝集素。
2.根據權利要求1所述西蘭苔凝集素的制備方法，其特征在于，具體步驟如下 (1)將西蘭苔洗凈，切碎，凍干后粉粹，得到干粉，準確稱取干粉10~100g，加入100-500ml緩沖液，置于冰箱中，過濾，濾液離心后收集上清液，將上清液在攪拌條件下加入硫酸銨晶體至飽和度為10%~90%，于冰箱中過夜，離心取沉淀，將沉淀加入蒸餾水溶解后，置于透析袋中進行透析，冷凍干燥，即為西蘭苔凝集素粗品； (2)稱取步驟(1)得到的西蘭苔凝集素粗品5(T300mg，溶解于0.5~5 ml，pH為6~9的Tris-HCl緩沖液，用DEAE Sephadex A-52離子交換層析，并用NaCl溶液梯度洗脫，調節流速為0.5 ml/min，每管收集8 min，收集具有凝血活性的第一個蛋白峰凍干保存，得到西蘭苔凝集素樣品； (3)稱取步驟(2)得 到的西蘭苔凝集素樣品10~200mg溶于0.5~5 ml pH為6、的Tris-HCl緩沖液中，再進行凝膠色譜葡聚糖凝膠S印hadex G-75分離純化，再用NaCl溶液梯度洗脫，調節流速為0.5 ml/min,每管收集8 min ,收集具有凝血活性的第一個蛋白峰凍干保存，得到純化的西蘭苔凝集素BL ；。
3.根據權利要求2所述的西蘭苔凝集素的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述緩沖液為磷酸緩沖液，pH=6~9 ;所述離心的離心溫度為4~8 °C，轉速為300(T10000 r/min,離心時間10~60 min。
4.根據權利要求2所述的西蘭苔凝集素的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述梯度洗脫為用濃度為0.1 mol/L^l mol/L的NaCl溶液，洗脫5次；所述NaCl溶液的溶劑為Tris-HCl緩沖液；所述Tris-HCl緩沖液pH 6~9。
5.根據權利要求1所述的西蘭苔凝集素的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述梯度洗脫為用濃度為I m0l/L~3 mol/L的NaCl溶液，洗脫5次；所述溶液溶劑為Tris-HCl緩沖液；所述Tris-HCl緩沖液pH 6~9。
6.根據權利要求1所述的西蘭苔凝集素的制備方法，其特征在于，所述西蘭苔凝集素BL具有抗菌活性和抗腫瘤活性。
7.由權利要求1-6任一所述制備方法制備得到的西蘭苔凝集素應用于抗菌功能食品或抗腫瘤醫藥的制備。
【文檔編號】C07K1/30GK103951742SQ201410149248
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月14日 優先權日:2014年4月14日
【發明者】張學武, 許平平 申請人:華南理工大學