專利名稱：家蠶c-型凝集素重組表達方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，涉及生物工程技術領域中的DNA重組表達技術及 應用，具體涉及一種C-型凝集素及其功能域的重組表達的創制方法及應用。
背景技術：
家蠶由于能夠生產蠶絲，是中國重要的傳統產業絲綢工業的重要養殖昆蟲。家蠶 在養殖過程中遭受各種病源生物危害，對蠶業生產造成嚴重經濟損失，迫切需要高效無害 的藥物來防治病害。現在家蠶飼養中主要使用抗生素防治微生物感染病害，使用抗生素的 結果會導致抗藥菌產生，對家蠶生長也有影響。隨著科學家對無脊椎動物先天免疫分子機 理的解析和基因工程技術的發展，我們可以通過基因工程技術，生產家蠶本身的免疫系統 的抗病蛋白如凝集素，用于防治家蠶養殖中的細菌性感染疾病。與所有無脊椎動物一樣，家蠶的免疫系統屬于先天免疫系統，與脊椎動物的免疫 系統具有極大差異，主要特點是沒有脊椎動物所具有的抗體，因此對病源生物的識別沒有 特異性，也沒有記憶性。無脊椎動物先天免疫的策略不在于體內的免疫分子能夠識別病源 微生物中的每一個可能的抗原，而是在于能夠識別在某類微生物中普遍存在的高保守的共 有結構，如脂多糖、肽聚糖。這些微生物中普遍存在的高保守的共有結構被稱為病原相關 分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs),而無脊椎云力物先天免疫系 統中能夠識別這些病原相關分子模式的受體被稱為模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)。在模式識別受體識別并結合外來微生物后，繼而啟動一系列先天免疫的 效應基因如各種抗菌肽的表達，這些抗菌肽可以抑制或消滅病源微生物。由于先天免疫是 昆蟲等無脊椎動物抵御病源生物入侵和危害的唯一途徑，因此，在無脊椎動物病害防治中 不能使用脊椎動物中普遍使用的疫苗防病策略和方法，而必須找到新的防病途徑。凝集素廣泛存在于動、植物體的細胞膜上、細胞質內和細胞外基質中，是一類具有 糖結合專一性、可促使細胞凝集的蛋白質，其主要功能是可以結合糖類，不同的凝集素可以 結合不同的糖類。目前已知昆蟲中存在各種不同的凝集素，其中，C-型凝集素是Ca2+依 賴的凝集素，從1988年被定義名稱以來，已經發現有一千多種。C-型凝集素在免疫相關 時期高表達，在Ca2+存在下能特異的識別病原微生物表面的糖類物質，引起宿主的一系列 免疫反應從而有效地抵抗病原微生物的入侵，是先天免疫反應中的一種模式識別受體，作 用機制是以其特有的碳水化合物識別結構域(carbohydrate recognition domain, CRD) 結合微生物表面碳水化合物，在免疫反應的非已識別中起重要作用(Chai Lian-Qin, Tian Yuan-Yuan, Yang Dan-Tong, Wang Jin-Xing, Zhao Xiao-Fan,2008, Molecular cloning and characterization of a C—type lectinfrom the cotton bollworm, Helicoverpa armigera. Developmental &Comparative Immunology,32 71-83)。家蠶凝集素基因克隆和功能已有研究報道，Koizumi (Koizumi N, Imamura Μ, Kadotani Τ, Yaoi K, Iwahana H, Sato R. The lipopolysaccharide-binding protein participating in haemocytenodule formation in the silkworm Bombyx mori isa novel member of the C-type lectin superfamilywith two different tandem carbohydrate-recognition domains.FEBS Lett 1999a ；443 139-143 ；Koizumi N， Imamura M，Kadotani T，Yaoi K，Iwahana H，Sato R. Lipopolysaccharide-bindingpr otein of Bombyx mori participates in a hemocyte-mediated defense reaction againstgram-negative bacteria. J Insect Physiol 1999b ；45 853-859.) iiE 明家胃 C-型凝集素具有脂多糖結合能力，其功能是在先天免疫中參與血細胞結節形成，參與血細 胞介導的革蘭士陰性菌防御，殺死入侵的病源微生物。但目前為止沒有關于家蠶凝集素的 重組表達和用于家蠶感染性疾病防治的研究報道。全基因組序列研究表明，C-型凝集素從 蠕蟲、果蠅到脊椎動物，雖然不 完全相同，但不同C-型凝集素的碳水化合物識別結構域CRD 序列具有相對保守的氨基酸殘基，C-凝集素的碳水化合物結合活性是通過碳水化合物識別 結構域來實現的，因此，重組表達凝集素全長基因(含結構域)或僅表達凝集素的碳水化合 物識別結構域均可以獲得有活性的產物。本發明通過生物工程技術生產家蠶C-型凝集素， 可以用于家蠶養殖中的微生物感染病害防治。

發明內容
針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種家蠶養殖中感染性病害使用的生 物藥物，用于家蠶的感染性病害防治。本發明在大腸桿菌中重組表達了家蠶C-型凝集素基因，實驗結果證明在大腸桿 菌中重組表達的家蠶C-型凝集素基因有幫助家蠶抵抗病源微生物侵襲的功能，可以用于 家蠶在養殖生產中的病害防治。本發明提供基因重組表達家蠶C-型凝集素的生物藥物，其特征是，將家蠶C-型凝 集素基因重組表達到大腸桿菌中。優選的，所述家蠶C-型凝集素基因來自家蠶C-型凝集素(Accession number :CAB38429 基因全序列在基因庫中，網址為//www. ncbi. nlm. nih. gov/ protein/4469126)。在大腸桿菌中重組表達家蠶C-型凝集素全長基因以及在上述基因的 基礎上進行修飾或堿基突變產生的基因，獲得重組蛋白凝集素。本發明還提供一種基因重組表達家蠶C-型凝集素的方法，包括如下步驟[1]針對插入表達載體的家蠶C-型凝集素的基因序列分別設計帶酶切位點的引 物，用PCR方法擴增家蠶C-型凝集素；[2]在大腸桿菌表達菌株中擴增并提取表達載體_家蠶C-型凝集素質粒；[3]將表達載體-家蠶C-型凝集素質粒轉入宿主體內，用誘導物誘導表達；[4]用Ni2+柱或其它填料純化重組表達家蠶C-型凝集素。重組表達家蠶C-型凝集素為在大腸桿菌中表達的家蠶C-型凝集素。步驟[3]中所述誘導物為IPTG(異丙基硫代-β -D-半乳糖苷的縮寫)、甲醇或其 它化合物。其中，步驟[1]中所述表達載體選自大腸桿菌表達載體和酵母表達載體。優選的， 大腸桿菌表達載體選自ρΕΤ系列載體或pGEX系列載體，酵母表達載體選自pPIC系列載體。其中，步驟[1]中所述家蠶C-型凝集素為家蠶C-型凝集素基因(Accession number :CAB38429，http //www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/4469126)及其基礎上進行修飾或堿基突變產生的基因。其中，步驟[2]中所述大腸桿菌表達菌株為任何大腸桿菌表達菌株，優選DH5 α。其中，步驟[3]中所述宿主為大腸桿菌、酵母菌或其它表達生物。所述大腸桿菌，優選BL21(DE3)；所述酵母菌，優選畢赤酵母(Pichia pastoris)；所述其它表達生物，優選 昆蟲細胞。本發明還提供所述基因重組表達家蠶C-型凝集素的生物藥物的應用，其特征是， 用于防治家蠶感染性病害。利用本發明的方法創制的基因重組家蠶C-型凝集素，可以用于家蠶的感染性病 害防治。將重組表達家蠶C-型凝集素噴灑到桑葉上或添加到滅菌冷卻至37°C的人工 養殖的家蠶的飼料中，lmg/L，防治微生物對家蠶的感染。所述微生物選自蘇云金桿菌 (Bacillusthuringiensis)，綠僵菌(Metarhizium anisopliae)或白僵菌(Beauveria bassiana)0本發明所述的重組表達家蠶C-型凝集素，減少病源生物在蟲體中的生存數量和 感染機會，可以減少病源生物對家蠶的致死率。防治家蠶細菌性疾病的傳統方法主要是使用抗生素，如添食氯霉素、紅霉素、土霉 素，這樣的方法會導致耐藥菌產生，抗生素對家蠶的正常生命活動也會產生不利影響。我們 發明的家蠶凝集素屬于生物藥物，家蠶凝集素是家蠶本身存在的抵御微生物浸染的天然物 質，通過生物技術方法重組表達生產的家蠶凝集素可以補充家蠶體內的凝集素的不足。重 組表達的凝集素通過取食或呼吸進入蟲體后通過凝集入侵的細菌從而直接殺死病源微生 物或增加血細胞對細菌的吞噬，不會導致耐藥菌產生，對家蠶本身的正常生命活動沒有不 良影響，使用該藥物可以減少抗生素的使用，減少環境中耐藥菌的產生。
具體實施例方式下面結合實驗，對利用本發明的方法得到的基因重組昆蟲凝集素的作用作進一步 的說明。方法⑴設計1對帶有酶切位點的引物擴增C-型凝集素基因，引物如下 LectEco :5’ -TACTCAGAATTCATGAAAGCGGCACTGGCCAGC-3’ (EcoR I ) ；LectXho :5’ -TACTC ACTCGAGTTCATTTGTCGTCGTGCTCTC-3’ (Xho I)，PCR 反應，條件為 94°C 30sec,60°C 45sec, 72°C lmin，72°C IOmin0 將 PCR 片段和 pET_30a (+)載體分別用 EcoRI 和 XhoI 酶切，由 T4DNA 連接酶將純化的cDNA片段與純化的pET-30a(+)載體連接，將連接產物轉化Ε. coli DH5 α， 篩選陽性克隆，提取質粒，取1 μ L構建好的表達質粒，稀釋10倍，轉化表達菌株Ε. coli BL21 (DE3)感受態細胞，在LB/Kan培養基中培養，加入終濃度為0. 5mM的IPTG誘導插入基 因的表達,取誘導后的菌液，6000rpm離心5min，收集菌體，用3ml PBS(140mM NaCl,2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4,1. 8mM KH2PO4,pH7. 4)禾口 30 μ 1 20% Triton X-100，充分混勻，冰浴超聲 破碎lOmin，破碎好的菌體4°C，12，OOOrpm離心20min，分別收集上清和沉淀，用鎳親和柱純 化重組蛋白重組表達家蠶C-型凝集素凝集素。方法(2)將重組表達家蠶C-型凝集素噴灑到桑葉上或添加到滅菌冷卻至37°C的 人工養殖的家蠶的飼料中，lmg/L，防治微生物對家蠶的感染。
實施例1設計1對帶有酶切位點的引物擴增C-型凝集素基因成熟肽(84_1013bp)，即去掉 信號肽部分。引物如下5’-TACTCAGAATTCATGAAAGCGGCACTGGCCAGC-3’ (EcoR I) ；LectXho 5，-TACTCACTCGAGTTCATTTGTCGTCGTGCTCTC-3’ (Xho I)，PCR 反應，條件為 94 "C 30sec, 60°C 45sec，72°C lmin，72°C IOmin0 將 PCR 片段和 pET_30a(+)載體分別用 EcoRI 和 XhoI 酶切，由T4DNA連接酶將純化的cDNA片段與純化的pET_30a(+)載體連接，將連接產物轉化 E. coli DH5 α，篩選陽性克隆，提取質粒，取IyL構建好的表達質粒，稀釋10倍，轉化表達 菌株Ε. coli BL21(DE3)感受態細胞，在LB/Kan培養基中培養，加入終濃度為0. 5mM的IPTG 誘導插入基因的表達，取誘導后的菌液，6000rpm離心5min，收集菌體，用3ml PBS(140mM NaCl，2. 7mM KCl，IOmM Na2HPO4,1. 8mM KH2PO4, pH7. 4)禾口 30 μ 1 20% Triton Χ-100，充分混 勻，冰浴超聲破碎lOmin，破碎好的菌體4°C，12，OOOrpm離心20min，分別收集上清和沉淀， 用鎳親和柱純化重組蛋白。實施例2將重組表達家蠶C-型凝集素噴灑到桑葉上或添加到滅菌冷卻至37°C的人工養殖 的家蠶的飼料中，lmg/L，防治微生物對家蠶的感染。試驗發現該方法可以減少環境中病源 微生物引起的家蠶感染性疾病的發生，如綠霉菌感染和蘇云金桿菌感染，發病率減少60%。實施例3在實施例1、2的基礎上，突變基因，獲得表達產物，具有相同的防治微生物感染的 功效。如1)將基因中任一編碼氨基酸的密碼子的第3位堿基突變而不改變氨基酸，獲得 具有相同氨基酸序列的重組表達家蠶C-型凝集素，如將tgg，cag, gag, get, cga (分別編 碼W, Q，Ε, A, R氨基酸)，突變成tgg, caa，gaa，gca，egg (仍然分別編碼W，Q，Ε, A, R氨基 酸)，基因中其它序列也如此；2)將基因中的部分序列缺失，獲得具有相同功效的重組表達 家蠶C-型凝集素，如將基因編碼框中的第1-78堿基缺失、或將第473-503堿基缺失、或將 第926-1010堿基缺失，獲得具有相同功效的重組表達家蠶C-型凝集素；3)將基因編碼蛋 白質中的氨基酸突變而獲得具有相同功效的重組表達家蠶C-型凝集素，如將K F HK V突 變成K F H D V，基因編碼蛋白質中的其它氨基酸突變也如此。實施例4在實施例1的基礎上，只表達基因的某個片斷，獲得表達產物，具有相同的防治微 生物感染的功效。如只表達家蠶C-型凝集素的第24到149氨基酸，獲得表達產物，或只 表達161到300氨基酸，獲得表達產物。實施例5在實施例1的基礎上，換用其它表達載體，如pGEX系列載體、酵母表達載體如pPIC 系列載體，獲得相同功能的凝集素產物。實施例6在實施例1的基礎上，換用其它表達系統，如酵母表達系統，獲得相同功能的凝集
素產物。實施例7給藥方式 將重組表達家蠶C-型凝集素添加到滅菌冷卻至37°C的人工養殖的家蠶的飼料 上，濃度為lmg/L，防治病源微生物對家蠶的感染。試驗發現該方法使家蠶感染性疾病的發生從90%降低到20%。 將重組表達家蠶C-型凝集素噴灑到桑葉上，濃度為lmg/L，防治微生物對家蠶的感染。試驗發現該方法使家蠶感染性疾病的發生從90%降低到20%。
權利要求
一種基因重組表達家蠶C-型凝集素的生物藥物，其特征是，將家蠶C-型凝集素基因重組表達到大腸桿菌中。
2.如權利要求1所述的，所述家蠶C-型凝集素基因來自基因庫家蠶C-型凝集素基因 (Accession number :CAB38429，//www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/4469126)、在大 腸桿菌中重組表達家蠶C-型凝集素全長基因、基因片斷、以及在上述基因的基礎上進行修 飾或堿基突變產生的基因，獲得重組蛋白凝集素或凝集素功能域。
3.一種基因重組表達家蠶C-型凝集素的方法，包括如下步驟[1]針對插入表達載體的家蠶C-型凝集素的基因序列分別設計帶酶切位點的引物，用 PCR方法擴增家蠶C-型凝集素基因；[2]在大腸桿菌中擴增并提取表達載體_家蠶C-型凝集素基因質粒；[3]將表達載體-家蠶C-型凝集素基因轉入宿主體內，用誘導物誘導表達；[4]用Ni2+柱或其它填料純化重組表達家蠶C-型凝集素。
4.如權利要求3所述的基因重組表達家蠶C-型凝集素的方法，其特征是，步驟[3]中 所述誘導物為IPTG、甲醇或其它化合物。
5.如權利要求3所述的基因重組表達家蠶C-型凝集素的方法，其特征是，步驟[1]中 所述表達載體選自大腸桿菌表達載體、酵母表達載體。優選的，大腸桿菌表達載體選自PET 系列載體或PGEX系列載體，酵母表達載體選自pPIC系列載體。
6.如權利要求3所述的基因重組表達家蠶C-型凝集素的方法，其特征是，步驟[1]中 所述家蠶C-型凝集素為家蠶C-型凝集素基因及其基礎上進行修飾或堿基突變產生的基 因。
7.如權利要求3所述的基因重組表達家蠶C-型凝集素的方法，其特征是，步驟[2]中 所述大腸桿菌表達菌株為DH5 α。
8.如權利要求3所述的基因重組表達家蠶C-型凝集素的方法，其特征是，步驟[3]中 所述宿主為大腸桿菌、酵母菌；所述大腸桿菌，選自BL21(DE3)；所述酵母菌，選自畢赤酵母 (Pichia pastoris)0
9.如權利要求1所述的基因重組表達家蠶C-型凝集素的生物藥物的應用，其特征是， 用于防治家蠶微生物感染性病害。
10.如權利要求9所述的基因重組表達家蠶C-型凝集素的生物藥物的應用，其特征是， 將重組表達家蠶C-型凝集素噴灑到桑葉或添加到滅菌冷卻至37°C的人工飼料中，lmg/L， 防治微生物對家蠶的感染；所述微生物選自蘇云金桿菌、綠僵菌或白僵菌。
全文摘要
本發明屬于生物工程技術領域，提供一種基因重組表達家蠶C-型凝集素的生物藥物，將家蠶C-型凝集素基因重組表達到大腸桿菌中。還提供基因重組表達家蠶C-型凝集素的方法。本發明的凝集素，可以減少病源生物對家蠶的致死率，增加血細胞對病源生物的吞噬效率，減少病源生物在蟲體中的生存數量。不會導致耐藥菌產生，對家蠶本身的正常生命活動沒有不良影響，使用該藥物可以減少家蠶飼養中抗生素的使用，減少環境中耐藥菌的產生。
文檔編號A23K1/16GK101864425SQ201010173398
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月17日 優先權日2010年5月17日
發明者宋凱, 王金星, 趙小凡 申請人:山東大學