專利名稱：：一種工程蠅凝集素的高效純化方法
技術領域：
：本發明屬于化學分離
技術領域：
，涉及一種凝集素，尤其是一種工程蠅凝集素的高效純化方法。
背景技術：
：凝集素有多種生物學活性，廣泛用于醫藥、食品、保鮮等行業，凝集素對機體免疫有雙重調節作用，能夠促進機體對腫瘤細胞的識別與清除，凝集素單獨作用于腫瘤細胞能夠引起腫瘤細胞凋亡，對于病毒在體內復制也有很好的抑制作用，還能促進炎癥后機體的恢復過程。從工程蠅體內提取的凝集素是一種糖蛋白，其生物活性功能與其分子量、分子結構、糖鏈的組分都有密切的關系，并使其具有特定的生物學功能，如抗腫瘤特性，對免疫應答、免疫低下、免疫疾病也有很好的調節作用。目前工業上運用最為廣泛凝集素是刀豆凝集素，但是由于提取得率低而且價格昂貴，如何高效提取凝集素組分是一亟待解決的問題。
發明內容本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種提取率高、方法簡單的工程蠅凝集素的高效純化方法。本發明的目的是通過以下技術方案實現的—種工程蠅凝集素的高效純化方法，純化的步驟是(1)對工程蠅的幼蟲進行誘導，待幼蟲化蛹后，收集蛹，除去飼養過程中混入的雜質，清水漂洗，收集漂洗干凈的蛹，加提取溶劑研磨，3-5t:靜置0.8-1.2h，得到浸提液備用；(2)由步驟(1)得到的浸提液，離心，過濾除去雜質，重復離心、過濾步驟2-4次，收集過濾后的上清液，經過石油醚的抽提，得到的濃縮液備用；(3)將步驟(2)得到的濃縮液在4-4(TC條件下與膠混合，每30min緩慢攪拌一次，3.5-4.5h后裝柱，緩沖液平衡，緩沖液洗脫流速控制在0.8-1.2mL/min，洗脫雜蛋白，之后進行糖溶液競爭性洗脫，競爭性洗脫液流速控制在0.5mL/min，收集洗脫峰；(4)將收集到洗脫峰過S印hadeXG200凝膠柱，先后檢測到四個峰值，分別對各個峰的成分進行回收、冷凍、干燥，得到白色粉末即為凝集素。而且，所述步驟(1)中幼蟲化蛹的化蛹率為80%。而且，所述步驟(1)的提取溶劑為生理鹽水或者昆蟲緩沖液BIS。而且，所述步驟(3)中混膠使用的是S印harose4B。而且，所述步驟(4)的緩沖液為昆蟲緩沖液BIS。而且，所述步驟(4)的競爭性洗脫液為D-半乳糖溶液0.2-0.3moL/L。本發明的優點和積極效果是1、本發明以工程蠅為原料，工程蠅凝集素具有糖結合專一性，其配基能與凝集素結合，適合采用特異性純化，利用色譜分離技術對其進行提取、分離、純化，并且工程蠅凝集素在4(TC下穩定，適合室溫提取，提取方法不僅簡單而且實用，適合大規模工業生產。2、本發明提取的工程蠅凝集素是一種具有不同的分子量、結合特異性的大分子物質，其分子量從68kD-22kD之間，由多種氨基酸組成，凍干后樣品為白色粉末，易溶于水，難溶于有機溶劑，如乙醇、乙醚、甲醛等，保藏方便，再利用方便。圖1為本發明工程蠅蛹提取液的親和層析圖；圖2為本發明電泳分析凝集素純度及分子量非變性電泳，圖中M為標準蛋白質樣品；1為經R-250染色的樣品；圖3為本發明凝集素SDS-PAGE電泳圖，M為標準蛋白質樣品，I為加入P-巰基乙醇。具體實施例方式下面結合實施例，對本發明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。—種工程蠅凝集素的高效純化方法，其純化的步驟是(1)利用工程蠅傳代，得到性狀穩定的子代，收集工程蠅子代的蛹，為提高子代繁殖率與性狀穩定，要求飼養環境24°C_301:，濕度控制在60%左右，室內飼養環境達到清潔級，飼料為高營養、高能量飼料。對工程蠅的幼蟲進行誘導，待幼蟲化蛹后(80%化蛹)，收集蛹，除去飼養過程中混入的雜質，用清水漂洗5次，收集漂洗干凈的蛹，以昆蟲緩沖液BIS或者生理鹽水做為蛹糖蛋白的提取溶劑，加5倍蛹體積的BIS或者生理鹽水進行研磨，4t:靜置lh，得到浸提液備用；注意用生理鹽水做為蛹糖蛋白提取溶劑時，溫度應控制在4t:，此時能抑制蛹體內一些蛋白酶對糖蛋白的降解，以提高產物的得率。(2)由步驟(1)得到的浸提液，先經過12000rpm離心15min，過濾除去幾丁質、脂肪等雜質，重復離心、過濾步驟3次，收集過濾后的上清液，經過石油醚的抽提，得到的濃縮液備用；其中石油醚抽提，處理溫度控制在4(TC以下，處理30min以上，可有效除去脂質。(3)將步驟(2)得到的濃縮液在4°C-4(rC條件下與S印harose4B瓊脂糖凝膠進行混合，每30min緩慢攪拌一次，4h后裝柱，昆蟲緩沖液BIS平衡，緩沖液洗脫流速控制在lmL/min，洗脫雜蛋白，并且親和目的蛋白，然后進行糖溶液競爭性洗脫，競爭性洗脫液D-半乳糖溶液0.2-0.3moL/L，流速控制在0.5mL/min，收集洗脫峰；其中色譜柱起到除雜蛋白質、親和目的蛋白的目的，當糖蛋白被洗脫時，可以得到與單糖有專一性結合的物質。(4)將收集到的步驟(3)的洗脫液過S印hadeXG200凝膠柱，先后檢測到四個峰值，分別對其進行回收、冷凍、干燥，得到白色粉末為凝集素純品，其純度達到90%以上。其中收集洗脫液通過G-200凝膠注，按分子量大小收集各組分，實驗證明各組分有多種生物學功能，如免疫調節、抗腫瘤、抗病毒等。4本發明的生物學功能檢測實驗情況1、對正常小鼠實驗表明，凝集素在非特異性免疫，細胞免疫，體液免疫三方面有一定調節作用。不同濃度的凝集素對脾臟淋巴細胞增殖能力都具有一定的促進作用。1200iig/mL濃度組具有極顯著差異。2、對于免疫低下小鼠的碳粒廓清實驗中，治療組中，高劑量組有顯著性差異。預防組中，凝集素的作用隨劑量的增大而顯著，免疫低下小鼠的血清溶血素實驗結果表明，高劑量的凝集素能明顯改善免疫低下小鼠的特異性體液免疫能力，而中低劑量組的效果并不明顯。凝集素對于免疫低下小鼠的遲發型超敏反應沒有明顯作用。3、體內小鼠實驗進一步說明了，凝集素對機體免疫水平的調節，無論是在正常小鼠還是在免疫低下小鼠，凝集素都有一定的作用，對于環磷酰胺所致的免疫低下小鼠有很好的拮抗作用。具體檢測見如下列表表1凝集素對正常小鼠免疫器官的影響G士sd，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(與空白對照組比較，*p<0.05)表2凝集素對正常小鼠非特異性免疫功能的影響(；士sd，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(與空白對照組比較，*p<0.05，**p<0.01)表3凝集素對正常小鼠體液免疫功能的影響(S士sd，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(與空白對照組比較，*p<0.05，**p<0.01)表4凝集素對脾臟淋巴細胞增殖能力的影響G±sd，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表6凝集素對環磷酰胺致免疫低下小鼠免疫器官的影響(；士sd，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表7凝集素對環磷酰胺致免疫低下小鼠非特異性免疫功能的影響(；士sd，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(與正常對照組比較，Ap<0.05，AAp<0.01;與治療組陰性對照組比較、<0.05，**p<0.01;與預防組陰性對照組比較Ap<0.05，▲<0.01)表8凝集素對環磷酰胺致免疫低下小鼠體液免疫功能的影響G±sd，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(與正常對照組比較，Ap<0.05AAp<0.01;與治療組陰性對照組比較fp<0.05，**p<0.01;與預防組陰性對照組比較Ap<0.01，<0.01)表9凝集素對環磷酰胺致免疫低下小鼠遲發型超敏反應的影響(；士sd，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(與正常對照組比較，Ap<0.05，AAp<0.01;與治療組陰性對照組比較fp<0.05，**p<0.01;與預防組陰性對照組比較Ap<0.01，<0.01)。權利要求一種工程蠅凝集素的高效純化方法，其特征在于其純化的步驟是(1)對工程蠅的幼蟲進行誘導，待幼蟲化蛹后，收集蛹，除去飼養過程中混入的雜質，清水漂洗，收集漂洗干凈的蛹，加提取溶劑研磨，3-5℃靜置0.8-1.2h，得到浸提液備用；(2)由步驟(1)得到的浸提液，離心，過濾除去雜質，重復離心、過濾2-4次，收集過濾后的上清液；(3)將步驟(2)得到的濃縮液混膠，在4-40℃條件下與膠混合，每30min緩慢攪拌一次，3.5-4.5h后裝柱，緩沖液平衡，緩沖液洗脫流速控制在0.8-1.2mL/min，洗脫雜蛋白，之后進行糖溶液競爭性洗脫，競爭性洗脫液流速控制在0.5mL/min，收集洗脫峰；(4)將收集到洗脫峰過SephadexG200凝膠柱，先后檢測到四個峰值，分別對各個峰的成分進行回收、冷凍、干燥，得到白色粉末即為凝集素。2.根據權利要求1所述的一種工程蠅凝集素的高效純化方法，其特征在于所述步驟(1)中幼蟲化蛹的化蛹率為80%。3.根據權利要求1所述的一種工程蠅凝集素的高效純化方法，其特征在于所述步驟(1)的提取溶劑為生理鹽水或者昆蟲緩沖液BIS。4.根據權利要求1所述的一種工程蠅凝集素的高效純化方法，其特征在于所述步驟(3)中混膠使用的是S印harose4B。5.根據權利要求1所述的一種工程蠅凝集素的高效純化方法，其特征在于所述步驟(4)的緩沖液為昆蟲緩沖液BIS。6.根據權利要求1所述的一種工程蠅凝集素的高效純化方法，其特征在于所述步驟(4)的競爭性洗脫液為D-半乳糖溶液0.2-0.3moL/L。全文摘要本發明涉及一種工程蠅凝集素的高效純化方法，其純化的步驟是對工程蠅的幼蟲進行必要的誘導，待幼蟲化蛹后(80％化蛹)，收集蛹，除去飼養中混入的雜質，以生理鹽水或者BIS做為提取溶劑提取蛹糖蛋白，提取液經離心、超濾、濃縮，吸附色譜柱脫色純化、離子交換色譜柱純化、凝膠色譜柱純化、濃縮等步驟得到一類分子量在68-22kDa之間的糖蛋白。本發明以工程蠅為原料，工程蠅凝集素有糖結合專一性，其能與色譜柱上的特定配基結合，適合采用特異性純化，利用色譜分離技術對其進行提取、分離、純化，并且工程蠅凝集素在40℃下穩定，適合室溫提取，提取方法不僅簡單而且實用，適合大規模工業生產。文檔編號C07K1/16GK101709075SQ200910228160公開日2010年5月19日申請日期2009年11月11日優先權日2009年11月11日發明者周明慧,曹小紅,王愛華申請人:天津科技大學