專利名稱：黃芪凝集素蛋白及其制備方法
技術領域：
本發明屬于植物蛋白領域，更具體地說，涉及從黃芪中分離一種凝集素蛋白及其制備方法。
背景技術：
中草藥主要根據所含有的活性成分入藥，為了充分利用資源和探索新地活性成分，其中蛋白質成分逐漸受到關注。近年來，已有許多具有生物活性的蛋白質相繼在多種中草藥中被發現。分離純化中草藥中的活性蛋白質成分，以期找到一些新的具有臨床應用價值的蛋白質或多肽，已經成為國內外眾多研究工作者的一個重要方向。
植物凝集素(lectin)是一類結合特異糖類蛋白質，又稱血細胞凝集素(haemagglutinin)或凝集素(agglutinin)，是一種非免疫起源的、非酶的糖蛋白，至少擁有兩個與糖結合的位點，而且結合是可逆的。近數十年來，人們對凝集素的性質、生理功能、基因結構與表達等方面進行了深入的研究，取得了有意義的進展。凝集素有許多生物學作用，這與凝集素與糖結合的專一性密切相關。
現已發現，植物凝集素可能與植物抗蟲和抗病性相關，部分具有殺蟲作用。國外最近報道某些凝集素對愛滋病病毒也有抑制作用。凝集素還參與了高等動物的發育、免疫、癌變以及細胞識別與信息傳遞等重要過程。凝集素廣泛存在于自然界中的不同生物物種中，早期的研究對象主要是植物，其中豆科植物種子的含量尤為豐富，相關研究也比較多。
根據凝集素氨基酸序列的同源性及其在進化上的關系植物凝集素被分成7個家族豆科凝集素，單子葉甘露糖結合凝集素，2型核糖體失活蛋白，木菠蘿(jacalin)家族，葫蘆科韌皮部凝集素和莧科凝集素(Peumans and VanDamme，Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 1998，15199-228)
黃芪具有較為廣泛的藥理活性，其多糖、皂甙和黃酮類等成分已有較為深入的研究。黃芪中蛋白質含量較高(15％以上)，但黃芪中活性蛋白的報道尚屬空白。因此，本發明首次對黃芪中的活性蛋白進行研究，為科學認識黃芪中蛋白質的功能提供依據。分離和純化植物體內特異的凝集素，對其進行生理生化特性、結構和功能的研究分析，在植物基因工程和植物病理學領域具有重要的理論和應用價值。
發明內容
本發明首次進行了黃芪中一種凝集素的分離、純化和鑒定。以黃芪為原料，通過硫酸銨分級沉淀及離子交換柱層析，得到了一種黃芪凝集素蛋白。
本發明的一個目的是提供一種黃芪凝集素蛋白，其是一種糖蛋白，在天然狀態下以兩個亞基組成的同源二聚體的形式存在，分子量為61.1kDa，單一亞基的分子量約為29.6kDa，其N端氨基酸序列為Glu-Ser-Gly-Iie-Asn-Leu-Gln-Gly-Asp-Ala-Thr-Leu-Ala-Asn-Asn。
本發明的黃芪凝集素蛋白通過N端15個氨基酸殘基的同源性比較，是一個新的凝集素蛋白，該黃芪凝集素蛋白是一種糖蛋白，糖含量約為19.6％。
該黃芪凝集素蛋白能用于血液凝集。能凝集兔和人的血紅細胞，特別對不同血型的人血表現出明顯的特異性。對胰蛋白酶處理后的兔血紅細胞，最低凝集濃度為2.3μg/ml。
糖抑制性實驗表明該黃芪凝集素蛋白屬半乳糖結合型的凝集素蛋白。
該黃芪凝集素蛋白還具有明顯的抗真菌活性，特別是對灰葡萄孢菌有很強的抑制能力。
本發明的另一目的還涉及黃芪凝集素蛋白的制備方法，該方法包括以下步驟
1)以黃芪為原料，粉碎成粗粉，添加磷酸緩沖液，攪拌下提取，離心收集上清液作為蛋白質粗提取液備用；
2)攪拌條件下，添加硫酸銨粉末至粗提取液中，使粗提取液中硫酸銨飽和度達15-30％，攪拌充分混合后，離心，棄去沉淀收集上清液，繼續添加硫酸銨粉末至上清液達50-70％硫酸銨飽和度，攪拌混合后，離心收集沉淀，棄去上清液。用磷酸緩沖液溶解沉淀，保存備用；
3)上述得到的蛋白用磷酸緩沖液透析后，再經以下三步離子交換柱層析來進行活性蛋白的純化
第一步離子交換層析采用QAE Sephadex A-25離子交換柱，先洗出未結合的蛋白，然后用溶于磷酸緩沖液中的NaCl溶液洗脫；收集具有凝集活性的組分，采用醋酸鈉緩沖液充分透析后保存備用；
第二步離子交換層析采用Econo-Pac CM離子交換柱，對第一步得到的粗蛋白進行層析，先洗出未結合的蛋白，然后用溶于磷酸緩沖液中的NaCl溶液洗脫，收集具有凝集活性的組分；
第三步離子交換層析采用Econo-Pac High Q離子交換柱，將上一步層析所得到的收集液，經Tris-HCl緩沖液透析后，再過第三步離子交換柱，先洗出未結合的蛋白，然后用溶于磷酸緩沖液中的NaCl溶液洗脫。收集具有凝集活性的組分，得到黃芪凝集素蛋白。
優選，本發明的黃芪凝集素蛋白是通過以下方法制備而成
1)以黃芪為原料，優選蒙古黃芪原料，粉碎成0.5-1.5mm粗粉，添加4～8倍量的50mM磷酸緩沖液，0～30℃攪拌下提取，0～30℃離心，收集上清液作為蛋白質粗提取液備用；
2)攪拌條件下，添加硫酸銨粉末至粗提取液中，使粗提取液中硫酸銨飽和度達15-25％，攪拌充分混合后，離心，棄去沉淀收集上清液，繼續添加硫酸銨粉末至上清液達55-65％硫酸銨飽和度，攪拌且充分混合后，離心收集沉淀，棄去上清液。用10mM磷酸緩沖液溶解沉淀，低溫保存備用；
3)上述得到的蛋白用10mM的磷酸緩沖液透析后，再經以下三步離子交換柱層析來進行活性蛋白的純化
第一步離子交換層析采用QAE Sephadex A-25離子交換柱，先洗出未結合的蛋白，然后用溶于10mM磷酸緩沖液中的0～0.5M的NaCl溶液洗脫。收集具有凝集活性的組分，采用10mM醋酸鈉緩沖液充分透析后保存備用；
第二步離子交換層析采用Econo-Pac CM離子交換柱，對第一步得到的粗蛋白進行層析，先洗出未結合的蛋白，然后用溶于10mM磷酸緩沖液中的0～0.3M的NaCl溶液洗脫，收集具有凝集活性的組分；
第三步離子交換層析采用Econo-Pac High Q離子交換柱。將上一步層析所得到的收集液，經10mM Tris-HCl緩沖液透析后，再過第三步離子交換柱，先洗出未結合的蛋白，然后用溶于10mM磷酸緩沖液中的0～0.3M的NaCl溶液洗脫，收集具有凝集活性的組分，得到黃芪凝集素蛋白。
本發明是根據目標黃芪凝集素蛋白的特性，通過不同飽和度的硫酸銨沉淀得到粗蛋白，然后將不同的離子交換柱結合應用，通過多步的離子交換層析獲得一種黃芪凝集素蛋白。經凝膠過濾分析和SDS-PAGE電泳分析，其分子量為61.1kDa，單一亞基的分子量約為29.6kDa.。在天然狀態下為兩個亞基組成的同源二聚體。
氨基酸組分分析表明，該凝集素蛋白富含甘氨酸(Gly，16.0％)、絲氨酸(Ser，11.0％)、天冬氨酸(Asp，9.9％)和亮氨酸(Leu，9.6％)，而半胱氨酸、組氨酸和甲硫氨酸沒有檢出。采用Edman降解法，在Applied BiosystemsProcise-PROCISE上進行N端氨基酸殘基組成的測定。N端氨基酸序列為ESGINLQGDATLANN(谷-絲-甘-異亮-天冬酰胺-亮-谷酰胺-甘-天冬-丙-蘇-亮-丙-天冬酰胺-天冬酰胺，Glu-Ser-Gly-Iie-Asn-Leu-Gln-Gly-Asp-Ala-Thr-Leu-Ala-Asn-Asn)。以這15個氨基酸為基礎，通過同源性比較發現，它與蛋白質數據庫(GenBank CD translation，PDB，SwissProt，NCBI，EBI和PIR)中已經報道的蛋白質沒有相同的序列，與花生(Arachis hypogaea)半乳糖結合凝集素和其前體具有53.3％的同源性，說明它是一種新的凝集素蛋白。
該凝集素能凝集兔和人的血紅細胞，特別對不同血型的人血表現出明顯的特異性。對胰蛋白酶處理后的兔血紅細胞，最低凝集濃度為2.3μg/ml。糖抑制性實驗表明該凝集素屬半乳糖結合型的凝集素。此外，該凝集素還具有明顯的抗真菌活性，特別是對灰葡萄孢菌有很強的抑制能力。
附圖1純黃芪凝集素蛋白的SDS-PAGE圖及糖蛋白的鑒定圖。
圖中M標準蛋白P純化的黃芪凝集素蛋白Q糖蛋白鑒定
如附圖1所示，經SDS-PAGE電泳后采用高碘酸-Schiff(PAS)試劑法鑒定，在相應位置上呈現明顯的粉紅色條帶，表明該黃芪凝集素蛋白是一種糖蛋白。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步詳細說明，但是不以任何方式限制本發明的范圍。
實施例黃芪凝集素蛋白的制備
1).粗蛋白的提取將5g黃芪原料粉碎成1mm左右粗粉，添加6倍量的50mM磷酸緩沖液，15℃攪拌下提取16小時，15℃離心(1000×g)10分鐘，收集上清液作為蛋白質粗提液備用；
2).在攪拌條件下，緩慢添加硫酸銨粉末至粗提液中，使粗提液中硫酸銨飽和度達20％，在冰水浴中緩慢攪拌充分混合后，離心(10000×g)10分鐘，棄去沉淀收集上清液。繼續添加硫酸銨粉末至上清液達60％硫酸銨飽和度，緩慢攪拌且充分混合后，離心(10000×g)10分鐘收集沉淀，棄去上清液，用10mM磷酸緩沖液溶解沉淀，保存備用；
3).上述得到的蛋白用10mM的磷酸緩沖液透析后，再經以下三步離子交換柱層析來進行活性蛋白的純化
第一步離子交換層析采用QAE Sephadex A-25離子交換柱，先洗出未結合的蛋白，然后用溶于10mM磷酸緩沖液的0～0.3M的NaCl溶液梯度洗脫。收集具有凝集活性的組分，采用10mM醋酸鈉緩沖液透析后保存備用。
第二步離子交換層析采用Econo-Pac CM離子交換柱，對第一步得到的粗蛋白進行層析，先洗出未結合的蛋白，然后用溶于10mM磷酸緩沖液中的0～0.3M的NaCl溶液梯度洗脫，收集具有凝集活性的組分。
第三步離子交換層析采用Econo-Pac High Q離子交換柱。將上一步層析所得的收集液，經10mM Tris-HCl緩沖液透析后，再過第三步離子交換柱。先洗出未結合的蛋白，然后用溶于10mM磷酸緩沖液中0～0.3M的NaCl溶液梯度洗脫。收集具有凝集活性的組分，得到黃芪凝集素蛋白。
實施例1制備的黃芪凝集素蛋白的分子特征
經凝膠過濾分析和SDS-PAGE電泳分析，其分子量為61.1kDa，單一亞基的分子量為29.6kDa，天然狀態下為兩個亞基組成的同源二聚體，如附圖1所示。經SDS-PAGE電泳后采用高碘酸-Schiff(PAS)試劑法鑒定，在相應位置上呈現明顯的粉紅色條帶，表明該凝集素蛋白是一種糖蛋白。
氨基酸組成分析表明，該蛋白富含甘氨酸(Gly，16.0％)、絲氨酸(Ser，11.0％)、天冬氨酸(Asp，9.9％)和亮氨酸(Leu，9.6％)，而半胱氨酸、組氨酸和甲硫氨酸沒有檢出。采用Edman降解法，在Applied Biosystems Procise-PROCISE上進行N端氨基酸殘基組成的測定。N-端氨基酸序列為ESGINLQGDATLANN(谷-絲-甘-異亮-天冬酰胺-亮-谷酰胺-甘-天冬-丙-蘇-亮-丙-天冬酰胺-天冬酰胺，Glu-Ser-Gly-Iie-Asn-Leu-Gln-Gly-Asp-Ala-Thr-Leu-Ala-Asn-Asn)。以這15個氨基酸為基礎，通過同源性比較發現，它與蛋白質數據庫(GenBank CD translation，PDB，SwissProt，NCBI，EBI和PIR)中已經報道的蛋白質沒有相同的序列，與花生(Arachis hypogaea)半乳糖結合凝集素和其前體具有53.3％的同源性，說明它是一種新的凝集素蛋白。
分析方法
蛋白和糖含量測定方法
蛋白的精確定量采用Lowry方法(Lowry等，1951)以牛血清蛋白為標準。糖含量測定采用苯酚-硫酸法(Dubois，1956)，以葡萄糖作為標準。
凝集活性的測定方法
在96孔U型凝血板上，每孔加入50μl的樣品溶液和2％新鮮血球懸液50μl(或經1mg/ml胰蛋白酶處理1h后)，混勻后，放置1h，肉眼觀察結果，以能使紅細胞凝集的最大樣品稀釋度為1個血凝單位(HU)。相對凝集活性為凝集活性與蛋白含量的比值。
該黃芪凝集素蛋白對天然或胰蛋白酶處理后的兔、人等血液具有較強的凝集活性，凝集兔血最低蛋白濃度為4.6μg/ml(天然)和2.3μg/ml(胰蛋白酶處理后)。凝集活性的最適pH范圍為4.5～7.5，在65℃以下穩定。
表1 凝集素對兔和人血的凝集活性
a蛋白濃度184μg/ml下凝集活性沒有檢出
糖抑制試驗
選取不同的糖(乳糖、半乳糖、棉子糖、鼠李糖、纖維二糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖)分別配成0.5M的糖溶液。將糖溶液用PBS溶液倍比稀釋，每孔25μl糖液，再在每孔中加入25μl樣品溶液(實驗采用4個血凝單位，即凝集活性為4HU)，混勻，室溫下讓其反應30min后，每孔加入50μl的2％的經胰蛋白酶處理的兔血紅細胞，混勻，靜置，待其凝集(大約1小時左右)后觀察結果。
表2 凝集素活性對糖的特異性
a4HU的凝集素所對應的最低抑制濃度
bNI，糖濃度達125mM時仍無抑制作用
對糖的特異性的試驗結果如表所示。半乳糖和乳糖能強烈抑制該凝集素的凝集活性，最低抑制濃度分別達7.8mM和3.1mM。D-棉子糖、L-鼠李糖和纖維二糖也能較強地抑制該凝集素對兔血的凝集活性。D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖為該凝集素的中等程度凝集活性抑制劑。但D-半乳糖醛酸、D-果糖、麥芽糖、D-甘露糖、D-核糖、L-山梨糖和蔗糖在濃度高達125mM情況下未見對兔血凝集活性的抑制。糖的特異性結果表明，該凝集素是一種半乳糖結合型的凝集素。
抗真菌活性
灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)，黃瓜鐮刀孢菌(Fusarium oxysporum)，Colletorichum sp.，Drechslera turcia，Mycosphaerella arachidicola和立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)購自中科院微生物所菌種保藏中心。
將指示真菌接種在培養皿中心，置25℃培養，待菌絲向外蔓延的圓面直徑約2～3cm時，在離菌絲生長邊緣約1cm處放置滅菌的濾紙圓片，在濾紙片上分別滴加10～15μl待測蛋白，置25～28℃培養72h，觀察并記錄菌絲生長被抑制的情況。
表3黃芪凝集素蛋白對六種真菌的抑制情況
“+++”在蛋白量為20μg即有較強抑制能力；“+”在蛋白量為100μg即有一定抑制能力；“-”當蛋白的量為200μg時，仍無抑制能力。
權利要求
1.一種黃芪凝集素蛋白，其特征在于，
N-端氨基酸序列為Glu-Ser-Gly-Iie-Asn-Leu-Gln-Gly-Asp-Ala-Thr-Leu-Ala-Asn-Asn
天然狀態下為兩個亞基組成的同源二聚體，分子量約61.1kDa，單一亞基的分子量為約29.6kDa；
2.根據權利要求1所述的凝集素蛋白在血液凝集中的應用。
3.根據權利要求1所述的凝集素蛋白用于抗真菌。
4.一種黃芪凝集素蛋白的制備方法，其特征在于，它包含下述步驟
1)以黃芪為原料，粉碎成粗粉，添加磷酸緩沖液，攪拌下提取，離心收集上清液作為蛋白質粗提取液備用；
2)攪拌條件下，添加硫酸銨粉末至粗提取液中，使粗提取液中硫酸銨飽和度達15-30％，攪拌充分混合后，離心，棄去沉淀收集上清液，繼續添加硫酸銨粉末至上清液達50-70％硫酸銨飽和度，攪拌混合后，離心收集沉淀，棄去上清液，用磷酸緩沖液溶解沉淀，保存備用；
3)上述蛋白用磷酸緩沖液透析后，再經以下三步離子交換柱層析來進行活性蛋白的純化
第一步離子交換層析采用QAE Sephadex A-25離子交換柱，先洗出未結合的蛋白，然后用溶于磷酸緩沖液中的NaCl溶液洗脫；收集具有凝集活性的組分，采用醋酸鈉緩沖液充分透析后保存備用；
第二步離子交換層析采用Econo-Pac CM離子交換柱，對第一步得到的粗蛋白進行層析，先洗出未結合的蛋白，然后用溶于磷酸緩沖液中的NaCl溶液洗脫，收集具有凝集活性的組分，
第三步離子交換層析采用Econo-Pac High Q離子交換柱，將上一步層析所得到的收集液，經Tris-HCl緩沖液透析后，再過第三步離子交換柱，先洗出未結合的蛋白，然后用溶于磷酸緩沖液中的NaCl溶液洗脫，收集具有凝集活性的組分，得到黃芪凝集素蛋白。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，它包含以下步驟
1)以蒙古黃芪為原料，粉碎成0.5-1.5mm粗粉，添加4～8倍量的50mM磷酸緩沖液，0～30℃攪拌下提取，0～30℃離心，收集上清液作為蛋白質粗提取液備用；
2)攪拌條件下，添加硫酸銨粉末至粗提取液中，使粗提取液中硫酸銨飽和度達15-25％，攪拌充分混合后，離心，棄去沉淀收集上清液，繼續添加硫酸銨粉末至上清液達50-65％硫酸銨飽和度，攪拌且充分混合后，離心收集沉淀，棄去上清液，用10mM磷酸緩沖液溶解沉淀，保存備用；
3)上述得到的蛋白用10mM磷酸緩沖液透析后，再經以下三步離子交換柱層析來進行活性蛋白的純化
第一步離子交換層析采用QAE Sephadex A-25離子交換柱，先洗出未結合的蛋白，然后用溶于10mM磷酸緩沖液中的0～0.5M NaCl溶液洗脫；收集具有凝集活性的組分，采用10mM醋酸鈉緩沖液充分透析后保存備用；
第二步離子交換層析采用Econo-Pac CM離子交換柱，對第一步得到的粗蛋白進行層析，先洗出未結合的蛋白，然后用溶于10mM磷酸緩沖液中的0～0.3M的NaCl溶液洗脫，收集具有凝集活性的組分，
第三步離子交換層析采用Econo-Pac High Q離子交換柱，將上一步層析所得到的收集液，經10mM Tris-HCl緩沖液透析后，再過第三步離子交換柱，先洗出未結合的蛋白，然后用溶于10mM磷酸緩沖液中的0～0.3M的NaCl溶液洗脫，收集具有凝集活性的組分，得到黃芪凝集素蛋白。
6根據權利要求4或5所述的制備方法所獲得的黃芪凝集素蛋白。
全文摘要
本發明提供從植物黃芪中分離純化后得到的凝集素蛋白及其制備方法，具體說，以黃芪為原料，通過不同飽和度的硫酸銨分級沉淀及多步的離子交換柱層析，得到的一種黃芪凝集素蛋白。該凝集素蛋白屬半乳糖結合型的凝集素蛋白，在天然狀態下為兩個亞基組成的同源二聚體，通過N端15個氨基酸殘基的同源性比較，是一個新的凝集素蛋白，用于血液凝集，并具有明顯的抗真菌作用。
文檔編號C07K7/08GK1687115SQ200510011480
公開日2005年10月26日 申請日期2005年3月25日 優先權日2005年3月25日
發明者閆巧娟, 韓魯加, 江正強, 楊紹青, 鄧偉 申請人:中國農業大學