專利名稱：：結合于人類白細胞抗原(hla)ⅰ類或ⅱ類分子的腫瘤相關肽及相關的抗癌疫苗的制作方法專利說明結合于人類白細胞抗原(HLA)Ⅰ類或Ⅱ類分子的腫瘤相關肽及相關的抗癌疫苗描述本發明是關于免疫療法，以及用于免疫療法的分子和細胞。特別是，本發明是有關于癌癥的免疫治療，尤其是腎臟癌癥的免疫療法。本發明還關于腫瘤相關的輔助性T細胞的肽表位，單獨或與其他能激起抗癌免疫反應而作為疫苗組合物的活性制藥材料。特別是，本發明是關于兩種源自人類癌細胞株，I類或II類人類白細胞抗原(HLA)分子的新型肽序列，此人類癌細胞株可被使用在疫苗組合物中以引起抗癌免疫反應。為了本發明的目的，所有被引用的資料在此作為參考文獻加以整體引述。
背景技術：
：免疫反應的刺激取決于被宿主免疫系統視為外來者抗原的出現。從發現腫瘤相關抗原的存在上，現可提高由宿主的免疫系統去調停腫瘤成長的可能性。利用免疫系統的體液性和細胞性的各種各樣的機制，現今被探究作為癌癥免疫療法。細胞性免疫反應的專一元素是能專一地識別和摧毀腫瘤細胞。從腫瘤浸潤的細胞群或從外周血液里分離出細胞毒性T細胞(CTL)，暗示這種細胞在自然免疫防御中對抗癌起重要作用(Cheeveretal.，AnnalsN.Y.Acad.Sci.1993690101-112)(奇弗等，紐約科學院年鑒，1993年，第六百九十冊，101至112頁)。特別是CD8陽性T細胞(TCD8陽性)，可識別I類主要組織相容性復合體(MHC)分子，具有通常八到十個源自細胞質蛋白質的肽殘基，在這個反應中起重要作用。此人類MHC分子也被選定作為人類白細胞抗原(HLA)。有兩類的MHC分子MHCMHCI類分子可在大多數有細胞核的細胞中發現，細胞里的肽起因于內源蛋白質和較大肽的蛋白水解。MHCMHCII類分子只在專門抗原呈遞細胞(APC)中發現，細胞里的肽是由抗原呈遞細胞的內吞作用而取得的外源蛋白質且隨即被處理。肽與MHCMHCI類分子的復合體可被CD8陽性細胞毒性T淋巴細胞所識別，肽與MHCMHCII類分子的復合體可被CD4陽性的輔助性T細胞所識別。CD4陽性的輔助性T細胞在協同建構抗腫瘤T細胞反應的效應因子作用中起重要作用，因而對源自腫瘤相關抗原(TAA)的CD4陽性T細胞表位的確認，在觸發抗腫瘤免疫反應的藥品的研發中也許是非常重要的(Kobayashi，H.，R.Omiya，M.Ruiz，E.Huarte，P.Sarobe，J.J.Lasarte，M.Herraiz，B.Sangro，J.Prieto，F.Borras-Cuesta，andE.Celis.2002.IdentificationofanantigenicepitopeforhelperTlymphocytesfromcarcinoembryonicantigen.Clin.CancerRes.83219-3225.，Gnjatic，S.，D.Atanackovic，E.Jager，M.Matsuo，A.Selvakumar，N.K.Altorki，R.G.Maki，B.Dupont，G.Ritter，Y.T.Chen，A.Knuth，andL.J.Old.2003.SurveyofnaturallyoccurringCD4+T-cellresponsesagainstNY-ESO-IincancerpatientsCorrelationwithantibodyresponses.Proc.Natl.Acad.ScIU.S.A.100(15)8862-7)(小林，H.、大宮R.、路易茲M.、沃爾特E.、沙鹿比P.、拉薩特J.J.、.赫拉易斯M、桑格魯B.、普里托J.、博拉斯-科斯塔F.和賽利斯E.。2002年。從癌胚抗原確認輔助性T淋巴細胞的抗原表位。臨床癌癥研究，第八冊，3219至3225頁。格尼亞提克，S.、艾坦拿高威克D.、杰格E.、松尾M.、塞爾萬庫馬A.、阿托其N.K.、真希R.G.、杜邦B.、利特爾G.、陳Y.T.、高德納A.和歐得L.J.。2003年。自然發生的CD4陽性T細胞在對抗癌癥患者體內的NY-ESO-1抗原反應的勘測與抗體反應交互作用。美國國家科學院研究，第一百冊，第十五號，8862至8867頁)。已知在哺乳動物的動物模型，例如小鼠，即使在缺少細胞毒性T淋巴細胞(CTL)效應因子細胞(即，CD8陽性T淋巴細胞)，CD4陽性T細胞足以抑制腫瘤的表現，是藉由干擾素γ(IFNγ)的分泌來抑制血管生成(Qin，Z.andT.Blankenstein.2000.CD4+T-cell-mediatedtumourrejectioninvolvesinhibitionofangiogenesisthatisdependentonIFNgammareceptorexpressionbynonhematopoieticcells.Immunity.12677-686)(秦Z.和布廉奇斯坦T.。2000年。CD4陽性T細胞--介導的腫瘤排斥牽涉血管生成的抑制，這是依靠由非造血細胞的干擾素γ受體的表達。免疫性。第十二冊，677至686頁)。另外，已知在CD4陽性T細胞識別由HLAII類分子呈現的腫瘤相關抗原的勝肽肽，可藉由抗體(Ab)的誘發來對抗腫瘤的發展(Kennedy，R.C.，M.H.Shearer，A.M.Watts，andR.K.Bright.2003.CD4+Tlymphocytesplayacriticalroleinantibodyproductionandtumourimmunityagainstsimianvirus40largetumourantigen.CancerRes.631040-1045)(甘乃迪R.C.、希勒M.H.、華特A.M.和布萊特R.K.。2003年。CD4陽性T淋巴細胞在抗體產生和腫瘤免疫抗猿猴病毒四十大腫瘤抗原上起一個重要的作用。臨床癌癥研究，第六十三冊，1040至1045頁)。與腫瘤相關勝肽肽結合HLAI類分子相對比，到目前為止只有很小數量的II類腫瘤相關抗原(TAA)配體被敘述(www.cancerimmunity.org，www.syfpeithi.de)。因為HLAII類分子的組成性表達通常被限制在免疫系統里的細胞(Mach，B.，V.Steimle，E.Martinez-Soria，andW.Reith.1996.RegulationofMHCclassIIgeneslessonsfromadisease.Annu.Rev.Immunol.14301-331)(馬克，B.、斯泰姆萊V.、馬丁尼茲-索洛亞E.和麗塔W.。1996年。II類MHC分子基因的調節由疾病而學習的功課。免疫評論年刊。第十四冊，301至333頁)，直接地從原發腫瘤來分離II類肽的可能性未被認為可行。因此，對標靶抗原進入抗原呈遞細胞(APCs)的II類處理路徑的許多策略被描述了，例如將抗原呈遞細胞與令人感興趣的抗原一起培養，使其能被吸取，被處理和被呈現(Chaux，P.，V.Vantomme，V.Stroobant，K.Thielemans，J.Corthals，R.Luiten，A.M.Eggermont，T.Boon，andB.P.vanderBruggen.1999.IdentificationofMAGE-3epitopespresentedbyHLA-DRmoleculestoCD4(+)Tlymphocytes.J.Exp.Med.189767-778)(喬克斯，P.、凡通米V.、斯特魯班特V.、席爾曼K.、哥圖斯J.、盧滕R.、艾格蒙特A.M.、布恩T.和凡得布魯根B.P.。1999年。由HLADR分型分子對CD4陽性T淋巴細胞所呈現的MAGE-3基因表位的識別。實驗醫學期刊。第一百八十九冊，767至778頁)，或以編碼為令人感興趣的且融入不變鏈抗原的基因或微小基因來轉染細胞，其介導抗原轉位至溶酶體的II類MHC的處理和組裝小室(MIIC)。為了使肽觸發(引出)一個細胞性的免疫反應，其必須結合MHC分子。這個過程依靠MHC分子的等位基因和肽的氨基酸序列的特殊多形性。MHCI類結合肽的一級氨基酸序列通常是八至十個殘基長和包含兩個不變殘基(″錨固″)，與MHC分子的對應結合凹槽交互作用。在沒有炎癥反應時，MHCII類分子的表達主要局限于免疫系統的細胞，特別是專門的抗原呈遞細胞(APC)，如單核細胞、單核細胞衍生細胞、巨噬細胞、樹突細胞。被腫瘤專一的T淋巴細胞所識別的抗原，即他們的抗原表位，可能為源自所有蛋白質組的分子，譬如酶、受體、轉錄因子等。此外，腫瘤相關抗原，例如，也可只在腫瘤細胞呈現，以突變基因的產物為例。另一個腫瘤相關抗原重要類型是組織專一的結構，譬如CT(″腫瘤睪丸″)抗原，其表達在各種不同的腫瘤和睪丸的健康組織。各種的腫瘤相關抗原已被識別了。此外，目前科學家正在費許多研究努力去識別額外的腫瘤相關抗原。一些腫瘤相關抗原群，且作為腫瘤特別抗原的技術品里，是組織專一的。包含但不限于，對黑色素瘤的酪氨酸酶、對前列腺癌的前列腺特別抗原(PSA)和前列腺特別膜抗原(PSMA)及染色體雜交(轉移)譬如在淋巴瘤的bcr/abl融合基因。然而許多腫瘤相關抗原的識別發生在多種腫瘤類型，和一些譬如致癌蛋白質且或腫瘤抑制基因(腫瘤抑制基因可參考如由萊亨WM、華爾勒MM、日巴B為腎臟癌癥所作的總覽。腎臟癌癥的基因依據。泌尿學期刊。2003年，十二月，第一百七十冊(第一部分之六)，2163至2172頁(LinehanWM，WaltherMM，ZbarB.Thegeneticbasisofcancerofthekidney.JUrol.2003Dec；170(6Pt1)2163-72))，其實際上引起的轉化事件，發生在幾乎所有腫瘤類型。例如，控制細胞成長和分化的正常細胞蛋白質，譬如抑癌蛋白p53(一個腫瘤抑制基因的例子)、ras、c-met、myc、pRB、VHL和HER-2/neu蛋白，由于表達的調節增加可積累突變，因此使他們成為致癌性(McCarteyetal.CancerResearch1-5；Disisetal.CibaFound.Symp.1994187198-211)(麥可卡提等。癌癥研究期刊，公元一九九八年，第十五冊，第五十八號，2601至2605五頁；戴席思等。西巴基金會研討會期刊。1994年，第一百八十七冊，198至211頁)。黏蛋白1(MUC1)是高度糖基化的I型跨膜糖蛋白，豐富地過度表達在許多人類腺癌像乳癌和卵巢癌的細胞表面。在惡性腫瘤的異常去糖基化是普遍的，且腫瘤細胞的不遮蔽表位或許不在正常細胞呈現。而且，MUC1的表達已被展示在多發性骨髓瘤和一些B細胞非霍奇金淋巴瘤(GendlerS，Taylor-PapadimitriouJ，DuhigT，RothbardJ，andBurchellJ.Ahighlyimmunogenicregionofahumanpolymorphicepithelialmucinexpressedbycarcinomasismadeupoftandemrepeats.J.Biol.Chem.26312820-12823(1988)；Siddiqui1988；GirlingA，BartkovaJ，BurchellJ，GendlerS，GillettC，andTaylor-PapadimitriouJ.AcoreproteinepitopeofthepolymorphicepithelialmucindetectedbythemonoclonalantibodySM-3isselectivelyexposedinarangeofprimarycarcinomas.Int.J.Cancer431072-1076(1989)；Brossart1999；Duperray1989；Mark1989；Delsol1988；ApostolopoulosVandMcKenzieIF.Cellularmucinstargetsforimmunotherapy.CritRev.Immunol.14293-309(1994)；FinnOJ，JeromeKR，HendersonRA，PecherG，DomenechN，Magarian-BlanderJ，andBarratt-BoyesSM.MUC-Iepithelialtumormucin-basedimmunityandcancervaccines.Immunol.Rev.14561-89(1995))(甘德勒S、泰勒-帕帕底米德里歐J、杜伊T、羅斯巴德J和白歇爾J。在惡性腫瘤表達的人類多形性上皮黏蛋白的一個高度致免疫區域，被串聯重復組成。生物化學期刊。1988年。第二百六十三冊，12820至12823頁；西迪奇公元一九八八年；格林A、巴特科夫J、白歇爾J、甘德勒S、吉利特C和泰勒-帕帕底米德里歐J。被單株抗體SM-3檢測到的多形性上皮黏蛋白的核心蛋白質表位，選擇性地被暴露在原發癌的范圍內。國際癌癥期刊，第四十三冊，1072至1076頁(1989年)；貝羅薩特1999年；杜班來1989年；馬克1989年；戴爾索1988年；阿波斯托洛普洛斯V和麥肯錫IF。細胞黏蛋白為免疫療法的標靶。關鍵的免疫學總覽，第十四冊，293至309頁(1994年)；芬OJ、杰若米KR、韓德森RA、皮切爾G、多明尼克N、馬格利恩-布藍德J和巴瑞特-博依斯SM。MUC1上皮組織腫瘤黏蛋白為基礎的免疫和癌癥疫苗。免疫學總覽，第一百四十五冊，61至89頁(1995年))。幾個最近的報告(ApostolopoulosVandMcKenzieIF.Cellularmucinstargetsforimmunotherapy.CritRev.Immunol.14293-309(1994)；FinnOJ，JeromeKR，HendersonRA，PecherG，DomenechN，Magarian-BlanderJ，andBarratt-BoyesSM.MUC-Iepithelialtumormucin-basedimmunityandcancervaccines.Immunol.Rev.14561-89(1995)；Barnd1989；Takahashi1994；Noto1997)(阿波斯托洛普洛斯V和麥肯錫IF。細胞黏蛋白為免疫療法的標靶。關鍵的免疫學總覽，第十四冊，293至309頁(1994年)；芬OJ、杰若米KR、韓德森RA、皮切爾G、多明尼克N、馬格利恩-布藍德J和巴瑞特-博依斯SM。MUC1上皮組織腫瘤黏蛋白為基礎的免疫和癌癥疫苗。免疫學總覽，第一百四十五冊，61至89頁(1995年)；巴爾德1989年；高橋1994年；能登1997年)顯示出，源自卵巢、乳房、胰臟和多發性骨髓瘤腫瘤的MHC-不受限制的細胞毒性T細胞可辨認MUC1的表位，其蛋白質核心位于串聯重復。源自MUC1的兩個HLAA2限制性的T細胞抗原表位已被識別了(貝羅薩特1999年，EP1484397)。其中一個肽源自MUC1蛋白質的串聯重復區域。第二個肽位于MUC1信號序列內。在晚期乳房癌或卵巢癌的患者身上以肽脈沖的樹突細胞做疫苗接種，使用那些肽去誘導細胞體內的細胞毒性T淋巴反應已經成功(Brossart2000)(Wierecky2005)(貝羅薩特2000年)(微爾斯基2005年)。談到腎臟細胞癌，在常規腫瘤上MUC1的表達是常見的，有報告指出其表達跟腫瘤等級和分期有關(Fujita1999；Kraus2002；Leroy2002；Bamias2003；Cao2000)(藤田1999年；克勞思2002年；里羅以2002年；巴米厄思2003年；曹2000年)。對MUC1，蛋白質的過度表達與信息核醣核酸的過度表達無關聯。脂肪分化相關蛋白(Adipophilin)是一個特別分化且包含脂肪滴細胞和脂質聚集細胞有關疾病的標志物(Heid1998)(海德1998年)。脂肪分化相關蛋白在大范圍的培養細胞株產生，包括纖維母細胞、內皮細胞和上皮細胞。然而在組織里，脂肪分化相關蛋白的表達被局限于某些細胞類型，譬如泌乳乳腺上皮細胞、腎上腺皮質細胞、雄性生殖系統的支持細胞和睪丸間質細胞及酒精性肝硬化的皮脂腺病或肝細胞脂肪變性(海德1998年)。有報告指出脂肪分化相關蛋白在結直腸癌(Saha2001)(沙哈2001年)、肝細胞癌(Kurokawa2004)(黑川2004年)和在腎臟細胞癌(Young2001)(楊2001年)會過度表達。c-Met編碼一種有著酪氨酸激酶活性的異質二聚合跨膜受體，是由與一個β亞單位體形成雙硫鍵的α鏈組成(Bottaro1991；Rubin1993)(伯特洛1991年；魯賓1993年)。兩個亞單位體被表達在表面，重型β亞單位體負責鍵結配體和肝細胞生長因子(HGF)，α亞單位體包含一個介導不同信號傳遞途徑的活化作用的細胞內區段。c-Met信號與器官再生有關，顯示在肝臟和腎臟、胚胎形成、造血作用、肌肉發育和正常活化的B細胞和單核細胞在遷移和吸附作用的調節(Zarnegar1995；Naldini1991；Montesano1998；Schmidt1995；Uehara1995；Bladt1995；Takayama1996；Mizuno1993；van，V1997；Beilmann2000)(薩尼格1995年；那迪尼1991年；蒙特沙諾1998年；史密德1995年；上原1995年；貝爾德1995年；高山1996年；美津厚1993年；凡，V1997年；貝爾曼2000年)。此外，許多研究顯示c-Met在惡性轉化和惡性腫瘤的侵襲上會過度表達。c-Met介導肝細胞生長因子/離散因子的多功能和潛在地致癌活性，包括促進細胞成長、活力、生存力、胞外基質溶解和血管新生(Bottaro1991；Rubin1993；Zarnegar1995)(伯特洛1991年；魯賓1993年；薩尼格1995年)。結合肝細胞生長因子至受體誘導c-Met的自磷酸化作用和活化下游信號事件，包括ras、磷脂酰肌醇3激酶、磷脂酶Cγ和絲裂素活化蛋白激酶相關的路逕(Naldini1991；Montesano1998；Furge2000；Ponzetto1993；Dong2001；Furge2001)(那迪尼1991年；蒙特沙諾1998年；福爾居2000年；旁類托1993年；董2001年；福爾居2001年)。c-Met基因主要地被表達在上皮細胞里，且被過度表達在幾種惡性組織和細胞株(DiRenzo1995；Ferracini1995；Tuck1996；Koochekpour1997；Li2001；Fischer1998；Maulik2002；Qian2002；Ramirez2000)(迪瑞佐1995年；法拉其尼1995年；塔克1996年；枯切科波爾1997年；李2001年；費雪1998年；茂里克2002年；錢2002年；拉米雷茲2000年)。從持續增加數量的報告顯示，非上皮細胞譬如造血、神經和骨骼細胞反應至肝細胞生長因子和血液學的惡性腫瘤像多發性骨髓瘤、霍奇金病、白血病和淋巴瘤皆表達c-Met蛋白質(Gherardi1991；Teofili2001；Borset1999；Jucker1994；Pons1998)(葛若帝1991年；提歐非力2001年；博爾塞1999年；賈克1994年；旁氏1998年)。從c-Met活化突變、c-Met的放大/過度表達和肝細胞生長因子/c-Met的自分泌環路的獲得，引起致癌基因c-Met活化而解除調節侵襲性成長表達型的的控制，而給予惡性細胞侵襲與轉變的性質。值得注意的是，在細胞生長因子過度表達的基因轉殖小鼠上基礎性活化c-Met可促進廣大的腫瘤發生(Wang2001；Takayama1997)(王2001年；高山1997年)。G蛋白質信號調節子5(RGS5)被認為是異質三聚體G蛋白質信號路逕的負向調節子，即使它在體內的功能依然是難了解的。G蛋白質信號調節子蛋白包括一個有著統一催化功能但多變組織分布的分子族群。他們激起內在活化的Gα亞單位體的鳥苷三磷酸酶(GTPase)活性，因此加速G蛋白質不活化作用。因而，G蛋白質信號調節子分子抑制信號令下游G蛋白質偶合的受體(De2000)(得2000年)。最近顯示在腫瘤新生血管化期間，G蛋白質信號調節子5在周細胞的誘導與活性血管重建相符。在胰臟小島細胞致癌作用的小鼠模型，以及在高度血管生成的星形細胞瘤，顯示G蛋白質信號調節子5在血管生成的開關期間伴隨活性血管重建時期會在周細胞過度表達。與胰島相比較，過度表達只局限于腫瘤的血管構造。但是在創傷愈合和排卵期間，G蛋白質信號調節子5的表達是上調的(Berger2005)(博格2005年)。G蛋白質信號調節子5在腎臟細胞癌表達被增加(雷2000年)。從其他研究得知，由反轉錄PCR反應顯示了G蛋白質信號調節子5在所有被檢查的腎細胞癌里有強烈的表達，且其在正常腎臟表達是非常微弱或檢測不到的(在實時性的PCR反應是6.6比1)。在腎細胞癌，腫瘤內皮細胞是G蛋白質信號調節子5的主要部位(Furuya2004)(古谷2004年)。此外，報告顯示，G蛋白質信號調節子5在肝細胞癌為一個竇狀內皮細胞的細胞標志(Chen2004)(陳2004年)。載脂蛋白L1(APOL1)是結合載脂蛋白A-I的分泌的高密度脂蛋白。載脂蛋白A-I是相對地多量的血漿蛋白質且是高密度脂蛋白的主要載脂蛋白。它參與在血漿中多數膽固醇酯的形成，并且促進細胞中膽固醇的外排。載脂蛋白L1也許在貫穿整個身體的脂質交換和運輸上起一定的作用，以及從外周細胞到肝臟的反向膽固醇運輸。血漿蛋白是一個有著明顯約40千道爾頓分子量的單鏈多肽(Duchateau1997；Duchateau2001)(杜查途1997年；杜查途2001年)。載脂蛋白L1互補去氧核醣核酸自一個活化的內皮細胞的互補去氧核醣核酸基因庫被分離，顯示是被腫瘤壞死因子-α所上調，而腫瘤壞死因子-α是一有效的促炎細胞因子。(Monajemi2002)(莫納賈米2002年)。KIAA0367基因從佐藤互補去氧核醣核酸計劃被識別，目的在于識別未知且長的編碼為推定蛋白質的人類轉錄本(Ohara1997)(大原1997年)。雖然KIAA0367基因推定的820個氨基酸長的蛋白質產物的功能是未知的，它包含一個位于C端的CRAL-TRIO脂質鍵結區段剖面，可結合小疏水分子并且是存在于幾個核苷酸交換因子和在于BCL2/腺病毒E1B19-千道爾頓分子量蛋白質交互作用的蛋白質2(BNIP-2)。BNIP-2涉及在不同細胞功能的控制包括細胞形態學、遷移、內嗜作用和細胞周期進展(Zhou2005)(周2005年)。KIAA0367位于染色體區域9q21。在許多腫瘤里，這個地區被描述為純合性缺失的一個共同的標靶(Gursky2001；Weber2001)(古爾斯基2001年；韋柏2001年)或異合子性的喪失(Louhelainen2000；Tripathi2003)(隆合雷南2000年；特里帕西2003年)。可溶解鳥苷酸環化酶(sGC)，是異質二聚體的蛋白質包括一個α和一個β亞單位體(1個血紅素群組)，催化鳥苷三磷酸轉化成第二信使環鳥苷酸和作為一氧化氮和硝基血管擴張劑藥物的主要受體(Zabel1998)(薩貝爾1998年)。在人的神經膠質瘤里，鳥苷酸環化酶a3和b3基因會過度表達。轉染反義的鳥苷酸環化酶1A3基因或鳥苷酸環化酶1B3基因減少了裸鼠里的血管再生和腫瘤生長。這也許歸結于血管內皮生長因子被環鳥苷酸所誘導的事實(Saino2004)(圣諾2004年)。鳥苷酸環化酶1A3促進小鼠乳房腫瘤細胞株的腫瘤細胞遷移(Jadeski2003)(杰德斯基2003年)。周期蛋白D1屬于高度恒定的周期蛋白族，對周期蛋白D亞族更具專一性(Xiong1991；Lew1991)(熊1991年；劉1991年)。周期蛋白作用為CDKs(周期蛋白依賴激酶)的調節子。不同的周期蛋白展示不同的表達和降解樣式，有助于每次有絲分裂事件的時態協同(Deshpande2005)(德許龐帝2005年)。周期蛋白D1與細胞周期蛋白依賴性激酶4或周期蛋白依賴性激酶6形成復合體且作為其調節亞單位體，其活性對細胞周期G1/S轉變是必須的。細胞周期調控基因1與細胞周期蛋白依賴性激酶4或周期蛋白依賴性激酶6形成一種為絲氨酸/蘇氨酸激酶全酶的復合體，給予底物對此復合體的專一性(Bates1994)(貝茲1994年)。此蛋白質顯示與腫瘤抑制蛋白質Rb交互作用(Loden2002)(羅丹2002年)且這個基因的表達是由腫瘤抑制蛋白質Rb正向地調節(Halaban1999)(哈拉班1999年)。這個基因的突變、放大作用和過度表達而改變細胞周期進展，在各種各樣的腫瘤中頻繁地被觀測到且也許引起腫瘤的發生的原因(Hedberg1999；Vasef1999；Troussard2000)(海德博格1999年；凡賽夫1999年；特勞薩爾德2000年)。基質金屬蛋白酶(MMP)族的蛋白質涉及在正常生理過程中細胞外基質的破壞，譬如胚胎發育、生殖和組織重建和在如關節炎和瘤轉移的致病過程，(Mott2004)(摩特2004年)。基質金屬蛋白酶7(MMP7)被分泌為不具活性分子量為29.6千道爾頓的原蛋白，由細胞外蛋白質酶切割而被活化。此活化酶的分子量是19.1千道爾頓且每個亞單位體可結合兩個鋅離子和兩個鈣離子(Miyazaki1990；Browner1995)(宮崎1990年；布朗尼爾1995年)。基質金屬蛋白酶7降解明膠、纖維連接蛋白和酪蛋白(Miyazaki1990；Quantin1989)(宮崎1990年；瓜爾定1989年)且與多數基質金屬蛋白酶家族成員不同，因為它缺乏一個恒定的C端蛋白質區段Gaire1994)(蓋爾1994年)。基質金屬蛋白酶7經常被發現在惡性組織里會過度表達(Lin2004；Bramhall1997；Denys2004)(林2004年；布藍霍爾1997年；丹尼斯2004年)，且顯示其可促進細胞體內腫瘤細胞的侵襲(Wang2005)(王2005年)。在多類型癌癥里，這些蛋白質可作為腫瘤專一免疫反應的標靶。B型肝炎病毒核心抗原肽HBV-001不是源自內源的人類腫瘤相關抗原，而是源自B型肝炎病毒核心抗原。首先，允許定量比較由腫瘤相關肽誘導的T細胞反應大小，因此允許在關于刺激抗腫瘤反應能力上下重要結論。第二，在患者缺乏任何T細胞反應病例下，可作為重要陽性對照。第三，并且允許在患者的免疫活性狀態予以歸納。B型肝炎病毒(HBV)感染是肝臟疾病的主要起因，影響約全世界三億五千萬人(Rehermann2005)(雷赫曼2005年)。基于簡易的水平和垂直的傳輸且也許導致肝硬化和肝細胞癌的慢性疾病的潛力，B型肝炎病毒在全世界許多國家代表對公共衛生系統的一種主要沖擊。B型肝炎病毒基因體(Previsani2002)(普雷文森特尼2002年)包括部份地雙股環狀去氧核醣核酸。在B型肝炎病毒的病毒粒子，與核心蛋白質和其他蛋白質被包裝在一起形成核衣殼，其核衣殼由含脂質和表面蛋白質族(并且叫做包膜蛋白質)的一個外包膜所包圍。與核心蛋白質和表面蛋白質連結的抗原決定簇，分別作為B型肝炎核心抗原和B型肝炎病毒表面抗原。這些與抗原相關的血清學，即在患者血液中發現的抗體反應，是在臨床上作為為B型肝炎病毒感染診斷最有用的抗原抗體系統。對先前沒被B型肝炎病毒感染的所有個人，B型肝炎核心蛋白質代表一種新奇的外來抗原。由于此抗原為知名的致免疫肽(Bertoletti1993；Livingston1997)(貝爾托拉提1993年；利文斯通1997年)，在IMA內源自B型肝炎核心抗原的十氨基酸肽被選擇作為陽性對照抗原。B型肝炎核心蛋白肽專一的細胞毒性T淋巴細胞的誘導將被作為患者免疫活性和成功接種的標記。在癌癥患者上的免疫療法針對專一地免疫系統細胞的活化，特別是所謂的細胞毒性T細胞(CTL，亦稱為″殺傷細胞″，亦稱為CD8陽性T細胞)，對抗腫瘤細胞但不是對抗健康組織。腫瘤細胞與健康細胞的相異處為腫瘤細胞能表達腫瘤相關蛋白質。HLA分子在細胞表面對外部呈現細胞的內容，如此使一個細胞毒性T細胞可區分健康和腫瘤細胞。這是由裂解細胞里的所有蛋白質至短肽，其短肽附著在HLA分子，然后在細胞表面呈現而被了解(Rammensee1993)(羅曼席1993年)。在腫瘤細胞所呈現的肽，但不呈現或非常少的呈現在身體的健康細胞，叫做腫瘤相關肽(TUMAPs)。第一次使用腫瘤相關肽的臨床試驗，由布恩和其同事在90年代中期就開始，主要作為黑色素瘤的檢測。臨床反應的最佳試驗范圍從10到30％。在任何使用以肽為基礎的疫苗單一療法的臨床試驗，嚴重的副作用或嚴重的自體免疫未曾被報告。以黑色素瘤相關肽治療的一些患者，輕微形式的白癜風已被報告。但是誘導一種細胞毒性T細胞通常是不足以消滅所有腫瘤細胞。腫瘤是非常突變的而能迅速地反應細胞毒性T細胞的攻擊，藉由改變他們的蛋白質樣式而逃避細胞毒性T細胞的識別。為了還擊腫瘤躲避機制，各種專一的肽被用于疫苗接種。這樣寬廣的同步攻擊可藉由幾種細胞毒性T細胞株來同時展開對抗腫瘤。這也許可減少腫瘤躲避免疫反應的機會。在一項臨床研究中治療晚期黑色素瘤患者上，這個假說最近被證實了。除了少數例子之外，患者有至少三個顯著的T細胞反應顯示客觀臨床反應或病情穩定(Banchereau2001)(班雪侯2001年)并且可增加存活機會(與班雪侯J.的個人通信)，而大多數少于三個T細胞反應的病人被診斷為進展性疾病。直到現在，許多標靶抗原至第二或第一類處理路逕的策略被描述了。為了被攝入和被處理，抗原呈遞細胞(APCs)可與令人感興趣的抗原一起培養(Chaux，P.，Vantomme，V.，Stroobant，V.，Thielemans，K.，Corthals，J.，Luiten，R.，Eggermont，A.M.，Boon，T.&vander，B.P.(1999)J.Exp.Med.189，767-778.DengjelJ，SchoorO，FischerR，ReichM，KrausM，MullerM，KreymborgK，AltenberendF，BrandenburgJ，KalbacherH，BrockR，DriessenC，RammenseeHG，StevanovicS.AutophagypromotesMHCclassIIpresentationofpeptidesfromintracellularsourceproteins.ProcNatlAcadSciUSA.2005May31；102(22)7922-7.)(喬克斯，P.、凡通米V.、斯特魯班特V.、席爾曼K.、哥圖斯J.、盧滕R.、艾格蒙特A.M.、布恩T.和凡得布魯根B.P.(1999年)實驗醫學期刊，第一百八十九冊，767至778頁。丹杰爾J、叔爾O、費雪R、雷奇M、克勞斯M、目勒M、克雷姆博格K、亞特貝雷德F、白蘭德博格J、卡爾巴策H、布魯克R、德瑞森C、羅曼席HG、史提芬奴域S。自體吞噬促進源自細胞內源蛋白質的MHCII類肽的呈現。美國國家科學院研究，2005年五月三十一日，第一百零二冊，第二十二號，7922至7927頁。)。其他策略使用包含溶酶體標靶序列的融合蛋白質。在抗原呈遞細胞里表達，這樣的融合蛋白質指導抗原進入II類處理隔間(Marks，M.S.，Roche，P.A.，vanDonselaar，E.，Woodruff，L.，Peters，P.J.&Bonifacino，J.S.(1995)J.CellBiol.131，351-369，Rodriguez，F.，Harkins，S.，Redwine，J.M.，dePereda，J.M.&Whitton，J.L.(2001)J.Virol.75，10421-10430)(馬克斯，M.S.、羅奇，P.A.、凡唐塞勒，E.、伍卓夫，L.、皮特斯，P.J.和博尼法奇諾，J.S.。(1995年)細胞生物學期刊。第一百三十一冊，351至369頁。羅德里格茲，F.、赫爾肯斯，S.、雷德丸，J.M.、德布雷特J.M.和惠頓，J.L.。(2001年)病毒學期刊。第七十五冊，10421至10430頁)。為了使蛋白質被細胞毒性T淋巴細胞識別為腫瘤專一抗原和可被使用在治療上面，必須履行特殊前提。抗原應該主要在腫瘤細胞里表達，而不是在正常健康組織里表達或在腫瘤細胞里表達相當少量。更令人滿意的是，個別的抗原不僅只在某一類型腫瘤表達而且是高厚度的(例如每細胞的拷貝數)。根本的是在抗原的氨基酸序列的表位的存在，因為這樣源自腫瘤相關抗原的肽(″致免疫的肽″)應該引導細胞體外或細胞體內T細胞反應。大約30％患者患有轉移性的腫瘤疾病和另外25％患者有著局部地晚期腫瘤。40％個體接受外科切除術終將產生癌癥轉移。在個體中有著轉移性的疾病者，大約75％顯示肺部轉移，36％有淋巴結且或軟組織轉移，20％有骨頭轉移，并且18％有肝臟轉移。5年的存活率依羅布森分期組而異。總而言之，腎細胞癌在幾乎80％患者中是致命的(SennHJ，DringsP，GlausA，JungiWF，PralleHB，SauerR，andSchlagPM.ChecklisteOnkologie，5thedition.GeorgThiemeVerlag，Stuttgart/NewYork(2001)，VokesEE，andGolombHM.OncologicTherapies，2ndedition.Springer-Verlag，Berlin/Heidelberg(2003))(尚恩HJ、得林斯P、葛勞斯A、鍾吉WF、普瑞爾HB、薩澳R和西勒格PM.腫瘤名冊，第5編輯，喬治信牡弗雷格，斯圖加特/紐約(2001年)。福克斯EE和哥倫布HM.。腫瘤療法，第2編輯，施普林格-弗雷格，柏林/海德堡(2003年))。腎臟細胞癌的分類是根據國際抗癌聯盟的TNM分期系統所完成(GuinanP.TNMStagingofRenalCellcarcinoma.Presentedat′DiagnosisandprognosisofRenalCellCarcinoma1997Workshop′，Rochester，Minnesota，March21-22，CommunicationoftheUICC-UnionInternationaleContreIeCancer，andAJCC-AmericanJointCommitteeonCancer，publishedbyASC-AmericanSocietyCancer(1997)，CommunicationoftheUICC)(桂南P.TNM腎臟細胞癌分期。在′腎臟細胞癌診斷和預測1997年研討會′提出，羅切斯特，明尼蘇達州，三月21至22日，國際抗癌協會通訊和美國癌癥聯合委員會，由美國防癌協會出版(1997年)，國際抗癌協會通訊)參見下列表A和B。表A腎臟細胞癌的國際抗癌聯盟的TNM分期系統T1小或等于七公分，只限于腎臟細胞N1一個區域淋巴結T2大于七公分，只限于腎臟細胞N2多于一個區域淋巴結T3侵入大靜脈，腎上腺或腎周圍的侵襲M0無遠處轉移T4侵入腎筋膜之外M1遠處轉移美國癌癥聯合委員會的分期國際抗癌聯盟的TNM分期第一期T1N0M0第二期T2N0M0第三期T1N1M0T2N1M0T3N0，N1M0第四期T4N0，N1M0任何TN2M0任何T任何NM1表B腎臟細胞癌的羅布森分期法與五年存活率羅布森分期組五年存活率第一/二期75％至86％第三期41％至64％第四期(T4)15％至18％第四期(M1)0％至3％*泌尿科疾病美國基金會腎臟細胞癌的標準治療是根本腎切除術(在所有分期)。放射治療也許可減少癌細胞的擴散，但腎臟細胞癌對放射線經常是有抵抗性的。荷爾蒙療法也許在某些情況下可減少腫瘤的成長(少于10％％)。在這種疾病，迄今化療未展現任何重大成效。長春堿、5-氟尿嘧啶(5-FU)和脫氧氟尿苷(FUDR)是被研究最多的化療藥物，但只有5-氟尿嘧啶和它的代謝產物脫氧氟尿苷顯示了10至12％活性效率(VokesEE，andGolombHM.OncologicTherapies，2ndedition.Springer-Verlag，Berlin/Heidelberg(2003))(福克斯EE和哥倫布HM.。腫瘤療法，第2編輯。施普林格-弗雷格，柏林/海德堡(2003年))。吉西他濱和5-氟尿嘧啶的組合導致17％的反應效率。免疫學治療譬如干擾素α(IFNα)或白細胞介素-2(IL-2)近年來由在美國和歐洲的管理當局評估了其對晚期腎臟細胞癌的治療。最新地高劑量白細胞介素-2治療仍然是唯一被糧食與藥物管理局所批準的免疫學方案。干擾素α單一療法初時曾被報告有25至30％的反應速度，但許多額外的試驗建議了僅僅大約10％的真正反應效率(VokesEE，andGolombHM.OncologicTherapies，2ndedition.Springer-Verlag，Berlin/Heidelberg(2003))(福克斯EE和哥倫布HM.。腫瘤療法，第2編輯。施普林格-弗雷格，柏林/海德堡(2003年))。與干擾素α比較，白細胞介素-2似乎有相似的整體反應效率，大約5％患者可達到耐久完全的緩解(Rosenberg1987)(羅森博格1987年)。最近對超過6,000名晚期腎臟細胞癌患者的綜合分析得出了結論，以細胞因子療法例如干擾素α，高劑量白細胞介素-2團注射或白細胞介素-2吸入平均只能達到12.9％臨床反應效率。同樣分析顯示了安慰劑有4.3％反應和在非免疫療法對照組的2.5％反應(CochraneDatabaseSystRev.2000；(3)CD001425.Immunotherapyforadvancedrenalcellcancer.CoppinC，PorzsoltF，AwaA，KumpfJ，ColdmanA，WiltT)(柯克倫資料庫系統總覽，2000年，(3)CD001425。對晚期腎臟細胞癌的免疫療法。科賓C、波茲所特F、阿娃A、庫姆夫J、克爾德曼A、威爾特T)。雖然新療法在許多腫瘤實體顯示了臨床效力且近年來已被證實，但在最近十年之內腎臟細胞癌的存活率并未顯著改變。當前可獲得的系統治療選擇方案，化療和免疫療法，顯示了相當貧瘠的效力結果且更要的是被顯著的系統毒性所限制。結果，對腎臟細胞癌新的治療選擇方案有著實質地不能被滿足的醫療需求。在抗腫瘤免疫方面，輔助性T細胞在統協細胞毒性T細胞的效應因子功能上起一個重要作用。觸發TH1型輔助性T細胞反應的輔助性T細胞表位，支援CD8陽性殺傷T細胞的效應因子功能，包括細胞毒素的作用引導抗腫瘤細胞來展現腫瘤相關肽或MHC在其細胞表面。藉此腫瘤相關輔助性T細胞肽表位，單獨或與其他腫瘤相關肽的組合，可擔當疫苗組合物的活性制藥成分而刺激抗腫瘤免疫反應。在腫瘤疫苗發展的主要工作是新奇的腫瘤相關抗原和源于其中的致免疫的輔助性T細胞表位的鑒定和描述特性，其可被CD8陽性T細胞或CD4陽性T細胞所識別，特別是TH1的CD4陽性T細胞。因此本發明的目標為，對這樣有能力結合人類MHC(MHC)I類(HLAI類)或II類分子(HLAII類)的肽提供新奇的氨基酸序列。本發明的進一步目標為，提供至少一部分是根據前述的新奇肽的有效抗癌疫苗。根據本發明，第一目標由提供腫瘤相關肽而解決，被挑選的肽包括至少一個根據任何附上序列目錄的SEQIDNo.1(SEQIDNo.1)或SEQIDNo.2(SEQIDNo.2)的序列，由其中肽有能力結合MHCII類(HLAII類)的分子，而其他肽有能力結合MHC)I類(HLAI類)的分子，提供其肽不是完整的人類腫瘤相關多肽。在本發明，發明者顯示可能直接地從哺乳動物腫瘤，人類腫瘤為優先地，最好像是腎臟細胞癌，來分離和描述肽結合HLAI類或II類分子的特性。本發明提供根源于抗原相關腫瘤發生的肽，且有能力充分地結合HLAII類分子而觸發人類白細胞的免疫反應，特別是淋巴細胞，尤其是T淋巴細胞，尤其是CD4陽性T淋巴細胞，尤其是介導TH1類型免疫反應的CD4陽性T淋巴細胞。本發明并且提供根源于抗原相關腫瘤發生的肽，且有能力充分地結合HLAI類分子而觸發人類白細胞的免疫反應，特別是淋巴細胞，尤其是T淋巴細胞，尤其是CD8陽性細胞毒素T淋巴細胞。根源于腫瘤相關抗原的肽，特別是源于有功能的腫瘤相關抗原，如蛋白質水解、血管新生、細胞生長、細胞周期調節、細胞分裂、轉錄的調節、翻譯的調節、組織入侵包括如源自基質金屬蛋白酶7(MMP7；SEQIDNo.1)的腫瘤相關肽和脂蛋白原L1(APOL1；SEQIDNo.4)。在本發明，發明者提供確鑿的證據，即腫瘤相關肽充分混雜地結合HLAII二類分子，特別是那些由人類基因體的人類白細胞組織抗原DR分型基因座編碼的HLAII類等位基因，能引出由人類CD4陽性T細胞介導的免疫反應。CD4陽性T細胞自人類外周血液被分離出，顯示申請專利范圍的肽是適合的在觸發人類免疫系統的T細胞反應來對抗腫瘤細胞肽組選擇的肽。依照以下源自基質金屬蛋白酶7(SEQIDNo.1)肽的例子，發現這混雜的人類白細胞組織抗原DR分型結合的腫瘤相關肽可被CD4陽性T細胞所識別。同樣地，腫瘤相關肽充分地結合HLAI類分子，能引出由人類CD8陽性細胞毒性T淋巴細胞介導的免疫反應，并且顯示申請專利范圍的肽是適合的在觸發人類免疫系統的反應來對抗腫瘤細胞肽組選擇的肽。因為肽可被化學地合成和可被使用作為制藥準備的活性制藥成分，所以本發明所提供的肽可被用在免疫療法，優先地用在癌癥免疫療法。為了識別源于腫瘤相關抗原的HLAI類或II類分子配體而作為以肽為基礎的免疫療法的發展，發明者試圖直接地從堅硬腫瘤來分離肽，特別是從腎臟細胞癌(RCC)來分離(參見下面例子)。重心放在腎臟細胞癌的原因是為了顯示概念的技術證據如下每年全世界大約150,000個人新近被診斷腎臟細胞癌，此疾病伴隨著高死亡率，導致每年大約78,000人死亡(Pavlovich，CP.andL.S.Schmidt.2004.Searchingforthehereditarycausesofrenal-cellcarcinoma.Nat.Rev.Cancer4381-393)(普拉維奇C.P.和L.S.舒密。2004年。尋找腎臟細胞癌的遺傳性起因。國際癌癥總覽，第四冊，381至393頁)。如果轉移被診斷出，一年的存活率減少到大約60％(Jemal，A.，R.C.Tiwari，T.Murray，A.Ghafoor，A.Samuels，E.Ward，EJ.Feuer，andMJ.Thun.2004.Cancerstatistics，2004.CACancerJ.Clin.548-29)(杰摩，A.、泰瓦里R.C.、墨瑞T.、加福爾A.、薩姆爾A.、華爾德E.、福威爾E.J.和圖恩M.J.。2004年。臨床醫生癌癥期刊。第五十四冊，8至29頁)，由此特徵強調高度未能滿足的醫療需求。由于這樣的事實，腎臟細胞癌似乎是一個產生免疫的腫瘤(OliverRTD，MehtaA，BarnettMJ.Aphase2studyofsurveillanceinpatientswithmetastaticrenalcellcarcinomaandassessmentofresponseofsuchpatientstotherapyonprogression.MoIBiother.1988；114-20.GleaveM，ElhilaliM，FrodetY，etal.Interferongamma-Ibcomparedwithplaceboinmetastaticrenalcellcarcinoma.NEnglJMed.1998；3381265)(奧麗維爾RTD、梅塔A、巴爾尼特MJ。對腎臟細胞癌轉移病人第二階段研究的監測和評估這種患者對療法的進展。分子生物療法。1988年，第一冊，14至20頁。格利芙M、愛爾喜拉利M、福羅德特Y等。在轉移的腎臟細胞癌里干擾素γ1b和安慰劑相比。新英格蘭醫學期刊。1998年，第三百三十八冊，1265頁)，由腫瘤反應和腫瘤浸潤的細胞毒性T淋巴細胞的存在所顯示(Finke，J.H.，P.Rayman，J.Alexander，M.Edinger，R.R.Tubbs，R.Connelly，E.Pontes，andR.Bukowski.1990.CharacterizationofthecytolyticactivityofCD4+andCD8+tumor-infiltratinglymphocytesinhumanrenalcellcarcinoma.CancerRes.502363-2370)(芬克，J.H.、雷曼P.、亞利山卓J.、艾丁戈爾M.、塔布斯R.R.、康納利R.、旁特氏E.和布考斯基R.。1990年。在人類腎臟細胞癌CD4陽性和CD8陽性腫瘤浸潤的淋巴細胞的溶細胞活性的特性描述。癌癥研究。第五十冊，2363至2370頁)，臨床試驗已起始開發以肽為基礎的抗腫瘤免疫接種(WiereckyJ，MuellerM，BrossartP.Dendriticcell-basedcancerimmunotherapytargetingMUC-I.CancerImmunolImmunother.2005Apr28)(維爾斯基J、謬勒M、普羅薩特P。樹突細胞為基礎的標靶黏蛋白1的癌癥免疫療法。癌癥免疫學的免疫療法。2005年4月28日)。但是，由于缺乏源自腫瘤相關抗原的輔助性T細胞表位，分子定義的疫苗通常包括只作為I類配體功能的肽。本發明的第二個目標由提供制藥制備來解決問題，最好以疫苗的形式，其對抗癌細胞是有效的，特別是細胞實體腫瘤，包括有效量的根據發明的肽，或包括編碼此種肽的核酸。疫苗進一步能包含額外的的肽且或賦形劑而使其更加有效，下面將進一步解釋。肽或編碼肽的核酸并且可構成腫瘤或癌癥疫苗。它也許直接地對患者施用，進入受侵襲的器官或系統，或以間接體內方式應用在從患者來的細胞或人類細胞株，隨后施用于患者，或以細胞體外方式取自患者免疫細胞所選擇亞群，然后再施用于患者。在發明的第一方面所提供的肽，包括根據SEQIDNo.1(SQDDIKGIQKLYGKRS)或SEQIDNo.2(VMAGDIYSV)的氨基酸序列或由此的變體，不是完整的氨基酸序列起源的人類多肽(即其中之一的全長序列照表列在基因座連接識別號(登錄號，參見下面的附表1))。根據以下所述，形成本發明基礎的肽藉由MHCI類或II類呈載細胞(腎臟細胞癌)的呈現，都已被確認了。因此，這些特殊肽以及其他肽包含序列(即衍生的肽)全部引起專一的T細胞反應，雖然這樣將被誘發的反應程度在個別肽之間也許有些差異。例如由于前述肽的突變也能導致不同的反應(參見下面)。在本領域所屬技術人員能夠明了本發明的方法可應用在確定被個別肽所誘發的反應程度，特別是關于在此的例子和相關的文獻。盡可能地，根據本發明的肽根本上包含的氨基酸序列是依照SEQIDNo.1或SEQIDNo.2或由此的變體。“根本上包括”意味根據本發明的肽，除了根據任何序列識別一號至序列識別十一號或由此的變體的序列之外，包含額外位于氨基酸延伸的N-且或C-端，其不一定構成肽的部分，作為肽的核心序列的功能包括結合基序和作為致免疫的輔助性T細胞表位。然而根據本發明，為了提供肽高效率地引入細胞，這些延伸可能很重要。在本發明的一個實施方案中，本發明的肽包括人類白細胞組織抗原DR分型抗原相關不變鏈(p33，在以下的“Ii”)的80個N端氨基酸，源于美國國立生物技術信息中心，數據庫登錄號X00497(Strubin，M.，Mach，B.andLong，E.O.ThecompletesequenceofthemRNAfortheHLA-DR-associatedinvariantchainrevealsapolypeptidewithanunusualtransmembranepolarityEMBOJ.3(4)，869-872(1984))(史楚賓，M.、馬克，B.和龍，E.O。信使核醣核酸的完整序列對人類白細胞組織抗原DR分型抗原相關不變鏈顯示多肽的異常介膜極性。歐洲分子生物學期刊。第三冊，第四號，869至872頁(1984年))。由指定氨基酸序列的“變體”，我們意指側鏈，例如修改一或兩個氨基酸殘基(例如用其他自然發生的氨基酸殘基側鏈或一些其他側鏈來替換他們)這樣的肽仍能結合HLA分子和包含的指定氨基酸序列的肽實質的作用方式一樣。例如，肽也許被修改以便如不能改善至少維持與合適的MHC分子交互作用與結合的能力，譬如HLA-DRB1分型在HLAII類分子情況下，或HLA-A2分型在HLAI類分子情況下，以致于如不能改善至少維持產生活化的細胞毒性T淋巴細胞，其能識別和殺傷有著異常表達的包含在發明方面被定義的氨基酸序列的多肽，或者有能力激發對CD8陽性T細胞提供幫助的輔助性T細胞或藉由分泌細胞因子直接地攻擊目標細胞。如以下所描述的能從資料庫里取得，HLA-DR分型結合的肽的某些位置是典型的錨固殘基，其形成核心序列撮合HLA結合槽的結合基。這些和其他涉及在結合HLADR分型殘基的修飾，也許在沒有改變細胞毒性T淋巴細胞的辨認下可提高結合性。不與T細胞受體基本地交互作用的那些氨基酸殘基可藉由置換其他的氨基酸而修飾，其摻入并不實質地影響T細胞反應性也不消除與相關的MHC的結合。因而，除所給的附文之外，發明的肽也許是任何肽(由此項我們包括寡肽或多肽)其包括因此所給與的氨基酸序列或部份或變體。此外為人所知對MHCII類呈現的肽，這些肽是由“核心序列”組成，其有某種HLA專一的氨基酸基序和，可選擇地，并不干擾核心序列作用的N-且或C端延伸(即被視為與肽和T細胞的交互作用無關)。N-且或C端可能是各自地延伸到1到10個氨基酸長。因而，本發明較好的肽展示整體長度在9至100個，更好的在9至30個，和最好的在9至16個氨基酸。根據下面描述這些肽可能被使用直接地為了裝載MHCII類分子或此序列可能被克隆入載體。因為這些肽形成在細胞內更大肽處理的最終產品，更長的肽也可被使用。發明的肽可以是任何大小，但他們基本上是少于100,000道爾頓分子量，優選少于50,000道爾頓分子量，優選少于10,000道爾頓分子量和典型地約5,000道爾頓分子量。以氨基酸殘基的數量而言，發明的肽可以少于1000個殘基，少于500個殘基較好，少于100個殘基更好。在本發明其他方面，對MHCII類分子與以上所說明的情況相似，發明的肽也許被使用在觸發MHCI類專一的反應，因為此肽可同時顯示HLAI類分子的核心或部份序列。本發明較好的MHCI類專一的肽顯示整體長度在9至16個，更好地在9至12個氨基酸。應該了解那些肽可被使用(例如在疫苗里)為更長的肽，與MHCII類肽相似。識別MHCI類專一的“核心序列”，此序列有某種針對HLAI類分子的HLA專一的氨基酸基序，的方法為有技術人員所熟悉的，且可被預測的，例如由電腦程式PAProC(//www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/)和SYFPEITHI(//www.syfpeithi.de)(參見下面)。發明的肽在免疫治療方法上為使T細胞能識別有著異常表達出形成本發明肽為基礎的多肽之細胞是特別有用的。因為這些專一的肽包括指定的氨基酸序列結合HLAI類或HLAII類分子，最優選結合HLAI類或HLAII類分子的發明的肽，且當如此時，結合HLA肽復合體是呈現在一個適合的抗原呈遞細胞的表面，其能引起可識別異常表達出包含指定氨基酸序列多肽的T細胞的激發。假如大于約12個氨基酸殘基的肽直接地被使用在結合MHC分子，優選核心HLA鍵結側區的氨基酸殘基不能實質地影響肽專一地結合MHC分子結合槽或對T細胞提呈肽的能力。但是，如以上述，最好使用較大的肽，特別是當由多核苷酸所編碼的，因為這些較大的肽可被適合的抗原呈遞細胞分段。例子如MHC配體肽、基序、變體以及某些例子為N-且或C端延伸，例如從資料庫SYFPEITHI所獲得(RammenseeH，BachmannJ，EmmerichNP，BachorOA，StevanovicS.SYFPEITHIdatabaseforMHCligandsandpeptidemotifs.Immunogenetics.1999Nov；50(3-4)213-9.Review.)(羅曼席H，巴哈曼J，艾莫里契NP，巴策爾OA，史提芬奴維奇S。SYFPEITHI資料庫為MHC配體和肽基序。免疫遺傳學。1999年11月；第五十冊，第三至四號，213-219頁。總覽。)在//syfpeithi.bmi-heidelberg.com/和依照被援引在其中的參考文獻。作為非局限的例子，在資料庫里為HLA-DR分型的某些肽是KHKVYACEVTHQGLSS源自免疫球蛋白輕鏈188至203(Kovatsetal.EurJImmunol.1997Apr；27(4)1014-21)(科瓦茨等。歐洲免疫學期刊。1997年四月，第二十七冊，第四號，1014至1021頁)；KVQWKVDNALQSGNS源自免疫球蛋白輕鏈145至159(Kovatsetal.EurJImmunol.1997Apr；27(4)1014-21)(科瓦茨等。歐洲免疫學期刊。1997年四月，第二十七冊，第四號，1014至1021頁)；LPRLIAFTSEHSHF源自谷氨酸脫羧酶65270至283(Endletal.JClinInvest.1997May15；99(10)2405-15)(恩朵等。臨床探究期刊。1997年5月15日，第九十九冊，第十號，2405至2415頁)或FFRMVISNPAATHQDIDFLI源自谷氨酸脫羧酶65556至575(Endletal.JClinInvest.1997May15；99(10)2405-15)(恩朵等。臨床探究期刊。1997年5月15日，第九十九冊，第十號，2405至2415頁)。另外，肽也可源自抗原突變的序列，譬如ATGFKQSSKALQRPVAS源自bcr-abl210千道爾頓分子量融合蛋白質(tenBoschetal.Blood.1996Nov1；88(9)3522-7)(坦巴哈等。血液。1996年11月1日，第八十八冊，第九號，3522至3527頁)，GYKVLVLNPSVAAT源自第一型C型肝炎病毒NS328至41蛋白Diepolderetal.JVirol.1997Aug；71(8)6011-9)(代波爾德等。病毒學期刊。1997年八月，第七十一冊，第八號，6011至6019頁)，或FRKQNPDIVIQYMDDLYVG源自第一型人類免疫缺陷病毒的D(HXB2)反轉錄酶326至345(vanderBurgetal.JImmunol.1999Jan1；162(1)152-60)(凡德博格等。免疫學期刊。1999年1月1日，第一百六十二冊，第一號，152至160頁)。所有“錨固”氨基酸(參見Friedeetal.，BiochimBiophysActa.1996Jun7；1316(2)85-101；Setteetal.JImmunol.1993Sep15；151(6)3163-70.；Hammeretal.Cell.1993M16；74(1)197-203.，andHammeretal.JExpMed.1995May1；181(5)1847-55.AsexamplesforHLA-DR4)(福萊迪等，生物化學與生物物理學報。1996年6月7日，第一千三百一十六冊，第二號，85至101頁；薩特等。免疫學期刊。9月1993年15日，第一百五十一冊，第六號，3163至3170.頁；漢姆爾等。細胞。1993年7月16日，第七十四冊，第一號，197至203頁，和漢姆爾等。實驗醫學期限刊。19955月1日，第一百八十一冊，第五號，1847至1855頁。以HLA-DR4分型為例)以粗體字形表示，推論的核心序列以下面劃線表示。所有上面被描述的肽由術語“變體”所包含的指定的氨基酸序列。從“肽”的想法，發明者包括不僅將分子里氨基酸殘基由肽鍵(-CO-NH-)聯結而且在分子里肽鍵是反向的。這樣的反逆向的模擬肽學能以巧妙的方法運用，譬如那些被描述在Meziereetal(1997)J.Immunol.159，3230-3237(梅利爾等(1997年)免疫學期刊。第一百五十九冊，3230至3237頁)，由此合并參考文獻。這種研討方法涉及制做偽肽，包含的變動涉及骨架，和不是側鏈的方位。梅利爾等(1997年)顯示，這些偽肽是有用的至少在對MHCII類和輔助性T細胞反應。反逆向的肽，包含以NH-CO鍵取代CO-NH肽鍵，對蛋白水解作用是有非常有抵抗性。基本上，如果在抗原呈遞細胞表達，發明的肽可被處理而導致片段產生，其能結合適合的MHC分子且可由一個適當的細胞呈現而引出一個適當的T細胞反應。由肽產生的片段也可是發明的肽是令人受到重視的。方便地，發明的肽含有一部份，包括指定的氨基酸序列或部份或因此部份的變體和一個給予令人滿意特質的較遠部份。例如，此較遠部份可包含一個較遠的T細胞表位(不管是否源自與第一個T細胞表位包含的部份相同之多肽)或者可包括載體蛋白質或肽。因此，在發明的肽的實施方案中，是被截短的人類蛋白質或蛋白質片段和其他提供在人類部份包含一個或更多有創新的氨基酸序列的多肽部份之融合蛋白質。于特別優選的實施方案中，發明的肽包括發明的氨基酸序列和至少一個較遠的T細胞表位，其中較遠的T細胞表位能促進T細胞反應的產生，由在異常表達腫瘤相關抗原的腫瘤類型所指引。因此，發明的肽包括所謂的“細繩上懸的珠子”多肽，并且可被使用作為疫苗。這樣的肽可被化學連接器分隔開，其也許包含氨基酸(譬如G-延展)，但其可額外或交替地-包含化學連接組(即除了提供特殊間距之外無作用)。由“異常表達”我們包括其含意為，與正常表達水平相比較多肽是過度表達或源自腫瘤的組織基因是不表達的但是在腫瘤里卻是表達的。由″過度表達″我們意為，多肽呈現在水平上至少是在正常組織的1.2倍，最優選至少2倍，優選5倍或10倍的呈現。肽(至少那些包含在氨基酸殘基之間的肽聯結)可由固相肽合成的9-芴甲氧羰基-聚醯胺方式所合成，由盧等揭露在(1981年)有機化學期刊，第四十六冊，433至3436頁(Luetal(1981)J.Org.Chem.46，3433-3436，在其中作為參考文獻。9-芴甲氧羰基(Fmoc)基給予N-氨基組暫時的保護。此高度堿性不安定保護基的反覆裂解由使用在N，N二甲基甲醯胺溶劑里20％哌啶來達成。側鏈功能可以丁基醚(在絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸情況下)，丁基酯(在谷氨酸和天門冬氨酸情況下)，丁氧甲酰基衍生物(在賴氨酸和組氨酸情況下)，三苯甲基衍生物(在半胱氨酸情況下)和4-甲氧基2，3，6三甲苯磺酰基衍生物(在精氨酸情況下)的形式所保護。而谷氨酰氨酸或天門冬酰氨酸是C端殘基，使用4，4′-二甲氧基二苯甲基作為側鏈氨基功能的保護。固相支持為多二甲基-丙烯酰胺聚合物，其由三個單體的二甲基丙烯酰胺(骨架單體)，雙丙稀酰乙烯二胺(交聯劑)和丙烯酰肌胺酸甲酯(機能試劑)所構成。對酸不安定的4-羥基甲基苯氧基乙酸的衍生物作為肽對樹脂可劈開的連接劑。所有氨基酸衍生物以其形成的對稱酐衍生物加入反應，除天門冬酰胺氨酸和谷氨酰胺氨酸之外，其加入是使用被反轉的N，N-二環己基-碳二醯胺/1羥基苯并三唑介導的偶合程序。所有偶聯和去保護反應以茚三酮、三硝基苯磺酸或靛紅試驗程序來監測。在合成完成時，肽從樹脂支撐被劈開且伴隨去除側鏈保護劑藉由95％三氟乙酸含50％凈化劑混合物品來處理。凈化劑常用的是乙二硫醇、酚、苯甲醚和水，確切的選擇則根據構成氨基酸的被合成肽。三氟乙酸在真空中被蒸發去除，隨后以乙醚研粉成粗制肽。所有凈化劑以簡單的提取程序在水相冷凍干燥中被去除成無凈化劑的粗制肽。肽合成試劑一般可從英國諾丁漢NG72QJ的肯爾生物化學-諾芙生物化學(英國)有限公司得到。純化技術可被任何一個，或任何組合影響，如尺寸排除色譜法、離子交換色譜法和(通常)反相階段高效液相色譜分析。對肽的分析可使用薄層色譜法、反相階段高和效液相色譜法、在酸水解以后的氨基酸分析和由快速原子撞擊(FAB)質譜儀分析，基體輔助激光解吸和電噴灑離子化-Q-飛行時間之質譜儀分析所執行。發明的進一步方面提供編碼為發明的肽的核酸(即多核苷酸)。根據本發明的核酸可以是去氧核糖核酸、互補去氧核糖核酸、肽核酸、循環核酸、核糖核酸或由此的組合，只要它編碼為肽包或不包含內含子皆可。當然，只有包含由自然發生的肽鍵連接之自然發生的氨基酸殘基的肽是由多核苷酸編碼。發明的更進一步方面提供表達載體能表達根據發明的多肽。各種的方法已被開發來施行地連接多核苷酸，特別是去氧核糖核酸，通過載體例如經由互補的黏接端。例如，互補均質聚物短道可以加入來去氧核糖核酸片段使其可被插入載體去氧核糖核酸。然后載體和去氧核糖核酸片段在互補均質的尾巴之間以氫鍵接合而形成重組去氧核糖核酸分子。合成的連接端包含一個或更多限制位點，提供銜接去氧核糖核酸片段到載體供選擇的方法。去氧核糖核酸片段，如早先所描述的由限制性內切酶切生成，以噬菌體T4去氧核糖核酸聚合酶或大腸桿菌去氧核糖核酸聚合酶I處理，酶以其3′-5′-核酸外切活性來去除3′單股端凸處，和以其聚合活性填裝3′端凹處。這些活性的組合因此生成平端的去氧核糖核酸片段。此平端片段然后與大量克分子剩余的連接端分子和能催化平端去氧核糖核酸分子連接的酶一起培養，如噬菌體T4去氧核糖核酸連接酶。因此，在其末端的反應產品是去氧核糖核酸片段攜帶聚合的連接端序列。這些去氧核糖核酸片段然后以適合的限制酶切開和連接到表達載體，此表達載體已被酶切開而產生能與此去氧核糖核酸片段相容的端點。合成連接端包含的各種限制性內切酶位點從一定數量來源的商業上可取得包括位于美國康涅狄格州紐黑文市之國際生技公司。一個合意的方式修飾編碼為發明的多肽之去氧核糖核酸，是使用由佐伯等發明的PCR反應(1988年)科學，第二百三十九冊，487至491頁(Saikietal(1988)Science239，487-491)。這個方法可被使用為引介去氧核糖核酸至適合的載體，例如由設計適合的限制性位點，或用其他知名技術的有用方式修改去氧核糖核酸。此方法以酶作用放大去氧核糖核酸是被兩個專一的引物接在側面，引物本身被并入放大的去氧核糖核酸。前述專一的引物可包含限制性內切酶辯識位點，運用已知技術的方法可被克隆至表達載體。去氧核糖核酸(或在反轉錄載體情況下，核糖核酸)然后被在一個適合的宿主表達使產生包含發明的復合物多肽。因此，編碼為構成發明的復合物多肽的去氧核糖核酸針對已知的技術可被使用，依此中包含的教學觀點適當地修改而建構表達載體，然后使用來轉化一個適合的宿主細胞作為表達和產生發明的多肽。包括的那些技術被批露在美國專利第4,440,859號在1984年4月3日對魯特爾等發布，第4,530,901號在1985年7月23日對威斯曼發布，第4,582,800號在1986年4月15日對克勞爾發布，第4,677,063號在1987年6月30日對馬克等發布，第4,678,751號在1987年7月7日對高德爾發布，第4,704,362號在1987年11月3日對Itakura等發布，第4,710,463號在1987年12月1日對莫瑞發布，第4,757,006號在1988年7月12日對圖爾，Jr.發布，第4,766,075號在1988年8月23日對高德爾等發布并且第4,810,648號在1989年3月7日對斯德克發布，通過參考在此合并。編碼為構成發明的復合物多肽的去氧核糖核酸(或在反轉錄載體情況下，核糖核酸)可被連接各種各樣的其他去氧核糖核酸序列以引入適當的宿主。此去氧核糖核酸同伴將取決于宿主的本質，去氧核糖核酸引入宿主的方式和是否如預期的游離基因維護或整合。通常，去氧核糖核酸被插入表達載體譬如質粒，在適當的取向和正確解讀框架所表達。如果需要，去氧核糖核酸可與被預期的宿主所識別之適當的轉錄和翻譯調節控制核苷酸序列連接，雖然這樣的調控在表達載體上普遍是可獲得的。然后載體經由標準技術被引入宿主。通常，不是所有宿主可被載體轉化。所以，在選擇被轉化的宿主細胞將是必要的。一個選擇技術涉及合并去氧核糖核酸序列入表達載體，以所有必要的控制元素，其在被轉化的細胞編碼一個可篩選的特徵如抗生素抗藥性。交互選擇地，此可篩選的特徵的基因可能是在另一個載體上，被共同轉化至被預期的宿主細胞。由發明的重組去氧核糖核酸轉化了宿主細胞，然后以此中揭露的教導觀點技藝上所知的技術在充足的時間和在適當的情況下培養而允許多肽的表達，其然后可被回收。許多已知的表達系統，包括細菌(例如大腸桿菌和枯草桿菌)、酵母菌(例如釀酒酵母)、纖維狀真菌(例如麴霉菌)、植物細胞、動物細胞和昆蟲細胞。更好地，此系統可以是腎臟細胞癌或阿威爾斯細胞。啟動子是由去氧核糖核酸序列形成的表達控制元素，允許核糖核酸聚合酶和轉錄本結合的發生。啟動子序列與示范性細菌宿主相容是典型地由質粒載體提供，質粒載體包含方便的限制性位點以便插入本發明的去氧核糖核酸片段。典型的原核載體質粒是pUC18、pUC19、pBR322和pBR329，可從寶瑞德實驗室得到(美國加州里士滿市)，pTrc99A和pKK223-3可從位于美國紐澤西州皮斯卡塔威市的法瑪西婭得到。典型的哺乳動物細胞載體質粒是pSVL可從位于美國紐澤西州皮斯卡塔威市的法瑪西婭得到。此載體使用猿猴病毒40晚期啟動子驅使被克隆的基因表達，最高水平的在T抗原產生細胞里表達被發現，如COS-1細胞。可誘導的哺乳動物表達載體的例子是pMSG，也可從法瑪西婭得到。此載體使用小鼠乳房腫瘤病毒長端重復的糖皮質激素可誘導的啟動子驅使被克隆的基因表達。有用的酵母菌質粒載體是pRS403至406和pRS413至416，通常是可從位于美國加州拉荷亞市郵政編碼92037的史催特基因克隆系統得到。質粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合質粒(Yips)并且并入酵母篩選標志HIS3、TRP1、LEU2和URA3。質粒pRS413至416是酵母著絲點質粒(Ycps)。其他公知技術的載體和表達系統是使用在各種各樣的宿主細胞。本發明也與宿主細胞以本發明的多核苷酸載體建構的轉化有關。宿主細胞可以是原核的或真核的。在某些情況下細菌細胞是較好的原核宿主細胞而典型地是大腸桿菌株，例如大腸桿菌株DH5可從位于美國明尼蘇達州畢士大市的研究實驗室公司得到，和大腸桿菌株RR1可從位于美國明尼蘇達州羅克維爾市的美國典型物種保藏中心(ATCC)得到(號碼ATCC31343)。較好的真核宿主細胞包括酵母、昆蟲和哺乳動物細胞、優選脊椎動物細胞如那些從小鼠、大鼠、猴子或人類的成纖維細胞和腎臟細胞系。酵母宿主細胞包括YPH499、YPH500和YPH501，通常可從位于美國加州拉荷亞市郵政編碼92037的史催特基因克隆系統得到。較好的哺乳動物的宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，可從美國典型物種保藏中心的CCL61細胞得到；美國國立衛生研究院瑞士小鼠胚胎細胞NIH/3T3，可從美國典型物種保藏中心的CRL1658細胞得到；猴子腎臟衍生的COS-1細胞可從美國典型物種保藏中心之人類胚胎腎臟細胞的CRL1650和293細胞得到。較好的昆蟲細胞是Sf9細胞，能以桿狀病毒表達載體轉染。以本發明的去氧核糖核酸建構轉化適當的細胞宿主是以知名的方法完成，其典型地取決于所使用的載體類型。關于原核宿主細胞的轉化，例如，參見Cohenetal(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA69，2110andSambrooketal(1989)MolecularCloning，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY.(科恩等(1972年)美國國家科學院研究。第六十九冊，2110頁和塞姆布魯克等(1989年)分子克隆實驗室手冊，紐約州冷泉港實驗室)。酵母細胞的轉化被描述在Shermanetal(1986)MethodsInYeastGenetics，ALaboratoryManual，ColdSpringHarbor，NY(謝爾曼等(1986年)酵母遺傳學方法的實驗室手冊，紐約州冷泉港實驗室)。貝格斯方法也是有用的(1978年)自然第二百七十五冊，104至109頁(Beggs(1978)Nature275，104-109)。關于脊椎動物的細胞，在轉染這樣細胞的有用試劑，例如磷酸鈣和二乙氨乙基-葡聚糖或微脂粒配方，可從史催特基因克隆系統或位于美國麻里蘭州蓋士堡市區域號碼20877的生命科技公司得到。電穿孔也是有用的于轉化且或轉染細胞，且是知名技術在轉化酵母細胞、細菌細胞、昆蟲細胞和脊椎動物的細胞。成功地被轉化的細胞，即包含本發明的去氧核糖核酸建構的細胞，可靠知名的技術確認。例如，由本發明的表達建構之引介而造成的細胞可以生長而產生發明的多肽。細胞可被采收和被分解且審查其去氧核糖核酸內容作為去氧核糖核酸的呈現，運用的方法如由Southern(1975)J.MoI.Biol.98，503orBerentetal(1985)Biotech.3，208(南方(1975年)分子生物學期刊，第九十八冊，503頁所描述或貝蘭特等(1985年)生物技術，第三冊，208頁)。交互選擇地，在上層清液蛋白質的出現可能被如下所述的抗體檢測到。除直接地檢測重組去氧核糖核酸存在之外，當重組去氧核糖核酸能指導蛋白質的表達，成功的轉化即可由公知的免疫學方法證實。例如，以表達載體成功地轉化細胞，產生的蛋白質顯示適當的抗原性。懷疑被轉化的細胞樣品被采收且使用適當的抗體檢測蛋白質。因此，除被轉化的宿主細胞本身，本發明也立意那些細胞的培養，優選單株的(無性繁殖系地均質的)培養，或在一個營養培養基里源自單株培養的培養。令人感謝的是，在準備發明的肽上發明的某些宿主細胞是有用的，例如細菌、酵母和昆蟲細胞。但是，在某些治療方法上其他宿主細胞也是有用的。例如抗原呈遞細胞，如樹突細胞，使用在表達發明的肽上也是有用地，這樣他們也可被裝載入適當的MHC分子。較好的宿主細胞是重組腎臟細胞癌或阿威爾斯細胞。較好的方法產生依照本發明的腫瘤相關肽，方法包括培養依照本發明的宿主細胞和由宿主細胞或其培養基分離肽，根據標準方法。發明的進一步方面提供產生肽的方法作為口腔、直腸、鼻或舌的攝入，靜脈(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮內(i.d.)注射、腹膜內(i.p.)注射、肌肉內(i.m.)注射。肽注射的較好方式是皮下、皮內、腹膜內、肌肉內和靜脈注射。去氧核糖核酸注射較好的方式是皮內、肌肉內、皮下、腹膜內和靜脈注射。可給予藥量在0.1至500毫克的肽或去氧核糖核酸，且如下所列述。發明的進一步方面與對根據發明的腫瘤相關肽的用途有關、根據發明的核酸或根據發明在醫學的表達載體。本發明的目標，由此進一步方面，由制藥組合物解決，其包含至少一種由根據發明的SEQIDNo.1或SEQIDNo.2的腫瘤相關肽、根據發明的核酸或根據發明的表達載體，和制藥可接受的載體。此組合物被使用為胃腸外給藥，如皮下、皮內、腹膜內、靜脈內、肌肉內或口服。為此，肽被溶解或懸浮在一個制藥可接受地，較好地含水載體。另外，此組合物可包含賦形劑，如緩沖液、結合劑、爆破劑、稀釋劑、香味、潤滑劑等。此肽并可與免疫刺激物質一起服用，如細胞因子。一個廣泛目錄的賦形劑可被使用在這樣的組合物，例如，可以采取從A.Kibbe，HandbookofPharmaceuticalExcipients，3.Ed.，2000，AmericanPharmaceuticalAssociationandpharmaceuticalpress(A.基比，制藥賦形劑手冊，第三版。埃德，2000年，美國配藥協會和配藥新聞)。此組合物可能被作為疾病防治、預防且或腺瘤性或癌性療法。此制藥預備，含至少一個本發明的肽包括SEQIDNo.1且或SEQIDNo.2，依照發明的核酸或依照發明的表達載體，施用在遭受伴隨著各別肽或抗原的腺瘤性或癌性的患者。藉此，T細胞介導的免疫反應可被觸發。根據本發明的制藥組合物更好包括至少另一種的腫瘤相關肽，包含根據任何SEQIDNo.3至SEQIDNo.10的序列，各別的核酸或各別的表達載體。通常，存在于根據發明的肽的制藥組合物，如上所述在本發明的肽包含SEQIDNo.1且或SEQIDNo.2的相同性質。因此，其能有整體長度在9至100個氨基酸，較好在9至30個氨基酸，最好在9至16個氨基酸。此外，至少一個依照任何SEQIDNo.1至SEQIDNo.11的肽可包括非肽鍵。此外，可編碼為在9至100個氨基酸，較好在9至30個氨基酸，最好在9至16個氨基酸的各別核酸。根據發明更好的制藥組合物包括(特別是腫瘤相關)肽含氨基酸序列依照SEQIDNo.1且或SEQIDNo.2和SEQIDNo.3至SEQIDNo.11。根據發明更好的制藥組合物，在其中根據發明的相當數量(特別是腫瘤相關)肽、核酸或根據發明的表達載體所呈現在前述組合物里是組織、癌癥且或患者專一的。此肽也可被標記，或是作為融合蛋白質，或是一個雜交分子。此肽也可是實質上純凈的，或與免疫激發佐劑組合，或與免疫激發細胞因子組合，或以一個適合的傳送系統施行，例如脂質體。其他適和的佐劑包括阿魁拉的刺激子(位于美國麻州渥斯特的阿魁拉生物技術)源自皂素、分枝桿菌萃取物和合成的細菌細胞壁仿造物，和專有的佐劑如利比的排毒劑。魁爾A，另一種源自皂素的佐劑，也可被使用(丹麥超弗氏)。其他佐劑如弗氏佐劑也是有用的。讓肽接合鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)或甘露聚糖也是有用的(參見WO95/18145和Longeneckeretal(1993)Ann.NYAcad.Sci.690，276-291(隆杰內克等(1993年)紐約科學院年鑒，第六百九十冊，276至291頁))。因為佐劑被定義為加強對抗原的免疫反應物質(醫療線上醫學字典，美國國家衛生研究院)有此功能可用的其他物質包括但不限于toll樣受體激動劑(TLR激動劑)，較好的物質是能與TLR3，7，8和9協同地交互作用，優選與TLR9作用，如魚精蛋白穩定核糖核酸、CpG寡核苷酸、CpR寡核苷酸、細菌去氧核糖核酸、咪唑喹啉等。在技術中已知是適合加強免疫反應的其他物質包括但不限于對可誘導的一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶(ARG1)、吲哚胺2，3雙加氧酶(IDO)、血管內皮細胞生長因子受體1(VEGFR-1)、血管內皮細胞生長因子(VEG)、環氧化酶-2(COX-2)、β-轉化生長因子受體I(TGF-beta-RI)抑制劑。這些抑制劑也是，例如，單株抗體對抗前述分子或小分子。在技術中已知的小分子和單株抗體對以上所述的因子有抑制作用，因此是免疫反應加強作用，例如1-MT、阿司匹林衍生物NCX-4016、羅菲可西保、希樂保、BEC、ABH、nor-NOHA、SB-505124、SD-208、LY580276、AMD3100、阿西替尼、貝伐珠單抗、JSI-124、CPA-7、XL-999、ZD2171、帕若盤尼、CP-547632和血管內皮細胞生長因子陷阱。并且，減少調節T細胞(CD4陽性、CD25陽性、FoxP3陽性)數量的物質作為佐劑是適和的。這些包括但不限于，例如環磷酰胺(癌得星)、安泰克斯(白介素2融合毒素)、舒尼替尼、抗-細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(MDX-010，CP-675206)、抗-CD25、抗-人類巨噬細胞來源的趨化因子和抗-糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體。在另一優選的實施方案中，疫苗是核酸疫苗。已知以核酸疫苗接種，如編碼為多肽的去氧核糖核酸疫苗，可導致T細胞反應。它可直接地被施用入患者，至受影響的器官或全力身系統性，或間接體內地應用在源自患者或人類細胞株的細胞，隨后對患者施用，或被使用以選擇源自患者的免疫細胞亞群，然后再對患者施用。如果對體外培養的細胞施行核酸，可以轉染細胞以便共同表達免疫刺發細胞因子，如白細胞介素2或巨噬細胞集落刺激因子。核酸疫苗也可與如卡介苗或明礬的佐劑一起施用。然而，優選在沒有佐劑下施用核酸疫苗。多核苷酸是實質地不含雜物的，或包含在一個適合的載體或傳送系統。適合的載體和傳送系統包括病毒的系統，如根據腺病毒、痘苗病毒、反轉錄病毒、皰疹病毒、腺病毒相關病毒或包含超過一種以上病毒元素的雜交種。非病毒傳送系統包括負離子脂質和負離子聚合物在去氧核糖核酸傳送是知名的技術。物理傳送，如通過″基因槍″也可被使用。肽或由編碼肽的核酸可以是融合蛋白質，例如可激發CD4陽性T細胞的破傷風類毒素表位。對患者適當地施用任一核酸都是無菌的和無致熱原的。裸露去氧核糖核酸可以肌肉內或皮內或皮膚下地注射方式給予。肽也可由肌肉內、皮內或皮膚下地注射方式給予。核酸疫苗可方便地包括任何適當的核酸傳送方式。此核酸，優選去氧核糖核酸，可以是裸露的(即以實質上無其他成分被施行)或是以脂質體傳送或作為病毒載體傳送系統的一部分。一般相信，由專門抗原呈遞細胞如樹突細胞之核酸的舍攝入和編碼為多肽的表達可能是免疫反應的激活機制；然而，樹突細胞不能被轉染但仍是重要的因為他們可以從組織中轉染的細胞里拾取表達的肽(″交叉激活″，如托馬斯AM、圣塔席若LM、魯茲ER、阿姆斯壯TD、陳YC、黃LQ、拉合如DA、高根斯M、哈魯班RH、杰菲EM。間皮素專一的CD8陽性T細胞反應由抗原呈遞細胞在被接種的胰臟癌癥患者上提供體內交叉激活的證據。實驗醫學期刊。2004年8月2日；第二百冊，第三號，297至306頁)。核酸疫苗如去氧核糖核酸疫苗，優選在肌肉施用，肽疫苗優選在皮下或皮內施用。如果疫苗施用入皮膚也是較好的。此核酸疫苗在沒有佐劑下可施用。此核酸疫苗也可與佐劑如卡介苗或明礬一起施用。其他適合的佐劑包括阿魁拉的的刺激子(位于美國麻州渥斯特的阿魁拉生物技術)源自皂素、分枝桿菌萃取物和合成的細菌細胞壁仿造物，和專有的佐劑如利比的去毒劑。魁爾A，另一種源自皂素的佐劑，也可被使用(丹麥超弗氏)。如果核酸疫苗在沒有佐劑下施用是較好的。其他佐劑如弗氏佐劑也是有用的。讓肽接合鑰孔蟲戚血藍蛋白是也有用的，較好與佐劑一起施用。癌癥的多核苷酸介導疫苗療法被描述在Conryetal(1996)SeminarsinOncology23，135-147；Condonetal(1996)NatureMedicine2，1122-1127；Gongetal(1997)NatureMedicine3，558-561；Zhaietal(1996)J.Immunol.156，700-710；Grahametal(1996)IntJ.Cancer65，664-670；andBurchelletal(1996)pp309-313InBreastCancer，Advancesinbiologyandtherapeutics，Calvoetal(eds)，JohnLibbeyEurotext(康里等(1996年)在腫瘤學研討會第二十三冊，135至147頁；康頓等(1996年)自然醫學第二冊，1122至1127頁；鞏等(1997年)自然醫學第三冊，558至561頁；翟等(1996年)免疫學期刊第一百五十六冊，700至710頁；格瑞漢等(1996年)國際癌癥期刊第六十五冊，664至670頁；和布爾歇爾等(1996年)309至313頁，在乳癌，生物和治療學進展，卡爾夫等(eds)，約翰利比歐洲文獻)，所有在此作為參考文獻加以整體引述。在標靶疫苗至特別細胞群也是有用的，例如抗原呈遞細胞，以標靶載體和傳送系統的注射，或從患者將這樣的細胞群選擇性純化和間接體內肽或核酸的施用(例如樹突細胞可被分類如描述在Zhouetal(1995)Blood86，3295-3301；Rothetal(1996)Scand.J.Immunology43，646-651)(周等(1995年)血液第八十六冊，3295至3301頁；羅斯等(1996年史坎德，免疫學期刊第四十三冊，646至651頁)。例如，標靶載體可包括組織或腫瘤專一的啟動子，指導在一個適當的地方的抗原表達。關于發明的制藥組合物的進一步方面，包含一個或更多前述根據發明的肽。此組合物被使用為腸外施用如皮下、皮內、肌肉內或口服。為此，肽被溶解或懸浮在一個制藥可接受更好地含水載體。另外，此組合物可包含賦形劑，譬如緩沖液、結合劑、爆破劑、稀釋劑、香味、潤滑劑等。此肽并可與免疫刺激物質一起服用，如細胞因子。一個廣泛目錄的賦形劑可被使用在這樣的組合物，例如，可以采取從A.Kibbe，HandbookofPharmaceuticalExcipients，3.Ed.，2000，AmericanPharmaceuticalAssociationandpharmaceuticalpress(A.基比，制藥賦形劑手冊，第三版。埃德，2000年，美國配藥協會和配藥新聞)。此組合物可能被作為疾病防治、預防且或腺瘤性或癌性療法。此制藥預備，含至少一個包括SEQIDNo.1且或SEQIDNo.2的本發明的肽，施用在遭受伴隨著各別肽或抗原的腺瘤性或癌性的患者。藉此，T細胞介導的免疫反應可被觸發。在本發明其他方面，兩個或幾個根據本發明肽的組合可被使用作為疫苗，可直接組合或在同樣治療方案范圍內。此外，與其他肽的組合，例如MHCI類或II類專一的肽可被使用。有技巧的人經由測試能選擇較好致免疫肽的組合，例如在體外T細胞的世代并且其效率和整體呈現、增殖、某些T細胞親合力和擴展對某些肽、和T細胞的功能如由分析干擾素-γ的產生(也參見如下例子)。通常，最有效率的肽然后被結合作為疫苗為如上所述目的。適合的疫苗優選包含1至20個肽，優選2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個不同肽，優選6、7、8、9、10或11個不同肽，最優選11個不同肽。用于癌癥疫苗的肽長度可以是任一適合的肽。特別是，它可以是適合的9單體單元肽或適合的7單體單元或8單體單元或10單體單元或11單體單元肽或12單體單元。更長的肽也是適合的，如在附表1所描述的9單體單元或10單體單元肽對MHCI類的肽是較好的。肽構成腫瘤或癌癥疫苗。它可直接地被施用入患者，至受影響的器官或全身系統，或間接體內地應用在源自患者或人類細胞株的細胞隨后對患者施行，或使用在體外培養以選擇源自患者的免疫細胞亞群，然后再對患者施行。此肽也可接合適合的載體如鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)或甘露聚糖(參見WO95/18145和Longeneckeretal(1993)Ann.NYAcad.Sci.690，276-291(隆杰內克等(1993年)紐約科學院年鑒，第六百九十冊，276至291頁))。此肽疫苗在沒有佐劑下也可被施行。此肽疫苗也可與佐劑如卡介苗或明礬一起施行。其他適合的佐劑包括阿魁拉的的刺激子(位于美國麻州渥斯特的阿魁拉生物技術)源自皂素、分枝桿菌萃取物和合成的細菌細胞壁仿造物，和專有的佐劑如利比的去毒劑。魁爾A，另一種源自皂素的佐劑，也可被使用(丹麥超弗氏)。其他佐劑如弗氏佐劑也是有用的。讓肽結合鑰孔蟲戚血藍蛋白，有佐劑下較好。其他佐劑如那些以上所提及，也可被使用。此肽也可被標記、或是融合蛋白質、或是一個雜交分子。本發明的此肽序列被預期可激發CD8陽性細胞毒性T淋巴細胞。然而，在CD4陽性T細胞所提供的幫助下其激發是更有效率的。因此，一個雜交分子的融合伙伴或分段適當地提供激發CD4陽性T細胞的表位。CD4陽性刺激表位在技術科中是知名的且包括那些在破傷風類毒素里被識別的。根據發明的肽疫苗的特別優選的實施方案，前述疫苗在腎臟細胞癌的治療上是多發性肽腫瘤疫苗。前述疫苗優選包括一組根據SEQIDNo.1至SEQIDNo.10的腫瘤相關肽，位于和已被識別在原發性腎臟癌細胞。此組包括HLAI類和II類肽。此肽組也可包含至少一個肽如從B型肝炎病毒核心抗原，被使用為正向調控肽作為免疫標志來測試皮內注射的效率。在一特別實施方案中，此疫苗包括11個各別的肽(根據SEQIDNo.1至SEQIDNo.11)大約1500微克至大約75微克，較好為大約1000微克至大約750微克，更好在大約500微克至大約600微克，最好每一個肽大約是578微克，以上所有肽可由高效液相色譜法和離子交換色譜法純化，呈現出白色至米色粉末。此冷凍干粉末優選溶在碳酸氫鈉里，且在室溫重建以后30分鐘內以皮內方式注射。根據本發明，較好的肽數量可在大約0.1至100毫克變化，更好在大約0.1到1毫克，最優選每500毫升溶液中有大約300毫克至80毫克。此中術語為″大約″將意味給予量的加或減10％，如果無不同地陳述。有技巧的人能調整使用的實際肽數量根據幾個因素，如個別患者的免疫狀態且或呈現在特殊類型癌癥的相當數量腫瘤相關肽。本發明的肽也許以其他適當的形式(無菌的溶液等)被提供以代替冷凍干粉末。在本發明所給予的一些肽序列被預期可激發CD8陽性T細胞(CTL)。然而在CD4陽性T細胞所提供的幫助下其激發是更有效率的。因此，一個雜交分子的融合伙伴或分段適當地提供激發CD4陽性T細胞的表位。CD4陽性刺激表位在技術中是知名的且包括那些在破傷風類毒素里被識別的或由這個發明提供源自基質金屬蛋白酶7的肽。終于，根據發明的疫苗可以用于特別類型癌癥，被治療的患者是正受苦于疾病狀態、早期的治療方式、患者的免疫狀態，且當然，患者的HLA-單倍型的狀態。此外，根據發明的疫苗可包含被個別有特性的成分，根據特殊患者的個人需要。例子是根據關于腫瘤相關抗原表達的不同數量的肽用在前述特殊患者上，由于個人過敏或其他治療而導致的不需要的副作用，在第一輪或治療計劃之后可接著調整做二次治療。本發明的更進一步方面為關于使用根據發明的肽，或編碼為這樣的肽的多核苷酸或表達載體在藥劑的制造作為殺傷在患者的標靶細胞，其標靶細胞異常表達包括發明的氨基酸序列的多肽。較好使用作為制藥組合物的是抗癌疫苗。本發明的更進一步方面為關于使用根據發明的肽，或編碼為這樣的肽的多核苷酸或表達載體在藥劑的制造作為誘發免疫反應，特別在細胞的免疫反應，更特別在T細胞介導對抗實體腫瘤細胞的免疫反應，此實體腫瘤細胞在其表面表達人類I類和II類MHC分子和呈現包括發明的氨基酸序列的多肽。令人驚奇地發現在本發明的實體腫瘤細胞狀況，與同樣組織的健康細胞相反的，在其表面表達HLAII類分子。這個事實只被描述了一次在布瑞薩南克等(BrasanacD，Markovic-LipkovskiJ，Hadzi-DjokicJ，MullerGA，MullerCA.ImmunohistochemicalanalysisofHLAclassIIantigensandtumorinfiltratingmononuclearcellsinrenalcellcarcinomacorrelationwithclinicalandhistopathologicaldata.Neoplasma.1999；46(3)173-8.(布瑞薩南克D、馬可威克-利普科弗斯基J、哈德茲-喬基奇J、莫勒GA、莫勒CA。在腎臟細胞癌的HLAII類抗原和腫瘤浸潤單核細胞的免疫組織化學分析與臨床和組織病理學資料相關。腫瘤，1999年，第四十六冊，第三號，173至178頁))，37個腎臟細胞癌(RCC)的冷凍切片-25個透明細胞型，10個顆粒狀和2個嫌色細胞型--被研究了以間接免疫過氧化物酶方法應用單株抗體(MoAb)對抗HLADR、DP和DQ分型抗原在HLAII類抗原的分析，和抗CD14、CD3、CD4和CD8單株抗體在腫瘤浸潤單核細胞(TIM)。陽性反應細胞的數字以半定量地估計，且免疫組織化學調查的結果與臨床(患者年齡和性別人、腫瘤大小和TNM分期)和腎臟細胞癌的組織病理(細胞學、組織學、等級)特徵有關聯。所有腎臟細胞癌表達HLADR分型，92％表達DQ分型和7％表達DP分型抗原，以表達的水平階層是DR大于DQ大于DP分型，但非統計地重要關聯能以任何組織病理或臨床參數分析建立。單核細胞比T淋巴細胞更多量而CD4陽性比CD8陽性T細胞更多量，但是腫瘤以T淋巴細胞占優勢且CD4陽性和CD8陽性T細胞的數量近乎相等，有最大平均直徑。由腫瘤細胞的T淋巴細胞的不充分活化作用(不管抗原呈現的能力)可能是此參數相關的原因，顯示以異常的HLAHLAII類抗原在腎臟細胞癌表達的更加侵襲性的腫瘤行為。本發明的更進一步方面為提供使用根據發明的肽，或編碼為這樣的肽的多核苷酸或表達載體在藥劑的制造作為殺傷在患者的標靶細胞，其標靶細胞異常表達包含被給予的SEQIDNo.1至SEQIDNo.10的氨基酸序列的多肽。發明的更進一步方面因此提供在細胞體內或細胞體外產生活化T淋巴細胞的方法。第一個方法包含以抗原負載的人類I類或II類MHC分子聯系體外T細胞，此抗原負載的人類I類或II類MHC分子在一個適合的抗原呈遞細胞的表面表達一段時期足以來活化，以抗原專一方式，前述的T細胞而其抗原是根據發明的肽。第二個方法，是較好的，由華爾特等所描述。(WalterS，HerrgenL，SchoorO，JungG，WernetD，BuhringHJ，RammenseeHG，StevanovicS.CuttingedgepredeterminedavidityofhumanCD8T-cellsexpandedoncalibratedMHC/anti-CD28-coatedmicrospheres.JImmunol.2003Nov15；171(10)4974-8)(華爾特S、荷爾根L、史舒爾O、容G、韋內特D、布合林HJ、羅曼席HG、史提芬奴維奇S。先鋒人類CD8T細胞預定的親和力擴展在被標定的MHC/抗CD28包覆的微球體。免疫學期刊，2003年11月15日，第一百七十一冊，第十號，4974至4978頁)。MHCII類分子可在任何適合的細胞表面表達，且優選假如細胞是一個不自然表達MHCII類分子(在此情況下細胞被轉染而表達這樣的分子)或，假如可以，在抗原處理或抗原呈遞的途逕是有缺陷的。這樣，是有可能的在細胞表達MHCII類分子以被選上的肽抗原實質地完全地預先誘導，在活化細胞毒性T淋巴細胞之前。抗原呈遞細胞(或刺激品細胞)典型地有MHCI類或II類分子在其表面，且優選實質上本身不能以選擇的抗原負載前述的MHCI類或II類分子。以下更詳細地描述，MHCI類或II類分子能以細胞體外選擇的抗原輕易地負載。優選哺乳動物細胞的TAP肽轉運體缺乏或減少量或減低作用。缺乏TAP的適當的細胞包括T2、RMA-S和果蠅細胞。TAP是抗原處理相關轉運體。人類肽負載缺少細胞株T2可從美國典型物種保藏中心得到，地址是美國馬里蘭州洛克維爾市公園草坪道12301號郵遞區號20852，在目錄下號碼CRL1992；果蠅細胞系謝德株2可從美國典型物種保藏中心在目錄下號碼CRL19863得到；小鼠RMA-S細胞株被描述在KarreandLjunggren(1985)J.Exp.Med.162，1745(卡雷和雍博瑞(1985年)實驗醫學期刊，第一百六十二冊，1745頁)。前述宿主細胞在轉染之前合宜地表達實質上無MHCI類分子。并且優選假如刺激子細胞表達分子對T細胞共刺激是重要的，如任何B7.1、B7.2、胞間質黏著分子-1和淋巴細胞功能相關抗原3。在一個更進一步的實施方案中，HLA分子的組合可能也被使用。重組多表位疫苗的用途為傳送多發的CD8陽性細胞毒性T淋巴細胞表位，被描述在Thomsonetal(1996)J.Immunol.157，822-826(湯姆森等(1996年)免疫學期刊，第一百五十七冊，822至826頁)和WO96/03144，二者通過參考在此合并。關于本發明合乎需要和有利的包括在單一疫苗，肽(或編碼肽的核酸)，其中的肽包括，以任何次序，本發明的氨基酸序列和CD4陽性T細胞刺激的表位(如源于基質金屬蛋白酶7)。在治療癌癥上這樣的疫苗會是特別有用的。許多其它方法可被使用作為在細胞體外產生細胞毒性T淋巴細胞。例如，方法被描述在Peoplesetal(1995)Proc.Natl.Acad.ScLUSA92，432-436andKawakamietal(1992)JImmunol.148，638-643(皮普氏等(1995年)美國國家科學院研究，第九十二冊，432至436頁和川上等(1992年)免疫學期刊，第一百四十八冊，638至643頁)，利用自體腫瘤浸潤淋巴細胞在細胞毒性T淋巴細胞的產生。Plebanskietal(1995)Eur.J.Immunol.25，1783-1787(普利班斯基等(1995年)歐洲免疫學期刊，第二十五冊，1783至1787頁)，利用自體外周血液淋巴細胞(PLBs)在細胞毒性T淋巴細胞的準備。Jochmusetal(1997)J.Gen.Virol.78，1689-1695(求切莫氏等(1997年)普通病毒學期刊，第七十八冊，1689至1695頁)，描述自體細胞毒性T淋巴細胞的產生藉由使用以肽或多肽脈沖的樹突細胞，或經由以重組病毒的傳染。Hilletal(1995)J.Exp.Med.181，2221-2228andJeromeetal(1993)J.Immunol.151，1654-1662(希爾等(1995年)實驗醫學期刊，第一百八十一冊，2221至2228頁和杰諾米等(1993年)免疫學期刊，第一百五十一冊，1654至1662頁)，利用B細胞在自體細胞毒性T淋巴細胞的產生。另外，巨噬細胞以肽或多肽脈沖，或以重組病毒的傳染，可被使用在自體細胞毒性T淋巴細胞的準備。異基因的細胞也可被使用在細胞毒性T淋巴細胞的準備且這個方法被詳細地描述在WO97/26328，通過參考在此合并。例如，除了果蠅細胞和T2細胞，其它細胞也可被使用在提呈抗原如CHO細胞、桿狀病毒感染的昆蟲細胞、細菌、酵母菌、牛痘病毒感染的標靶細胞。另外植物病毒也可被使用(參見，例如Portaetal(1994)Virology202，449-955(波爾塔等(1994年)病毒學，第二百零二冊，449至955頁)，描述豇豆嵌紋病毒發育作為外來肽呈現的高產系統。根據本發明較好的方法，抗原呈遞細胞包含如上所述的表達載體。被指揮對抗發明的肽的活化T細胞在治療上是有用的。因此，發明的進一步方面提供活化的T細胞，可由發明的前述方法獲得。發明的更進一步方面提供活化的T細胞，此活化的T細胞有選擇性地識別細胞有異常表達含發明的氨基酸序列的多肽。更好地，T細胞識別前述細胞藉由與HLA和肽復合體的交互作用(例如，結合)。T細胞是有用的在殺傷患者體內標靶細胞的方法上，其標靶細胞異常地表達含發明的氨基酸序列的多肽，在此患者被施用有效數量的活化T細胞。對患者施用的T細胞也源于患者再被如上所述的方式活化(即他們是自體T細胞)。交互選擇地，T細胞不是源自患者而是源自其它個體。當然，優選假如個體是健康個體。由″健康個體″發明者意味個體通常是有好身體，較好能有稱職的免疫系統，和更好的是不患有任何可被容易測試和查出的疾病。此活化的T細胞表達的T細胞受體(TCR)，涉及在識別表達異常多肽細胞。它是有用的假如編碼T細胞受體的去氧核糖核酸從活化的T細胞被克隆且轉移入更多的T細胞而表達。在細胞體內，此標靶細胞為根據本發明的實施方案的CD4陽性T細胞可以是腫瘤(有時表達MHCII類)且或包圍腫瘤的基質細胞(腫瘤細胞)(有時也表達MHCII類)。對發明肽專一的發明T細胞克隆的T細胞受體被克隆。在T細胞克隆里T細胞受體用途由使用(i)T細胞受體易變區域專一的單株抗體和(ii)用對Va和Vp基因族專一的引物之反轉錄PCR式反應，來決定。從T細胞克隆提取出的多腺嘌呤核苷酸的信使核糖核酸來制備互補去氧核糖核酸基因庫。可使用對T細胞受體C端部份的A和P鏈和N端部份已被確認的Va和P片段專一的引物。對T細胞受體A和P鏈的完全互補去氧核糖核酸以高精度去氧核糖核酸聚合酶放大，且此被放大的產品被克隆入適當的克隆載體。被克隆的A和P鏈基因可被組裝至單鏈T細胞受體，方法被描述在Chungetal(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91，12654-12658(鍾等(1994年)美國國家科學院研究，第九十一冊，12654至12658頁)。在此單鏈構造VaJ片段之后接VDJ片段，之后接Cp片段之后接CD3鏈的跨膜和細胞質片段。此單鏈T細胞受體然后被插入反轉錄表達載體(載體盤區可被使用是根據其感染成熟人類CD8陽性T淋巴細胞和介導基因表達的能力反轉錄載體系統Kat是一種更好的可能性(參見Fineretal(1994)Blood83，43(芬納等(1994年)血液第八十三冊，43頁))。高滴定量兩性特質的反轉錄病毒被使用在感染被純化的自患者腫瘤外周血液分離出的CD8陽性或CD4陽性T淋巴細胞(遵循實驗草案由Robertsetal(1994)Blood84，2878-2889(羅伯特等在(1994年)血液第八十四冊，2878至2889頁)所出版，通過參考在此合并)。抗CD3抗體被使用在觸發被純化的CD8陽性T細胞的增生，促進反轉錄病毒的整合和單鏈T細胞受體的穩定表達。反轉錄病毒轉導效率由被感染的CD8陽性T細胞以對單鏈T細胞受體專一的抗體的染色而確定。被轉導的CD8陽性T細胞的細胞體外分析建立，顯示腫瘤專一殺傷與源自最初被克隆的T細胞受體鏈的異基因限制T細胞克隆一樣。有著預期專一性的被轉導的CD8陽性T細胞群可被使用在腫瘤患者的過繼免疫療法。患者可被治療以介于10的8次方至10的11次方的被自體轉導的T細胞。與CD8陽性細胞類似地，可產生被轉導的CD4陽性T輔助性細胞運載相關的建構。其它適當的系統作為引介基因入T細胞被描述在Moritzetal(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91，4318-4322(摩里茲等(1994年)美國國家科學院研究，第九十一冊，4318至4322頁)，通過參考在此合并。Eshharetal(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90，720-724andHwuetal(1993)J.Exp.Med.178，361-366(艾許豪等(1993年)美國國家科學院研究，第九十冊，720至724頁和胡等(1993年)實驗醫學期刊，第一百七十八冊，361至366頁)，并描述T細胞的轉導。因此，發明的更進一步方面提供T細胞受體識別異常表達含發明的氨基酸序列多肽的細胞，從活化的T細胞上T細胞受體是可獲得。和T細胞受體一樣，對T細胞受體的功能上等效分子在發明里被包含。這些包括與T細胞受體是功能上等效的可執行和T細胞受體一樣作用的任何分子。特別是，這樣分子包括基因工程的三個領域之單鏈T細胞受體，做成的方法被描述在Chungetal(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91，12654-12658(鍾等(1994年)美國國家科學院研究，第九十一冊，12654至12658頁)，通過參考在此合并，與以上所提及的。此發明并包括編碼T細胞受體或功能作用相等的分子的多核苷酸，和編碼T細胞受體或就其功能作用相等的分子的表達載體。作為表達發明的T細胞受體的適當表達載體包括那些上述提及關于發明的肽之表達。然而，更好的表達載體是繼轉導之后在T細胞能表達T細胞受體。發明的更進一步方面提供在患者上殺傷標靶細胞方法，其標靶細胞異常表達含發明的氨基酸序列多肽，方法包括對患者施用有效數量根據發明的肽，或有效數量的編碼前述的肽的多核苷酸或表達載體，或有效數量的以上定義的T淋巴細胞，其前述肽的數量或前述多核苷酸的數量或表達載體或T細胞是有效的挑起抗標靶細胞免疫反應在前述患者上。標靶細胞典型地是腫瘤或癌細胞，特別是實體腫瘤，在其表面表達人類MHCI類或II類分子且呈現含以上所給的氨基酸序列的多肽。發明的更進一步方面提供殺傷在患者標靶細胞方法，其標靶細胞異常表達含發明的氨基酸序列多肽，方法包括步驟(1)從患者獲得T細胞；(2)引介入前述細胞編碼T細胞受體或一個作用上等效分子的多核苷酸，依照以上所定義；并且(3)引介在步驟(2)產生的細胞至患者。發明的更進一步方面提供在患者上殺傷標靶細胞方法，其標靶細胞異常表達含依照以上所定義的氨基酸序列多肽，方法包括步驟(1)獲得抗原呈遞細胞，譬如源自前述患者的樹突細胞；(2)依照被定義在發明的第一或第二或第三個方面的肽與前述抗原呈遞細胞聯系，或以編碼這樣肽的多核苷酸，間接體內；并且(3)再引介如此被處理的抗原呈遞細胞至患者。更好地，抗原呈遞細胞是樹突細胞。適當地，樹突細胞是以抗原性肽脈沖的自體樹突細胞。抗原性肽可以是任何引起合適的T細胞反應的適當的抗原性肽。T細胞療法使用自體樹突細胞以源自腫瘤相關抗原的肽脈沖，被透露在Murphyetal(1996)TheProstate29，371-380andTjuaetal(1997)TheProstate32，272-278(墨菲等(1996年)前列腺，第二十九冊，371至380頁和天均等(1997年)前列腺，第三十二冊，272至278頁)。在一個更進一步的實施方案中，抗原呈遞細胞，譬如樹突細胞，與編碼發明的肽之多核苷酸聯系。多核苷酸可以是任何適當的多核苷酸并且它優選能轉染樹突細胞，如此造成肽的呈現和免疫的誘發。方便地，多核苷酸可以包含在病毒多核苷酸或病毒中。例如，腺病毒傳感樹突細胞被顯示誘發抗原專一抗腫瘤免疫關于粘蛋白1(參見Gongetal(1997)GeneTher.4，1023-1028(鞏等(1997年)基因治療，第四冊，1023至1028頁))。同樣地，基于腺病毒的系統可被使用(參見，例如，Wanetal(1997)Hum.GeneTher.8，1355-1363(萬等(1997年)人類基因治療，第八冊，1355至1363頁)；反轉錄病毒系統也可使用(Spechtetal(1997)JExp.Med.186，1213-1221)(史貝刻特等(1997年)實驗醫學期刊。第一百八十六冊，1213至1221頁)和Szabolcsetal(1997年)血液粒子介導的轉移至樹突細胞也可被使用(Tutingetal(1997)Eur.J.Immunol.27，2702-2707)(圖汀等(1997年)歐洲免疫學期刊，第二十七冊，2702至2707頁))；和核糖核酸也可被使用(Ashleyetal(1997)J.Exp.Med.186，11771182)(艾許利等(1997年)實驗醫學期刊。第一百八十六冊，1177至1182頁)。被贊賞地，關于殺傷在患者的標靶細胞方法，是特別認為較好為標靶細胞是癌細胞，更好為腎臟或結腸癌細胞。在優選的實施方案中，在患者的HLA單體型在治療之前被確定。HLA單體型分析可使用任何適當的方法來執行；這樣的方法在技術方面眾所皆知。發明尤其包括使用發明的肽(或編碼它們的多核苷酸)為積極的細胞體內接種；為自體樹突細胞在細胞體外的操作隨后由在細胞體內如此被操作的樹突細胞的引介來活化T細胞反應；來活化在細胞體外的自體T細胞隨后有過繼療法(即如此被操作的T細胞被引介至患者)；并且從健康捐贈者來活化T細胞(MHC配對或不配對)體外的研究隨后有過繼療法。在優選的實施方案中，本發明的疫苗以單獨地或與其它癌癥療法的組合施行至宿主抑制或壓制腫瘤的形成。此肽疫苗可在沒有佐劑下被施用。此肽疫苗也可與佐劑一起施行如卡介苗或明礬。其它適當的佐劑如上所述。根據發明的肽也可被使用作為診斷試劑。使用此肽其可以被分析，是否在T細胞群其T細胞是存在的，是專一地被指導對抗肽或由治療來激發。此外，前驅體T細胞增量可被測試以顯示反應性對抗被定義的肽的那些肽。此外，肽可被使用作為標志為了監測腫瘤的疾病的進展，此腫瘤表達由前述抗原而來的肽。在附表1列出被確認的肽。另外，肽源自在表中被選定的蛋白質，并且肽的各別位置在各別蛋白質里。此外被給予的個別的Acc序列號與美國國家衛生院的″美國國家生物技術信息中心″的基因庫有關(參見http:www.ncbi.nlm.nih.gov)。在其它優選的實施方案中，肽被使用為白細胞的染色，特別是T淋巴細胞。這個用途有特殊好處假如它可被證明，是否在細胞毒性T淋巴細胞群里被指揮對抗肽的專一的細胞毒性T淋巴細胞是存在。此外肽可能被使用作為標志以確定在腺瘤性或癌性疾病或病害上療法的進展。在其它優選的實施方案中，肽被使用為抗體的產生。多株抗體可以由動物免疫的標準方式獲得，經由肽注射和隨后免疫球蛋白的純化。單株抗體可被產生根據標準實驗規約所描述，例如，在MethodsEnzymol.(1986)，121，Hybridomatechnologyandmonoclonalantibodies(酶學方法(1986年)121頁，雜交瘤技術和單株抗體)。在抗腫瘤免疫療法上T細胞相關抗原的輔助性T細胞表位的確認依然是一項重要任務。直到現在，不同的策略已被執行了為確認源自T細胞相關抗原的I類或II類肽，范圍從以感興趣的抗原來培養抗原呈遞細胞以便被攝取和被處理(Chaux，P.，V.Vantomme，V.Stroobant，K.Thielemans，J.Corthals，R.Luiten，A.M.Eggermont，T.Boon，andB.P.vanderBruggen.1999.IdentificationofMAGE-3epitopespresentedbyHLA-DRmoleculestoCD4(+)Tlymphocytes.J.Exp.Med.189767-778)(喬克斯，P.、V.凡通米、V.斯特魯班特、K.席爾曼、J.哥圖斯、R.盧滕、A.M.艾格蒙特、T.布恩和B.P.凡得布魯根。1999年，MAGE-3表位的確認由HLA-DR分型分子對CD4陽性T淋巴細胞所呈現。實驗醫學期刊，第一百八十九冊，767至778頁)，到以融合蛋白質的各種各樣轉染策略(Dengiel，J.，P.Decker，O.Schoor，F.Altenberend，T.Weinschenk，H.G.Rammensee，andS.Stevanovic.2004.IdentificationofanaturallyprocessedcyclinD1T-helperepitopebyanovelcombinationofHLAclassIItargetinganddifferentialmassspectrometry.Eur.J.Immunol.343644-3651)(丹杰爾，J.、P.戴克爾、O.史舒爾、F.艾爾坦博蘭德、T.溫斯玄克、H.G.羅曼席和S.史提芬奴維奇。2004年。自然地被處理的細胞周期蛋白D1T-輔助性表位的確認由HLAII類靶向和差別的質譜儀分析的一個新穎組合。歐洲免疫學期刊，第三十四冊，3644至3651頁)。所有這些方法都非常費時的且經常保持不明，假如識別的HLA配體由人類組織實際上在細胞體內呈現。發明者識別了一個配體證明是從基質金屬蛋白酶7的核心序列。發明者發現了此蛋白質在腎臟細胞癌被過度表達，另外，它被描述了與腫瘤相關(Miyamoto，S.，K.Yano，S.Sugimoto，G.Ishii，T.Hasebe，Y.Endoh，K.Kodama，M.Goya，T.Chiba，andA.Ochiai.2004.Matrixmetalloproteinase-7facilitatesinsulin-likegrowthfactorbioavailabilitythroughitsproteinaseactivityoninsulin-likegrowthfactorbindingprotein3.CancerRes.64665-671；Sumi，T.，T.Nakatani，H.Yoshida，Y.Hyun，T.Yasui，Y.Matsumoto，E.Nakagawa，K.Sugimura，H.Kawashima，andO.Ishiko.2003.Expressionofmatrixmetalloproteinases7and2inhumanrenalcellcarcinoma.Oncol.Rep.10567-570)(宮本S.、K.矢野、S.杉本、G.石井、T.長谷部、Y.遠藤、K.兒玉、M.戈雅、T.千葉和A.落合。2004年。基質金屬蛋白酶7促進類胰島素生長因子生物相容性通過其蛋白酶活性在類胰島素生長因子結合蛋白質3。癌癥研究，第六十四冊，665至671頁；島本，T.、T.中谷、H.吉田、Y.賢、T.安井、Y.松本、E.中川、K.杉村、H.川島和O.石河。2003年，基質金屬蛋白酶7和2在人類腎臟細胞癌的表達。腫瘤學報告，第十冊，567至570頁)。此肽雜亂地結合至HLA第二分子和能活化從不同的健康捐贈者的CD4陽性T細胞。因而，發明者的方法將是有用的從腫瘤相關抗原識別新的II類肽候選者而用于臨床疫苗接種方案。理解其發明的特點在此被透露和被描述，可被使用不僅在依照被表明的各自組合而且用單一方式沒有背離本發明的計劃的范圍。發明以下列圖形、序列目錄和例子的參考下，現在作更詳細描述。下列例子只為說明性的目而提供并無打算限制發明。SEQIDNo.1至SEQIDNo.2顯示T細胞表位的肽序列，包含根據本發明由MHCI類或II類所呈現的肽。SEQIDNo.3至SEQIDNo.11顯示被使用在本發明疫苗的肽之肽序列，后來被稱為“IMA”。圖1顯示c-Met的原致癌基因推導的肽IMA-MET-001存在于原發腫瘤樣品腎臟細胞癌013。奈米毛細現象高性能液相層析電噴霧電離質譜技術應用在從腎臟細胞癌013上洗脫的肽。此質量層析圖為1006.54正負0.5道爾頓顯示峰頂在滯留時間47.8分鐘。碰撞引起衰減的質量光譜從質量對電荷比例1006.54，被記錄在第二次液相層析-質譜行程在指定的滯留時間并且顯示在插圖里，證實了IMA-MET-001的存在(溫斯錢科2002年)。圖2顯示c-Met的原致癌基因(MET)的組織表達。基因表達以寡核苷酸陣列分析。拷貝數與腎臟是相對的，被設置在1.0。″P″意指基因是存在，″A″是不存在和″M″是邊界，根據統計絕對指令算法。″I″意指基因的表達顯著的增加相對于腎臟，″D″代表減少的表達，并且″NC″意指在表達上沒有變化。表達值相對于腎臟從信號對數比率和顯示在桿的頂部被計算。水平虛線顯示在正常組織的最高的表達(肺臟在這種情況下)。圖3顯示以IMA-MET-001誘導的細胞毒性T淋巴細胞對肽負載標靶細胞的殺傷。圖4顯示以IMA-MET-001誘導的細胞毒性T淋巴細胞對惡性細胞的殺傷。圖5顯示冷靶抑制分析。圖6顯示對微球體驅使擴展的四聚體分析。圖7顯示IMA-MMP-001的細胞體外免疫原性-典型的細胞內干擾素γ對CD4四個健康捐贈者的染色。捐贈者1，2和3顯示了CD4陽性T細胞反應對抗IMA-MMP-001在第三和第四刺激以后。捐贈者4總是陰性的。圖8顯示在腫瘤和健康組織上差異的肽呈現-(A)兩個肽種類的質譜其質量對電荷比例739.96和741.95，各別地源自正常腎臟和患者RCC100的腎臟細胞癌組織。質譜顯示四倍脂肪分化相關蛋白肽的在腎臟細胞癌組織過度表達，與對應的自體正常組織相比(B)從質量對電荷比例741.95的碰撞引起衰減的質量光譜儀分析(腫瘤)顯露肽序列IMA-ADF-003，此肽序列源自脂肪分化相關蛋白。圖9顯示細胞體內免疫對抗IMA-ADF-001-T細胞免疫在二名腎臟細胞癌患者上，對抗幾個非疫苗接種的肽在以兩個源自黏蛋白的腫瘤相關肽脈沖自體樹狀細胞的患者。對IMA-ADF-001(″脂肪分化相關蛋白″)專一的T細胞，在接種之前是不存在的且在6次接種以后在第三號患者被檢測出(上格)和在8次接種以后在第八號患者被檢測出(下格)。圖10顯示典型IMA誘發T細胞反應的例子，由被放大的酶聯免疫斑點分析識別對同樣患者和抗原。上列和下列分別地代表陰性對照組抗原HIV-001和單一腫瘤相關肽IMA-CCN-001其被使用為資料分析。左列顯示合并樣品的酶聯免疫斑點分析被采取在接種之前在篩選第二天(S2)并且立刻在第一次注射之前(V1)。右列顯示合并樣品的酶聯免疫斑點分析被采取在接種實驗方案期間在第二十二天(V6)和第三十六天(V7)。每個實驗皆給予陽性細胞的數量。圖11IMA典型誘發T細胞反應的例子由被放大的四聚體染色分析確認。上格和中格代表二維點圖門控CD3陽性淋巴細胞，下格門控CD3陽性CD8陽性淋巴細胞。患者、時間點和染色依各列表明的那樣。S1+V樣品被采取在接種之前；V4+V5樣品被采取在第八天和第十五天；V6+V7樣品被采取在第二十二天和第三十六天；V8+FU樣品被采取在第六十四天(最后接種)并且在八十五到九十二天以后(研究的結尾)A患者03-004的資料證實對IMA-CCN-001的免疫學反應被顯示在圖10。一個細胞群陽性的在CD3陽性和IMA-CCN-001四聚物可被識別在第四次和第五次的IMA注射以后(V6+V7；中格)占0.78％淋巴細胞(V6+V7；下格)。陽性群未被發現在K67-001四聚物(上格)。B患者03-003的資料展示無免疫學反應對抗IMA-RGS-001肽(上格)但發展IMA-CCN-001四聚物陽性反應在接種實際方案期間(中格，第三列和第四列)占直到0.8％淋巴細胞(下格；第三列)。圖12T細胞量動力學的觀察在單一時間點被放大的四聚物分析。結果顯示在患者05-001單一時間點資料分析，其疫苗誘發的T細胞反應以合并樣品的定期放大的四聚物分析已被偵測出。結果被給予在所有腫瘤相關抗原呈現在IMA(腫瘤相關肽庫)且特別是在IMA-CCN-001肽。另外，HIV-001和IMA-HBV-001控制組在同樣單一時間點分析被顯示。實施例辭匯解釋術語或縮寫描述AE不良事件AJCC美國癌癥聯合會BfArM聯邦藥物與醫療器械所CTL細胞毒性T細胞DC樹突細胞GM-CSFrhuGM-CSF(重組人類粒細胞巨噬細胞集落刺激因rhuGM-CSF子)HBVB型肝炎病毒HLA人類白細胞抗原IARC國際癌癥研究署IMP試驗用藥品INF干擾素MAA營銷授權申請MHCMHCRCC腎臟細胞癌SAE嚴重不良事件SmPC產品特點概述TUMAP腫瘤相關抗原I.本發明的肽的特性描述關于從基因產品里得到的IMA肽之表達數據從原發腎細胞癌組織被識別的肽，被選擇作為包括進疫苗IMA(參見下面)，根據一種內部等級制度主要基于已知抗原的特性而由此推導出已被確認的肽之基因表達分析、文憲和資料庫查尋。所有自然地被提呈的肽在腎細胞癌組織是非常過度表達的與正常的腎組織和多種其他有重要的器官和組織相比。這樣選擇是必要的在(1)選擇肽能誘發T細胞以高專一性在腫瘤但非其它組織的識別使被IMA接種誘發的自體免疫的機會減到最小，和(2)保證在患者群的多數腫瘤由誘發的T細胞所識別。被推導的肽包含在IMA里的抗原的平均發生率是68％(在腎細胞癌與重要器官和組織過度表達，在n等于24的腎細胞癌樣品)范圍從54％到96％為單一抗原。這顯然比在標準腫瘤抗原里高，譬如Her2/neu發生率25％至30％)。全球性基因表達描述檔以一個商業可利用的高密度微陣列系統(艾飛矩陣)而執行。核糖核酸從組織被分離、被處理和雜染至高密度寡核苷酸微陣列。在染色和洗滌以后，列陣被掃描且各個點的熒光強度在陣列代表基因表達水平的種類配對寡核苷酸的去氧核糖核酸序列。幾種寡核苷酸在陣列包含各個基因序列。在統計軟件分析以后，兩兩的相對表達值在兩個樣品之間對各個基因能被獲得。以一個恒定的樣品作為基礎線使不同的樣品之所有資料的正常化，在所有樣品之間允許表達水平的相對量化。核糖核酸來源-來自人類組織的總核糖核酸可在商業上獲得(英國杭廷頓的安比昂；德國海得爾堡的克隆科技；荷蘭阿姆斯特丹的史楚特基因；德國海得爾堡的生物鏈)。來自一些個體的總核糖核酸被混合，用從每個單獨個體的核糖核酸被相等地衡量的方式。質量和數量被確定在安捷倫2100芯片分析系統(德國沃爾特布隆的安捷倫)以核糖核酸6000奈米芯片實驗室試劑盒(安捷倫)。高密度寡核苷酸陣列分析-雙股去氧核糖核酸被合成從5至8微克的總核糖核酸以速克隆反轉錄酶II(德國卡爾斯魯厄的生命技術公司)和引物(比利時瑟蘭的歐洲基因科技)依照由艾飛矩陣手冊所給予的指示。細胞體外轉錄以生物芯片公司高產量核糖核酸轉錄標記的試劑盒(紐約法明達里的安諾診斷有限公司)，碎裂、雜交在艾飛矩陣U133A或U133升級2.0版基因芯片(艾飛矩陣，圣塔克來拉，加州)，和以鏈酶親和素-藻紅素和生物素化抗鏈酶親和素抗體染色(荷蘭萊頓的分子探針)遵循制造商的實驗規約(艾飛矩陣)。艾飛矩陣基因掃描器被使用且以微陣列分析組件5.0軟件或基因芯片操作軟件(GCOS)分析資料。為規范化，使用由艾飛矩陣提供的100個家務基因。兩兩相比的計算使用在腎臟里表達值作為基礎線。相應地，所有表達值的計算是以相對于腎臟的信號對數比率，被設置為1。顯著的差別表達由″變動″值判斷，其值由統計算法軟件實施。對于絕對表達的檢測，使用統計算法資料被再一次分析。基因表達的存在或缺乏由絕對指令算法確定。一個典型組織表達格對c-Met原致癌基因(MET)的基因表達被顯示在表2。在分析96％腎細胞癌(n等于24，右邊)MET是過度表達的，但在幾個選擇的重要健康組織和器官與免疫學上重要組織和細胞是不表達或非常低的表達(在表2左邊)表1總結包含在發明的疫苗IMA的肽，且包括根據發明的肽。表1根據本發明的肽表2總結表達結果在所有編碼為包含在發明的疫苗IMA的肽的抗原，且包括根據發明的肽。表2在腎細胞癌(n等于24)抗原的過度表達頻率1根據由統計算法所給予的“變動”值在軟件實施(“I”的數目)2有更高表達的腎細胞癌與有最高表達的正常組織比較在所有正常組織的數目3腦是免役豁免的因此未被考慮在腎細胞癌的最少的過度表達對所有正常組織是54％，最大值是96％。這是顯著較高的比在標準腫瘤抗原里譬如Her-2/neu(發生率25％至30％)。1.黏蛋白是例外的，沒有過度表達被查出在黏蛋白核糖核酸。但是，接下來的出版報告必須考慮到在惡性細胞的異常去糖基化是常見的且在腫瘤細胞里無遮蔽的表位也許不被呈現在正常細胞。這樣的機制也發生在腎細胞癌是非常可能的。這可解釋表達黏蛋白的腫瘤細胞株的專一殺傷(Brossart1999)(布魯薩爾特1999年)。也請參見章節4.1.5在黏蛋白的特性。2.在杜賓根大學的研究員起始的試驗里，IMA-MUC-001與自體樹突細胞一起被施用。此試驗最近在2003年的美國臨床腫瘤醫學會(Mueller2003)(謬勒2003年)被提出并且后續資料在2005年的美國臨床腫瘤醫學會(Wierecky2005)(維瑞基2005年)被提出，會議中無自體免疫的作用被報告。3.從臨床研究的其它報告顯示，在乳癌(Rentzsch2003)(藍茲科2003年)和結直腸癌患者(Dittmann2004)(戴特曼2004年)對IMA-MUC-001專一的細胞毒性T細胞自然地發生(無需免疫接種)。在這些患者無自體免疫的作用被報告。這強調IMA-MUC-001-專一的T細胞的自然角色。根據這支持性的資料IMA-MUC-001的施用被認為是安全的，雖然無黏蛋白抗原過度表達被檢測出在單獨的信使核糖核酸水平上。IMA-MMP-001的雜亂結合至幾個HLA-DR分型等位基因IMA-MMP-001是結合HLA-DR分型的肽，是HLAII類分子。II類腫瘤相關肽活化T輔助性細胞，在協助被II類腫瘤相關肽活化的細胞毒性T細胞作用的一個關鍵的角色。雜亂結合HLA-DR分型的肽是重要的在保證以IMA治療的多數(大于50％)HLA-A*02-陽性患者，還能引起對IMA-MMP-001的T細胞反應。對IMA-MMP-001結合的電子分析顯示，IMA-MMP-001雜亂地結合幾個HLA-DR分型等位基因(DRB1*0101，*0301，*0401，*1101和*1501)包含總共至少69.6％的HLA-A2陽性高加索人群。雜亂結合的IMA-MMP-001由細胞體外產生免疫性資料實驗性地證實。測試的原理使用在杜賓根大學開發的SYFPEITHI算法(Rammensee1997；Rammensee1999)(羅曼席1997年；羅曼席1999年)，IMA-MMP-001結合幾個共同的HLA-DR分型等位基因(參見下表)被排等級。從大范圍的抗原，此算法已成功地使用在識別I類和II類表位，例如從人類腫瘤相關抗原酪氨酸酶相關蛋白2(I類)(Sun2000)(孫2000年)和滑膜肉瘤x斷點2(II類)(Neumann2004)(紐曼2004年)。被分析的HLA-DR分型等位基因包含至少69.6％的HLA-A2陽性高加索人群(Mori1997)(莫理1997年)。結合閥被定義在比分18依照對已知發表的雜亂HLA-DR分型配體結合比分的分析。雜亂結合被定義為HLA-DR分型肽結合好幾個HLA-DR分型等位基因，其被表達在至少50％高加索人群。HLA-A和HLA-DR分型基因座是在連鎖不平衡產生HLA-A2和專一的HLADRs的組合，與其他相比較是傾向產生此組合(表3)。表3北美洲高加索人單元體頻率-被顯示是血清學單元體。N.a.代表沒被指定(Mori1997)(莫理1997年)。某些MHC分子配體攜帶化學相關氨基酸在于其一級序列的某些位置，容許肽基序的定義在每個MHC等位基因(FaIk1991)(法爾克1991年)。SYFPEITHI使用推論自細化基序的基序矩陣，完全根據由埃德曼降解法和串聯質譜檢測的自然配體分析(Schirle2001)(西爾勒2001年)。這些矩陣允許所指定的呈現在MHCI類或II類分子上蛋白質序列的肽確切預測(Rotzschke1991)(羅茲杰克1991年)。表4IMA-MMP-001結合比分對常見的HLA-DR分型等位基因顯示在高加索人群IMA-MMP-001SYFPEITHI結合比分對最常見的HLA-DRB1分型等位基因。HLA-A2分型陽性的高加索人對應的血清學單元體頻率被測量在括弧里。肽被認為結合HLA分子，當比分是等于或大于18。根據SYFPEITHI算法所預測IMA-MMP-001可能結合幾個HLA-DR分型等位基因(DRB1*0101，*0301，*0401，*1101和*1501)包含至少69.6％的HLA-A2分型陽性的高加索人群。因為HLA-DR15分型頻率資料不可獲得，此等位基因在演算里被省略了。因而是非常可能的，此人群所包含的范圍比69.9％更高。實驗性確認IMA-MMP-001的雜亂結合可由細胞體外產生免疫性資料獲得(參見下面)。抗原的表達和衍生肽的呈現在腫瘤和自體正常組織的比較。過度表達的抗原應該是在細胞表面上HLA分子被過度表達。示范地，源自脂肪分化相關蛋白的HLA-A*03肽，是一個過度表達的抗原，兩個包含在IMA的HLA-A*02肽IMA-ADF-001和IMA-ADF-002源自此抗原肽，以QUALITEA策略顯示其高度過度表達在腎臟細胞癌組織當與患者腎細胞癌100的自體正常組織比較。這顯示出在這個示范案例，抗原的過度表達(在此案例為脂肪分化相關蛋白)與同樣抗原的衍生肽的過度表達相關聯。此方法被詳細描述在(Lemmel2004)(勒梅爾2004年)。QUALITEA代表一個作為從腫瘤和正常組織洗脫的HLA肽的差異定量的策略。源自兩個不同來源的HLA配體是由1Hx-或2Dx-試劑和組合來衍生化N端。由高性能液相色譜降低肽復雜度以后，根據其峰面積以電噴霧質譜分析定量肽。一對被衍生化的肽(1Hx-衍生作用和2Dx-衍生作用)物理化學上相同的且容易地被檢測，因其基本上共洗脫在色譜分析的系統。此外，有一個恒定的質量差異被測量在質譜掃瞄。此差異取決于在衍生物的穩定同位素數目。配體的序列識別由電噴霧串聯質譜分析顯示和光譜的電腦輔助的資料庫查尋被記錄。因而，此分析提供關于呈現在腫瘤和正常組織的肽定性和定量方面的資訊。HLA肽差異性呈現在過度表達抗原的腫瘤和正常組織的一個例子被顯示在表8。肽IMA-ADF-003在腫瘤組織是4倍的過度呈現對腎細胞癌編號100患者的健康腎臟組織，由碰撞引起的衰減質譜分析在許多相等地呈現的肽之中被確認。此在腫瘤組織過度呈現的肽源自脂肪分化相關蛋白。對同樣患者腎細胞癌編號100的基因表達分析，也是2.64倍的脂肪分化相關蛋白過度表達在這個腫瘤組織與健康腎臟比較(資料沒被顯示)。這資料證實在這個特殊案例，在腫瘤組織的基因水平上過度表達導致在腫瘤細胞表面的肽過度呈現。細胞活體內產生免疫性對抗IMA-ADF-001從腎細胞癌患者產生的自體樹突細胞(DCs)以兩個源自黏蛋白的腫瘤相關肽脈沖，在這些IMA-MUC-001之中。IMA-ADF-001未被接種。接種是以皮下注射方式每兩個星期四次且每月重復的執行直到腫瘤發展。在第五次樹突細胞注射以后患者另外接受了三次每星期低藥量白細胞介素-2(1MioIE/m2)的皮下注射。T細胞前驅體的活化作用被以干擾素γ的酶聯免疫斑點試驗監測。除T細胞的誘導對抗兩個被接種的肽以外，且T細胞活性對抗幾個其它已知的腫瘤相關肽，在他們之中IMA-ADF-001被測試。此結果最近被顯示，由彼得·布羅薩特博士(杜賓根大學)在美國臨床腫瘤學會(ASCO)的2005年的年會上發表，此完全的發表被出版在ASCO網站。在二名患者(患者8號和患者13號)以兩個黏蛋白肽脈沖在對其它肽的自體樹突細胞T細胞免疫性上接種，然后被接種的患者在接種以后被檢測(圖9)。由于在接種之前免疫不是存在的，非常有可能這樣的T細胞被表位擴展所誘導。表位擴展可發生當腫瘤細胞破裂(例如壞死、被疫苗誘導的T細胞所溶解等)并且釋放出抗原然后被抗原呈遞細胞(APCs，即樹突細胞)所吸收。這些抗原呈遞細胞然后可在細胞內處理抗原且呈現T細胞表位(即腫瘤相關肽)指示T細胞反應。此資料強調IMA-ADF-001的強烈潛在作用為自然發生的T細胞抗原。II.根據發明對疫苗“IMA”的生產和用途IMA是包含一組腫瘤相關肽的疫苗，位于和被識別在原發腎癌細胞。此組包括HLAI類和II類肽。此肽組且包含一個源自B形肝炎病毒核心抗原的肽，被使用為陽性對照肽作為免疫標志來測試皮內注射的效率。肽疫苗接種通常需要被輔助，所以例如，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子將被開發作為輔藥在此疫苗接種時間表(人類粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子是商業可得的在沙格司亭、魯克恩、博勒克思)。在十個腫瘤腫瘤相關肽中有八個包含在IMA，用以下所述之XPRESIDENT技術所識別。對這些肽自然呈現在由腫瘤表達的HLA分子背景，因此被直接的證據證明。肽IMA-MUC-001和IMA-CCN-001以其它技術識別。對兩后者肽，這些肽在腫瘤細胞株里自然呈現被基于在細胞體外產生免疫性檢測的間接證據所證明(參見下面)。測試原理HLA分子從沖擊冷凍處理的原發腎細胞癌組織被純化且HLA相關肽被分離。這些肽或是由高效液相色譜法離線式分離且分組物被分析或質譜的序列分析由聯機的高效液相色譜-串聯質譜儀實驗完成。因此產生的序列由被識別的肽合成與被識別的和被合成的肽的片段圖譜之比較所證實。如同被識別的肽是直接地源自原發性腫瘤的HLA分子，這些結果呈現直接證據在原發性腎細胞癌組織里被識別的肽之自然處理和呈現。方法方法詳細被描述在(溫斯錢科2002年)。簡要地，沖擊冷凍的患者樣品從度賓根大學泌尿學系獲得的(被當地方道德委員會批準)被溶解了，HLA分子使用HLAI類專一的抗體W6/32或HLA-A*02-專一的抗體BB7.2或(在IMA-MMP-001的例子)HLA-DR-專一的抗體L243的親合色譜法所純化。HLA相關肽由酸處理所洗脫且以超濾法分離MHCα鏈蛋白質。被分離的肽或者是由反相高性能液相色譜法離線式分離并且分組物由奈米-電噴霧質譜分析在一臺混雜四極正交加速時間飛行串聯質譜儀(Q-TOFI或Q-TOFUltima，沃特斯)或是使用同樣儀器的聯機的液相-串聯質譜法分析所完成。空白的運轉總是包括的用以保證系統免于肽干擾。每天至少校正一次且在適當的間期完成標準化合物的分析以保證系統的最佳表達。片段圖譜的解釋用人工完成。分析的證明由資料庫查尋和假定肽序列的固相合成及被確認與合成的肽片段圖譜的比較所獲得。所有肽包含在IMA(資料沒被顯示)除了IMA-MUC-001和IMA-CCN-001以相同形式被識別，證實這些肽在原發性腎細胞癌組織的自然呈現。IMA成分在此臨床發展的肽由標準和建立很好的9-甲酸芴甲酯化學合成。肽的純化以制備的高效液相色譜和離子交換法完成。重要地，肽的性質和純度能以容易地和高準確性地質譜和高效液相色譜分析所確定。IMA的配方包括十一種各別的藥物物質，在下面被進一步仔細描述。表5在IMA的抗原所有肽由9-甲酸芴甲酯固相化學合成和由高效液相色譜和離子交換色譜法純化至大于95％的純度。正確結構由氨基酸分析和質譜分析確定。表6在IMA之肽的物理化學的特性藥品IMA以凍干粉呈現作為皮內施用，其包含11個肽-每一個肽是578微克-以鹽(醋酸鹽)的形式。在對患者的臨床試驗配方的施用上，注射的粉末包含578微克的各個肽被溶化在700毫升的碳酸氫鈉(4.2％)。在回收500毫升的溶液后(均等的413微克的各個肽單一藥量在每次注射和4.5毫克IMA總單一藥量在每次注射)將以皮內方式注射。表7在IMA其它成分*在制造過程期間被去除IMA的質量因為使用滿足歐洲藥典要求的有效成分和賦形劑被保證。包含在IMA肽的細胞體外致免疫性IMA包含九個HLAI類腫瘤相關肽、一個HLAII類腫瘤相關肽和一個HLAI類病毒對照組肽。細胞體外致免疫性能被為大多數包含在IMA的肽證明。細胞體外致免疫性能被為包含在IMA之十個HLAI類序列中的八個證明，主要是以二種T細胞檢測A.在鉻釋放法之標靶細胞的細胞毒殺且或B.由HLA四聚物檢測T細胞。這些分析證明專一的前驅體細胞存在于HLA-A*02陽性捐贈者血液并且這樣專一的T細胞在殺傷標靶細胞的能力之證據。像在后者案例且幾種腫瘤細胞株內在地表達抗原是被識別的。這給予額外的(間接)指證在被使用的肽的自然呈現在腫瘤細胞，且顯示以這些肽產生的細胞毒性T細胞有一個大的親合力在腫瘤細胞的識別。細胞體外致免疫性被為包含在IMA的HLAII類肽IMA-MMP-001以細胞內細胞因子染色之流式細胞分析儀所證明(參見下面)。表8為包含在IMA的肽之細胞體外致免疫性資料總結殺傷細胞分析標靶的細胞毒殺由鉻釋放分析所測量；細胞因子釋出細胞因子的釋出由T細胞以酶免疫分析法測量；細胞因子染色細胞因子的合成由T細胞以細胞內流式細胞分析儀測量；四聚體檢測由HLA四聚體檢測肽專一T細胞。包含在IMA的HLAI類肽之細胞體外致免疫性IMA包含10個HLAI類結合肽。為測試肽關于其細胞體外致免疫性，CD8陽性細胞毒性T細胞以包含在IMA的單一肽從健康捐贈者的自體外周血液單核細胞(PBMC)產生，并且這些細胞毒性T細胞的活性以鉻釋出分析所測試與在流式細胞分析儀里以HLA四聚體檢測T細胞。詳細的資料被顯示在一示范性的肽(IMA-MET-001)的兩個方法，有關其它肽的資料被總結在以上之表8。在第一步，細胞毒性T細胞的產生(誘導)是在細胞體外由外周血液單核細胞(PBMC)的重復的刺激，此外周血液單核細胞是源自健康的HLA-A*02陽性捐贈者以專一肽所測試。此誘導可使用從捐贈者的血液單核細胞產生的自體樹突細胞或使用HLA四聚體裝載的小珠來完成。A.標靶的細胞毒殺傷在第二步，這樣被誘導的細胞毒性T細胞(CTLs)的細胞毒性被測試以放射性鉻標記標靶細胞和將測試標靶細胞與產生的細胞毒性T細胞一起培養。放射性鉻釋放入上層清液的數量可直接地與被殺傷的標靶細胞的比例關聯。B.以HLA四聚體檢測T細胞交互選擇地，在第二步被誘導的細胞毒性T細胞對一指定的肽的專一性以HLA四聚體所查出。四聚體包括四個肽裝載的HLA-A*02分子互相連結。這些建構允許同源T細胞受體的專一標記，其識別在四聚體里之HLA肽復合物，且以熒光染色標記四聚體隨后在流式細胞分析儀(FACS)被分析。以樹突細胞誘導細胞毒性的T細胞。在細胞毒性T細胞誘導，5x105的樹突細胞以每毫升50微克合成的肽IMA-MET-001脈沖2小時，洗滌，與2.5x106的自體外周血液單核細胞一起培養在RP10培養基。培養7天以后，細胞被再激發以自體肽脈沖外周血液單核細胞和每毫升1納克的人類重組合白細胞介素-2(R&D系統)于第一天，第三天和第五天被加入。被誘導的細胞毒性T細胞的細胞溶解活性在第五天的最后再刺激以后以標準51鉻釋放分析(Brossart1999)(布羅薩特1999年)。(參見下面)以四聚體裝載的小珠的細胞毒性T細胞體外誘導。細胞體外誘導由以前所描述的執行(Walter2003)(華爾特2003年)或較小幅度的修改。簡要地，生物素化重組的HLA-A*0201分子缺乏跨膜區段且是依照早先所描述的在重鏈羧基末端被生物素化(Altman1996)(艾爾特曼1996年)。純化的共激小鼠IgG2a抗人類CD28抗體9.3(Jung1987)(容1987年)是在由制造商建議的情況下(德國波昂的普達生物科技公司)以磺基-N-羥基琥珀酰亞胺生物素行化學地生物素化。微球體被使用是5.60微米直徑鏈霉親和素覆上的聚丙乙烯微粒，有著結合容量大約0.06微克的生物素異硫氰酸熒光黃在每毫克微球體(美國伊利諾洲費雪的班氏實驗室)。在微球體處理上，使用無菌的磷酸鹽/牛血清白蛋白/乙二胺四乙酸緩沖液。為偶聯至生物素化分子，微球體被洗滌和使重新懸浮為2×106微粒在每毫升包含各種厚度的生物素化的MHC且或抗體的緩沖液。在室溫下振動30分鐘以促使結合。包覆小珠被洗滌三次，使重新懸浮在上述的緩沖液和被存放在攝氏4度在使用之前達4個星期。外周血液單核細胞與新鮮的白細胞層以標準梯度分離培養基(德國維爾茨堡-貝廷根的連納瑞斯或奧地利林茲的PAA實驗室)分離。未接觸的CD8T細胞以CD8T細胞分離試劑盒在制造商的條件下(德國貝爾吉施-格拉德巴赫的天旎生物技術公司)藉由陰性消耗而磁性地富取，使得CD8陽性T細胞受體陽性的細胞純凈度超過80％。細胞體外刺激被起始在24孔板里，每個孔有5×106反應器細胞加上1x106抗原呈遞細胞或微球體在1.5毫升T細胞培養基。如果沒陳述則每毫升5納克人類白細胞介素-12p70(R&D)與抗原呈遞細胞或微球體一起加入。在3至4天于攝氏37度下共培養以后，新鮮培養基和每毫升20單位的人類白細胞介素-2(R&D)被加入且細胞進一步被培養在攝氏37度3至4天。這個刺激周期被重復兩次。細胞毒性T細胞的標靶細胞殺傷由使用鉻釋放分析。標準51鉻釋放分析如所描述的執行(Brossart2001).(布羅薩特2001年)。標靶細胞以每毫升5納克的肽脈沖2小時和以51鉻酸鈉標記在RP10培養基在攝氏37度1小時。104個細胞被轉移到一個96孔板的圓底孔。變化數目的細胞毒性T細胞加入以給予最后的體積為200微升和被培養在攝氏37度4小時。在分析的結尾上清液(每孔50微升)被收集和以β板計數器計數。百分比專一的溶解被計算為100x(實驗性釋放減掉自發性釋放除以最大釋放減掉自發性釋放)。自發和最大的釋放被決定于各自存在的培養基或2％曲拉通X-100。腫瘤細胞的抗原專一性進一步被確定在一個冷標靶抑制分析，由分析肽容量脈沖未標志的T2細胞以阻攔腫瘤細胞溶解在20比1的比率(抑制劑對標靶的比率)。以HLA四聚體檢測細胞毒性T細胞。四聚體染色如以前所描述的(Walter2003)(華爾特2003年)或以小幅度修改來執行。簡要地，生物素化重組的HLA-A*0201分子缺乏跨膜區段且是依照早先所描述的在重鏈羧基末端被生物素化(Airman1996)(艾爾特曼1996年)。螢光四聚物的產生由共培養生物素化HLA-A*0201與鏈霉親和素-藻紅蛋白或鏈霉親和素-別藻藍蛋白(荷蘭萊頓的分子探針)以4比1的莫耳比率。在四聚體的分析，細胞以磷酸鹽/牛血清白蛋白/乙二胺四乙酸包含每毫升10毫克的疊氮化鈉(德國達姆施塔特的默克)洗滌并且被染色在攝氏4度20分鐘在同樣緩沖液包含抗體CD4-異硫氰酸熒光黃和CD8-多甲藻素-葉綠素蛋白克隆SK1(兩個都來自貝克頓迪更生)。在微球體刺激實驗后，每毫升100微克未標志的鏈霉親和素(斯格碼)是包括的。細胞被洗滌在磷酸鹽緩沖液包含2百分以熱滅活的胎牛血清(德國艾丹巴赫的潘生物技術公司)，2毫克分子的乙二胺四乙酸和每毫升10毫克的疊氮化鈉，且四聚體被染色在攝氏4度30分鐘在磷酸鹽/胎牛血清/乙二胺四乙酸/疊氮化鈉但其胎牛血清是50％。四聚體試劑總被使用在每毫升5微克的MHC厚度。染色的細胞被徹底地在磷酸鹽/胎牛血清/乙二胺四乙酸/疊氮化鈉溶液洗滌和以1％的甲醛(默克)固定。細胞以四顏色FACSCalibur流式細胞儀(貝克頓迪更生)分析。此結果被詳細地示范顯示在IMA-MET-001于方法A和方法B。此結果對其它HLAI類肽被總結在表8。A.標靶細胞毒殺結果被發表在(Schag2004)(史查格2004年)。相關的信息在以下被總結。在第一步，被誘導的細胞毒性T細胞的細胞毒性以肽裝載的T2細胞和自然體的樹突細胞作為標靶的標準51鉻釋放檢測而分析。依照圖3所顯示，在二次每周再刺激后獲得的細胞毒性T細胞系展示了抗原專一殺傷。此T細胞只識別T2細胞或覆上此同源肽的樹突細胞，當他們沒有溶解標靶細胞其以源自存活素蛋白質或人類免疫缺陷病毒-1反轉錄酶之毫不相關的HLA-A2結合肽脈沖，證實其溶細胞活性的專一性。在第二步，細胞體外誘導的細胞毒性T細胞溶解內在地表達c-Met蛋白質的腫瘤細胞之能力被分析，以使用表達c-Met為標靶的HLA-A*02陽性細胞系HCT116(結腸癌)、A498、MZ1257(腎臟細胞癌)、MCF-7(乳癌)、Mel1479(惡性黑色素瘤)和U266(多發性骨髓瘤)在標準51鉻釋放分析。以艾伯斯坦-巴爾病毒轉化的B細胞株Croft(HLA-2陽性/c-Met陰性)和卵巢癌細胞株SK-OV-3(HLA-A3陽性/c-Met陽性)被包括以確定細胞毒性T細胞的專一性和HLA限制性。依照表4所展示，此c-Met肽專一的細胞毒性T細胞能高效率地溶解表達HLA-A2和c-Met的惡性細胞。卵巢癌細胞SK-OV-3或Croft細胞的不能識別顯示出，腫瘤細胞上在HLA-A2分子序列之c-Met肽的呈現作為標把細胞高效率的溶解是必需的且證實細胞毒性T細胞的抗原專一性和MHC限制性。細胞體外誘導的T細胞不能識別K562細胞顯示，細胞毒素的活性不是自然殺傷細胞介導的。為進一步證實細胞體外誘導的胞毒性T細胞系的抗原專一性和MHC限制性我們執行冷標靶抑制分析。標靶細胞(U266和A498)的溶解能被阻攔在冷標靶抑制分析。以同源肽脈沖冷的(沒有以51鉻標記)T2細胞減少了腫瘤細胞的溶解但是T2細胞以毫不相關的肽脈沖則是無效的(圖5)。B.以HLA四聚體檢測T細胞富集的A*02陽性健康捐贈者之CD8T細胞被刺激三次以小珠覆上10納米分子的CD28抗體加上10納米分子的毫不相關的A*02復合體(左格)或以被指示的抗原之A*02重摺疊(中間和右格)。被指示的抗原是源自鋸細胞病毒pp65抗原的肽NLVPMVATV(Wills1996)(威爾斯1996年)，修飾過的肽ELAGIGILTV源于黑色素-A或T細胞識別黑色素瘤抗原-1(Kawakami1994)(川上1994年)和肽IMA-MET-001。所有T細胞株在表面以CD8-多甲藻素-葉綠素蛋白抗體，同源四聚物-藻紅蛋白染色(圖6；左和中間格)和毫不相關的A*02/ILKEPVHGV四聚體-將別藻藍蛋白(右格)。在CD8陽性淋巴細胞中的四聚體陽性細胞的百分比被表明在各種圖面。包含在IMA的HLAII類肽之細胞體外致免疫性IMA包含源自基質金屬蛋白酶-7的HLAII類結合肽，IMA-MMP-001。為測試肽關于其細胞體外致免疫性和關于其雜亂結合特性，CD4陽性T細胞以IMA-MMP-001肽從有著不同的HLA基因型的健康捐贈者的自體外周血液單核細胞(PBMC)而產生，且這些輔助性T細胞的活性被以細胞內細胞因子染色在流式細胞分析儀所測試。從健康捐贈者的外周血液單核細胞(PBMC)用在白細胞介素-12的情況下被測試的專一的肽在細胞體外重復的刺激而產生(誘導)CD4陽性T細胞。使用從捐贈者的血液單核細胞產生的自體樹突細胞來執行此誘導。在第二步，對指定的肽專一的被誘導的CD4陽性T細胞之活性由干擾素γ產生的測量而測試，此測量為由細胞內干擾素γ以螢光標記的抗體染色。此分析由流式細胞分析儀(FACS)完成。樹突細胞(DCs)的產生人類樹突細胞由從健康捐贈者新鮮地抽取的血液之外周血液單核細胞所制備。外周血液單核細胞以聚蔗糖密度梯度(淋巴細胞分離培養基，奧地利柏斯澄的德國PAA實驗室)被分離。被獲得的細胞被洗滌，重新懸浮在X-Vivo15培養基以每毫升50單位的青霉素、每毫升50微克的鏈霉素和2毫克分子的左旋麩醯胺酸(比利時韋爾維耶的百威泰克)補充并且被裝在每毫升7×106個細胞的密度。在攝氏37度2個小時以后，附著的單核細胞被培養了6天在X-Vivo培養基以每毫升100納克的粒巨噬細胞集落刺激因子和每毫升40納克的白細胞介素-4(德國福萊莎勒的艾爾免疫工具。在第7天發育未全的樹突細胞以每毫升10納克的腫瘤壞死因子-α(德國威斯巴登的R&D系統)和每毫升20克的多(IC)(德國施泰因海姆的斯格碼-奧德利馳)活化3天。樹突細胞分化狀態由流式細胞分析儀審查，成熟的樹突細胞主要地是CD14陰性、CD40陽性、CD80陽性、CD83陽性、CD86陽性和HLA-DR分型陽性(資料沒被顯示)。抗原專一的CD4陽性T細胞的產生為產生CD4陽性T細胞，106個外周血液單核細胞以2×105的自體樹突細胞刺激。在誘導以后，以冷凍保存的自體外周血液單核細胞每6到8天進行再刺激。對于刺激步驟，細胞以每毫升5微克的肽在攝氏37度下90分鐘脈沖和被放射線照射(60格雷；加拿大安大略諾迪安國際公司的珈瑪細胞1000優良輻照儀)。細胞被培養在96-孔的平板(每位捐贈者和每種肽7個孔)在T細胞培養基RPMI1640包含4-羥乙基乙磺酸緩沖液和左旋麩醯胺酸(英國佩茲利的吉貝科)補充以10％的熱滅活人類血清(德國柯爾貝的PAA)、每毫升50個單位的青霉素、每毫升50微克的鏈霉素和每毫升20微克的硫酸慶大霉素(百威泰克)以及每毫升10納克的白細胞介素-12(德國海得爾堡的普羅姆細胞)。在攝氏37度下3到4天共培養以后，加入新鮮的有著每毫升80個單位的白細胞介素-2(美國加州愛蜜莉維爾的普留凈和雪然股份有限公司)和每毫升5納克的白細胞介素-7(普羅姆細胞)的培養基。以細胞內干擾素γ染色的分析被執行在第三和第四次刺激以后。細胞內干擾素γ染色冷凍保存的外周血液單核細胞被解凍，以X-Vivo15培養基洗滌二次，使重新懸浮以每毫升107細胞在T細胞培養基和被隔間培養使減少不專一的干擾素γ產生(Provenzano2002)(普羅文扎諾2002年)。在次日，外周血液單核細胞以每毫升5微克的肽脈沖2小時，以X-Vivo15培養基洗滌三次并且與效應因子細胞以1比1的比例一起培養小時。加入高基氏體抑制劑(德國海得爾堡的貝克頓迪更生)在最后4小時的培養。細胞以細胞固定/細胞穿透試劑盒(貝克頓迪更生)分析并且CD4-異硫氰酸熒光黃-(免疫工具)、干擾素γ-藻紅蛋白-和CD8-多甲藻素-葉綠素蛋白克隆SK1抗體(貝克頓迪更生)。染色以后，細胞在三色的FACSCalibur(貝克頓迪更生)被分析。為產生抗原專一的CD4陽性T細胞和為測試肽的雜亂結合，四位健康捐贈者有著不同的HLA-DR分型等位基因的外周血液單核細胞(圖7)以肽脈沖的自體樹突細胞刺激。作為在干擾素γ產生的抗原專一的CD4陽性T細胞的讀取系統，是由流式細胞分析儀所評估。在第三和第四次刺激以后，T細胞以細胞內干擾素γ染色加上CD4-異硫氰酸熒光黃和CD8-多甲藻素-葉綠素蛋白染色進行分析以確定在專一的T細胞亞群中干擾素γ產生的細胞的百分比。在所有實驗里，以毫不相關的肽和無肽施行刺激以作為陰性對照組。干擾素γ的反應被認為是陽性的假如干擾素γ引起的CD4陽性T細胞的檢測與陰性對照組比較是超過二倍。(豪爾頓2004年)。在四位捐贈者中的三位對感興趣的肽能引起CD4陽性T細胞專一地反應(圖7)。T細胞反應不能被觀測到在捐贈者四既非在第3次之后也非在第4次刺激之后。生產為IMA-MMP-001專一的CD4陽性T細胞的干擾素γ的最高的頻率分別被在捐贈者1和2看見。因此，IMA-MMP-001是一種雜亂結合劑能引出CD4陽性T細胞反應在四位中的三位攜帶不同的HLA等位基因的健康捐贈者。根據結合預測和被獲得的結果，肽由HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401/*0408和HLA-DRB1*1101所呈現是非常有可能的。所有四個等位基因在其β鏈有甘氨酸殘基在位置86和天門冬氨酸殘基在位置57(資料沒被顯示)。所以，他們有非常相似的結合基序在其結合囊P1和P4分享結合特徵(Rammensee1997；Hammer1993；Marshall1994)(羅曼席1997年；漢姆爾1993年；馬歇爾1994年)。捐贈者4攜帶HLA-DRB1*0318和DRB1*1401等位基因有非常不同的結合基序。這將解釋為什么用來自這位捐贈者使用上述的肽以細胞引出T細胞反應是不可能的。在人類的作用自1996年以來，對那些被描述在此有著相似長度和氨基酸分布的短肽已被用來免疫治療數以萬計的患者以各種各樣的階段1到3臨床試驗。在這些研究中無任何嚴重有害事件被報告。另外，包含在IMA的肽IMA-MUC-001已經被使用于接種疫苗，其被裝載在由德國杜賓根大學調查員起創始試驗的樹突細胞，且有非常好地奈受性(Wierecky2005)(維瑞基2005年)。SEQIDNo.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的肽被測試在30名患者，其中26名在10周的時間完成一全套接種疫苗。比例高達74％的患者，對包含在疫苗內的肽序列顯示專一的免疫反應。已經在這小的第一階段群組內，細胞體內生物作用的8和9肽(序列識別號為2、3、4、5、6、7、8、9)結合MHCI類(等位基因HLA-A*02)可能依照被放大的酶聯免疫斑點法且或四聚體染色分析結果所證實像在下面描述的那樣處理。需要不同的讀取有著序列識別號為1的肽(IMA-MMP-001)不能被測試的原因歸結于從患者血液中外周血液單核細胞的有限的可及性。專一的免疫學參數(免疫監測)迄今，免疫監測是普遍做法在數以萬計患者以各種的治療性疫苗接種研究(Romero2004)(羅密羅2004年)。許多不同的免疫監測的方法迄今被報告了，包括功能的和專一的分析檢測。治療性疫苗IMA的致免疫成分為HLA結合肽，在細胞體內應該誘導專一的T淋巴細胞。這活化作用將導致他們的增殖和獲得效應因子的功能，包括當抗原接觸時其分泌細胞因子的能力。作為一個替代品標志在T細胞活化作用，在血液中專一的細胞因子分泌的單核細胞頻率可被酶聯免疫斑點法分析所測試。這樣的分析檢測是特別適當的為此目的，因為他們是單一細胞為基礎的并且導致一個參數(即斑點形成細胞的數目在單核細胞之中)被預期與細胞因子分泌的抗原專一的T淋巴細胞之真實頻率直接地被關聯在血液樣本。因為這樣，分析檢測也能同步處理相對地很大數量的樣品和肽，他們到目前為止已經廣泛被應用在免疫監測的研究在很大數量的臨床研究上(Schmittel2000)(舒密特爾2000年)。免疫反應免疫學活性或效能可由T細胞反應分析所描述。關于免疫反應之不同的指徵從不同的臨床研究之經驗和結果可在文獻被發現。在有卵巢和乳癌患者中達100％的T細胞反應由戴西斯等于1999年(Disisetal.，1999)描述。表位擴展在84％的卵巢、乳房和非小細胞肺癌患者中(64人)以Her2/neu抗原加上粒巨噬細胞集落刺激因子的3方研究由戴西斯于2002年(Disisetal.in2002)報告。其它作者出版了結果關于33％至83％的黑色素瘤患者T細胞反應(Keilholz/Schadendorf，2003；Slingluffetal.，2004)(卡爾霍茲/史查德道爾夫2003年；史林魯夫等2004年)。Gaudernack/Gjertsen，2003(高德納克/杰特森，2003年)報告關于在這項研究內幾種對抗原專一的CD4陽性和CD8陽性T細胞克隆之免疫反應。并且，結果由Wiereckyetal.，ASCO2005(維爾基等在2005年的美國臨床腫瘤協會)提出源自樹突細胞(DC)的自體成熟單核細胞以二種從黏蛋白1肽所推導的HLA-A2結合肽脈沖。為招攬和活化CD4陽性T細胞，樹突細胞進一步與PAN-DR結合肽PAN-DR輔助性T細胞表位一起培養。疫苗接種是以皮下方式每兩個星期注射一次，共四次，并且每月重復的直到用這種治療方法的腫瘤發展。在第五次樹狀細胞注射以后患者另外接受了每周三次注射低藥量白細胞介素-2(1MioIE/m2)。T細胞前驅體的強化以干擾素γ酶聯免疫斑點法和51鉻釋放分析所監測。此外以疫苗相關表位挑戰生產細胞因子的外周血液單核細胞的能力被定時定量PCR反應測試。由維瑞基等所做的這項研究中，細胞體內黏蛋白1肽專一的T細胞反應在所有患者外周血液單核細胞被檢測。這些細胞體內誘導的T細胞能夠識別脈沖以同源肽的標靶細胞或配對的異源腫瘤細胞(A498)，其結構性地表達黏蛋白1在抗原和HLA限制的方式在細胞體內再次次激以后。在患者對治療所起的反應中，對抗原的T細胞反應沒被使用在疫苗接種像脂肪分化相關蛋白、端粒酶或腫瘤相關胎抗原蛋白能被檢測出，顯示也許發生表位擴展。對PAN-DR輔助性T細胞表位肽的增殖反應是可檢測的在16個患者中的11個，在一些患者已經在第2次接種以后。結論在被接種的患者上對表位擴展的分析而關聯臨床和免疫學反應也許是一個有用的參數。細胞體內免疫反應臨床試驗配方IMA的臨床試驗配方包括-包含11種肽在3毫升小瓶里的冷凍干燥粉末-稀釋劑(碳酸氫鈉4.2％)IMA劑形注射用的粉末在3毫升玻璃小瓶里。包裝信息4個小瓶被裝入箱子。稀釋劑包括700微升的碳酸氫鈉被包裝在250毫升瓶。1小瓶IMA由加入700微升的4.2％之碳酸氫鈉溶液(稀釋劑)重新組成。為了溶化IMA小瓶和稀釋劑使勁地被搖動3分鐘和由超聲波處理1分鐘。爾后小瓶再次被搖動1分鐘。500微升的這樣溶液在重新組成后30分鐘內被施用。疫苗接種在這項研究中晚期的腎臟細胞癌患者在十個星期的時期接受了八次接種。總共，共計有HLA-A*02陽性的HLA類型之24名患者參與。皮內接種(粒巨噬細胞集落刺激因子加上IMA)被給予在第1、2、3、8、15、22、36天和第64天。在研究期間血樣被采取在不同的時間點并且T細胞包含在患者的外周血液單核細胞之內(PBMCs)從肝素血液里由密度梯度離心法被分離，使用血球計數器來計數和被保存以存放在冷凍的溫度直到分析檢測。二種不同的常規酶聯免疫斑點法分析和一種常規四聚物分析然后由申請人施行。被放大的酶聯免疫斑點法分析在“間接體內的酶聯免疫斑點法”分析，細胞被解凍從不同的時間點，活細胞的數目被計數并且樣品與不同的肽或在三份孔里的對照組培養1天后被分析檢測或控制。間接體內的酶聯免疫斑點法分析提供定量資料以更快的方式與其它的分析方法比較。另外，這是唯一的分析法允許一種包含在IMA的HLAII類肽(IMA-MMP-001)的測量。然而，這個分析法的敏感性有限并且陽性資料只被預期在非常強烈的T細胞反應情況下與對病毒的記憶(回憶)免疫反應可比較。在“被放大的酶聯免疫斑點法”分析，從不同時間點的細胞被合并、被計數和以抗原被前刺激大約兩個星期而允許專一的細胞分化。細胞然后從培養皿里被收集，重新計數然后被分析檢驗如上所述為干擾素γ斑點產生在1天的以抗原再次刺激。在這樣情況下被活化的細胞分泌干擾素γ，由酶連接的三明治抗體方法被檢測。由顏色形成反應斑點可視見且斑點以一臺自動化的高解析率數字照相機(此中叫做“酶聯免疫斑點法讀取者”)被計數。斑點的數量與在樣品中被活化的抗原專一T淋巴細胞真頻關聯，是由軟體算法以酶聯免疫斑點法讀取者所采取的圖像確定。這個分析經常被使用來檢測T細胞反應對被接種的腫瘤抗原在各種的第三方臨床試驗。基由于T細胞的“細胞體外誘導”的假陽性資料可能性可以使用在此分析的各種控制而排除。與下面的四聚體分析相比較，此分析提供額外的功能信息，即干擾素γ細胞因子的釋放。在此研究放大的酶聯免疫斑點法分析被執行在28名患者并且所有抗原預先和在接種期間實驗規約于不同的時間點呈現在IMA。圖10顯示IMA誘導的T細胞反應的代表性例子由被放大的酶聯免疫斑點法分析識別在同樣的患者和抗原。上部和下部的欄柱代表陰性對照抗原HLA-001和單一腫瘤相關肽IMA-CCN-001各自地被使用讀取。在各個實驗陽性細胞的數量被給予。左欄顯示合并在接種之前被采取的樣品的酶聯免疫斑點法，而右欄顯示合并在接種規約期間被采取的樣品的酶聯免疫斑點法。當對照抗原沒有導致斑點數量的增加在免疫反應的誘導以后，IMA的注射導致了斑點數量的增殖為IMA-CCN-001。陽性的數字，即干擾素γ分泌細胞，在接種之前從27至34增加到100至141在第四和第五次注射以后。以IMA治療在這名患者導致被活化的T淋巴細胞專一的為IMA-CCN-001抗原頻率的增加。被放大的四聚體分析在“被放大的四聚體”分析從不同的時間點的細胞被解凍，被計數和以抗原前刺激大約兩個星期而允許專一的細胞分化。細胞然后從培養皿里被收集，重新計數和以藻紅蛋白-和將別藻藍蛋白-螢光染料標記的主要組織相容性復合多體多聚體加上抗體所染色而定義CD8陽性T細胞(一個孔在每個染色和每個時間點)。MHC多聚體是重組的肽-MHC的復合體，多聚體形成和共軛于一種螢光染料。只有完全相當于最初引進到領域(艾爾特曼1996年)的那些四聚體的HLA-A*0201多聚體，此中簡要地稱四聚體被使用了。被染色的和被固定的樣品以在技術知名的標準程序之流式細胞分析儀所分析，導致一個基于單細胞的每個樣品的數據集。這“被放大的四聚體”分析是非常高敏感性但與間接體內分析比較下較不定量的。為對四聚體資料的主要分析完全被評估的CD8陽性T細胞的數量，每樣品的單一四聚體陽性和雙重四聚體陽性細胞的數量以使用商業軟件之細胞分析儀列入表方式文件所電子計數。CD8陽性T細胞被識別由前向和側向的散射門控在活的淋巴細胞和次門控在根據抗體熒光的CD8陽性CD3陽性項目。淋巴細胞閘門和CD3/CD8閘門的定義是相同的為一名患者所有染色在分析檢測之內。四聚體陽性群從CD8陽性T細胞以象限或閘門分析雙重四聚體點圖所識別。四聚體陽性細胞的定義是相同的為分析上在一名指定患者的各個染色的條件和根據可識別的細胞群。被放大的四聚體分析檢測在研究里28名患者上被執行并且所有抗原預先和在接種期間實驗規約于不同的時間點呈現在IMA。圖11顯示由被放大的四聚體染色分析IMA誘導的T細胞反應的代表性例子。上格和中格代表二維點圖門控在CD3陽性淋巴細胞，下格門控在CD3陽性CD8陽性淋巴細胞。患者、時間點和染色是依各個欄柱所表明。在表11A患者03-004對IMA-CCN-001的免疫學反應，已由酶聯免疫斑點法分析(圖10)顯示由四聚體分析證實。一個為CD3陽性的陽性細胞群且IMA-CCN-001四聚體被識別在IMA的第四和第五次注射以后(V6+V7；中格)當無陽性群被為K67-001四聚體發現時(上格)。IMA-CCN-001陽性細胞在前三次注射之后從接種疫苗之前的0.03％增加到0.78％的淋巴細胞(V6+V7；下格)。患者03-003陳列無免疫學反應抗RGS-001肽(圖11B；上格)但發展IMA-CCN-001四聚體陽性反應在接種疫苗規約的時間過程(S1+V1樣品被采取在接種之前；V4+V5樣品被采取在第8天和第15天；V6+V7樣品被采取在第22天和第36天；V8+FU樣品被采取在第64天(最后一次接種)并且在第85至第92天以后；研究結束)。在中格，第3和第4欄顯示明顯的細胞群陽性為CNN-001和CD3陽性。在疫苗接種的時間過程這些細胞數量在前三次注射之后從接種疫苗之前的0.02％增加到0.8％的淋巴細胞(下格；第3欄)在第64天以后則減少到0.31％(下格；第4欄；V8+FU)。在被選擇的患者上被放大的四聚體分析在單一時間點進行，即血樣未被合并，允許被描述在圖12之T細胞動能學的例子更加精確的評估。被觀察的T細胞大小值動能學在單一時間點被放大的四聚體分析所顯示于患者05-001。腫瘤相關抗原呈現在IMA(腫瘤相關肽合并庫)在第22、36天和第64天(V6、V7和V8)是最高的而對IMA-CCN-001肽的反應的最高峰為較早的第22天(V6)。B型肝炎病毒-001陽性對照組引起更加快速的反應在第15天達其最高值(V5)。對IMA-CCN-001有非常高反應的二名病人被選擇在一個非被放大的實驗里以確認被放大的四聚體分析的結果。這些間接體內的四聚體分析被執行于兩個星期沒有培育細胞。結果被總結在下面表9。其顯示所有可評量的結果從間接體內的四聚體和患者與抗原配對的被放大的四聚體分析，由此一個疫苗誘導的反應在被放大的分析所檢測。在“間接體內”方法，四聚體陽性在總CD8陽性T細胞之中的百分比被表明。至于“放大，常規”評估方法，CD8陽性T淋巴細胞的亞群可被分析，常規資料的第二次再估價被顯示(“放大，定量”)以演算根據總CD8陽性T淋巴細胞。“放大作用因子”被計算假如離散的四聚體陽性群在間接體內和被放大的四聚體分析中被檢測到。此結果清楚地展示，免疫學反應以被放大的四聚體分析所測量不歸結于在兩個星期培養期間的細胞擴展而是根據早先“間接體內”淋巴細胞在患者血液的呈現。整體患者反應性T細胞反應由以上所述的分析檢測在包含于IMA的所有肽為28名患者在研究的不同的時間點被評估。患者被計分為“反應的”即顯示了疫苗誘導的免疫反應，假如被采取在接種時間點之后這血樣之一包含四聚體陽性淋巴細胞或分泌干擾素γ以其中之一肽刺激。依所期望，患者對包含于IMA不同的肽個別地起反應。考慮到小的患者的數量，一個令人吃驚好的反應性被取得，因為多數患者(27名可評估患者中的23名)對至少其中之一肽發展免疫反應。27名可評估患者中的8名(30％)甚至顯示抗多種腫瘤相關肽的T細胞反應。結合。參考文獻AltaianJD，MossPA，GoulderPJ，BarouchDH，McHeyzer-WilliamsMG，BellJI，McMichaelAJ，andDavisMM.Phenotypicanalysisofantigen-specificTlymphocytes.Science27494-96(1996).ApostolopoulosVandMcKenzieIF.Cellularmucinstargetsforimmunotherapy.CritRev.Immunol.14293-309(1994).BamiasA，ChortiM，DeliveliotisC，TrakasN，SkolarikosA，ProtogerouB，LegakiS，TsakalouG，TamvakisN，andDimopoulosMA.PrognosticsignificanceofCA125，CD44，andepithelialmembraneantigeninrenalcellcarcinoma.Urology62368-373(2003).BarndDL，LanMS，MetzgarRS，andFinnOJ.Specific，MajorHistocompatibilityComplex-UnrestrictedRecognitionofTumor-AssociatedMucinsbyHumanCytotoxicT-cells.PNAS867159-7163(1989).BatesS，BonettaL，MacAllanD，ParryD，HolderA，DicksonC，andPetersG.CDK6(PLSTIRE)andCDK4(PSK-J3)areadistinctsubsetofthecyclin-dependentkinasesthatassociatewithcyclinDl.Oncogene971-79(1994).BeilmannM，VandeWoudeGF，DienesHP，andSchirmacherP.Hepatocytegrowthfactor-stimulatedinvasivenessofmonocytes.Blood953964-3969(2000).BergerM，BergersG，ArnoldB，HammerlingGJ，andGanssR.RegulatorofG-proteinsignaling-5inductioninpericytescoincideswithactivevesselremodelingduringneovascularization.Blood1051094-1101(2005).BertolettiA，ChisariFV，PennaA，GuilhotS，GalatiL，MissaleG，FowlerP，SchlichtHJ，VitielloA，ChesnutRC，and.DefinitionofaminimaloptimalcytotoxicT-cellepitopewithinthehepatitisBvirusnucleocapsidprotein.JVirol.672376-2380(1993).BladtF，RiethmacherD，IsenmannS，AguzziA，andBirchmeierC.Essentialroleforthec-metreceptorinthemigrationofmyogenicprecursorcellsintothelimbbud.Nature376768-771(1995).BorsetM，SeidelC，Hjorth-HansenH，WaageA，andSundanA.Theroleofhepatocytegrowthfactoranditsreceptorc-Metinmultiplemyelomaandotherbloodmalignancies.Leuk.Lymphoma32249-256(1999).BottaroDP，RubinJS，FalettoDL，ChanAM，KmiecikTE，VandeWoudeGF，andAaronsonSA.Identificationofthehepatocytegrowthfactorreceptorasthec-metproto-oncogeneproduct.Science251802-804(1991).BramhallSR，NeoptolemosJP，StampGW，andLemoineNR.Imbalanceofexpressionofmatrixmetalloproteinases(MMPs)andtissueinhibitorsofthematrixmetalloproteinases(TIMPs)inhumanpancreaticcarcinoma.JPathol.182347-355(1997).BrossartP，HeinrichKS，StuhlerG，BehnkeL，ReichardtVL，StevanovicS，MuhmA，RammenseeHG，KanzL，andBruggerW.IdentificationofHLA-A2-restrictedT-cellepitopesderivedfromtheMUC1tumorantigenforbroadlyapplicablevaccinetherapies.Blood934309-4317(1999).BrossartP，SchneiderA，DillP，SchammannT，GrunebachF，WirthsS，KanzL，BuhringHJ，andBruggerW.TheepithelialtumorantigenMUClisexpressedinhematologicalmalignanciesandisrecognizedbyMUCl-specificcytotoxicT-lymphocytes.CancerRes.616846-6850(2001).BrossartP，WirthsS，StuhlerG，ReichardtVL，KanzL，andBruggerW.InductionofcytotoxicT-lymphocyteresponsesinvivoaftervaccinationswithpeptide-pulseddendriticcells.Blood963102-3108(2000).BrownerMF，SmithWW，andCastelhanoAL.Matrilysin-inhibitorcomplexescommonthemesamongmetalloproteases.Biochemistry346602-6610(1995).CaoY，KarstenU，ZerbanH，andBannaschP.ExpressionofMUCl，Thomsen-Friedenreich-relatedantigens，andcytokeratin19inhumanrenalcellcarcinomasandtubularclearcelllesions.VirchowsArch.436119-126(2000).ChenX，HigginsJ，CheungST，LiR，MasonV，MontgomeryK，FanST，vandeRM，andSoS.Novelendothelialcellmarkersinhepatocellularcarcinoma.Mod.Pathol.171198-1210(2004).DeVL，ZhengB，FischerT，ElenkoE，andFarquharMG.TheregulatorofGproteinsignalingfamily.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.40235-271(2000).DelsolG，AlST，GarterKC，GerdesJ，SchwartingR，CaveriviereP，Rigal-HuguetF，RobertA，SteinH，andMasonDY.Coexpressionofepithelialmembraneantigen(EMA)，Ki-I，andinterleukin-2receptorbyanaplasticlargecelllymphomas.Diagnosticvalueinso-calledmalignanthistiocytosis.Am.J.Pathol.13059-70(1988).DenysH，DeWeverO，NusgensB，KongY，SciotR，LeAT，VanDamK，JadidizadehA，TejparS，MareelM，AlmanB，andCassimanJJ.InvasionandMMPexpressionprofileindesmoidtumours.Br.JCancer901443-1449(2004).DeshpandeA，SicinskiP，andHindsPW.Cyclinsandcdksindevelopmentandcanceraperspective.Oncogene242909-2915(2005).DiRenzoMF，OliveroM，GiacominiA，PorteH，ChastreE，MirossayL，NordlingerB，BrettiS，BottardiS，GiordanoS，and.Overexpressionandamplificationofthemet/HGFreceptorgeneduringtheprogressionofcolorectalcancer.Clin.CancerRes.1147-154(1995).DittmannJ，Keller-MatschkeK，WeinschenkT，KrattT，HeckT，BeckerHD，StevanovicS，RammenseeHG，andGouttefangeasC.CD8(+)T-cellresponseagainstMUCl-derivedpeptidesingastrointestinalcancersurvivors.CancerImmunolImmunother.(2004).DongG，ChenZ，LiZY，YehNT，BancroftCC，andVanWC.Hepatocytegrowthfactor/scatterfactor-inducedactivationofMEKandPOKsignalpathwayscontributestoexpressionofproangiogeniccytokinesinterleukin-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含有非肽鍵。7.如權利要求1-6任一權利要求所述的腫瘤相關肽，其中所述肽是融合蛋白，特別是含有HLA-DR抗原相關不變鏈(Ii)的N端氨基酸。8.核酸，其編碼權利要求1-7中任一權利要求的肽。9.如權利要求8所述的核酸，其是DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA或前述的混合。10.能夠表達權利要求8或9所述核酸的表達載體。11.權利要求1-7中任一權利要求的腫瘤相關肽、權利要求8或9的核酸或權利要求10的表達載體在醫學中的用途。12.含有權利要求8或9的核酸或權利要求10的表達載體的宿主細胞。13.如權利要求12所述的宿主細胞，其是重組的RCC或Awells細胞。14.藥物組合物，其包含至少一種權利要求1-7中任一權利要求的腫瘤相關肽、權利要求8或9的核酸或權利要求10的表達載體，及制藥學上可接受的載體。15.如權利要求14所述的藥物組合物，其還包含至少一種另外的肽，該肽含有SEQIDNo.3至SEQIDNo.11的任一序列。16.如權利要求14或15所述的藥物組合物，其中所述肽具有9至100個氨基酸，優選為9至30個氨基酸，且最優選為9至16個氨基酸的總長度。17.如權利要求14-16中任一權利要求所述的藥物組合物，其中所述至少一種肽含有非肽鍵。18.如權利要求14-17中任一權利要求所述的藥物組合物，其包含由SEQIDNo.1和/或SEQIDNo.2，以及SEQIDNo.3至SEQIDNo.11的氨基酸序列組成的肽。19.如權利要求14-18中任一權利要求所述的藥物組合物，其中在所述組合物中存在的腫瘤相關肽的量是組織、癌癥和/或患者特異的。20.如權利要求14-19中任一權利要求所述的藥物組合物，其還含有至少一種適合的佐劑。21.如權利要求20所述的藥物組合物，其中所述佐劑選自集落刺激因子，例如粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。22.權利要求14-21中任一權利要求所述的藥物組合物作為抗癌疫苗的用途。23.生產權利要求1-7中任一權利要求的腫瘤相關肽的方法，所述方法包含培養權利要求12所述的宿主細胞以及從所述宿主細胞或其培養基中分離所述的肽。24.殺傷患者的靶細胞的方法，所述患者的靶細胞異常表達含有權利要求1-7中任一權利要求給出的氨基酸序列的多肽，所述方法包含給予所述患者有效量的權利要求1-7中任一權利要求的肽、或權利要求8或9的核酸或權利要求10的表達載體，其中所述肽的量或所述核酸的量或所述表達載體的量，對激發所述患者中抗靶細胞的免疫反應是有效的。25.權利要求1-7中任一權利要求的腫瘤相關肽、權利要求8或9的核酸或權利要求10的表達載體在制造用于殺傷患者的靶細胞的藥物中的用途，所述患者的靶細胞異常表達含有權利要求1-6中任一權利要求給出的氨基酸序列的多肽。26.體外產生活化的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的方法，所述方法包含將CTL體外接觸抗原加載的在適合的抗原呈遞細胞表面表達的人類MHCI類或II類分子足夠的時間，從而以抗原特異的方式活化所述CTL，其中所述抗原為權利要求1-7中任一權利要求所述的肽。27.如權利要求26所述的方法，其中所述抗原通過將充足量的所述抗原與抗原呈遞細胞接觸，加載于在適合的抗原呈遞細胞表面表達的MHCI類或II類分子上。28.如權利要求27所述的方法，其中所述抗原呈遞細胞包含權利要求10所述的表達載體。29.權利要求26-28中任一權利要求所述的方法產生的活化的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，其選擇性識別異常表達含有權利要求1-5中任一權利要求或權利要求7給出的氨基酸序列的多肽的細胞。30.T細胞受體(TCR)，其識別異常表達含有權利要求1-7中任一權利要求給出的氨基酸序列的多肽的細胞，所述TCR獲得自權利要求29的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)或是所述TCR的功能等價分子。31.編碼權利要求30的T細胞受體(TCR)的核酸。32.能夠表達權利要求30的T細胞受體(TCR)的表達載體。33.殺傷患者的靶細胞的方法，所述患者的靶細胞異常表達含有權利要求1-5中任一權利要求或權利要求7給出的氨基酸序列的多肽，所述方法包含給予所述患者有效數量的權利要求29定義的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。34.殺傷患者的靶細胞的方法，所述患者的靶細胞異常表達含有權利要求1-5中任一權利要求或權利要求7給出的氨基酸序列的多肽，所述方法包含以下步驟(1)從所述患者獲得細胞毒性T淋巴細胞(CTL)；(2)將編碼權利要求30定義的T細胞受體(TCR)或功能等價分子的核酸引入所述細胞；(3)將步驟(2)中產生的細胞引入所述患者。35.權利要求1-7中任一權利要求的腫瘤相關肽、權利要求8或9的核酸、權利要求10的表達載體、權利要求14-21中任一權利要求的藥物組合物在制造用于殺傷患者的癌癥細胞的藥物中的用途。36.如權利要求35所述的用途，其中所述癌癥細胞是腎癌細胞。全文摘要本發明涉及免疫治療方法、及用于免疫治療方法的分子與細胞。特別是，本發明與癌癥免疫療法有關。本發明此外更與腫瘤相關輔助性T細胞肽表位有關，此肽表位單獨的或與其它腫瘤相關肽的組合可擔當疫苗組合物的活性制藥成分，其刺激抗腫瘤免疫反應。特別是，本發明與兩種源自人類腫瘤細胞株的HLAII類分子的新型肽序列有關，其可被使用在疫苗組合物中以引起抗腫瘤免疫反應。文檔編號A61K38/00GK101287755SQ200680038407公開日2008年10月15日申請日期2006年9月5日優先權日2005年9月5日發明者哈伯特·辛格,尼爾斯·伊姆瑞希,斯蒂芬·沃爾特,托尼·文希恩克申請人:伊瑪提克斯生物技術有限公司