專利名稱：：抗腫瘤相關肽及相關抗癌疫苗組合物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及免疫治療肽及其在免疫療法，特別是癌癥免疫療法中的用途。本發明披露了單獨形式的或與其他腫瘤相關肽(剌激抗腫瘤免疫反應疫苗化合物的活性藥物成分)組合形式的腫瘤相關T輔助細胞肽表位。特別是本發明的肽組合物可用于引發結直腸癌抗腫瘤免疫反應的疫苗化合物。為了本發明之目的，以下所有引用文獻均以其參考文獻的完整形式并入本文。
背景技術：
：結直腸癌根據美國癌癥協會的報道，結直腸癌(CRC)是美國位于第三位的最常見癌癥，每年折磨著超過175，000名新增患者。在美國、日本、法國、德國、意大利、西班牙和英國，每年有超過480，000例患者罹患該疾病。它是發達國家癌癥死亡的最常見原因之一。研究表明，結直腸癌的發病是遺傳和環境因素之間相互作用的結果。在大多數病例中，結直腸腫瘤似乎由腺瘤息肉演變而來；但是這個演變過程可能需要很多年。結直腸癌的主要危險因素是年齡，90%的病例在50歲之后診斷患有此病。根據美國癌癥協會的報道，結直腸癌的其他危險因素包括飲酒、飲食富含脂肪和/或紅色肉類、水果和蔬菜的攝取量不足。結直腸癌的發病率繼續上升，特別是日本等地區，這些地區接受西化飲食，攝入過多的脂肪和肉類而纖維攝入量減少，這些因素可能是罪魁禍首。但是發病率的上升速度比不上以前，這可能是由于進行了更多的篩查和息肉切除從而防止了息肉發展成為癌癥。和大多數實體腫瘤的治療一樣，一線治療方案為手術治療，然而，手術受益者仍僅限于早期患者，但有很大一部分患者確診時已是晚期。基于氟尿嘧啶的化療方案是晚期結直腸癌的標準治療方法。這些治療方案的大多數是FOLFOX方案(注射5-FU/亞葉酸+奧沙利鉑)和FOLFIRI(伊立替康、亞葉酸，團注和連續輸注5-FU)方案。第三代細胞毒素類藥物(如伊立替康和奧沙利鉑)的應用增加了顯著改善療效的希望，但預后仍較差，轉移癌的生存率一般仍只有大約20個月，因此，治療該疾病的需求仍遠未滿足。最近，新一代藥物_分子靶向藥物(如阿瓦斯丁(貝伐單抗)和愛必妥(西妥昔單抗))已經問世，大約有40種針對各種期別結直腸癌的化合物正處于臨床開發后期。這些化合物的幾種聯合用藥有望增加未來潛在治療方案的數量。絕大部分藥物都處于開發的第二階段，這些化合物比其他任何藥物都更多地針對促使結直腸癌發展的表皮生長因子受體(EGFR)，這是由于80%以上結直腸癌患者的EGRF表達都上調。針對II期結直腸患者使用最近批準的單克隆抗體(mAb)聯合化療(西妥昔單抗+伊立替康或F0LF0X4方案；貝伐單抗單藥或與F0LF0X4方案聯合)的臨床試驗目前正在進行。經過三至四年的觀察，預計這些試驗會得出有統計學意義的結果。目前腫瘤科所用的單克隆抗體(mAb)—般都可能不會妨礙主動免疫治療。事實上，有臨床前證據表明，用貝伐單抗去除VEGF是DC-介導的T細胞激活的積極結果。4目前，大約有16個試驗正在測試治療結直腸癌的新免疫療法的安全性和潛力。免疫治療方法是否能剌激免疫反應取決于是否存在被宿主免疫系統視為異物的抗原。發現腫瘤相關抗原的存在增加了運用宿主免疫系統干預腫瘤生長的可能性。對于癌癥免疫療法，目前正在探索控制免疫系統中的體液和細胞免疫的各種機制。細胞免疫反應的特定元素能特異性地識別和破壞腫瘤細胞。從腫瘤浸潤細胞群或外周血中分離出的細胞毒性T細胞(CTL)表明，這些細胞對癌癥的天然免疫防御中發揮了重要作用(Cheeveretal.，AnnalsN.Y.Acad.Sci.1993690:101-112;ZehHJ，Perry-LalleyD，DudleyME，RosenbergSA，YangJC;JImmunol.1999,162(2):989-94;HighavidityCTLsfortwoself—antigensdemonstratesuperiorinvitroandinvivoantitumorefficacy.)特別是CD8陽性T細胞(TCD8+)在這種反應中發揮重要作用，TCD8+能識別細胞液8至10個源自蛋白或缺損核糖體產物(DRIPS)(SchubertU，Ant6nLC，GibbsJ，NorburyCC，YewdellJW，Be皿inkJR.;Rapiddegradationofalargefractionofnewlysynthesizedproteinsbyproteasomes;Nature2000;404(6779):770-774)的殘基中載有主要組織相容性復合體(MHC)的肽中所含的I類分子。人MHC分子也稱為人白細胞_抗原(HLA)。MHC分子有兩類MHC-I類分子，大部分細胞核提呈內源性蛋白DRIPS裂解生成的肽以及較大肽的細胞上都能發現此類分子。MHC-II類分子，主要發現于專職抗原提呈細胞(APC)及其在內吞作用過程中攝取并且隨后進行加工的外源性蛋白提呈肽中。肽和MHC-I類分子的復合物由CD8陽性細胞毒性T淋巴細胞的相應TCR識別，肽和MHC-II類分子的復合物由CD4陽性輔助T細胞的相應TCR識別。CD4陽性輔助T細胞在安排抗腫瘤T細胞反應的效應子功能中發揮重要作用，因此，腫瘤相關抗原(TAA)衍生的CD4陽性T細胞表位的識別對開發能引發抗腫瘤免疫反應的藥物可能非常重要(Kobayashi，H.，R.Omiya，M.Ruiz，E.Huarte，P.Sarobe，J.J.Lasarte，M.Herraiz，B.Sangro，J.Prieto，F.Borras—Cuesta，andE.Celis.IdentificationofanantigenicepitopeforhelperTlymphocytesfromcarcinoembryonicantigen.Clin.CancerRes.2002，8:3219-3225.，Gnjatic，S.，D.Atanackovic，E.Jager:，M.Matsuo，A.Selvak咖ar，N.K.Altorki，R.G.Maki，B.D卯ont，G.Ritter，Y.T.Chen，A.K皿th，andLJ.Old.SurveyofnaturallyoccurringCD4+T_cellresponsesagainstNY_ES0_lincancerpatients-Correlationwithantibodyresponses.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2003,100(15):8862—7)CD4+TcellscanleadtolocallyincreasedlevelsofIFNy(QinZ，SchwartzkopffJ，PraderaF，KammertoensT，SeligerB，PircherH，BlankensteinT;Acriticalrequirementofinterferongamma—mediatedangiostasisfortumorrejectionbyCD8+Tcells;JCancerRes;2003，63(14):4095-4100)。哺乳動物(如小鼠)模型顯示，即使沒有細胞毒性T淋巴細胞(CTL)效應細胞(即，CD8陽性T淋巴細胞)，CD4陽性T細胞也能通過抑制干擾素_y(IFNy)分泌的血管生成從而抑制腫瘤的出現(Qin，Z.andT.Blankenstein.CD4+T—cell——mediatedtumourrejectioninvolvesinhibitionofangiogenesisthatisdependentonIFNgammareceptorexpressionbynonhematopoieticcells.Immunity.2000，12:677-686)。此夕卜，研究還顯示，CD4陽性T細胞可識別HLA-II類分子所提呈的腫瘤相關抗原中的肽，這樣可通過誘導抗體(Ab)反應而阻止腫瘤進展(Kennedy,R.C.，M.H.Shearer,A.M.Watts，andR.K.Bright.CD4+Tlymphocytesplayacriticalroleinantibodyproductionandtumourimmunityagainstsimianvirus401argetumourantigen.CancerRes.2003，63:1040-1045)。與腫瘤相關肽和HLA-I類分子相結合相比較而言，迄今只對TAA的少量II類配體有過描述(www.cancerimm皿ity.org,www.syfpeithi.de)。由于HLA-II類分子的組成性表達通常僅限于免疫系統的細胞(Mach，B.，V.Steimle，E.Martinez-Soria，andW.Reith.RegulationofMHCclassIIgenes:lessonsfromadisease.An皿.Rev.Immunol.1996，14:301-331)，因此，直接從原發月中瘤中分離II類肽被認為是不可能的事。然而，發明人最近成功地在腫瘤中直接識別了MHC-II類抗原的表位(EP1642905，EP1760088;DengjelJ，NastkeMD，GouttefangeasC，GitsioudisG，Schoor0，AltenberendF，MiillerM，KrSmerB，MissiouA，SauterM，HennenlotterJ，WernetD，StenzlA，RammenseeHG，KlingelK，Stevanovi6S.;UnexpectedabundanceofHLAclassIIpresentedpeptidesinprimaryrenalcellcarcinomas;ClinCancerRes.2006;12:4163-4170)。在沒有炎癥的情況下，MHC-II類分子的表達主要局限于免疫系統細胞，尤其是專職抗原提呈細胞(APC)，例如，單核細胞、單核細胞源性細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞。令人吃驚的是，在腫瘤患者的腫瘤細胞中發現有MHC-II類分子的表達(DengjelJ，NastkeMD，GouttefangeasC，GitsioudisG，Schoor0，AltenberendF，MiillerM，KramerB，MissiouA，SauterM，HennenlotterJ，WernetD，StenzlA，RammenseeHG，KlingelK，Stevanovi6S.;UnexpectedabundanceofHLAclassIIpresentedpeptidesinprimaryrenalcellcarcinomas;ClinCancerRes.2006;12:4163-4170)。對于觸發(引發)細胞免疫反應的肽，它必須與MHC分子結合。這一過程依賴于MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特異多態性。MHC-I類-結合肽的長度通常為8-10個氨基酸殘基，并且在其與MHC分子相應結合溝槽相互作用的序列中通常包含兩個保守殘基("錨")。這樣，每個MHC的等位基因都有"結合基序"，從而確定哪些肽能與結合溝槽特異性結合(RammenseeHG，BachmannJ，StevanovicS.MHCligandsandpeptidemotifs,LandesBioscience,USA，1997)。在MHC-I類依賴性免疫反應中，肽不僅能與腫瘤細胞表達的某些MHC-I類分子結合，而且它們還必須能被T細胞特異性T細胞受體(TCR)識別。腫瘤特異性T淋巴細胞所識別的抗原，即它們的表位，可以是源自所有類蛋白的分子，如，酶、受體、轉錄因子等。此外，腫瘤相關抗原也可以只存在于腫瘤細胞中，如突變基因產物中。另一種重要的腫瘤相關抗原是組織特異性抗原，如，表達于不同類型腫瘤和健康睪丸組織中的癌睪丸(CT)抗原。多種腫瘤相關抗原已經得到確定。此外，在識別其他腫瘤相關抗原方面也做了大量研究。有些腫瘤相關抗原，在本領域中也稱作腫瘤特異性抗原，具有組織特異性。例子包括但(不僅限于)黑色素瘤的酪氨酸酶、前列腺癌的PSA和PSMA、淋巴瘤中諸如bcr/abl的染色體交叉(易位)部位。但是，許多得到確定的腫瘤相關抗原出現于多種類型腫瘤中，有些抗原，如，實際上導致轉化事件的致癌蛋白和/或腫瘤抑制基因(腫瘤抑制基因是Linehan麗，felther匪，ZbarB關于腎癌綜述Thegeneticbasisofcancerofthekidney.JUrol.2003Dec;170(6Ptl):2163-72中所提及的)幾乎出現于所有類型腫瘤中。例如，控制細胞生長和分化的正常細胞蛋白，如P53(—種腫瘤抑制基因)、ras、c-met、myc、pRB、VHL和HER-2/neu可累積突變，導致這些基因產物的表達上調，從而致癌(McCarteyetal.CancerResearch,1998，15:582601-5;Disisetal.CibaFound.Symp.1994，187:198-211)。這些突變蛋白也可以是多種癌癥的腫瘤特異性免疫反應的一個標靶。癌癥患者免疫治療的目標是特異性激活免疫系統細胞，特別是作用于腫瘤細胞而不作用于健康組織的所謂細胞毒性T細胞(CTL，稱為"殺傷細胞"、也稱為CD8陽性T細胞)。腫瘤細胞因表達腫瘤相關蛋白而與健康細胞不同。細胞表面的HLA分子將細胞內容物提呈出細胞外，從而使細胞毒性T細胞辨別出健康細胞和腫瘤細胞。這通過把細胞內的所有蛋白分解為短肽，然后再粘附到HLA分子并提呈到細胞表面上而實現(Rammensee，HG，Falk，K，andRotzschke，0;P印tidesnaturallypresentedbyMHCclassImolecules,An皿.Rev.Immunol.，1993，11,213-244)。提呈于腫瘤細胞但在人體健康細胞上沒有或少得多的肽稱為腫瘤相關肽(TUMAP)。對于被細胞毒性T淋巴細胞識別為腫瘤特異性抗原或相關性抗原以及用于治療的蛋白質，必須具備特殊的條件。該抗原應主要由腫瘤細胞表達，而正常健康組織根本不表達或表達數量較少。此外，必要時，各個抗原不僅出現于一種腫瘤中而且濃度高(即，每細胞各種肽的拷貝數)。腫瘤特異性抗原和腫瘤相關抗原通常是源于由于細胞周期調控或凋亡等功能在正常細胞轉化為腫瘤細胞中直接受累的蛋白。另外，這些直接導致轉化的蛋白的下游靶標也可能會被上調，因此間接與腫瘤相關。這些間接腫瘤相關抗原也可能是預防接種方法的靶標。至關重要的是，在這兩種情況中，都存在抗原氨基酸序列的表位，所以這種來自腫瘤相關抗原的肽("免疫原性肽")可導致體外或體內T細胞反應。基本上，任何能與MHC分子結合的肽都可能充當一個T細胞表位。誘導體外或體內T細胞反應的前提是存在有著相應TCR的T細胞并且沒有這個特定表位的免疫耐受性。輔助T細胞在安排抗腫瘤免疫方面的CTL效應子功能中發揮著重要作用。觸發TH1類型輔助T細胞反應的輔助T細胞表位支持CD8陽性殺傷T細胞的效應功能，其中包括直接作用于腫瘤細胞的細胞毒性功能(該類腫瘤細胞表面顯示有腫瘤相關肽/MHC復合物)。這樣，單獨形式的或與其他腫瘤相關肽形成組合物的腫瘤相關T輔助細胞肽表位可作為剌激抗腫瘤免疫反應疫苗化合物的活性藥物成分。由于CD8及CD4依賴型反應共同和協同促進抗腫瘤作用，因此，CD8+CTL(MHC_I分子)或CD4陽性CTL(MHC-II類分子)對腫瘤相關抗原的識別和鑒定對開發腫瘤疫苗非常重要。因此，提出含有與任一類MHC復合物結合的肽組合物是本發明的一個目標。使用腫瘤相關肽進行的臨床試驗最初由Boon及其同事在20世紀90年代中期進行，主要適應癥為黑色素瘤。試驗的最佳臨床有效率為10%至30%。使用基于肽的疫苗單一治療的任何臨床試驗中，都未曾報告有嚴重的副作用或嚴重的自身免疫性。用黑色素瘤相關肽治療的一些患者報告有輕度的白癜風。但是，使用一種CTL通常不足以消滅所有腫瘤細胞。腫瘤具有很強的誘變性，能快速對CTL的攻擊作出反應，通過改變CTL的蛋白質模式以逃避被CTL識別。為了反擊腫瘤逃逸機制，在接種疫苗中，運用各種特異性肽。這樣，可同時使用數種CTL克隆物對腫瘤進行廣泛的同時攻擊。這可能會減少腫瘤逃避免疫反應打擊的機會。這一假設最近已經在治療晚期黑色素瘤患者的一項臨床研究中得到證實。除了少數情況之外，至少有三次不同T細胞反應的患者顯示出客觀的臨床有效率或穩定的病情(Banchereau,J，Palucka，AK，Dhodapkar，M，Burkeholder，S，Taquet，N，Rolland，A，Taquet，S，Coquery，S，Wittkowski，KM，Bhardwaj，N，Pineiro,L，Steinman，R，andFay，J;Imm皿eandclinicalresponsesinpatientswithmetestaticmelanomatoCD34(+)progenitor-deriveddendriticcellvaccine,CancerRes.，2001，61，6451-6458)以及生存期延長(與J.Banchereau私下交流結果)，但絕大多數少于三次T細胞反應的患者診斷患有進展性疾病。申請人:的一項研究顯示，當使用一種由13種不同肽組成的疫苗接種腎細胞癌患者時，得到了類似結果(H.Singh-Jasuja，S.Walter,T.Weinschenk，A.Mayer，P.Y.Dietrich,M.Staehler，A.Stenzl，S.Stevanovic，H.Rammensee，J.Frisch;CorrelationofT—cellresponse,clinicalactivityandregulatoryT-celllevelsinrenalcellcarcinomapatientstreatedwithIMA901,anovelmulti-p印tidevaccine;ASCOMeeting2007Poster#3017;M.Staehler，A.Stenzl，P.Y.Dietrich,T.Eisen，A.Haferkamp，J.Beck，A.Mayer，S.Walter,H.Singh，J.Frisch，C.G.Stief;Anopenlabelstudytoevaluatethesafetyandimm皿ogenicityofthepeptidebasedcancervaccineIMA901，ASC0meeting2007;Poster#3017)。因此，開發一種腫瘤疫苗的主要任務不僅要識別和鑒定新型腫瘤相關抗原及其免疫原T輔助表位，而且還要組合不同抗原表位以增加每位患者對一種以上表位產生反應的可能性。因此，本發明的一個目標是提出有能力與人主要組織相容性復合體(MHC)I(HLA-I)或II(HLA-II)類分子結合的肽氨基酸序列的組合物。本發明的另一目標是提出一種基于肽組合物的有效抗癌疫苗。在本發明中，發明人分離和描述與直接來自于哺乳動物結直腸癌等腫瘤中的HLA-I或II類分子結合的肽。本發明提出了這樣的肽它們來源于致瘤相關抗原并且有能力與MHC(HLA)-II類分子充分結合，觸發人白細胞免疫反應，特別是淋巴細胞、T淋巴細胞、CD4陽性T淋巴細胞、介導Thl型免疫反應的CD4陽性T淋巴細胞。本發明還提出了這樣的肽它們來源于致瘤相關抗原，并且有能力與MHC(HLA)-I類分子充分結合，觸發人白細胞免疫反應，特別是淋巴細胞、T淋巴細胞、CD8陽性細胞毒性T淋巴細胞以及對癌癥患者接種疫苗有益的兩種肽的組合物。根據本發明，其目標通過這樣方式達成提供了一種至少有兩種肽組成的藥物組合物，這兩種肽含有從SEQIDNOl至SEQIDNO7組成的基團中所選的氨基酸序列、和/或含有與SEQIDNOl至SEQIDNO7組成的基團80%同源的一個變異氨基酸序列，和/或含有編碼為SEQIDNOl至SEQIDNO7核酸的多聚核苷酸或變異氨基酸序列，以及藥用載體。同時，本發明的藥物組合物還可包括至少這樣的一種額外的肽它含有從SEQIDNO8至SEQIDNO15組成的基團中所選的氨基酸序列、或含有與SEQIDNO8至SEQIDNO15組成的基團80X相同的一個變異氨基酸序列，或含有編碼為SEQIDNO8至SEQIDNO15核酸的多聚核苷酸或變異氨基酸序列。這些肽的總長度可為8至100個氨基酸、優選為8至30個氨基酸，最優選為8至16個氨基酸。這些肽也可含有非肽鍵。如下文所述，構成本發明基礎的肽都被確定為MHC-I類或II類承載細胞所提呈的肽。因此，這些特殊肽以及其他含有序列的肽(即衍生肽)都能引發特異性T細胞反應，雖然其誘導的反應程度可能會因不同的肽和患者而不同。差異可能因肽的突變等原因造成。本領域技術人員熟知可應用于確定各個肽誘導反應程度的方法，特別是參照本文實施例和有關文獻后。優選情況是，發明中的變體可誘導T細胞與發明中各個肽發生交叉反應。肽氨基酸序列或編碼肽的核酸序列及變體間的同源比例可運用本領域已知的算法計算。本發明中，"同源性"一詞是指兩個氨基酸序列之間的同一度，如肽或多肽序列。前文所述的"同源"是通過將理想條件下調整的兩個序列與待比較序列進行比對后確定的。此處要比對的氨基酸或核酸序列在兩個序列最佳排列中可能有增加或刪除(例如，序列缺口等)。此類序列同源性可通過使用ClustalW等算法創建一個排列而進行計算(NucleicAcidRes.，22(22):46734680(1994)。可用使用一般序列分析軟件，更具體地說，是VectorNTI、GENETYX或由公共數據庫，如htto:〃restools.sdsc.edu/biotools/biotoolsl6.himi提供的分析工具。藥用載體通常是已熟知的液體，可配制其中的一種有效治療劑制。劑型中的載體雖然可能具有化學和/或生物穩定性、釋放特性等等，但是一般不具備任何藥理活性。典型配方可在諸如AlfonsoR.Ge皿aro.Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,20thEditionBaltimore，MD:LippincottWilliams&Wilkins，2000等書籍中找至lj，包括(但不限于)鹽水、水、緩沖水、0.3%甘氨酸、透明質酸、葡萄糖等。最近，人們發現在人類患者中用作靜脈營養很多年的某些脂肪乳劑也可充當一種肽賦形劑。有兩種此類乳劑已用作商用脂肪乳劑，名叫Intralipid、Lipofundin。〃Intralipid〃是瑞典KabiPharmacia公司一種靜脈營養脂肪乳劑的注冊商標，美國專利號為3169094。〃Intralipid〃是德國B.BraunMelsungen公司的注冊商標。兩者均包含大豆油脂肪(1000蒸餾水中含100或200克即含量分別為10%或20%)。Intralipid中卵黃磷脂用作乳化劑(12g/l蒸餾水)，Lipof皿din中蛋黃卵磷脂用作乳化劑(12g/l蒸餾水)。Intralipid和Lipof皿din的等滲性均是在它們中加入甘油(25g/l)的結果。肽來源于腫瘤相關抗原，特別是具有蛋白酶解、血管生成、細胞生長、細胞周期調控、細胞分裂、轉錄調控、翻譯調控、組織浸潤等功能的腫瘤相關抗原。表1描述了這些肽及生成這些肽的蛋白的功能。表1:本發明中的肽及其親本蛋白的功能序列ID號肽ID序列基因符號功能與MHC結合1C20-001ALSNLEVTLC20orf42連接肌動蛋白細胞骨架和ECMHLA-A*022N0X-001ILAPVILYIN0X1NADra氧化酶HLA-A*029<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>20號染色體開放閱讀框42C20orf42是參與肌動蛋白細胞骨架附著到細胞質膜和整合素介導細胞過程的粘著斑蛋白。C20orf42缺失會導致喪失功能的突變，從而引起Kindler綜合癥，它是一種常染色體隱性遺傳性皮膚病，其特點是皮膚起泡、逐步萎縮、對光敏感，偶爾也能致癌(Herz，C，Aumailley，M，Schulte，C，Schlotzer—Schrehardt，U，Bruckner—Tuderman，L，andHas，C;Kindlin-lisaphosphoproteininvolvedinregulationofpolarity,proliferation,andmotilityofepidermalkeratinocytes，JBiolChem.，2006，281，36082-36090)。最近，一名患有功能喪失突變的患者報告有嚴重的胃腸道疾病并伴出血性腸炎(Sadler,E，Klausegger，A，Muss，W，Deinsberger，U，Pohla_Gubo，G，Laimer，M，Lanschuetzer，C，Bauer，JW，andHintner，H;NovelKINDlgenemutationinKindlersyndromewithseveregastrointestinaltractinvolvement,Arch.Dermatol.，2006，142，1619-1624)。在癌癥方面，關于癌癥相關基因表達的研究已對C20orf42進行了描述。結果發現，接受檢查的70%結腸癌和60%肺癌(n=10)中C20orf42表達過量。NorthernBlot法檢測顯示，正常組織表達僅限于神經肌肉組織(Weinstein，EJ，Bourner，M，Head，R，Zakeri，H，Bauer，C，andMazzarella，R;URP1:amemberofanovelfamilyofPHandFERMdomain—containingmembrane—associatedproteinsissignificantlyover—expressedinlungandcoloncarcinomas,Biochim.Biophys.Acta,2003，1637，207-216)。此夕卜，C20orf42已被確定為參與TGF-0介導的細胞遷移和腫瘤浸潤的一種基因(Kloeker，S，Major,MB，Calderwood，DA，Ginsberg,MH，Jones，DA，andBeckerle，MC;TheKindlersyndromeproteinisregulatedbytransforminggrowthfactor—betaandinvolvedinintegrin-mediatedadhesion,J.Biol.Chem.，2004，279，6824-6833)。NADPH氧化酶同源物_1(N0X1)N0X1是一種對生長因子有反應的酶，催化生成活性氧超氧化物(02-)和過氧化氫(H202)。其表達最初發現于結腸、前列腺、子宮和增殖的血管平滑肌細胞中(Suh，Y.A.etal.Celltransformationbythesuperoxide—generatingoxidaseMoxl.Nature1999,401,79-82)。它的表達與細胞增殖、血管生成、細胞信號通路激活等生物反應次數相關(Harper,R.W.，Xu，C.，Soucek，K.，Setiadi，H.andEiserich，J.P.AreappraisalofthegenomicorganizationofhumanNoxlanditssplicevariants.Arch.Biochem.Biophys.2005，435，323-330)。N0X1在結腸中高表達，但其在結腸生理或病理學中的功能仍然知之甚少。在正常組織中，N0X1在回腸中表達低，在右結腸中表達中等，在左結腸中表達高。N0X1在腺瘤、高分化或低分化結腸腺癌樣本中的表達沒有統計學差異。N0X1在結腸上皮細胞的隱窩內和腔表面均呈高表達。總之，N0X1是組成型表達于結腸上皮細胞并與致瘤不直接相關的一種酶(Szanto，I.etal.ExpressionofNOXl，asuperoxide-generatingNADPHoxidase,incoloncancerandinflammatoryboweldisease.JPathol.2005，207，164-176)。免疫組織化學表明，N0X1組成型表達于表面粘液細胞。腺瘤和高分化腺癌上調N0X1表達。核因子(NF)-KB主要在N0X1表達豐富的腺瘤和腺癌細胞中被激活，這表明N0X1可在結腸腫瘤中剌激NF-KB依賴型抗凋亡途徑(Fukuyama，M.etal.Overexpressionofanovelsuperoxide—producingenzyme,NADPHoxidase1，inadenomaandwelldifferentiatedadenocarcinomaofthehumancolon.CancerLett.2005，221，97-104)。Wnt3a/P-Catenin信號傳導被描述為可誘導N0X1表達(Petropoulos，H.&Skerjanc，I.S.Beta_cateninisessentialandsufficientforskeletalmyogenesisinP19cells.JBiolChem.2002，277，15393-15399)。最近，活性氧分子表明可誘導內皮細胞凋亡，隨后可誘導各種腫瘤細胞粘附分子的表達。這表明，通過阻止R0S的生成而預防腫瘤遠處復發是可行的(Ten,KM，vanderWal，JB，Sluiter，W，Hofland，LJ，Jeekel，J，So皿eveld，P，andvanEijck，CH;Theroleofsuperoxideanionsinthedevelopmentofdistanttumourrecurrence,2006，Br.JCancer，)。鳥氨酸脫羧酶1(0DC1)0DC1是將鳥氨酸催化為腐胺的多胺生物合成途徑的限速酶。該限速酶的活性水平根據對生長促進性剌激的反應而不同，與其他哺乳動物蛋白質相比，表現出較高的周轉率。多胺代謝是上皮組織癌變機制的組成部分。0DC1增加往往與正常細胞開始生長以及腫瘤細胞持續生長相關。實驗模型中，0DC1抑制劑可抑制膀胱癌、乳腺癌、結腸癌和皮膚癌的形成。0DC1活性的過度表達是許多癌癥的公認特點，0DC1已被視作一種原癌基因(Auvinen，M.，Paasinen，A.，Andersson，LC.andHoltta，E.Ornithinedecarboxylaseactivityiscriticalforcelltransformation.Nature1992，360，355-358)。結腸腺瘤樣息肉(APC)基因的胚系突變是結腸癌最明確的遺傳因素之一。APC突變導致游離P-catenin水平大幅增高并進入細胞核，在那里，與序列特異性轉錄因子中的淋巴增強因子(LEF)/T細胞因子(TCF)家族成員形成一種復合物。c-myc癌基因是一禾中Tcf革巴向基因(He，T.C.etal.Identificationofc—MYCasatargetoftheAPCpathway(Science281，1509-1512(1998)。c-MycRNA和蛋白在結直腸腫瘤癌變早期和晚期都過量表達)。ODC是一種c-Myc耙向基因。APC功能喪失可導致0DC1上調(Gerner，EWandMeyskens，FL，Jr.，Polyaminesandcancer:oldmolecules,newunderstanding,Nat.Rev.Cancer,2004，4，781-792)，結直腸癌中經常可觀察到過量表達(Hu，H.Y.etal.Ornithinedecarboxylasegeneisoverexpressedincolorectalcarcinoma，WorldJ.Gastroenterol.2005，11，2244—2248;Kitahara，0.etal.AlterationsofgeneexpressionduringcolorectalcarcinogenesisrevealedbycDNAmicroarraysafterlaser—c即turemicrodissectionoftumortissuesandnormal印ithelia;CancerRes.2001，61，3544—3549;Nemoto，T.，Kubota，S.，Ishida，H.，Murata，N.andHashimoto,D.Ornithinedecarboxylase,mitogen—activatedproteinkinaseandmatrixmetalloproteinase—2expressionsinhumancolontumors.WorldJ.Gastroenterol.2005，11，3065-3069)。0DC1充當血管內皮抑制素的抑制劑，具有促進血管生成的特性(Nemoto，T.，Hori，H.，Yoshimoto，M.，Seyama，Y.&Kubota，S.Overexpressionofornithinedecarboxylaseenhancesendothelialproliferationbysuppressingendostatinexpression.Blood2002,99，1478-1481)。結直腸癌細胞株HT-29感染0DCl和S-腺苷蛋氨酸脫羧酶(另一重要多胺生物合成途徑酶)的腺病毒編碼的反義RNA可導致CCND1下調和細胞周期阻滯。此外，P-catenin的核轉位也受到了抑制(Gong，L，Jiang，C，Zhang，B，Hu，H，Wang，W，andLiu，X;Adenovirus—mediatedExpressionofBothAntisenseOrnithineDecarboxylaseandS_adenosylmethionineDecarboxylaselnducesG(l)ArrestinHT-29Cells，JBiochem.Mol.Biol，2006，39，730-736)。腺病毒也誘導裸鼠腫瘤的消退(Zhang，B，Liu，XX，Zhang，Y，Jiang，CY，Hu，HY，Gong，L，Liu，M，andTeng，QS;Polyaminedepletionby0DC_AdoMetDCantisenseadenovirusimpairshumancolorectalcancergrowthandinvasioninvitroandinvivo，2006，JGeneMed，8，980-989)。0DC1的特異性不可逆轉性抑制劑為2-二氟甲基鳥氨酸(DMFO，Eflornithine(Sanofi-Aventis公司))。它作為昏睡病(由錐蟲引起)的治療方法而推廣，并且是脫毛霜Vaniqa的活性成分。在癌癥方面，DMF0已被廣泛用于臨床前模型中，并通過降低多胺水平而顯示出有希望的抗月中瘤作用(Gerner，EWandMeyskens，FL，Jr.;Polyaminesandcancer:oldmolecules,newimderstanding,Nat.Rev.Cancer,2004，4，781—792)。對于多個癌禾中已經進行了臨床試驗，而針對結直腸癌的一些試驗目前正在進行中。但是，這些研究大多數針對容易演變為結直腸癌(腺瘤息肉)患者，采取預防組合方法。免疫原性ODC肽(ODC-001)先前已得到確定(M.Diehl，PhDThesis,UniversityofTubingen,1998)增殖細胞核抗原(PCNA)PCNA發現于細胞核中，是DNA聚合酶S的輔助因子。編碼蛋白質充當一個同源三聚體，幫助提高DNA復制過程中前導鏈的持續合成能力。因此，它在所有增殖細胞尤其是腫瘤細胞中表達，用作檢測增殖的標志物。PCNA免疫組化分析中定義的腫瘤及其鄰近正常粘膜的增殖指數很久以前就被認為是結直腸癌患者復發和生存期差的獨立預測因素(al-Sheneber，IF，Shibata，HR，Sampalis，J，andjothy，S;Prognosticsignificanceofproliferatingcellnuclearantigenexpressionincolorectalcancer,Cancer,1993，71，1954—1959;Mayer，A，Takimoto，M，Fritz，E，Schellander，G，Kofler，K，andLudwig，H;Theprognosticsignificanceofproliferatingcellnuclearantigen,epidermalgrowthfactorrec印tor，andmdrgeneexpressionincolorectalcancer,Cancer,1993，71，2454-2460;Nakamura，T，Tabuchi，Y，Nakae，S，0hno，M，andSaitoh,Y;Se進carcinoembryonicantigenlevelsandproliferatingcellnuclearantigenlabelingindexforpatientswithcolorectalcarcinoma.Correlationwithtumorprogressionandsurvival,Cancer，1996，77，1741-1746)。DNA拓撲異構酶II(T0P2)T0P2A和T0P2B編碼一種DNA拓撲異構酶的異形體，這種酶能夠控制和改變轉錄過程中DNA的拓撲狀態。這種核酶參與諸如染色體凝集、染色單體分離以及減輕DNA轉錄和復制過程中產生的扭轉應力等過程。它可催化兩個雙鏈DNA的短暫斷裂和重新連接，這使得DNA鏈可穿過對方，從而改變DNA的拓撲結構。這種酶的兩種異構體可能以基因復制產物的形式存在。該基因編碼的a形式位于17號染色體處，13基因位于3號染色體處。T0P2A是幾種抗癌藥物的耙標，這個基因的各種突變都可導致出現耐藥。T0P2A基因與HER-2癌基因(最常見的乳腺癌擴增癌基因)相鄰，位于染色體位置17ql2-q21處，其擴增或刪除頻率在幾乎90%的HER-2擴增原發性乳腺腫瘤中都相等(Jarvinen，TAandLiu，ET;TopoisomeraseIIalphagene(T0P2A)amplificationanddeletionincancer__morecommonthananticipated,Cytopathology，14，309-313)。另夕卜，其他癌癥也報告了有T0P2A擴增。最近的實驗以及很多大型的多中心試驗表明，T0P2A擴增(和/或刪除)可證明該基因對常用細胞毒藥物敏感或耐藥，如對拓撲異構酶II抑制劑(蒽環類藥物等)(Kellner，U，Sehested，M，Jensen,PB，Gieseler，F，andRudolph,P;Culpritandvictim—DNAtopoisomeraseII，LancetOncol.，2002，3，235-243)，這取決于T0P2A處的具體基因缺陷(Jarvi體，TAandLiu，ETSimultaneousamplificationofHER-2(ERBB2)andtopoisomeraseIIalpha(T0P2A)genes__molecularbasisforcombinationchemotherapyincancer,Curr.CancerDrugTargets.，2006，6，579-602)。沒有T0P2ADNA復制和細胞分裂是不可能的。因此，它成為了眾多抗癌治療方案的主要靶標，即使殺傷細胞的確切機制仍難以解釋(Kellner，U，Sehested，M，Jensen,PB，Gieseler，F，andRudolph,P;Culpritandvictim__DNAtopoisomeraseII，LancetOncol.，2002，3，235-243)。這種方法的成功與否受到自發耐藥性的限制，藥物引起的DNA損傷可增加腫瘤的惡性程度。T0P2B是T0P-001的第二種潛在源蛋白，由于其位于染色體區域(3p24)中，是否在腫瘤中頻繁擴增尚不清楚，因此，癌癥研究中還沒有得到過多關注。但是，T0P2B與T0P2A的主要結構類似，并與其具有幾乎相同的催化性能(Leontiou，C，Lightowlers，R，Lakey，JH，andAustin，CA;KineticanalysisofhumantopoisomeraseIIalphaandbetaDNAbindingbysurfac印lasmonresonance,FEBSLett.，2003，554，206-210)。另一項研究中也顯示這兩個異構體可以相互替代(Sakaguchi，AandKikuchi，AfunctionalcompatibilitybetweenisoformalphaandbetaoftypeIIDNAtopoisomerase,JCellSci.，2004，117，1047-1054)。本發明中，發明人提出了確鑿的證據表明，腫瘤相關肽與HLA-I類分子充分結合能引發人CD8陽性細胞毒性T淋巴細胞介導的免疫反應，同時也證明了權利要求中的肽適合觸發人免疫系統對腫瘤細胞多肽組選定的肽發生反應。同樣地，我們發現腫瘤相關肽與HLA-II類分子充分結合，尤其是與人基因組HLADR位點編碼的HLA-II類等位基因結合，能夠引發人CD4陽性T細胞介導的免疫反應。CD4陽性T細胞從人外周血中分離，這表明權利要求中的肽適合觸發人免疫系統對腫瘤細胞多肽組選定的肽發生反應。下面所列舉的肽TGFBI-004(與HLA-DR結合腫瘤相關肽)發現可被CD4陽性T細胞識別。由于肽可化學合成，并可用作藥物制劑的藥用活性成分，因此，本發明提出的肽可用于免疫治療，優選為癌癥免疫治療。另一方面，該藥物組合物包括至少另外一種肽，這種肽含有從SEQIDNO8至SEQIDN015組成的基團中所選的一個氨基酸序列、或含有與SEQIDNO8至SEQIDNO15組成的基團至少80%同源的一個變異氨基酸序列，或含有編碼為SEQIDNO8至SEQIDNO15核酸的多聚核苷酸或變異氨基酸序列。含SEQIDNO8至SEQIDNO13以及SEQIDNO15序列的肽是之前確定的并與MHC-I類和MHC-II類分子結合的免疫原性肽(見表2)。這些肽顯示可引發腎細胞癌(RCC)患者的體內T細胞反應(H.Singh-Jasuja，S.Walter,T.Weinschenk，A.Mayer，P.Y.Dietrich,M.Staehler，A.Stenzl，S.Stevanovic，H.Rammensee，J.Frisch;CorrelationofT—cellresponse,clinicalactivityandregulatoryT—celllevelsinrenalcellcarcinomapatientstreatedwithIMA901,anovelmulti-peptidevaccine;ASCOMeeting2007Poster#3017;M.Staehler，A.Stenzl，P.Y.Dietrich,T.Eisen，A.Haferkamp，J.Beck，A.Mayer，S.Walter,H.Singh，J.Frisch，C.G.Stief;Anopenlabelstudytoevaluatethesafetyandimm皿ogenicityofth印印tidebasedcancervaccineIMA901，ASCOmeeting2007;Postert3017)。由于親本蛋白質不僅在腎細胞癌中，而且在結直腸癌以及其他類型癌癥中過量表達，因此這些肽也可用于治療其他癌種的疫苗中，特別是抗結直腸癌疫苗中。表2:本發明組合物中其他有用的免疫原性肽序列ID號肽ID序列基因符號功能與MHC結合8CEA-006SPQYSWRINGIPQQHTCEACAM5癌胚抗原HLA-DR9CCN-001LLGATCMFVCCND1細胞周期蛋白DlHLA-A*0210MUC-001STAPPVHNVMUC1粘蛋白1HLA-A*0211MMP-001SQDDIKGIQKLYGKRS麗P7金屬蛋白酶7HLA-DR12CEA-005YLSGADLNLCEACAM5CEA肽變體HLA-A*0213MET-001YVDPVITSIMETMet原癌基因HLA-A*0214(,-001)FLPSDFFPSV控制肽14<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>癌胚抗原相關細胞粘附分子5癌胚抗原(CEA=CEACAM5)是一種分子量為180kDa的高度糖基化膜蛋白分子，由三個C2Ig樣重復單元組成，兩側含有一個N-端IgV樣區域和一個C-端區域，其中包括糖磷月旨酰肌醇連接區域(Hegde，P，Qi，R，Gaspard，R，Abernathy，K，Dharap，S，Earle-Hughes，J，Gay，C，Nwokekeh，NU，Chen，T，Saeed，AI，Sharov，V，Lee，NH，Yeatman，TJ，andQuackenbush，Jsldentificationoftumourmarkersinmodelsofhumancolorectalcancerusinga19，200-elementcomplementaryDNAmicroarray，CancerRes.，2001，61，7792-7797)。癌胚抗原CEA在胎兒發育過程中表達，但是在成人胃腸道上皮中表達低。但是，CEA在人腫瘤中有較高比例的過量表達，其中包括90X的胃腸道癌、結直腸癌和胰腺癌，70%的非小細胞肺癌細胞和50%的乳腺癌(Thompson,JA，Grunert，F，andZimmermann，W;Carcinoembryonicantigengenefamily:molecularbiologyandclinicalperspectives,JClinLabAnal.，5，)。由于CEA在腫瘤細胞中表達并向血清中分泌，因此，CEA已被廣泛用作腫瘤標志物(Sikorska，H，Shuster，J，andGold,PsClinicalapplicationsofcarcinoembryonicantigen,CancerDetect.Prev.，12，)，并作為監測結直腸癌的標準血清標志物(Locker，GY，Hamilton,S，Harris,J，Jessup，肌Kemeny，N，Macdonald，JS，Somerfield，MR，Hayes，DF，andBast，RC，Jr.;ASCO2006updateofrecommendationsfortheuseoftumourmarkersingastrointestinalcancer,JClinOncol，24，5313-5327，2006)。盡管CEA在腫瘤細胞中過量表達，但是癌癥患者通常對這種抗原并未表現出免疫反應(0refice，S，Fossati，G，Pietrojusti，E，andBonfanti，G;Delayedcutaneoushypersensitivityreactiontocarcinoembryonicantigenincancerpatients,Tumouri，1982,68,473-475，)。由于CEA—般在體內表達水平低，因此免疫系統通常對其具有耐受性。但是，在一系列臨床疫苗試驗中，CEA的免疫原性已得到證明(Sarobe，P，Huarte，E，Lasarte，JJ，andBorras—Cuesta，F;Carcinoembryonicantigenasatargettoinduceanti—tumourimmuneresponses,Curr.CancerDrugTargets.，2004，4，443-454)，特別是結直腸癌(CRC)(Mosolits，S，Ullenhag，G，andMellstedt，H;Therapeuticvaccinationinpatientswithgastrointestinalmalignancies.Areviewofimmunologicalandclinicalresults，Ann.Oncol.，2005，16，847-862)，并且CEA是這種癌種試驗中在最多疫苗平臺上得到測試的腫瘤相關抗原(TAA)(vonMehren，M^Colorectalcancervaccines:whatweknowandwhatwedon'tyetknow,Semin.Oncol.，2005，32，76-84)。CEA的幾種細胞毒性和輔助T細胞表位已進行了描述(Crosti，M，Longhi，R，Consogno，G，Melloni，G，Zannini，P，andProtti，MP;IdentificationofnovelsubdominantepitopesonthecarcinoembryonicantigenrecognizedbyCD4+T_cellsoflungcancerpatients,JImmunol.，2006，176，5093—5099;Novellino，L，Castelli，C，andParmiani，G;AlistingofhumantumourantigensrecognizedbyT—cells:March2004update，CancerImmunol.Immunother.，2004，54，187-207;Ruiz，M，Kobayashi，H，Lasarte，JJ，Prieto，J，Borras—Cuesta，F，Celis，E，andSarobe，P;IdentificationandcharacterizationofaT—helperpeptidefromcarcinoembryonicantigen,ClinCancerRes.，2004，10，2860-2867)，這使得各種以肽為基礎的結直腸癌免疫試驗成為可會g(Babatz，J，Rollig，C，Lobel，B，Folprecht，G，Haack，M，Gunther，H，Kohne，CH，Ehninger，G，Schmitz，M，andBornhauser，M;Inductionofcellularimmuneresponsesagainstcarcinoembryonicantigeninpatientswithmetastatictumoursaftervaccinationwithalteredpeptideligand-loadeddendriticcells,Cancerlmm皿ol.Immunother.，2006，55，268_276;Fong，L，Hou，Y，Rivas，A，Benike，C，Yuen，A，Fisher，GA，Davis，MM，andEngleman，EG;AlteredpeptideligandvaccinationwithFlt3ligandexpandeddendriticcellsfortumourimmunotherapy,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，2001，98，8809-8814;Liu，KJ，Wang，CC，Chen，LT，Cheng，AL，Lin，DT，Wu，YC，Yu，WL，Hung，YM，Yang，HY，Juang，SH，andWhang—Peng,J^Generationofcarcinoembryonicantigen(CEA)-specificT-cellresponsesinHLA_A*0201andHLA_A*2402late_stagecolorectalcancerpatientsaftervaccinationwithdendriticcellsloadedwithCEAp印tides，ClinCancerRes.，2004，10，2645-2651;Matsuda，K，Tsunoda，T，Tanaka，H，Umano，Y，Tanimura，H，Nukaya，I，Takesako，K，andYamaue，H^EnhancementofcytotoxicT_lymphocyteresponsesinpatientswithgastrointestinalmalignanciesfollowingvaccinationwithCEApeptide—pulseddendriticcells,CancerImmunol.Immunother.，2004，53，609—616;Ueda，Y，Itoh，T，Nukaya，I，Kawashima，I，0kugawa，K，Yano，Y，Yamamoto，Y，Naitoh，K，Shimizu，K，Imura，K，Fuji,N，Fujiwara，H，Ochiai，T，Itoi，H，Sonoyama，T，Hagiwara，A，Takesako,K，andYamagishi，H;Dendriticeel1—basedimmunotherapyofcancerwithcarcinoembryonicantigen—derived,HLA_A24_restrictedCTLepitope:Clinicaloutcomesof18patientswithmetastaticgastrointestinalorlungadenocarcinomas,Int.JOncol.，2004，24，909—917;Weihrauch，MR，Ansen，S，Jurkiewicz，E，Geisen，C，Xia，Z，Anderson,KS，Gracien，E，Schmidt，M，Wittig，B，Diehl，V，Wolf，J，Bohlen，H，andNadler，LM;PhaseI/IIcombinedchemoimmunotherapywithcarcinoembryonicantigen—derivedHLA_A2_restrictedCAP_1peptideandirinotecan，5_fluorouracil，andleucovorininpatientswithprimarymetastaticcolorectalcancer,ClinCancerRes.，2005，11，5993-6001)。至lj目前為止，上述試驗以及其他臨床試驗已經證實了CEA接種的安全性并提供了誘導這種抗原免疫反應的證據(vonMehren，M;Colorectalcancervaccines:whatweknowandwhatwedon'tyetknow,Semin.Oncol.，2005，32，76-84)。CEA—006的變禾中在先前已經公布(Ruiz，M，Kobayashi，H，Lasarte，JJ，Prieto，J，Borras_Cuesta，F，Celis，E，andSarobe，P;IdentificationandcharacterizationofaT_helperpeptidefromcarcinoembryonicantigen,ClinCancerRes.，2004，10,2860-2867)。CEA-005是進行單個氨基酸交換的變種，已報告能克服中樞免疫耐受性(Zaremba，S，Barzaga，E，Zhu，M，Soares，N，Tsang，KY，andSchlom，JidentificationofanenhanceragonistcytotoxicTlymphocytep印tidefromhumancarcinoembryonicantigen,CancerRes.，1997，57，4570-4577)。轉化生長因子13誘導的(TGFBI)基因TGFBI最先被認定為人肺腺癌細胞株的TGF_P誘導基因。它能編碼分泌出的細胞外基質蛋白，該蛋白被認為作用于細胞粘附物和細胞外基質成分。TGFBI是一種結直腸癌中升高最為明顯的基因，也在腺瘤中高表達。定量PCR結果顯示，它在未純化的和純化的腫瘤上皮細胞中均大大升高。因此，原位雜交實驗表明，TGFBI在基質和上皮細胞等多種細胞類型中表達(Buckhaults，P，Rago，C，St，CB，Romans,KE，Saha，S，Zhang，L，Vogelstein，B，andKinzler，KW;Secretedandcellsurfacegenesexpressedinbenignandmalignantcolorectaltumours,CancerRes.，2001，61，6996-7001)。在一次對結直腸癌基因表達研究進行的薈萃分析中，TGFBI被確認為9個基因中唯一的一個不斷上調的基因(TGFBI的4個研究)(Shih，W，Chetty，R，andTsao，MS;Expressionprofilingbymicroarraysincolorectalcancer,Oncol.Rep.，2005，13，517-524)。在人胰腺癌組織中，TGFBImRNA水平比正常對照組織中增加32.4倍。原位雜交分析結果顯示，TGFBImRNA主要表達于胰腺腫瘤中的癌細胞(Schneider,D，Kleeff，J，Berberat，P0，Zhu，Z，Korc，M，Friess，H，andBuchler，麗；Inductionandexpressionofbetaig-h3inpancreaticcancercells,Biochim.Biophys.Acta,2002，1588，1_6)。在體外模型中，TGFBI被確定為一種促血管生成基因。此外，在另外幾種腫瘤中，檢測到TGFBI表達顯著增強。TGFBI的反義寡核苷酸既阻止體外基因表達又阻止體外內皮細胞管形成，這表明TGFBI可在內皮細胞基質的相互作用中發揮著關鍵作用(Aitkenhead，M，Wang，SJ，Nakatsu，MN，Mestas，J，Heard,C，andHughes,CCidentificationofendothelialcellgenesexpressedinaninvitromodelofangiogenesis-inductionofESM-l，(beta)ig-h3，andNrCAM，Microvasc.Res.，2002，63，159—171)。粘蛋白-l(MUCl)粘蛋白是高分子量上皮糖蛋白，與富含蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸的串聯重復肽0-型糖苷連接的簇生寡糖含量高。根據結構和功能，有類粘蛋白跨膜粘蛋白(MUCl屬于該類蛋白)和分泌型凝膠形成粘蛋白。結腸癌粘蛋白在作為診斷及預后標志物以及癌癥疫苗的靶標時，其碳水化合物結構有所不同。MUC1蛋白的細胞外區由20種氨基酸高度保守的重復序列組成，實際重復次數為25至100不等，取決于等位基因。每個串聯重復序列包含5個潛在的糖基化位點，在蘇氨酸和絲氨酸二聯體之間有一個免疫優勢區，包含各種抗MUC1抗體識別的表位(Taylor-Papadimitriou，J，Burchell，J，Miles，DW，andDalziel，M;MUClandcancer,Biochim.Biophys.Acta,1999，1455，301-313)。與大多數其他上皮細胞相比，結腸的MUC1糖基化程度更高，從而掩蓋了MUC1特異性抗體對MUC1蛋白的免疫組化染色。在結直腸癌中，MUC1糖基化程度較低，可進行免疫檢測。異常糖基化MUC1具有新的結合特性，能同時介導和阻止與具有某些分子特異性的粘附分子結合，從而在腫瘤細胞的轉移擴散中扮演著雙重角色(McDermott，KM，Crocker,PR，Harris,A，Burdick，MD，Hinoda，Y，Hayashi，T，Imai，K，andHollingsworth，MA;OverexpressionofMUClreconfiguresthebindingpropertiesoftumorcells,Int.JCancer,2001,94,783-791)。免疫學檢測顯示，MUCl在結腸癌中表達增加，與較差的預后相關(Byrd，JCandBresalier，RS;Mucinsandmucinbindingproteinsincolorectalcancer,CancerMetastasisRev.，2004，23，77-99)，這表明結直腸癌的進展可能與MUCl的上調有關。轉移結腸癌比無轉移者MUC1的表達更高(Nakamori，S，0ta，DM，Cleary，KR，Shirotani，K，andIrimura，T;MUClmucinexpressionasamarkerofprogressionandmetastasisofhumancolorectalcarcinoma,Gastroenterology,1994，106，353-361)，并且一項石開究顯示，MUC1染色在所有累及肝臟的結直腸癌中均呈陽性(Matsuda，K，Masaki，T，Watanabe，T，Kitayama，J，Nagawa，H，Muto，T，andAjioka，Y;ClinicalsignificanceofMUClandMUC2mucinandp53proteinexpressionincolorectalcarcinoma，Jpn.JClinOncol.，2000，30，89-94)。最近針對462名結直腸患者的一項研究發現，MUCl表達是預后差的一個獨立指標(Duncan，TJ，Watson，NF，Al-Attar，AH，Scholefield，JH，andDurrant，LG;TheroleofMUClandMUC3inthebiologyandprognosisofcolorectalcancer,WorldJSurg.0ncol，2007，5，31)。結直腸癌中的循環型抗MUC1抗體具有病理生理學意義31名健康受試者中有5名檢測出有抗MUCl抗體(16.1%)和56名結直腸患者中有27名檢測出有抗MUC1抗體(48.2%)(Nakamura，H，Hinoda，Y，Nakagawa，N，Makiguchi，Y，Itoh，F，Endo，T，andImai，K^Detectionofcirculatinganti—MUClmucincoreproteinantibodiesinpatientswithcolorectalcancer,JGastroenterol.，1998，33，354-361)。除了作為抗體靶標，MUCl還是細胞毒性T細胞的大家接受的靶標。數份報告表明，卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌以及多發性骨髓瘤的細胞毒性MHC非限制性T細胞可識別串聯重復序列中的MUC1蛋白核的表位(Apostolopoulos,VandMcKenzie，IF;Cellularmucins:targetsforimmunotherapy,CritRev.Immunol.，1994，14，293—309;Finn,0J，Jerome,KR，Henderson,RA，Pecher，G，Domenech，N，Magarian—Blander，J，andBairatt—Boyes，SM;MUC-lepithelialtumormucin—basedimmunityandcancervaccines,Immunol.Rev.，1995，145，61—89;Barnd，DL，Lan，MS，Metzgar，RS，andFi皿，0J;Specific，majorhistocompatibilitycomplex—unrestrictedrecognitionoftumor—associatedmucinsbyhumancytotoxicTcells,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，1989，86，7159_7163;Takahashi，T，Makiguchi，Y，Hinoda，Y，Kakiuchi，H，Nakagawa，N，Imai，K，andYachi，A^ExpressionofMUClonmyelomacellsandinductionofHLA_unrestrictedCTLagainstMUClfromamultiplemyelomapatient,J.Immunol.，1994，153，2102-2109;Noto，H，Takahashi，T，Makiguchi,Y，Hayashi，T，Hinoda，Y，andImai，K^CytotoxicTlymphocytesderivedfrombonemarrowmononuclearcellsofmultiplemyelomapatientsrecognizeanunderglycosylatedformofMUClmucin,Int.Immunol.，1997，9，791-798)。但是來自MUCl蛋白的HLA-A氺02限制性T細胞表位也得至Ll石角認(Apostolopoulos,V，Karanikas，V，Haurum，JS，andMcKenzie，IF;Induction18ofHLA—A2—restrictedCTLstothemucin1humanbreastcancerantigen,JImmunol.，1997，159，5211-5218;Brossart，P，Heinrich，KS，Stuhler，G，Behnke，L，Reichardt，VL，Stevanovic，S，Muhm，A，Rammensee，HG，Kanz，L，andBrugger，WidentificationofHLA_A2_restrictedT—cell印itopesderivedfromtheMUCltumorantigenforbroadlyapplicablevaccinether即ies，Blood，1999，93，4309-4317)。這些肽中其中一個為MUC-001。它來自MUCl蛋白的串聯重復區。接種疫苗后，使用這些MUCl肽在晚期乳腺癌或卵巢癌患者的肽沖擊樹突細胞中成功地誘導了細胞毒性T淋巴細胞的體內反應(Brossart，P，Wirths，S，Stuhler，G，Reichardt，VL，Kanz，L，andBrugger，W;InductionofcytotoxicT_lymphocyteresponsesinvivoaftervaccinationswithp印tide-pulseddendriticcells,Blood，2000，96，3102-3108;Wierecky，J，Mueller,M，andBrossart，P;Dendriticcell_basedcancerimmunotherapytargetingMUC_1，CancerImmunol.Immunother.，2005Apr.28:288-94)。此夕卜，這些疫苗已成功地誘導了腎細胞癌患者的臨床反應(Wierecky，J，Muller，MR，Wirths，S，Halder-0ehler，E，Dorfel，D，Schmidt,SM，Hantschel，M，Brugger，W，Schroder,S，Horger，MS，Kanz，L，andBrossart，P;Immunologicandclinicalresponsesaftervaccinationswithp印tide—pulseddendriticcellsinmetastaticrenalcancerpatients,CancerRes.，2006，66，5910-5918)。結直腸癌中免疫反應性MUCl的上調大多并不是因為mRNA的過量表達，而是糖基化降低、暴露了表位從而抗體可識別造成的，特別是在MUC1串聯重復區。同時，這種去糖基化通過改變腫瘤細胞的抗原加工過程(這在正常細胞因糖基化而受阻)為T細胞表位生成提供了機會。這一機制可解釋為什么MUC-001盡管沒有很強的mRNA過量表達卻具有腫瘤相關T細胞表位的鮮明特征。糖基化的變化確實可能影響到抗原加工的一些證據來自最近的一項觀察，結直腸癌MUC1糖基化改變可通過專門識別腫瘤糖型的受體而被抗原提呈細胞檢測至U(Saeland，E，vanVliet，SJ，Backstrom，M，菌，dB，V，Geijtenbeek，TB，Meijer，GA，andvan,KY;2006，TheC-typelectinMGLexpressedbydendriticcellsdetectsglycanchangesonMUClincoloncarcinoma，CancerImmunol.Immunother.，2007,56(8):1225-36)。抗原提呈細胞對腫瘤糖型的特異性吸收和加工也可解釋MUC-001特異性T細胞在未接種疫苗的乳腺癌患者(Rentzsch，C，Kayser，S，Stumm，S，Watermann，I，Walter,S，Stevanovic，S，Wallwiener，D，andGuckel，B;Evaluationofpre—existentimmunityinpatientswithprimarybreastcancer:molecularandcellularassaystoquantifyantigen—specificTlymphocytesinperipheralbloodmononuclearcells,ClinCancerRes.，2003，9，4376-4386)和結直腸癌患者(Dittmann，J，Keller-Matschke，K，Weinschenk，T，Kratt，T，Heck，T，Becker,HD，Stevanovic,S，Rammensee，HG，andGouttefangeas，C;CD8+T_cellresponseagainstMUCl-derivedpeptidesingastrointestinalcancersurvivors,Cancerlmm皿ol.Immunother.，2005，54，750-758)自然觀察到這一事實。在這些患者中，未報告有自體免疫作用。這說明，MUC-001具有誘導特異性T細胞的腫瘤相關肽的自然屬性；并且表明，雖然MUCl在mRNA水平上并未檢測到過量表達，但是給予MUC-001可考慮為安全的。[OO97]Met原癌基因(肝細胞生長因子受體)(c-Met)19MET原癌基因的蛋白產物是肝細胞生長因子受體。它包含一個激活參與細胞增殖、運動、粘附和浸潤的信號途徑的酪氨酸激酶域(Trusolino，LandComoglio，PM;Scatter—factorandsem即horinreceptors:cellsignallingforinvasivegrowth,Nat.Rev.Cancer,2002，2，289-300)。不同類型腫瘤的研究已證明了激活c-Met的若干機制，包括HGF/C_Met的自分泌循環、激活位點突變、TPR-Met融合蛋白以及將c-Met分裂為a禾P0鏈失敗(DiRenzo，MF，Olivero，M，Martone，T，Maffe，A，Maggiora，P，Stefani，AD，Valente，G，Giordano,S，Cortesina，G，andComoglio，PM;SomaticmutationsoftheMEToncogeneareselectedduringmetastaticspreadofhumanHNSCcarcinomas,Oncogene,2000，19，1547—1555;Ebert，M，Yokoyama，M，Friess，H，Buchler，麗，andKorc，M;Coexpressionofthec—metproto—oncogeneandhepatocytegrowthfactorinhumanpancreaticcancer,CancerRes.，1994，54，5775—5778;Mondino，A，Giordano,S，andComoglio,PM;DefectiveposttranslationalprocessingactivatesthetyrosinekinaseencodedbytheMETproto-oncogene(hepatocytegrowthfactorreceptor),Mol.CellBiol.，1991,11,6084-6092;01ivero，M，Valente，G，Bardelli，A，Longati，P，Ferrero，N，Cracco，C，Terrone，C，Rocca—Rossetti，S，Comoglio，PM，andDiRenzo，MF;NovelmutationintheATP_bindingsiteoftheMEToncogenetyrosinekinaseinaHPRCCfamily,Int.JCancer,1999，82，640-643;Park，M，Dean，M，Cooper,CS，Schmidt,M，0'Brien，SJ，Blair，DG，andVandeWoude，GF;Mechanismofmetoncogeneactivation,Cell,1986,45,895-904;Park，WS，Dong，SM，Kim，SY，Na，EY，Shin，MS，Pi，JH，Kim，BJ，Bae，JH，Hong，YK，Lee，KS，Lee，SH，Yoo，NJ，Jang，JJ，Pack,S，Zhuang，Z，Schmidt,L，Zbar，B，andLee，JY;1999，SomaticmutationsinthekinasedomainoftheMet/hepatocytegrowthfactorreceptorgeneinchildhoodhepatocellularcarcinomas,CancerRes.，59，307-310;Rahimi，N，Tremblay，E，McAdam，L，Park,M，Schwall，R，andElliott,B;1996，Identificationofahepatocytegrowthfactorautocrineloopinamurinemammarycarcinoma,CellGrowthDiffer.，7，263—270;Schmidt，L，Duh，FM，Chen，F，Kishida，T，Gle皿，G，Choyke，P，Scherer，SW，Zhuang，Z，Lubensky，I，Dean，M，Allikmets，R，Chidambaram,A，Bergerheim，UR，Feltis，JT，Casadevall，C，Zamairon，A，Ber皿es，M，Richard,S，Lips，CJ，Walther，匪，Tsui，LC，Geil，L，0rcutt，ML，Stackhouse，T，Lipan，J，Slife，L，Brauch，H，Decker,J，Niehans，G，Hughson，MD，Moch，H，Storkel，S，Lerman，MI，Linehan，麗，andZbar，B;1997，GermlineandsomaticmutationsinthetyrosinekinasedomainoftheMETproto—oncogeneinpapillaryrenalcarcinomas,Nat.Genet.，16，68_73;Schmidt，L，Junker,K，Weirich，G，Gle皿，G，Choyke，P，Lubensky，I，Zhuang，Z，Jeffers，M，Vande，WG，Neumann,H，Walther，M，Linehan，麗，andZbar，B;1998，TwoNorthAmericanfamilieswithhereditarypapillaryrenalcarcinomaandidenticalnovelmutationsintheMETproto_oncogene，CancerRes.，58，1719-1722)。從作用機理上來說，c-Met過量表達與致癌基因Ki-ras突變共同提高體內結腸癌細胞的致瘤性(Long，IS，Han，K，Li，M，Shirasawa，S，Sasazuki，T，Johnston,M，andTsao，MS;MetreceptoroverexpressionandoncogenicKi—rasmutationcooperateto20enhancetumorigenicityofcoloncancercellsinvivo，Mol.CancerRes.，2003，1，393-401)。有趣的是，有些證據表明，MET信號與Wnt/13-catenin途徑的相互作用經常在結腸癌中加強。前列腺素E2(PGE2)可激活MET，并且前列腺素E2激活的c-Met與P-catenin相關而且增加其酪氨酸磷酸化，從而誘導結腸癌細胞的浸潤性(Pai，R，Nakamura，T，Moon，WS，andTarnawski，AS;Prostaglandinspromotecoloncancercellinvasion;signalingbycross-talkbetweentwodistinctgrowthfactorreceptors,FASEBJ，2003，17，1640-1647)。最近，有研究說明了MET和P-catenin可相互激活，導致結直腸腫瘤癌變中這兩個主要因素間的正反饋環路(Rasola，A，Fassetta，M，De，BF，D'Alessandro，L，Gramaglia，D，DiRenzo，MF，andComoglio，PM;Apositivefeedbackloopbetweenh印atocytegrowthfactorreceptorandbeta_cateninsustainscolorectalcancercellinvasivegrowth,Oncogene,2007，26，1078-1087)。原發性結直腸癌(n=36)中的c-MetmRNA表達水平是早期浸潤和疾病局部轉移的預測性標記物，這與結腸癌的期別直接相關(Takeuchi，H，Bilchik，A，Saha，S，Turner,R，Wiese，D，Tanaka，M，Kuo，C，Wang，HJ，andHoon，DS;c-METexpressionlevelinprimarycoloncancer鄰redictoroftumorinvasionandlymphnodemetastases,ClinCancerRes.，2003，9，1480-1488)。另一項對130個結直腸癌樣本中c-Met表達的分析顯示，c-Met在69%的原發性結直腸癌中過度表達(T/N>2.0)并且在有血管浸潤(P=0.04)以及晚期(P=0.04)的結直腸癌中c-Met水平顯著增高，這支持了c-Met在人結直腸癌進展和轉移中的作用(Zeng，Z，Weiser，MR，D'Alessio，M，Grace,A，Shia，J，andPaty，PB5Imm皿0bl0tanalysisofc—Metexpressioninhumancolorectalcancer:overexpressionisassociatedwithadvancedstagecancer,ClinExp.Metastasis,2004，21，409-417)。另一項研究顯示，60名結腸腺癌患者中，有69%和60%的患者癌中c-Met表達比鄰近正常粘膜分別高2倍和10倍(Kammula，US，Kuntz，EJ，Francone，TD，Zeng，Z，Shia，J，Landma皿，RG，Paty，PB，andWeiser，MR;Molecularco—expressionofthec_Metoncogeneandh印atocytegrowthfactorinprimarycoloncancerpredictstumorstageandclinicaloutcome,CancerLett.，2007，248，219-228)。因此，c-Met信號傳導增強在早期結直腸癌中經常發生，但在晚期和轉移性癌腫中表達大大提高。細胞周期蛋白Dl(CCND1)CCND1屬高度保守的細胞周期蛋白家族，其成員的特點是在整個細胞周期中都富含蛋白。細胞周期蛋白的功能是調節CDK激酶。不同的細胞周期蛋白表現出不同的表達和降解模式，以進行每個有絲分裂活動的時序協調。該細胞周期蛋白可形成一種復合物，作為CDK4或CDK6的一種調節亞基，其活性是細胞周期Gl/S期轉換所需的。這種改變細胞周期進程的基因之突變、擴增和過量表達經常可在各種腫瘤中觀察到，并可能有助于腫瘤癌變(Fu，M，Wang，C，LI，Z，Sakamaki,T，andPestell，RG;Minireview:CyclinDl:normalandabnormalfunctions,Endocrinology,2004，145，5439-5447)。常見的A/G單核苷酸多態性(A870G)導致a、b兩種不同的mRNA異構體。交替拼接異構體b可編碼一種截短蛋白，該截短蛋白與較高的腫瘤發病率有關(包括肺癌、結腸癌禾口其它癌禾中)(Fu，M，Wang，C，LI，Z，Sakamaki,T，andPestell，RG;Minireview:CyclinDl:normalandabnormalfunctions,Endocrinology,2004，145，5439-5447)。對于結直腸癌，也經常報道有CCNDl在mRNA和蛋白水平上過量表達(Sutter，T，Doi，S，Carnevale，KA，Arber，N，andWeinstein，IB^ExpressionofcyclinsDlandEinhumancolonadenocarcinomas，JMed，1997，28，285—309;Mermelshtein，A，Gerson，A，Waifisch，S，Delgado，B，Shechter—Maor，G，Delgado，J，Fich，A，andGheber，L^ExpressionofD—typecyclinsincoloncancerandincelllinesfromcoloncarcinomas,Br.JCancer，2005，93，338_345;Balcerczak，E，Pasz-Walczak，G，Kumor，P，Panczyk，M，Kordek，R，Wierzbicki，R，andMirowski，M;CyclinDlproteinandCCND1geneexpressionincolorectalcancer,Eur.JSurg.Oncol.，2005，31，721—726;Bondi，J，Husdal，A，Bukholm，G，Nesland，JM，Bakka，A，andBukholm，IR^Expressionandgeneamplificationofprimary(A，B1，D1，D3，andE)andsecondary(CandH)cyclinsincolonadenocarcinomasandcorrelationwithpatientoutcome,JClinPathol.，2005，58，509—514;Perez，R，Wu，N，Klipfel，AA，andBeart，RW，Jr.;Abettercellcycletargetforgenetherapyofcolorectalcancer;cyclinG，JGastrointest.Surg.，2003，7，884—889;Wong，NA，Morris,RG，McCondochie，A，Bader，S，Jodrell，DI，andHarrison,DJ;CyclinDloverexpressionincolorectalcarcinomainvivoisdependentonbeta_cateninproteindysregulation，butnotk_rasmutation,JPathol.，2002，197，128—135;McKay，JA，Douglas,JJ，Ross，VG，Curran，S，Murray,GI，Cassidy，J，andMcLeod，HL;CyclinDlproteinexpressionandgenepolymorphismincolorectalcancer.AberdeenColorectallnitiative，Int.JCancer，2000，88，77_81^Bartkova，J，Lukas，J，Strauss，M，andBartek，J;ThePRAD_l/cyclinDloncogeneproductaccumulatesaberrantlyinasubsetofcolorectalcarcinomas,Int.JCancer,1994，58，568-573)。CCND1是結直腸癌經常上調的0-Catenin-TCF/LEF途徑這一既定事實也可解釋上述現象(Shtutman，M，Zhurinsky，J，Simcha，I，Albanese，C，D'Amico，M，Pestell，R，andBen-Ze'ev，A;ThecyclinDlgeneisatargetofthebeta_catenin/LEF_lpathway,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，1999，96，5522-5527;Tetsu，0andMcCormick，F;Beta_cateninregulatesexpressionofcyclinDlincoloncarcinomacells,Nature,1999,398,422-426)。CCND1增強表達預示著腫瘤分級高、有轉移以及生存期下降(Balcerczak，E，Pasz-Walczak，G，Kumor，P，Panczyk，M，Kordek，R，Wierzbicki，R，andMirowski，M;CyclinDlproteinandCCNDlgeneexpressionincolorectalcancer，Eur.JSurg.Oncol.，2005，31，721_726;Bahnassy，AA，Zekri，AR，El-Houssini，S，El-Shehaby，AM，Mahmoud，MR，Abdallah，S，andEl—Serafi，M;CyclinAandcyclinDlassignificantprognosticmarkersincolorectalcancerpatients,BMC.Gastroenterol.，2004，4，22;McKay，JA，Douglas,JJ，Ross，VG，Curran，S，Murray,GI，Cassidy，J，andMcLeod，HL;CyclinDlproteinexpressionandgenepolymorphismincolorectalcancer.AberdeenColorectallnitiative，Int.JCancer,2000，88，77—81;Maeda，K，Chung，Y，Kang，S，0gawa，M，0noda，N，Nishiguchi，Y，Ikehara，T，Nakata，B，0kuno，M，andSowa，M;CyclinDloverexpressionandprognosisincolorectaladenocarcinoma,Oncology,1998,55，145-151)。基質金屬蛋白酶7(基質溶解素，子宮)(匪P7)基質金屬蛋白酶(匪P)系屬結構相關的鋅依賴蛋白酶的大家族，通常描述為可降解細胞外基質降解成分。各種已確認的匪P顯示在腫瘤中表達增加，大多數腫瘤顯示匪P活性增強(Curran，SandMurray,GI;1999，Matrixmetalloproteinasesintumourinvasionandmetastasis,JPathol.，189，300—308;Curran，SandMurray,GI;2000，Matrixmetalloproteinases:molecularaspectsoftheirrolesintumourinvasionandmetastasis,EurJCancer,36，1621-1630)。基底膜和細胞外基質是惡性腫瘤浸潤的兩個物理障礙，而匪P對其降解作用在腫瘤進展和轉移性擴散中起著關鍵作用(Johnsen，M，Lund，LR，Romer，J，Almholt，K，andDano，K;1998，Cancerinvasionandtissueremodeling:commonthemesinproteolyticmatrixdegradation,Curr.Opin.CellBiol.，10，667-671;Nelson，AR，Fingleton，B，Rothenberg，ML，andMatrisian，LM;2000，Matrixmetalloproteinases:biologicactivityandclinicalimplications,JClinOncol.，18,1135-1149;Wang，FQ，So，J，Reierstad，S，andFishman，DA;2005，Matrilysin(MMP-7)promotesinvasionofovariancancercellsbyactivationofprogelatinase，Int.JCancer,114，19-31)。除了上述功能，匪P還參與腫瘤的發生和發展(包括在細胞凋亡、細胞增殖和細胞分化的作用)目前正在討論中。這些功能都與匪P介導的非基質蛋白水解及與其酶活性不同的作用相關(Egeblad，MandWerb，Z;2002，Newfunctionsforthematrixmetalloproteinasesincancerprogression，Nat.Rev.Cancer,2，161—174;Leeman，MF，Curran，S，andMurray,GI;2003，Newinsightsintotherolesofmatrixmetalloproteinasesincolorectalcancerdevelopmentandprogression,J.Pathol.，201，528-534)。最近的研究表明，一些基質金屬蛋白酶，特別是基質溶解素(匪P7)，與參與結直腸癌發展的特異性分子遺傳和信號通路相互作用。特別是，基質溶解素在結直腸早期癌變時被P-catenin信號通路激活(Brabletz，T，Jung，A，Dag，S，Hlubek，F，andKirch證，T;1999，beta—cateninregulatestheexpressionofthematrixmetalloproteinase—7inhumancolorectalcancer,Am.JPathol.，155，1033—1038;Leeman，MF，Curran，S，andMurray,GI;2003，Newinsightsintotherolesofmatrixmetalloproteinasesincolorectalcancerdevelopmentandprogression,J.Pathol.，201，528—534;Zucker，SandVacirca，J;2004，Roleofmatrixmetalloproteinases(醒Ps)incolorectalcancer，CancerMetastasisRev.，23，101-117)。匪P7在良性和惡性結直腸腫瘤中都過量表達(Ishikawa，T，Ichikawa，Y，Mitsuhashi，M，Momiyama，N，Chishima，T，Tanaka，K，Yamaoka，H，Miyazakic，K，Nagashima，Y，Akitaya，T，andShimada,H;1996，Matrilysinisassociatedwithprogressionofcolorectaltumor，CancerLett.，107，5—10;McDonnell，S，Navre，M，Coffey，RJ，Jr.，andMatrisian，LM;1991，Expressionandlocalizationofthematrixmetalloproteinasepump-l(MMP-7)inhumangastricandcoloncarcinomas,Mol.Carcinog.，4,527-533;Miyazaki，K，Hattori，Y，Umenishi，F，Yasumitsu，H，andUmeda，M;1990，Purificationandcharacterizationofextracellularmatrix—degradingmetalloproteinase,matrin(pump-l)，secretedfromhumanrectalcarcinomacellline,CancerRes.，50，7758—7764;Nagashima，Y，Hasegawa，S，Koshikawa，N，Taki，A，Ichikawa，Y，Kitamura，H，Misugi，K，Kihira，Y，Matuo，Y，Yasumitsu，H，andMiyazaki，K;1997，Expressionofmatrilysininvascularendothelialcellsadjacenttomatrilysin—producingtumors,Int.JCancer,72，441-445;Newell，KJ，Witty，JP，Rodgers，WH，andMatrisian，LM;1994，Expressionandlocalizationofmatrix—degradingmetalloproteinasesduringcolorectaltumorigenesis，Mol.Carcinog.，10,199—206;Yoshimoto，M，Itoh，F，Yamamoto，H，Hinoda，Y，Imai，K，andYachi，A;1993，ExpressionofMMP—7(PUMP—l)mRNAinhumancolorectalcancers,Int.JCancer,54，614-618)。匪P7是月中瘤細胞真正分泌的少數幾禾中匪P之——(Overall,CMandKleifeld，0;2006，Tumourmicroenvironment—opinion:validatingmatrixmetelloproteinasesasdrugtargetsandanti_targetsforcancertherapy,Nat.Rev.Cancer,6，227-239)。此外，匪P7mRNA表達水平與預示著結直腸癌發展期另ll(Ishikawa，T，Ichikawa，Y，Mitsuhashi，M，Momiyama，N，Chishima，T，Tanaka，K，Yamaoka，H，Miyazakic，K，Nagashima，Y，Akitaya，T，andShimada，H;1996，Matrilysinisassociatedwithprogressionofcolorectaltumor，CancerLett.，107，5—10;Mori，M，Barnard,GF，Mimori，K，Ueo，H，Akiyoshi，T，andSugimachi，K;1995，Overexpressionofmatrixmetalloproteinase_7mRNAinhumancoloncarcinomas,Cancer,75，1516-1519)。在結直腸癌的轉移中，匪P7起著關鍵作用(Adachi，Y，Yamamoto，H，Itoh，F，Hinoda，Y，0kada，Y，andImai，K;1999，Contributionofmatrilysin(MMP_7)tothemetastaticpathwayofhumancolorectalcancers,Gut，45，252—258;Mori，M，Barnard,GF，Mimori，K，Ueo，H，Akiyoshi，T，andSugimachi，K;1995，Overexpressionofmatrixmetalloproteinase_7mRNAinhumancoloncarcinomas,Cancer,75，1516-1519)。血清匪P7水平升高預示著晚期結直腸癌患者的預后差(Maurel，J，Nadal，C，Garcia—Albeniz，X，Gallego，R，Carcereny，E，Almendro，V，Marmol，M，Gallardo，E，Maria，AJ，Longaron，R，Martinez—Fernandez,A，Molina,R，Castells，A，andGascon,P;2007，Serummatrixmetalloproteinase7levelsidentifiespoorprognosisadvancedcolorectalcancerpatients,Int.JCancer,PublishedOnline:8May2007)，在結直腸患者中過量表達又能導致生存期下降，這表明通過腫瘤細胞上的Fas裂解可促進其從免疫監視中逃逸(Wang，WS，Chen，PM，Wang，HS，Liang，WY，andSu，Y;2006，Matrixmetalloproteinase—7increasesresistancetoFas—mediatedapoptosisandisapoorprognosticfactorofpatientswithcolorectalcarcinoma,Carcinogenesis,27，1113-1120)。本發明中的蛋白可作為多種癌癥的腫瘤特異性免疫反應的標靶。乙型肝炎病毒核心抗原肽HBV-001并非來自內源性人腫瘤相關抗原，而是來自于乙肝病毒核心抗原。首先，有了它，就可對TUMAP誘導的細胞反應量進行量化比較，從而可得出抗腫瘤反應能力的重要結論。其次，它可在患者缺乏任何T細胞反應時，作為重要的陽性對照。第三，有了它還可以對患者的免疫功能狀態得出結論。乙型肝炎病毒(HBV)感染是引起肝病的主要原因之一，全球約有3.5億人受其影口向(Reherma皿，BandNascimbeni，M;ImmunologyofhepatitisBvirusandhepatitis24Cvirusinfection,Nat.Rev.Immunol.，2005，5，215-229)。由于該病毒較容易進行水平和垂直傳播并可能發展為慢性疾病，這些慢性疾病可能導致肝硬化和肝癌，因此，乙肝病毒對全球很多國家的公共衛生系統產生重大影響。乙型肝炎病毒基因組(Previsani，NandLavanchy，D;2002，HepatitisB，(EpidemicandPandemicAlertandResponse,WorldHealthOrganization,Geneva,2002)由部分雙鏈環狀DNA組成。在乙肝病毒體中，含有核心蛋白HBc和其他蛋白質一起形成核衣殼，包裹于含脂質的外部包膜以及表面蛋白家族HBs(也稱為包膜蛋白)中。與HBc和HBs相關的抗原決定簇分別為HbcAg和HBsAg。這些抗原與血清學反應，如患者血液中發現的抗體反應有關，并且是臨床上最有用的乙型肝炎病毒感染診斷抗原_抗體系統之一。HBc代表所有先前無HBV感染者的一種新型外來抗原。由于這種抗原熟知免疫原性肽(Bertoletti，A，Chisari，FV，Penna，A，Guilhot，S，Galati，L，Missale，G，Fowler，P，Schlicht，HJ，Vitiello，A，Ches皿t，RC，and.;1993，DefinitionofaminimaloptimalcytotoxicT—cellepitopewithinthehepatitisBvirus皿cleocapsidprotein,J.Virol.，67,2376-2380山ivingston，BD，Crimi，C，Grey，H，Ishioka，G，Chisari，FV，Fikes，J，Grey，H，Ches皿t，RW，andSette，A;1997，ThehepatitisBvirus—specificCTLresponsesinducedinhumansbylipop印tidevaccinationarecomparabletothoseelicitedbyacuteviralinfection,J.Immunol.，159，1383-1392)，因此，HbcAg中一種由10個氨基酸組成的肽被選定為IMA內的一種陽性對照抗原。那么，對HBc肽特異性CTL的誘導將被看作患者免疫功能和成功疫苗接種的一個指標。該藥物組合物還可包含更有效的其他肽和/或賦形劑，將進一步解釋如下。發明人用給定氨基酸序列的"變種氨基酸序列"表示，一個或多個氨基酸殘基等的側鏈通過取代另一個自然產生的氨基酸殘基的側鏈或其他側鏈而改變，這樣，這種肽仍然能夠以含有給定氨基酸序列的肽大致同樣的方式與HLA分子結合。例如，一種肽可能被修飾以便至少維持(如果不提升的話)其與HLA-A或HLA-DR等合適的MHC分子互動和結合，以及至少維持(如果不提升的話)其產生能識別和殺傷細胞(這些細胞表達含本發明中所定義的一種氨基酸序列的多肽)的激活CTL的能力。正如數據庫中所述，HLA-A結合肽的某些位點通常為錨定殘基，可形成一種與HLA結合槽的結合基序相稱的核心序列。這些不與T細胞受體互動的氨基酸殘基可通過取代另一個幾乎不影響T細胞反應并不妨礙與相關MHC結合的氨基酸而得到修飾。因此，除了特定限制性條件外，本發明中的肽可能為任何包括給定氨基酸序列或段或變體的肽(發明人所用的這個術語包括寡肽或多肽)。MHC-II類提呈肽更為大家熟知，這些肽由具有某種HLA特異性氨基酸基序并且N和/或C-端隨意延伸(不干擾肽核心序列功能，如，被視為與肽和T細胞相互作用無關)的"核心序列"組成。N-和/或C端可分別延伸l至10個氨基酸的長度。這些肽可直接用于加載MHC-II類分子或其序列可克隆入下文所述載體。由于這些肽可在細胞內形成較大肽加工過程的最終產物，因此，也可用長肽。本發明中肽的大小不限，但通常它們的分子量可能小于100000，優選為小于50000，更優選為小于10000，通常約為5000。對于氨基酸殘基數目，本發明中的肽可能少于1000個殘基，優選為少于100個殘基，更優選為少于500個殘基。因此，本發明還提出了總長度為8至100個、優選為8至30個、最優選為8至16個(即8、9、10Ul、12、13、14、15或16個)氨基酸的肽或變體的復合物。相應地，誘導T細胞與本發明中的肽發生交叉反應的變體往往為長度可變的變體。如果長度約為12個氨基酸殘基的肽直接與MHC-II類分子結合，那么，兩側有核心HLA結合區、且不會對該肽與MHC-II類分子的結合槽特異性結合能力或該肽提呈至CTL的能力產生重大影響的殘基則為優選。但是，正如上所述，應了解，可使用較大的肽(特別是核苷酸進行編碼時)，因為這些較大的肽可被適當的抗原提呈細胞分成片段。MHC-I類表位(通常長度為8至10個氨基酸)也可能由肽從較長的肽或包含實際表位的蛋白中加工而產生。與MHC-II表位相似，兩側有結合區、不會對該肽與MHC-I類分子的結合槽特異性結合能力或該肽提呈至CTL的能力產生重大影響、也不會掩蓋加工過程中暴露實際表位所需蛋白裂解位點的殘基為MHC-I類表位的優選。因此，本發明還提出了總長度為8至100個、優選為8至30個、最優選為8至16個(即8、9、10、11、12、13、14、15或16個)氨基酸的MHC-I類表位的肽或變體。當然，本發明中的肽或變體能與人主要組織相容性復合體(MHC)I或II類分子結合。肽或變體與MHC復合物結合性可用本領域內的已知方法進行測試，例如，本發明下列實施例中所述的方法或文獻中所述的檢測不同MHC-II類等位基因的方法(例如，VogtAB，KropshoferH,KalbacherH，KalbusM，RammenseeHG，ColiganJE，MartinR;LigandmotifsofHLA-DRB5柳101andDRB1^1501moleculesdelineatedfromself-p印tides;JImmunol.1994;153(4):1665-1673;MalcherekG，GnauV，StevanovicS，RammenseeHG，JungG，MelmsA;Analysisofallele—specificcontactsitesofnaturalHLA-DR17ligands;JImmunol.1994;153(3):1141-1149;ManiciS，SturnioloT，ImroMA，HammerJ，SinigagliaF，NoppenC，SpagnoliG，MazziB，BelloneM，DellabonaP，ProttiMP;MelanomacellspresentaMAGE-3印itopetoCD4(+)cytotoxicTcellsinassociationwithhistocompatibilityleukocyteantigenDRll;JExpMed.1999;189(5):871-876;HammerJ，GallazziF，BonoE，KarrRW，GuenotJ，ValsasniniP，NagyZA，SinigagliaF;P印tidebindingspecificityofHLA—DR4molecules-correlationwithrheumatoidarthritisassociation;.JExpMed.1995181(5):1847-1855;TompkinsSM，RotaPA，MooreJC，JensenPE;AeuropiumfluoroimmunoassayformeasuringbindingofantigentoclassIIMHCglycoproteins;JImmunolMethods.1993;163(2):209-216;BoytonRJ，Lohma皿T，LondeiM，KalbacherH，HalderT，FraterAJ，DouekDC，LeslieDG，FlavellRA，Altma皿DM;GlutamicaciddecarboxylaseTlymphocyteresponsesassociatedwithsusceptibilityorresistancetotypeIdiabetes-analysisindiseasediscordanthumantwins,non_obesediabeticmiceandHLA-DQtransgenicmice;IntI匪nol.1998(12):1765-1776)。氨基酸其他N和/或C端延伸處不一定能形成作為MHC分子表位的肽，但對有效將本發明中的肽引進細胞具有重要作用。在本發明的一實施案中，本發明的肽為融合蛋白，含來自NCBI、GenBank登錄號X00497的HLA-DR抗原相關不變鏈(p33，以下稱為"Ii"鏈)的80個N_端氨基酸等(Strubin，M.，Mach，B.andLong,E.0.ThecompletesequenceofthemRNAfortheHLA_DR_associatedinvariantchainrevealsapolypeptidewithan麗simltra固emb屋印olarityEMBOJ.3(4)，869-872(1984)。優選的藥物組合物，其中這些肽的總長度可為8至100個氨基酸、優選為8至30個氨基酸，最優選為8至16個氨基酸。此外，該肽或變體可進一步修飾以提高穩定性和/或與MHC分子結合，從而引發更強的免疫反應。肽序列的該類優化方法是本領域內所熟知的，包括，例如，反式肽鍵和非肽鍵的引入。因此，另一方面，本發明提出了一種藥物組合物，其中，至少有一個含非肽鍵的肽或變體。在反式肽鍵氨基酸中，肽(-CO-NH-)并未連接其殘基，但是其肽鍵是反向的。這種逆向反向模擬肽(retro-inversop印tidomimetics)可通過本領域已知的方法制備，例如Meziere等在《免疫學雜志》((1997)J.Immunol.159,3230-3237)中所述的方法，以引用的方式并入本文。這種方法涉及制備包含骨架(而并非側鏈)改變的模擬肽。Meziere等人(1997年)的研究顯示，這些模擬肽有利于MHC和輔助性T細胞的反應。以NH-CO鍵替代CO-NH肽鍵的逆向反向肽大大地提高了抗水解性能。非肽鍵為_CH2_NH、_CH2S_、_CH2CH2_、_CH=CH_、_C0CH2_、_CH(OH)CH廠和-CH^0-等。美國4897445號專利提出了多肽鏈中非肽鍵(_CH2_NH)的非固相合成法，該方法涉及按標準程序合成的多肽以及通過氨基醛和一種含NaCNBH3的氨基酸相互作用而合成的非肽鍵。含本發明上述序列的肽可與其氨基和/或羧基末端的其他化學基團進行合成，從而提高肽的穩定性、生物利用度、和/或親和力等。例如，芐氧羰基、丹酰基等疏水基團或叔丁氧羰基團可加入肽的氨基末端。同樣，乙酰基或9-芴甲氧羰基可能位于肽的氨基末端。此外，如疏水基團、叔丁氧羰基團或氨基團都可能被加入肽的羧基末端。另外，本發明中的所有肽都可能經合成而改變其空間構型。例如，可能使用這些肽的一個或多個氨基酸殘基的右旋體，通常不是其左旋體。更進一步地，本發明中肽的至少一個氨基酸殘基可被熟知的一個非天然氨基酸殘基取代。諸如此類的改變可能有助于增加本發明肽的穩定性、生物利用度和/或結合作用。同樣，本發明中的肽或變體可在合成肽之前或之后通過特異氨基酸的反應而進行化學修飾。此類修飾的實施例為本領域所熟知，例如，在R.Lundblad所著的ChemicalReagentsforProteinModification(3rded.CRCPress,2005)中有概述，以參考文獻的方式并入本文。氨基酸的化學修飾方法包括(但不限于)通過以下方法修飾酰基化、脒基化、賴氨酸吡眵基化、還原烷基化、以2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)三硝基苯基化氨基團、通過將半胱氨酸過甲酸氧化為磺基丙氨酸而對羧基團和巰基進行氨基修飾、形成易變衍生物、與其他巰基化合物形成混合二硫化合物、與馬來酰亞胺反應，與碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化、在堿性PH值下與氰酸鹽甲氨酰化，上述方法無限制。在這方面，技術人員參考了CurrentProtocolsInProteinScience(Eds.Coliganetal.(JohnWiley&SonsNY1995-2000))中第15章所述的在蛋白質化學修飾相關的廣泛方法。簡言之，修飾蛋白質的精氨酰殘基等往往依賴于鄰二羰基化合物(如苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮以及l，2-烯巳二酮)的反應而形成加合物。另一個實施例是丙酮醛與精氨酸殘基反應。半胱氨酸可在賴氨酸和組氨酸等親核位點不作隨同修飾的情況下就得到修飾。因此，有大量試劑可進行半胱氨酸的修飾。Pierce化學公司、Sigma-Aldrich公司以及其他公司的網站有具體試劑的信息。蛋白質中二硫鍵的選擇性還原也很普遍。二硫鍵可在生物制藥熱處理中形成和氧化。伍德沃德氏試劑K可用于修飾特定的谷氨酸殘基。N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基_碳二亞胺可用于形成賴氨酸殘基和谷氨酸殘基的分子內交聯。例如焦碳酸二乙酯是修飾蛋白質組氨酸殘基的試劑。組氨酸也可使用4-羥基-2_壬烯醛進行修飾。賴氨酸殘基與其他a-氨基團的反應，例如，有利于肽結合到蛋白/肽的表面或交聯處。賴氨酸聚是多(乙烯)乙二醇的附著點，也是蛋白質糖基化的主要修飾位點。蛋白質的蛋氨酸殘基可通過碘乙酰胺、溴乙胺、氯胺T等被修飾。四硝基甲烷和N-乙酰基咪唑可用于酪氨酸殘基的修飾。經二酪氨酸形成的交聯可通過過氧化氫/銅離子完成。對色氨酸修飾的最近研究中使用了N-溴代琥珀酰亞胺、2_羥基-5-硝基芐溴或3-溴-3-甲基-2-(2-硝苯巰基)-3H-吲哚(BPNS-糞臭素)。當蛋白與戊二醛、聚乙二醇二丙烯酸酯和甲醛的交聯用于配制水凝膠時，治療性蛋白和含聚乙二醇的肽的成功修飾往往可延長循環半衰期。針對免疫治療的變態反應原化學修飾往往通過氰酸鉀的氨基甲酰化實現。—般來說，肽和變體(至少含氨基酸殘基之間的肽聯接)可使用Lu等人(1981)J.Org.Chem.46，3433)以及此處列出的參考文獻所披露的固相肽合成Fmoc-聚酰胺模式等方法進行合成。純化可通過以下技術的任何一種或組合方法實現，如再結晶法、體積排阻色譜法、離子交換色譜法、疏水作用色譜法以及(通常)反相高效液相色譜法(如使用乙腈/水梯度分離)。肽分析可使用以下方法進行薄層色譜法、電泳法、特別是，毛細管電泳法、固相萃取法(CSPE)、反相高效液相色譜法、酸水解后的氨基酸分析、快原子轟擊(FAB)質譜分析法以及MALDI、ESI-Q-T0F質譜分析法。另一方面，本發明提出了一種編碼本發明中肽或變體的核酸(如多聚核苷酸)。多聚核苷酸可能為DNA、cDNA、PNA、CAN、RNA等或為單鏈和/或雙鏈，或多聚核苷酸的原生或穩定形式，如具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸，或其組合物，并且只要它編碼肽，就可能包含也可能不包含內含子。當然，多聚核苷酸只能編碼加入天然肽鍵并含有天然氨基酸殘基的肽。另一個方面，本發明提出了一種可根據本發明表達多肽的表達載體。不同類型細胞的表達載體為本領域所熟知并且無需過度不當實驗就可選定。—般來說，DNA可以適當的方向和正確的表達閱讀框架附著到一種表達載體(如質粒)中。如有必要，該DNA可能與所需宿主所識別的相應轉錄和翻譯調節控制核苷酸序列連接，盡管表達載體中一般存在此類控制功能。然后，該載體通過標準技術被引入宿主。指導可參閱，如Sambrook等(1989)所著MolecularCloning,ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY。但是，在本發明的一個特別優選實施方案中，藥物組合物至少包括兩種含有從SEQIDN01至SEQIDNO15所選的氨基酸序列的肽。疫苗所含每種肽的最佳量以及最佳給藥方案可由一名對本領域技術人員確定，而無需進行過度不當實驗。例如，肽或其變體可制備為靜脈(i.v.)注射劑、皮下(s.c.)注射劑、皮內(i.d.)注射劑、腹腔(i.p.)注射劑、肌肉(i.m.)注射劑。肽注射的優選途徑為s.c.、i.d.、i.p.、i.m.和i.v.注射。DNA注射的優選途徑為i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射。例如，給予1至500mg、50iig至1.5mg，優選為125yg至500yg的肽或DNA，這取決于具體的肽或DNA。上述劑量范圍在以前的試驗中成功使用(BrunsvigPF，AamdalS，GjertsenMK，KvalheimG，Markowski—G:rims:rudCJ，SveI，DyrhaugM，TrachselS，M0llerM，EriksenJA，GaudernackG;Telomerasepeptidevaccination:aphaseI/IIstudyinpatientswithnon_smallcelllungcancer;CancerImmunolImm皿other.2006;55(12):1553-1564;M.Staehler，A.Stenzl，P.Y.Dietrich,T.Eisen，A.Haferkamp，J.Beck，A.Mayer，S.Walter,H.Singh，J.Frisch，C.G.Stief;Anopenlabelstudytoevaluatethesafetyandimm皿ogenicityofthepeptidebasedcancervaccineI應Ol，ASCOmeeting2007;AbstractNo3017)本發明的藥物組合物可能會進行匯編，其中，從而組合物中肽的選擇和所含數量都能特異性地針對組織、癌癥和/或患者。例如，特定組織中親本蛋白的表達模式可引導肽的準確選擇，從而避免副作用。這種選擇可能會依賴于待治療患者具體的癌癥類型、以及疾病狀態、早期治療方案、患者免疫狀態，當然，還有患者的HLA單倍型。此外，根據特定患者的個人需求，本發明的疫苗可包含個性化成分。根據特定患者的相關TAA的表達、由于個人過敏或其它治療方法而產生的意外副作用、以及第一輪治療后對二次治療或治療方案的調整，各實施例中的肽含量有所不同。對于用作結直腸癌疫苗的一種組合物，例如，親本蛋白在正常組織中高表達的肽在本發明的組合物中將會避免使用或含量較低。另一方面，如果已知某個患者的腫瘤高表達某種蛋白，則治療這種癌癥的各藥物組合物可能含有大量和/或一個以上針對這種特定蛋白的肽，或者可能含有這種蛋白的通路。技術人員可通過以下測試選擇免疫原性肽的優選組合，如測試體外T細胞的產生情況及其效果和總量、針對某些肽的某些T細胞的增殖、親和力和擴增，以及通過分析IFN-Y的產生(參閱下文實施例)測試T細胞的功能性。通常為了上述之目的，最有效的肽然后組合為一種疫苗。—種合適的疫苗將優選為包含1至20個肽，更優選為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個不同的肽，進一步優選為6、7、8、9、10、11、12、13或14個不同的肽，最優選為14個不同的肽。用于癌癥疫苗的肽長度為任何合適的肽。特別是，它可能是一種合適的9-mer肽或一種合適的7_mer或8_mer或10-mer或ll-mer肽或12_mer、13-mer、14-mer或15-mer肽.。較長的肽也可能適合，附表1和2中所述的9_mer或10-mer肽優選為MHC-I類肽，而12-至15-mer肽優選為MHC-II類肽。肽組成了腫瘤或癌癥疫苗。該疫苗可直接給到患者的受影響器官，也可全身給藥，或體外應用到來自患者或其細胞株的細胞(隨后再將這些細胞注入到患者中)，或體外用于從來自患者的免疫細胞的一個細胞亞群(然后再將細胞重新給予患者)。該肽可能為純肽，也可能是與免疫剌激佐劑的組合物(見下文)、或與免疫剌激細胞因子聯合使用、或以適當的輸送系統給藥，例如脂質體。該肽也可共軛形成一種合適的載體如鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)或甘露到合適的載體(參閱W095/18145及Longenecker等(1993)Ann.NYAcad.Sci.690,276-291)。該肽也可進行標記、或是一種融合蛋白或是雜合分子。本發明中給出肽序列的肽預期會剌激CD4或CD8CTL。但是，有反向CD陽性T細胞提供幫助時，剌激更為有效。因此，對于剌激CD4CTL的MHC-II類表位，一種雜合分子的融合伙伴或片段提供了剌激CD8陽性T細胞的適當表位。另一方面，對于剌激CD8CTL的MHC-I類表位，一種雜合分子的融合伙伴或片段提供了剌激CD4陽性T細胞的適當表位。CD4-和CD8剌激表位為本領域所熟知、并包括本發明中確定的表位。為了引發免疫反應，通常疫苗有必要包括使該組合物具有更多免疫原性的輔料。因此，在本發明的一個優選實施方案中，本藥物組合物進一步包括了至少一種合適的佐劑。佐劑是那些非特異性地增強或加強免疫反應的物質(例如，通過CTL和輔助T(TH)細胞介導的對一種抗原的免疫應答，因此被視為對本發明的藥劑有用。適合的佐劑包括(但不僅限于)1018ISS、鋁鹽、Amplivax、AS15、BCG、CP-870，893、CpG7909、CyaA、dSL頂、GM-CSF、IC30、IC31、Imiquimod、ImuFactMP321、ISPatch、ISS、ISCOMATRIX、Juvlmmune、LipoVac、MF59、單磷酰脂A、Montanide頂S1312、MontanideISA206、MontanideISA50V、MontanideISA_51、0K_432、0M_174、0M-197-MP-EC、ONTAK、PepTel⑧載體系統、PLG微粒、resiquimod、SRL172、病毒顆粒和其他病毒樣顆粒、YF_17D、VEGFtr即、R848、P_葡聚糖、Pam3Cys、源自皂角苷、分支桿菌提取物和細菌細胞壁合成模擬物的Aquila公司的QS21剌激子(Aquila生物技術公司，Worcester,MA，USA)，以及其他專有佐劑，如Ribi'sDetox。Quil或Superfos。優選佐劑如弗氏不完全佐劑或GM-CSF。前面一對一些樹突狀細胞特異性免疫佐劑(如MF59)及其制備方法進行了描述(DupuisM，MurphyTJ，HigginsD，UgozzoliM，vanNestG，0ttG，McDonaldDM;Dendriticcellsinternalizevaccineadjuvantafterintramuscularinjection;CellImmunol.19985186(1):18_27;AllisonAC;Themodeofactionofimmunologicaladjuvants;DevBiolStand.1998;92:3-11)。也可使用細胞因子。一些細胞因子直接影響樹突狀細胞向淋巴組織遷移(如，TNF-)，加速樹突狀細胞成熟為T淋巴細胞的有效抗原提呈細胞(如，GM-CSF、IL-1和IL-4)(美國5849589號專利，特別以其參考文獻的完整形式并入本文)，并充當免疫佐劑(如，IL-12)(GabrilovichDI，Cu皿inghamHT，CarboneDP;IL_12andmutantP53p印tide—pulseddendriticcellsforthespecificimm皿other即yofcancerJImm皿otherEmphasisTumorImmunol.1996(6):414-418)。據報告，CpG免疫剌激寡核苷酸可提高佐劑在疫苗中的作用。如果沒有理論的約束，CpG寡核苷酸可通過Toll樣受體(TLR)(主要為TLR9)激活先天(非適應性)免疫系統從而起作用。CpG引發的TLR9活化作用提高了對各種抗原的抗原特異性體液和細胞反應，這些抗原包括肽或蛋白抗原、活病毒或被殺死的病毒、樹突狀細胞疫苗、自體細胞疫苗以及預防性和治療性疫苗中的多糖結合物。更重要的是，它會增強樹突狀細胞的成熟和分化，導致V細胞的活化增強以及細胞毒性T淋巴細胞(CTL)生成加強，甚至CD4T細胞幫助的缺失。甚至有疫苗佐劑的存在也能維持TLR9活化作用誘發的THl偏移，這些佐劑如正常促進TH2偏移的明礬或弗氏不完全佐劑(IFA)。CpG寡核苷酸與以下其他佐劑或配方一起制備或聯合給藥時，表現出更強的佐劑活性，如微粒、納米粒子、脂肪乳或類似制劑，當30抗原相對較弱時，這些對誘發強反應尤為必要。他們還能加速免疫反應，使抗原劑量減少約兩個數量級，在有些實驗中，對不含CpG的全劑量疫苗也能產生類似的抗體反應(ArthurM.Krieg，TherapeuticpotentialofToll—likereceptor9activation，NatureReviews,DrugDiscovery,2006，5，471-484)。美國6406705B1號專利對CpG寡核苷酸、非核酸佐劑和抗原結合使用促使抗原特異性免疫反應進行了描述。市售CpGTLR9拮抗劑為Mologen公司(德國柏林)的dSLIM(雙干環免疫調節劑)，這是本發明藥物組合物的優選成分。也可使用其他如TLR結合分子，如RNA結合TLR7、TLR8和/或TLR9。其他有用的佐劑例子包括(但不限于)化學修飾性CpG(如CpR、Idera)、Poly(1:C)(如polyl:C12U)、非CpG細菌性DNA或RNA以及免疫活性小分子和抗體，如咪唑喹啉、環磷酰胺、舒尼替單抗、西樂葆、NCX-4016、西地那非、他達拉非、伐地那非、索拉非尼、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、ZD2171、AZD2171、ipi1imumab、treme1imumab和SC58175，這些藥物都可能有治療作用和/或充當佐劑。技術人員無需過度進行不當實驗就很容易確定本發明中有用的佐劑和添加劑的數量和濃度。優選佐劑為dSLM、BCG、0K432、咪喹莫特、PeviTer和Juvlmmune。本發明藥物組合物的一個優選實施方案中，佐劑從含集落剌激因子制劑中選擇，如粒細胞巨噬細胞集落剌激因子(GM-CSF，沙格司亭)。在本發明藥物組合物的一個優選實施方案中，佐劑為咪喹莫特。此組合藥物為非腸道注射使用，如皮下、皮內、肌肉注射，也可口服。為此，肽和其他選擇性分子在藥用載體中分解或懸浮，優選為水載體。此外，組合物可包含輔料，如緩沖劑、結合劑、沖擊劑、稀釋劑、香料、潤滑劑等。這些肽也可與免疫剌激物質合用，如細胞因子。可用于此類組合物的更多輔料可在從A.Kibbe所著的HandbookofPharmaceuticalExcipients(第3版，2000年，美國醫藥協會和制藥出版社)等書中獲知。此組合藥物可用于阻止、預防和/或治療腺瘤或癌性疾病，優選為結直腸癌。細胞毒性T細胞(CTL)可識別與MHC分子而不是與完整外來抗原本身結合的以一種肽形式出現的抗原。MHC分子本身位于抗原提呈細胞的細胞表面。因此，只有出現肽抗原、MHC分子和APC三聚體復合物時，才可能激活CTL。相應地，如果并非只有該肽用于激活CTL，而是添加了含各MHC分子的額外APC，則可提高免疫反應。因此，在本發明藥物組合物的一個優選實施方案中，另外至少包含一種抗原提呈細胞。抗原提呈細胞(或剌激因子細胞)通常在其表面有一個MHC-I類或II類分子，在一個實施方案中，該抗原提呈細胞自身基本上不能向MHC-I類或II類分子載入選定抗原。正如下面的更為詳細描述，MHC-I類或II類分子在體外可很容易載入選定抗原。優選情況是，哺乳動物細胞缺乏TAP肽轉運載體或水平下降或功能降低。缺乏TAP肽轉運載體的適合細胞包括T2、RMA-S和果蠅細胞。TAP表示"轉運載體相關的抗原加工"。人體肽載入的缺陷細胞株T2從屬美國菌種保藏中心(ATCC，12301ParklawnDrive,Rockville，Maryland20852，美國)目錄號CRL1992;果蠅細胞株Schneider2號株從屬ATCC目錄CRL19863;小鼠RMA-S細胞株Karre和Ljunggren(985)在《實驗醫學雜志》(J.E鄧.Med.162,1745)中有過描述。這些細胞株可作為抗原提呈細胞(APC)，由于缺乏TAP,MHC-I類分子提呈的所有的肽幾乎都受到關注，用于外部載入這些細胞株的空載MHC-I類分子，因此所有作用都將無疑地歸因于使用的肽。抗原提呈細胞優選為樹突狀細胞。適當的樹突狀細胞為自體樹突狀細胞，用抗原肽作脈沖處理。抗原肽可以是產生適當T細胞反應的任何合適的抗原肽。Murphy等人(1996)在《前列腺》雜志(TheProstate29,371-380以及TheProstate32,272-278)中披露了一種使用自體樹突狀細胞的T細胞療法，自體樹突狀細胞由一種抗原相關腫瘤的肽進行脈沖處理。因此，在本發明的一個優選實施方案中，至少包含一種抗原提呈細胞的藥物組合物以該肽進行脈沖處理或進行加載，例如，通過實施例4的方法。作為一種替代物，抗原提呈細胞包括一個編碼肽的表達載體。多聚核苷酸可能選為任何合適的多聚核苷酸，優選為能轉導樹突狀細胞，從而提呈一種肽并誘導免疫性。本發明的核酸優選為由一種病毒核苷酸或病毒組成。例如，腺病毒轉導的樹突狀細胞表明可誘導與MUC1相關的抗原特異性抗腫瘤免疫(參閱Gongetal(1997)GeneTher.4，1023-1028)。同樣地，也可使用基于腺病毒的系統(例如參閱，Wanetal(1997)Hum.GeneTher.8，1355-1363);可使用逆轉錄病毒系統(Spechtetal(1997)J.Exp.Med.186，1213-1221和Szabolcsetal(1997)(也可使用血液顆粒介導移轉至樹突狀細胞的方法(Tutingetal(1997)Eur.J.Immunol.27，2702-2707);亦可使用RNA(Ashleyetal(1997)J.Exp.Med.186，11771182)。—般來說，本發明中，含有發明中的一種(多種)核酸的藥物組合物可用本發明中那些含有肽的藥物復合物的相似給藥方式給予，如靜脈注射、動脈注射、腹腔注射、肌肉注射、皮內注射、瘤內注射、口服、經皮、經鼻腔、經口腔、經直腸、經陰道、吸入、或外用。由于逃逸機制的原因，腫瘤往往對治療藥物產生耐藥。耐藥性可能在治療期間出現，并轉移和復發腫瘤中表現出來。為了避免這種耐藥性，腫瘤通常通過聯合給藥治療，轉移瘤和無病期后復發的腫瘤后往往需要不同的藥物組合來治療。因此，在本發明的一方面，藥物組合物與第二種抗癌藥物結合使用。第二種藥物可在本發明中的藥物組合物給藥之后給予，也可同時給藥。例如，如果化學性質相容，本發明中的藥物組合物可與第二種抗癌藥物混合使用，從而實現同時給藥。同時給藥的另一種方法是，本組合物與抗癌藥物同一天給藥，給藥途徑可不同，例如，本發明的藥物組合物可注射給藥，而第二種抗癌藥物可口服。藥物組合物和第二種抗癌藥物也可在同一療程給藥，但是不在同一天和/或在不同的療程內給藥。另一個方面，本發明提出了一種治療或預防患者癌癥的方法，包括給予患者本發明中的任何一種藥物組合物的有效治療量。有效治療量是指能引發免疫反應的量，特別是激活CTL亞群。本領域的技術人員可使用免疫學標準方法很容易確定使用量是否有效，如本說明書實施例中的方法。監測本藥物組合物某種量效果的方法是觀察受治療腫瘤的生長和/或其復發情況。在本發明藥物組合物的一個特別優選實施方案中，本藥物組合物作為抗癌疫苗使用。含肽組合物或肽編碼的核酸也可以構成腫瘤或癌癥的疫苗。該疫苗可直接給到患者的受影響器官，也可全身給藥，或體外應用到來自患者或其細胞株的細胞(隨后再將這些細胞注入到患者中)，或體外用于從來自患者的免疫細胞的一個細胞亞群(然后再將細胞重新給予患者)。本發明的藥物組合物可用于治療癌癥或作為癌癥疫苗使用。癌種可能是口腔癌、咽癌，消化道癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、呼吸道癌、乳腺癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、子宮體癌、卵巢癌、男性生殖道癌、尿道癌、骨癌、軟組織癌、卡波西肉瘤、皮膚黑色素瘤、眼黑色素瘤、非黑色素瘤眼癌、腦癌、中樞神經系統癌、甲狀腺癌、其他內分泌腺癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤，優選為腎癌、結直腸癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、腦癌、胃腸道間質瘤或膠質母細胞瘤。根據本發明，治療方法或疫苗的一個最優選實施方案中，疫苗為治療結直腸癌的一種多肽腫瘤疫苗。該疫苗優選包括從SEQIDNo.1至SEQIDNo.15選定的一系列腫瘤相關肽，它們已經被確定位于原發性結直腸癌中。這些肽包括HLA-I類和II類肽。這些肽還可至少包括乙肝病毒核心抗原中的一種肽，這種肽為正性控制肽，是檢測皮內給藥療效的免疫標記物。在一個特別的實施方案中，疫苗包括14種肽(根據SEQIDNo.1至SEQIDNo.15)，每種肽含量約為1500yg至75iig，優選為約1000yg至750yg，更優選為約500iig至600iig，最優選為約578yg，所有的肽都可用HPLC和離子交換色譜法進行純化，外觀為白色或類白色粉末。真空凍干粉最好溶于碳酸氫鈉，在室溫下重組后30分鐘用于皮內注射。根據本發明，肽的首選含量約為0.1至100mg，優選為約0.1至lmg，最優選為每500mg的溶液中約300iig至800yg。在此，如果未具體說明，"約"一詞系指給定值的+/_10%。技能嫻熟的人能根據以下因素調整肽的實際使用量，如患者個體的免疫狀態和/或特定癌種所提呈的TUMAP含量。本發明的肽可能有其它形式(無菌溶液等)，而不是真空凍干粉。本發明中含肽和/或核酸的藥物制劑給予罹患與各種肽或抗原相關的腺瘤或癌性疾病患者。通過這種方法可以觸發T細胞介導的免疫反應。根據本發明，優選的一種藥物組合物，其中(尤其是腫瘤相關的)肽、核酸或表達載體含量為組織、癌癥和/或患者特異性含量。本發明的另一實施方案中，疫苗為核酸疫苗。接種核酸疫苗(如DNA疫苗)編碼多肽會導致T細胞反應。該疫苗可直接給到患者的受影響器官，也可全身給藥，或體外應用到來自患者或其細胞株的細胞(隨后再將這些細胞注入到患者中)，或體外用于從來自患者的免疫細胞的一個細胞亞群(然后再將細胞重新給予患者)。如果核酸給予體外細胞，可能有益于細胞轉染，以共同表達免疫剌激細胞因子，如白細胞介素-2或GM-CSF。核酸可完全單獨給藥，也可與免疫剌激佐劑或與免疫剌激細胞因子聯合使用，或以適當的輸送系統給藥，例如脂質體。核酸疫苗可與佐劑一起使用，如上述與肽疫苗一起使用的佐劑。核酸疫苗優選為不與佐劑聯合給藥。多聚核苷酸可完全單獨給藥，可用合適的載體或輸送系統給藥。合適的載體和輸送系統包括病毒系統，如基于腺病毒、牛痘病毒、逆轉錄病毒、皰疹病毒、腺相關病毒或含一種以上病毒元素的混合病毒的系統。非病毒輸送系統包括陽離子脂質體和陽離子聚合物，都是DNA輸送本領域內熟知的方法。也可使用物理輸送系統，如通過"基因槍"。肽或核酸編碼的肽可以是一種融合蛋白，例如，含破傷風類毒素的一個表位(剌激CD-4陽性T細胞)。適當的情況是，給予患者的任何核酸都是無菌、無熱原的。裸DNA可肌肉注射、皮內注射或皮下注射。核酸疫苗優選可包括任何合適的核酸輸送工具。核酸，優選為DNA，也33可用一種脂質體或病毒載體輸送系統輸送。如果是核酸疫苗(如DNA疫苗)，首選注入肌肉，而肽疫苗首選皮下注射。疫苗也優選注入皮內。我們認為，核酸的吸收和專業抗原提呈細胞(如樹突狀細胞)編碼的肽的表達可能是免疫反應的啟動機制所致；然而，樹突狀細胞可能不會被轉染，但是由于它們可能會從組織中的轉染細胞中挑選出被表達的肽，因此仍然很重要("交叉啟動"，例如，ThomasAM，SantarsieroLM，LutzER，ArmstrongTD，ChenYC，HuangLQ，LaheruDA，GogginsM，HrubanRH，JaffeeEM.Mesothelin-specificCD8(+)Tcellresponsesprovideevidenceofinvivocross—primingbyantigen—presentingcellsinvaccinatedpancreaticcancerpatients.JExpMed.2004Aug2;200(3):297-306)。Conry等(1996年)在《腫瘤學論文集》(SeminarsinOncology23,135-147)中、Condon等(1996年)在《自然-醫學》(NatureMedicine2,1122-1127)中、Gong等(1997年)在《自然-醫學》(NatureMedicine3,558-561)中、Zhai等(1996年)在《免疫學雜志》(J.Immunol.156,700-710)中、Graham等(1996年)在《國際癌癥雜志》(IntJ.Cancer65,664-670)中、Burchell等(1996)309-313在BreastCancer,Advancesinbiologyandtherapeutics—文中、Calvo等(eds)、JohnLibbeyEurotext都對多聚核苷酸介導的癌癥免疫化治療進行了描述，以完整引用形式并入本文。這也可能有益于疫苗特異性靶向作用于細胞群(例如抗原提呈細胞)，可使用局部注射、使用靶向性載體和輸送系統、或對患者該類細胞群的選擇性純化以及體外給予肽或核酸(例如，樹突狀細胞可按Zhou等人(1995年)在Blood86,3295-3301中、Roth等人(1996年)在Scand.J.Immunology43,646-651中所述的方法進行分類)。例如，耙向性載體可包括一個組織或腫瘤特異性啟動子，引導抗原在適當的位置表達。最后，本發明的疫苗可由待治療患者具體的癌癥類型、以及疾病狀態、早期治療方案、患者免疫狀態所決定，當然，還有患者的HLA單倍型。此外，根據特定患者的個人需求，本發明的疫苗可包含個性化成分。根據特定患者的相關TAA的表達、由于個人過敏或其它治療方法而產生的意外副作用、以及第一輪治療后對二次治療或治療方案的調整，各實施例中的肽含量有所不同。本發明中的肽除了用于治療癌癥，也可用于診斷。由于肽由膠質母細胞瘤產生，并且這些肽確定不在正常組織中出現，因此這些肽可用于診斷癌癥是否存在。含本發明肽的組織切片有助于病理師診斷癌癥。用抗體、質譜或其它本領域內已知的方法檢測本發明的某些肽可使病理師判斷該組織為惡性的、炎癥還是一般病變。本發明肽的提出使得能對病變組織進行分類或進一步分成子類。對病變標本中本發明肽的檢測使得能對免疫系統治療方法的利益進行判斷，特別是如果T淋巴細胞已知或預計與作用機制有關。MHC表達的缺失是一種機制，充分說明了哪些受感染的惡性細胞逃避了免疫監視。因此，本發明肽的提出表明，分析過的細胞并沒有利用這種機制。本發明的肽可用于分析對本發明肽發生的淋巴細胞反應(如T細胞反應)，或對本發明肽發生的抗體反應，或分析本發明中與MHC分子絡合的肽。這些淋巴細胞反應可以作為預后指標，決定是否采取進一步的治療。這些反應也可以用作免疫療法中的替代指標，旨在以不同方式誘導淋巴細胞反應，如接種蛋白疫苗、核酸、自體材料、淋巴細胞過繼轉移。基34因治療中，對本發明肽發生的淋巴細胞反應可以在副作用的評估中考慮。淋巴細胞反應監測也可能成為移植療法復查中的一種有價值的工具，如，用于檢測移植物抗宿主和宿主抗移植物疾病。本發明中的肽可用于生成和開發出針對MHC/肽復合物的特定抗體。這些抗體可用于治療，將毒素或放射性物質靶向作用于病變組織。這些抗體的另一用途是為了成像之目的(如PET)將病變組織作為放射性核素的靶標。這可有助于檢測小轉移灶或確定病變組織的大小和準確位置。此外，可用這些肽在活檢樣本的基礎上驗證病理師對癌癥的診斷。在另一個方面，本發明涉及一種套件，包括(a)—個容器，包含上述溶液或凍干粉形式的藥物組合物；(b)可選項，第二個容器，含凍干粉劑型的稀釋劑或重組溶液；及(c)可選項，(i)使用溶液或(ii)重組和/或使用凍干粉劑型的說明。該套件還包括一個或多個(iii)緩沖劑，(iv)稀釋劑，(v)過濾液，(vi)針，或(v)注射器。容器優選為瓶子、西林瓶、注射器或試管；也可為多用途容器。藥物組合優選為凍干粉劑。本發明中的套件優選包含一種置于合適容器中的凍干制劑以及重組和/或使用說明。適當的容器包括，例如瓶子、西林瓶(如雙室瓶)、注射器(如雙室注射器)和試管。該容器可能由多種材料制成，如玻璃或塑料。優選情況是，套件和/或容器上有說明，表明重組和/或使用的指示。例如，標簽可能表明凍干劑型重組為上述肽濃度。該標簽可進一步表明制劑用于皮下注射。存放制劑的容器可使用多用途西林瓶，使得可重復給予(例如，2-6次)重組劑型。該套件可進一步包括裝有合適稀釋劑(如碳酸氫鈉溶液)的第二個容器。稀釋液和凍干制劑混合后，重組制劑中的終肽濃度優選為至少O.15mg/mL/肽(=75iig)，不超過3mg/mL/肽(=1500yg)。該套件還可包括商業和用戶角度來說可取的其他材料，包括其他緩沖劑、稀釋劑，過濾液、針頭、注射器和帶有使用說明書的包裝插頁。本發明中的套件可能有一個單獨的容器，其中包含藥品成分的制定根據與其他組件或無本發明(例如，其他化合物或及其藥物組合物)或可能有明顯的每個組件的容器。優選情況是，本發明的套件包括與本發明的一種制劑，包裝后與第二種化合物(如佐劑(例如GM-CSF)、化療藥物、天然產品、激素或拮抗劑、抗血管生成劑或抑制劑、凋亡誘導劑或螯合劑)或其藥物組合物聯合使用。該套件的組件可預絡合或每個組件在給予患者之前可放置于單獨的不同容器。該套件的組件可以是一種或多種溶液，優選為水溶液，更優選為無菌水溶液。該套件的組件也可為固體形式，加入合適的溶劑后轉換為液體，最好放置于另一個不同的容器中。治療套件的容器可能為西林瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器、或任何其他指裝載固體或液體的工具。通常，當多于一個組件時，套件將包含第二個西林瓶或其他容器，使得可以單獨計量。該套件還可能包含另一個裝載藥用液體的容器。優選情況是，治療套件將包含一個設備(如，一個或多個針頭、注射器、滴眼器、吸液管等)，使得可注射本發明的藥物(本套件的組合物)。本發明的藥物配方適合以任何可接受的途徑進行肽給藥，如口服(腸道)、鼻內、眼內、皮下、皮內、肌內，靜脈或經皮給藥。優選為皮下給藥，最優選為皮內給藥，也可通過輸液泵給藥。應該認識到，此處披露和描述的本發明特點不僅可聯合使用，而且也可以單獨的35方式使用，只要在本發明的預期用途范疇內。為了本發明之目的，所有參考文獻均以完整引用的形式并入本文。下列參考圖、序列表和實施例將對本發明進行詳細描述。以下實施例僅作為說明之用，而不是為了限制本發明。圖1:微球促使的外周血ODC-001和N0X-001特異性CD8+淋巴細胞增殖的四聚體技術分析。與抗CD28+高密度腫瘤抗原A*0201/0DC-001(上板)或抗CD28+高密度腫瘤抗原A柳201/N0X-001(下板)耦合的微球每周對每孔中健康HLA-A柳201的lxl06CD8+濃縮PBMC+供體HD100進行剌激。經過三次體外剌激，所有的細胞用抗體CD8FITC+四聚體A*0201/N0X-001PE和A*0201/0DC_001APC進行染色。細胞在淋巴細胞群或CD8+淋巴細胞(右板)上得到門控，并且數字代表四聚體+CD8+淋巴細胞群內的百分比。圖25個剌激周期后干擾素y酶聯免疫斑點(IFNyELISPOT)檢測到的TGFBI-004體外免疫原性。TGFBI-004反復引發和再剌激細胞，然后以分別相關TGFBI-004(第1、2、3禾口4孑L)和不相關(陰性對照)肽進行培養。IFNyELISPOT檢測后，對ELISPOT閱讀器(CTL公司，美國克利夫蘭)進行分析。植物血凝素離子霉素作為陽性對照。數字表示陽性點計數。圖3:5個剌激周期后ICS檢測到的TGFBI-004體外免疫原性。負載TGFBI-004的DC引發細胞，自體PBMC+TGFBI-004反復再剌激細胞。對于讀出細胞分別以相關TGFBI-004(第1、2、3和4孔)和不相關(陰性對照)肽進行培養。除了細胞內IFNy染色，細胞還用CD4-FITC和CD8-PerCP抗體染色。用四色流式細胞儀(BD生物科學公司，德國)進行分析。圖4:NOX-OOl肽體外重剌激后T細胞株產生IFNy的ELISPOT分析。A.T細胞株7+源自供體HBC-154(分選的CD8+N0X-001四聚體+);B.T細胞株7-源自供體HBC-154(分選的CD8+N0X-001四聚體_)。分選的CD8+N0X-001四聚體+(A.)和分選的CD8+N0X-001四聚體-(B.)細胞在用不相關(MLA-001)(上孔)和相關(N0X-001)(下孔)肽(10yg/ml)重新剌激之后，用IFNyELISPOT法分析。數字表示陽性點計數。圖5:四個HLA-A2健康供體用CEA-004剌激后流式細胞術分析得出的CEA-004特異性CD8+T細胞頻率。圖6:HLA-A*0201等位基因編碼的本發明HLA-I類肽對MHC分子的親和性。實施例1.合成與結構肽通過使用Fmoc化學以標準、廣為接受的固相合成法合成。制備液HPLC純化之后，進行離子交換純化程序從而加入生理相容性反離子(醋酸或氯化物)。最后，在凍干后制得白色至類白色固體。在制造過程中由于技術原因，除了IMA-CCN-001以氯化鹽形式存在之外，其它所有TUMAP都作為醋酸鹽給予。重要的是，肽的身份和純度可很容易使用質譜、氨基酸分析法和HPLC分析法確定，并且確認精確度高。根據分析結果，IMA910疫苗所用的所有肽都顯示出正確的結構，純度為95%以上。表IMA910肽的物理化學特征<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>重組后獲得的顆粒，通過直接捕捉每個顆粒(0.25至100ym)的圖像之后進行分析從而測量其粒度分布和顆粒形狀。結果發現大多數(>95%)粒子的大小在0.25至0.27iim之間。到目前為止，在重組后1、2或3小時內未發現顆粒大小和形狀分布上有很大的差異。2.典型藥物組合物IMA910的組成IMA910由合成腫瘤相關肽(TUMAP)的混合物組成，其中大部分已在原發性結直腸癌細胞中得到確定。TUMAP包括10種能激活細胞毒性T細胞(CD8+T細胞)的HLA-I類結合肽以及3種能激活T輔助細胞(CD4+T細胞)的HLA-II類結合肽。輔助性T細胞通過釋放細胞因子而輔助細胞毒性T細胞的功能，此類細胞因子能提高CD8+T細胞殺傷力，也可直接作用于月中瘤細胞(Knutson，KLandDisis，ML;AugmentingThelpercellimmunityincancer,Curr.DrugTargets.Immune.Endocr.Metabol.Disord.，2005，5，365-371)。除了這13種TUMAP夕卜，IMA910包含一種病毒控制肽。手術切除的惡性腫瘤樣本和結直腸腸癌患者的正常組織以及健康供體的血液以循序漸進的方法進行分析首先使用微陣列全基因組mRNA表達分析法來確定惡性腫瘤組織與一系列正常器官和組織相比過度表達的基因。在第二個步驟中，惡性腫瘤的HLA配體用質譜法確定。隨后，確定的HLA配體與基因表達數據進行比較。第1步中檢測到的選擇性表達或過度表達基因所編碼的肽考慮為多肽疫苗的合適候選TUMAP。文獻檢索以確定更多證據以支持確認為TUMP的肽的相關性。最后，使用多種免疫檢測方法(體外T細胞檢測法)檢測健康個體中的外周血CD8+T細胞對腫瘤相關HLA配體的活性。表3:IMA910TUMAP組合物。IMA910含有10種HLA_A*02(I類)和3個HLA-DR(II類)TUMAP。此外，也包括HBV-001病毒標志物肽，在此未羅列。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>3.腫瘤樣本中IMA910所含表位的提呈制備手術切除組織標本由UniversitatsklinikfiirAllgemeine，Viszeral—undTransplantationschirurgie，Tubingen獲得每名患者的書面知情同意后提供。從組織樣本中分離HLA肽根據方案略加修改，使用HLA-A*02特異性抗體BB7.2或HLA-A、HLA-B、HLA-C特異性抗體怖/32、CNBr活化的瓊脂糖凝膠、酸處理和超濾方法以固體組織的免疫沉淀法獲得了冷休克組織樣本的HLA肽庫(Falk，K.，Rotzschke，0.，Stevanovic，S.，Jung，G.&Rammensee，H.G.Allele—specificmotifsrevealedbysequencingofself-p印tideselutedfromMHCmolecules.Nature1991，351，290-296;Seeger，F.H.etal.TheHLA—A稱601peptidemotif:predictionbypocketstructureandverificationbypeptideanalysis.Imm皿ogenetics1999，49，571-576)。用電噴霧液相色譜質譜(ESI-LCMS)檢測TUMAPIMA910所含表位用質譜法在結直腸癌樣本上進行了系統搜索。獲得HLA肽庫根據其疏水性用反相色譜(C即LC，Waters)分離，洗脫肽用裝備電噴霧源的四極桿_飛行時間串聯質譜(Q-TOFUltima,Waters)進行了分析。肽庫被載到C18預處理柱進行濃縮和脫鹽。載入后，C18預處理柱排成一行，用填充5ymC18反相材料(Dionex)的熔煉石英微毛細管柱(75iim內徑x250mm)進行分離。溶劑A為4mM醋酸銨/水。溶劑B為2M濃度為80%乙腈/水中的醋酸銨。這兩種溶劑均用甲酸將pH值調整為3.0。對15X至60X的溶劑B在90分鐘內進行二元梯度色譜法分析，分流系統將應用流量從5ii1/min降低至200nl/min。金鍍膜玻璃毛細管(PicoTip，NewObjective)用于引入到微電噴霧源。T0F分析儀的積分時間為1.9秒，掃描間延遲時間為0.l秒。對于已定義肽的檢測，根據已知分子量和肽在色譜系統中的停留時間，在ESI-LCMS實驗中進行了高靈敏度篩選。因此，在選擇前體中，應用一個清單，其中含先前確定的肽(單電荷和/或雙電荷)的m/z值。隨后，用碰撞誘導解離(CID)質譜(ESI-LCMS/MS)揭示序列。生成的自然TUMAP破碎模式與合成序列相同參考肽的破碎模式進行比較后，確保了TUMP的序列。使用企業內標準-豐富內源性HLA-A*02肽(從DDX5獲得的YLLPAIVHI)的強度和存留時間，評價了HLA純化產量和分析系統的可復制性，包括保留時間的穩定性。因此，這些實驗中為了檢測先前確認的TUMAP所用的結直腸癌樣本納入標準在LCMS/MS實驗中(企業內標雙電荷信號，YLLPAIVHI)每次掃描的最小強度設定為650次，以確保成功分離HLA肽以及分析系統的性能。表3顯示了不同階段結腸和直腸癌樣本以及源自這兩種原發性腫瘤轉移癌的分析結果。大部分樣本中都發現了所有HLA-A柳2TUMAP。HLA-DRTUMAP—般很少需要再次檢測。這是因為每個核心序列都可能村子HLA-II類肽、幾種長度可變的變體。表3:重新檢測結直腸癌樣本中的TUMAP<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>n.a.未作分析4.IMA910MHC-I類提呈肽的體外免疫原性為了獲知關于IMA910包括的肽免疫原性方面的信息，我們使用了Walter,S、Herrgen，L、Schoor，0、J皿g，G、Wernet，D、Buhring，HJ、Rammensee，HG禾口Stevanovic,S等人2003年在Cuttingedge-predeterminedavidityofhumanCD8TcellsexpandedoncalibratedMHC/￡mti_CD28_co￡itedmicrospheres,J.Immunol.，171，4974-4978—文中所述的被廣為接受的體外剌激平臺進行了研究。用這種方法，IMA910中得到檢測的10種HLA-A*0201限制肽都顯示出正向免疫原性數，這表明這些肽為人CD8+前體T細胞的T細胞表位。IMA910(MUC-001)中所含的唯一另外一種HLA-I類肽不能使用此方法進行檢測，因為該TUMAP的A*0201親和力較低。最近的證據給CEA-005對癌癥疫苗的用處帶來了嚴峻的挑戰。在最近的一項綜合石開究中(Iero，M，Squareina，P，Romero，P，Guillaume，P，Scarselli，E，Cerino，R，Carrabba，M，Toutirais，0，Parmiani，G，Rivoltini，L;LowTCRavidityandlackoftumorcellrecognitioninCD8(+)TcellsprimedwiththeCEA-analogueCAP1-6Dpeptide,CancerImmunolImmunother.2007Dec;56(12):1979-91)，作者首次系統地描述了CEA-005激活的T細胞對原生序列CEA-004的效應子功能。在結直腸癌患者和健康者的大量血液樣本中，觀察到T細胞和CEA-005的激活可重復促進低親和性T細胞(這些細胞無能力識別表達CEA的結直腸癌細胞提呈的原生序列)的生成。對原生序列進行這種無效低親和力交叉識別可能時使用改變肽配體的疫苗接種方案中普遍存在的一個問題，在另一種CEA肽及其改變激動劑的最近報道中有相似結果也證實了這一點(Alves，PM，Viatte，S，Fagerberg，T，Michielin，0，Bricard，G，Bouzourene，H，Vuilleumier，H，Kruger，T，Givel，JC，Levy,F，Speiser，DE，Cerottini，JC，Romero,P;Imm皿ogenicityofthecarcinoembryonicantigenderivedpeptide694inHLA—A2healthydonorsandcolorectalcarcinomapatients，CancerImmunol.Immunother.，2007，56，1795-1805)。此夕卜，在廣為接受的黑色素瘤抗原Melan-A/MART-1及其激動劑的原生序列中也報告了這樣的結果(D.Speiser，私下交流)。總之，盡管改變激動劑肽的免疫原性普遍增強，但是最近的證據表明，原生肽可能是更具吸引力的候選疫苗，因為改變激動劑剌激的T細胞對其原生序列的交叉識別能力不足。這表明，CEA-004(CAP1)應優選為其激動劑，如W09919478A1中所述，如，CEA-005(CAP1-6D)或CAP1-6D，71。事實上，大量數據表明了原生CEA-004序列本身的重要體外免疫原性。在一些研究中，已發現了癌癥患者(不是健康供體)對這種肽發生了自發性誘導T細胞反應(Nagorsen，D，Keilholz，U，Rivoltini，L，Schmittel，A，Letsch，A，Asemissen，AM，Berger，G，Buhr，HJ，Thiel，E，Scheibenbogen，C;NaturalT—cellresponseagainstMHCclassIepitopesofepithelialcelladhesio腹olecule，her_2/neu，andcarcinoembryonicantigeninpatientswithcolorectalcancer,CancerRes.2000，60，4850—4854;Weihrauch，MR，Ansen，S，Jurkiewicz，E，Geisen，C，Xia，Z，Anderson,KS，Gracien，E，Schmidt,M，Wittig，B，Diehl，V，Wolf，J，Bohlen，H，Nadler，LM;PhaseI/IIcombinedchemoimmunotherapywithcarcinoembryonicantigen-derivedHLA_A2_restrictedCAP_1peptideandirinotecan，5_fluorouracil,andleucovorininpatientswithprimarymetastaticcolorectalcancer,ClinCancerRes.2005,11，5993-6001;Babatz，J，Rollig，C，Lobel，B，Folprecht，G，Haack，M，Gunther，H，Kohne，CH，Ehninger，G，Schmitz，M，Bornhauser，M^Inductionofcellularimmuneresponsesagainstcarcinoembryonicantigeninpatientswithmetastatictumorsaftervaccinationwithalteredpeptideligand-loadeddendriticcells,CancerImmunol.Immunother.2006，55，268-276)。此夕卜，使用CEA-004或CEA蛋白進行的疫苗接種方法已經被證明能有效刺激對CEA-004的T細胞反應(Tsang，KY，Zaremba，S，Nieroda，CA，Zhu，MZ，Hamilton,JM，Schlom，J^GenerationofhumancytotoxicTcellsspecificforhumancarcinoembryonicantigenepitopesfrompatientsimmunizedwithrecombinantvaccinia—CEAvaccine,JNatl.CancerInst.1995，87，982—990;Morse，MA，Deng，Y，Coleman，D，Hull,S，Kitrell-Fisher，E，Nair，S，Schlom，J，Ryback，ME，Lyerly，HK;APhaseIstudyofactiveimmunotherapywithcarcinoembryonicantigenpeptide(CAP-l)-pulsed,autologoushumancultureddendriticcellsinpatientswithmetastaticmalignanciesexpressingcarcinoembryonicantigen,ClinCancerRes.1999，5，1331-1338;Zhu，MZ，Marshall,J，Cole，D，Schlom，J，Tsang，KY;SpecificcytolyticT—cellresponsestohumanCEAfrompatientsimmunizedwithrecombinantavipox—CEAvaccine,ClinCancerRes.2000，6，24_33;Weihrauch，MR，Ansen，S，Jurkiewicz，E，Geisen，C，Xia，Z，Anderson,KS，Gracien，E，Schmidt,M，Wittig，B，Diehl，V，Wolf，J，Bohlen，H，Nadler，LM;PhaseI/IIcombinedchemoimmunotherapywithcareinoembryonicantigen_derivedHLA_A2_restrictedCAP—lpeptideandirinotecan,5_fluorouracil,andleucovorininpatientswithprimarymetastaticcolorectalcancer,ClinCancerRes.2005，11，5993—6001)。CD8+T細胞體外啟動為了用載有肽-MHC復合物(p腿C)和抗CD28抗體的人工抗原提呈細胞(aAPC)進行體外剌激，我們首先運用標準密度梯度分離介質(德國科爾貝PAA公司)從新鮮HLA-A柳2+血沉棕黃層中分離出PBMC(外周血單核細胞)。血沉棕黃層從Tubingen或KatharinenhospitalStuttgart的血庫獲得。分離出的PBMC在T細胞培養基(TCM)中培養過夜，在體外填裝，包括RPMI-Glutamax(Invitrogen公司，卡爾斯魯厄，德國)并補充10%熱滅活人AB血清(PAA公司，科爾貝，德國)，100U/ml青霉素ml/100yg/ml鏈霉素(Cambrex公司，韋爾維耶，比利時)，lmM丙酮酸鈉(CCPro公司，Neustadt，德國)和20iig/ml慶大霉素(Cambrex公司)。CD8+淋巴細胞根據制造商的說明使用CD8+MACS陽性選擇套件(Miltenyi公司，BergischGladbach，德國)進行分離。獲得的CD8+T細胞培養，直到TCM補充了2.5ng/ml的IL-7(PromoCell公司，海德堡，德國)和10U/ml的IL-2(Chiron公司，慕尼黑，德國)后才使用。pMHC/抗-CD28涂層珠的生成、T細胞的剌激和讀出方法如前所述(Walter,S，Herrgen，L，Schoor，0，J皿g，G，Wernet，D，Buhring，HJ，Rammensee，HG，andStevanovic，S;Cuttingedge-predeterminedavidityofhumanCD8TcellsexpandedoncalibratedMHC/anti_CD28_coatedmicrospheres,J.Immunol.，2003，171，4974-4978)并作微小改動。簡言之，缺乏跨膜域和在重鏈羧基端中生物素化的生物素化重組HLA-A*0201分子用以下所述方法制成(Altman，JD，Moss，PA，Goulder，PJ，Barouch，DH，Heyzer-Williams，MG，Bell，JI，McMichael，AJ，andDavis，匪；Phenotypicanalysisofantigen-specificTlymphocytes,Science,1996，274，94-96)。純化的共剌激小鼠IgG2a抗人CD28抗體9.3(J皿g，G，Ledbetter，JA，andMuller-Eberhard，HJ;InductionofcytotoxicityinrestinghumanTlymphocytesboundtotumorcellsbyantibodyheteroconjugates，ProcNatlAcadSciUSA，1987，84，4611-4615)使用制造商(Perbio公司，波恩，德國)推薦的N-羥基琥珀酰亞胺生物素進行化學生物素化處理。所用珠為5.60iim的大鏈霉抗生物素蛋白包裹的多聚苯乙烯顆粒(BangsLabooratories，伊利諾伊州/美國)。作為陽性和陰性對照的pMHC分別為A*0201/MLA-001(從Melan-A/MART-l中修飾制得的肽ELAGIGILTV)和A*0201/DDX5_001(從DDX5中獲得的YLLPAIVHI)或A初201/HBV-001(FLPSDFFPSV)。800.000珠/200y1包裹于96孔板，以600ng生物素抗CD28+200ng相關生物素pMHC(高密度珠)或2ng相關+200ng不相關(pMHC庫)MHC(低密度珠)存在。在37。C下，在含5ng/mlIL-12(PromoCell)的200ii1TCM中共培養lxl06CD8+T細胞與2xl05的清洗涂層珠3至4天，從而啟動剌激。之后，一半培養基與補充80U/mlIL-2的新鮮TCM進行交換，并且培養在37t:下持續3至4天。這種剌激性周期總共進行3次。最后，在四色流式細胞儀(BD公司)上用熒光MHC四聚體(如Altman，JD，Moss，PA，Goulder，PJ，Barouch，DH，Heyzer-Williams，MG，Bell，JI，McMichael，AJ，andDavis，匪；Phenotypicanalysisofantigen-specificTlymphocytes,Science,1996，274，94_96所述方法制得)+抗體CD8-FITC克隆SK1(BD公司，海德堡，德國)進行四聚體分析。肽特異性細胞以占總CD8+T細胞的百分比形式進行計算。四聚體分析結果用FCSE鄧ress軟件(DeNovoSoftware公司)進行評估。特定四聚體+CD8+淋巴細胞的體外填裝用適當的門控技術以及與陰性對照剌激組比較而進行檢測。如果健康供體中的至少一個可評價的體外剌激孔在體外剌激后發43現含有特異性CD8+T細胞株(即該孔包含至少lX特定四聚體+CD8+f細胞，并且特定四聚體+的百分比至少為陰性對照剌激中位數的io倍)，則檢測給定抗原的免疫原性。10IMA910肽的體外免疫原性對于全部10種受到測試的HLA-I類肽，可通過肽特異性T細胞株的生成證明其體外免疫原性。代表性染色顯示產生的N0X-001和0DC-001特異性T細胞株如圖1所示。結果見表4。IMA910(MUC-001)中所含的唯一另外一種HLA-I類肽不能使用此方法進行測試，因為該TUMAP的A*0201親和力較低，因此這使之在方法學上不可能使用pMHC單體進行此類剌激。表4:IMA910所含10種HLA-I類肽的免疫原性<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>Immatics公司針對IMA910所含11種HLA-I類肽中的10種進行了體外免疫原性實驗，結果總結如下。所示結果通過剌激高密度珠CD8+細胞而獲得。由于不同批次的血清可能會大大影響免疫原性的結果，所以只評價了那些只使用同一批次血清的化驗結果。IMA-CEA-004體外剌T細胞有4/6的供體可進行評價。在所有四個供體中，用CEA-004剌激后，能成功地誘導CEA-004針對T細胞的體外反應(見圖表)。因此，CEA-004肽被證明是人CD8+T細胞體外反應的一個很強的誘因。重要的是，CEA-004與CEA-005相比，可反復引發更高頻率的CEA-004特異性T細胞反(83%的孔對64%的孔，見表4)。與CEA-005剌激相比，CEA-00444剌激后，各個陽性孔內CEA-004特異性細胞的頻率也較高(見圖5)。流式細胞分析確定的4個健康HLA_A*02供體的肽特異性CD8+T細胞體外反應CD8+T細胞用分別載有CEA-004、CEA-005或不相關肽(IMA-RSL-OOl)的人工抗原提呈細胞引入。經過3個周期的剌激后，用CEA-004-+CEA-005四聚體(表5A.)和CEA-004—不相關A柳201-四聚體(表5B.)雙染色對肽反應性細胞進行檢測。表中顯示的數代表須含有CEA-004+或CEA-005+CTL的孔所占百分比。所有實驗使用的人血清批次均為C02104-0167。表5A.<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表5B.<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>CD8+T細胞從PBMC中分離，用分別載有CEA_004、RSL-001或DDX5-001肽的人工抗原提呈細胞引入。經過3個周期的剌激后，用CEA-004—不相關A*0201-四聚體染色對肽反應性細胞進行檢測。上述這些值代表了每個剌激孔CEA-004特異性細胞的百分比。RSL-001和DDX5-001剌激作為陰性對照。圖5顯示了四個HLA-A2健康供體用CEA-005剌激后流式細胞術分析得出的CEA-004特異性CD8+T細胞頻率。陽性對照孔的閾值分別適用于每個供體(—)，并確定為陰性對照中位數的IO倍，而且其值至少為1%。百分比高于閾值(>1%)的孔被認為是陽性的，用粉紅色菱形表示，而陰性對照孔用黑色菱形表示。5.IMA910MHC-II類提呈肽的體外免疫原性輔助T細胞在協助CTL激活和維持腫瘤細胞的免疫反應中發揮著重要作用。因此，MHC-II類肽被列入IMA910。TGFBI-004,IMA910中三個II類肽之一，對其體外免疫原性潛力進行了檢測，結果證明它既是特異性CD4+T細胞也是CD8+T細胞的一種誘導物。使用自體系統剌激的實驗顯示生成了CD4+和功能性CD8+T淋巴細胞。測試原理特異性人CD4+和CD8+細胞的啟動和擴增使用自體DC、通過單核細胞缺乏的PBMC啟動以及使用自體PBMC進行重新剌激而進行體外檢測。簡言之，為了生成抗原特異性CD4+T細胞，健康供體的單核細胞缺乏的PBMC(HLA基因型I類A1/A25/B8/B18和II類DQB1*02/DQB1*06/DRB1*03/DRB1*15/DRB3/DRB5)使用肽脈沖擊自體DC進行了剌激并且使用了自體PBMC+肽進行了再剌激。作為一個讀出系統，短期重剌激后的IFNy產量用ELISPOT和流式細胞術進行了評估。在ELISPOT和細胞內IFNy染色+CD4-FITC和CD8-PerCPT剌激8次之后，對T細胞進行了分析以確定特異性T細胞亞群中產生IFNy細胞的百分比。在本實驗中，對不同孔中的TGFBI-004所剌激的細胞，進行匯集、使用讀出的不相關肽進行培養并作為陰性對照。樹突狀細胞(DC)的生成人DC從DC培養基中培養的單核細胞獲得，培養基包括RPMI1640-Glutamax/25mMH印es(Invitrogen公司，德國)禾P10%自體血槳〃100U/ml青霉素和100iig/ml鏈霉素。首先，血沉棕黃層和血漿經離心健康供體血液而獲得(Tubingen血庫)。然后，PBMC使用標準密度梯度分離法(淋巴細胞分離液，PAA公司，奧地利)從血沉棕黃層中分離，并在DC培養液中懸浮以確定總細胞數。洗滌100-120MioPBMC，在15mlX-Vivo20培養基BioWhittaker公司，比利時)中重新懸浮，并轉移至細胞培養瓶。在37。C下待2小時后，含外周血白細胞(PBL)的培養液被清除，粘附單核細胞用10mlPBS洗滌兩次并在用lOOng/mlGM-CSF和30ng/mlIL-4(I匪noTools公司，德國)或20ng/ml(R&Dsystems公司，德國)在10mlDC培養液中培養6天。在第3天和第5天，加入lOOng/mlGM-CSF和30ng/mlIL-4(Immunotools公司)或20ng/mlIL-4(R&DSystems公司，德國)。第7天，未成熟的DC用10ng/mlTNF-a(R&DSystems公司，德國)和20iig/ml多聚(IC)(SigmaAldrich公司，德國)或100ng/mlLPS剌激24小時。其余的PBMC以及獲得的PBL進行等分和冷凍。特異性T細胞體外啟動為了生成CD4+T細胞，用2X105自體DC對3MioPBMC/PBL進行剌激。DCZ在第8天收集(參見第3.1章，"DC的生成")。含5mM乙二胺四乙酸的PBS用于獲得盡可能多細胞之目的(包括粘附細胞)。DC培養液洗滌后，確定細胞數。為了裝載肽，DC在lmlDC培養液中再懸浮并用25iig/ml在37t:下培養2小時。用于沖擊DC的肽為TGFBI_004、Posmix(EBV和CMV相關肽的混合物)、Padre和CMV。解凍自體PBMC/PBL、用DC培養液洗滌(至少兩次)并在24孔板中展開，密度為lml中3Mio細胞/ml。然后，將載有肽的DC加入(如含肽的lml懸浮液)到入板的PBMC/PBL并在37t:下培養7天。啟動后，首先用已接受照射(30Gy;Gammacell1000Elite照射儀，NordionInternational公司，加拿大)。為此目的，每孔加入5xl05CTL和2、5xl06PBMC。使用肽對PBMC進行沖擊如前所述(針對DC的方法)。第一次重新剌激的第1天，加入IL-2(R&DSystems公司，德國)和IL-7使最終濃度分別為2ng/ml和5ng/ml。此后，在每個第2天和第7天，向培養液加入IL-2和IL_7。7天后進行第二次重新剌激，但這次只向培養的CTL加入肽(不加入PBMC)。重剌激7天為一周期用負載肽的PBMC和單肽交替加入。在第8次剌激之后，用細胞內IFNy和IFNyELISPOT法進行分析。結果啟動對相關肽特異性反應的CD4+T細胞株是可能的(圖2和圖3)。可通過ELISPOT法在4個細胞株中檢測到其中2個有T細胞反應，而使用ICS法的檢測結果表明，有四分之三的T細胞株TGFBI-004特異性IFNy產生CD4+和/或CD8+細胞。因此，用上述實驗系統的測試中，TGFBI-004能引發供體的CD4+和CD8+T細胞反應。根據這一有前景的結果，很可能這種肽具有免疫原性，并有能力誘導T細胞反應。6.NOX-001和TGFBI-001功能驗證舉例46IMA910疫苗中所含肽的免疫原性使用immatics—TUMAP驗證平臺進行了論證。對特異性T細胞的誘導說明了肽有能力成功地成功激活免疫系統。由于只有激活的T細胞具有高親合力和功能性時才有可能發生有效的抗腫瘤免疫反應，因此，我們進一步研究了TUMAP以通過其IFNy或殺死腫瘤細胞株的能力而激活其高親合力和T淋巴細胞的功能。由于N0X-001和TGFBI-001能體外誘導CTL的高親合力，因此選擇這兩種肽進行深入驗證。我們能夠證明，高親合力前體T細胞對人體肽和NOX-001能產生的CD8+T細胞株都有作用。測試原理為了對IMA910肽免疫原性和特異性T細胞的特性更加深入的認識，選定NOX-001和TGFBI-001這兩種肽作進一步的評估。為此目的，在Immatics公司進行了實驗(細胞分選在Tubingen大學的Dr.B他ring實驗室進行)。T細胞株依據其被高密度或低密度抗原激活的能力大小，可分為高或低親合力T細胞株。如先前研究所示，(Walter,S，Herrgen，L，Schoor，0，Jung，G，Wernet，D，Buhring，HJ，Rammensee，HG，andStevanovic,S;Cuttingedge-predeterminedavidityofhumanCD8TcellsexpandedoncalibratedMHC/anti_CD28_coatedmicrospheres,J.Immunol.，2003，171,4974-4978)，與低親合力CD8+T細胞相比，人高親合力CTL可使用較少肽進行激活而成功獲得。研究還表明，細胞以這種方式擴增可更有效地識別抗原表達細胞株，從而構成了開發治療策略的一個可能的主要工具。為了能夠確定肽生成高親合力CTL株的能力，用含低密度pMHC(肽-MHC-復合體)涂層珠和含IL-12與IL-2的抗CD28抗體對分離出來的人CD8+細胞進行反復剌激從而使之啟動和擴增。經過三次剌激后，激活T細胞的一部分以四聚體染色和流式細胞術法檢測。之后，根據其抗原特異性，對每個供體的四聚體陽性細胞進行儲存，以PMHC-四聚體和人抗CD8-FITC抗體進行染色，最后在FACSAria上進行FACSA分類。分類過的細胞在照射過的飼養細胞、細胞因子及絲裂素中培養和擴增。為了讀出高親合力抗原特異性細胞的生成情況，進行四聚體法染色。為了確定它們的功能，在以相應的肽和腫瘤細胞株重剌激這些細胞后，用ELISPOT法測定IFNy的產量，并在死/活細胞染色的基礎上，使用細胞毒性測定法檢查腫細胞株的殺傷情況。特異性CD8+T細胞株的生成如上所述，我們應用載有肽-MHC復合體(pMHC)和抗-CD28抗體的人工剌激抗原提呈細胞(aAPC)進行了體外剌激。與上述方法唯一的區別就是進行剌激用的珠裝載有2ng相關+200ng不相關庫內(pMHC)MHC(低密度珠)，而不是200ng相關MHC(高密度珠)。因此，高親合力T細胞的產生主要是為了對肽進行更深入的驗證。經過三次剌激后，激活T細胞的一部分以四聚體染色和流式細胞術測。如果健康供體中的至少一個可評價的體外剌激孔在體外剌激后發現含有特異性CD8+T細胞株(即該孔包含至少lX特定四聚體+CD8+f細胞，并且特定四聚體+的百分比至少為陰性對照剌激中位數的10倍)，則檢測給定抗原的免疫原性。之后，根據其抗原特異性，對每個供體的四聚體陽性細胞進行儲存，以相應的pMHC-四聚體和人抗CD8-FITC抗體克隆SKI進行染色，最后在FACSAria(BDBiosciences公司，德國)上進行FACSA分類。分類過的細胞在含有5x105細胞/ml照射過的新鮮異源PBMC、5x104細胞/ml照射過的LG2-EBV細胞、150U/mlIL_2(Chiron公司，慕尼黑，德國)和0.5iig/mlPHA-L(RocheDiagnostics公司，Mannheim，德國)的T細胞培養基中培養(培養基為RPMI-Glutamax，補充有10%熱滅活人AB血清、100U/ml青霉素、100iig/ml鏈霉素、ImM丙酮酸鈉和20iig/ml慶大霉素)。這些細胞在含150U/mlIL_2的T細胞培養基中擴展。為了讀出高親合力抗原特異性細胞的生成情況，如前述方法進行四聚體法染色并在四色FACSCalibur上進行了分析(BDBiosciences公司，德國)。功能性測試為了確定它們的功能，在以相應的肽重剌激這些細胞后，用ELISPOT法(IFNYELISPOTSet，BD公司，德國)評估IFNY的產量。此外，細胞介導的特異性CTL的細胞毒性使用LIVE/DEAD(死/活)細胞介導的細胞毒性套件(L7010,Invitrogen公司，德國)殺死腫瘤細胞株而進行了研究。除非另有說明，否則上述兩種測定方法都根據制造商的指示進行。結果用低密度pMHCaAPC成功啟動后顯示，NOX-001和TGFBI-001這兩種肽具有體外免疫原性。對于NOX-001以及TGFBI-001特異性T細胞株可以用FACS建立，從而證明高親合力CD8+T細胞前體存在于健康供體中。此外，對于NOX-OOl，可確定一個T細胞株，ELISPOT法也證明了其功能，因為在用這種肽重剌激后，NOX-001特異性表達IFNy(圖4)。7.將本發明中的HLA-I類限制肽與HLA_A*0201結合本分析的目的是評價HLA-I類肽對HLA_A*0201等位基因編碼的腿C分子的親和力，因為這是IMA910作用模式的一項重要參數。IMA910中90%的HLA-I類限制肽都對HLA-A*0201有很高的親和力，解離常數(KD)范圍為0.001到0.2nM。同時，病毒標志物肽IMA-HBV-001還表現出較強的結合力。對IMA-MUC-OOl的親和力大約減弱20倍。這些結果證實，IMA910候選疫苗中90%的HLA-I類肽對MHC分子具有較強的結合親和力。測試原理穩定HLA/肽復合物包括三種分子HLA重鏈、P_2微球蛋白(b2m)和肽類配體。變性重組HLA-A*0201重鏈分子的活性便可進行保存，使之功能與"空載HLA-A*0201"相當。被稀釋為包含b2m和相應肽的水緩沖液后，這些分子以完全肽依賴方式迅速有效地折疊。這些可用的分子用于基于ELISA的檢測方法中，來衡量肽和HLA-I類分子相互作用間的親和力(Sylvester-Hvid等，2002)。純化的重組HLA_A*0201分子與b2m、不同等級劑量的肽一起培養。從頭折疊HLA/肽復合物的量用定量ELISA法測定。解離常數(KD值)使用從校準HLA/肽復合物稀釋液中記錄的標準曲線進行計算。結果結果如圖6所示。較低的KD值反應對HLA-A柳201具有較高的親和力。大多數IMA910肽和病毒控制肽IMA-HBV-001在0.001(IMA-TGFBI-OOl)到0.2nM(IMA-0DC_001)的范圍內對HLA-A柳201都具有相似的較強親和力。IMA-MUC-001與大多數配體相比，其親和力低20-30倍。然而，在immatics公司先前所做的一項臨床試驗中，接種IMA_MUC_001-001導致了腎細胞癌患者的免疫反應，因此，不必擔心IMA-MUC-001較低的親和力。權利要求一種藥物組合物，其包括至少有兩種肽，這兩種肽含有從SEQIDNO1至SEQIDNO7組成的基團中所選的氨基酸序列、和/或含有與SEQIDNO1至SEQIDNO7組成的基團80％同源的一個變異氨基酸序列，和/或含有編碼為SEQIDNO1至SEQIDNO7核酸的多聚核苷酸或變異氨基酸序列，以及一種藥用載體。2.根據權利要求1所述的藥物組合物，其進一步包括至少另外一種肽，這種肽含有從SEQIDNO8至SEQIDNO15組成的基團中所選的一個氨基酸序列、或含有與SEQIDNO8至SEQIDNO15組成的基團至少80X同源的一個變異氨基酸序列，或含有編碼為SEQIDNO8至SEQIDNO15核酸的多聚核苷酸或變異氨基酸序列。3.根據權利要求1或2所述的藥物組合物，其中該肽總長度為8至100個氨基酸、優選為8至30個氨基酸，最優選為8至16個氨基酸。4.根據權利要求1-3任一項中所述的藥物組合物，其中至少有一種肽包含非肽鍵。5.根據權利要求1-4任一項中所述的藥物組合物，至少包括兩種含有從SEQIDNO1至SEQIDNO15所選的氨基酸序列的肽。6.根據權利要求l-5任一項中所述的藥物組合物，其中所含肽的選擇、數量均特異性地針對具體的組織、癌癥和/或患者。7.根據權利要求l-6任一項中所述的藥物組合物，其進一步包括至少一種合適的佐劑，該佐劑系選自含下列各物的群組，包括1018ISS、鋁鹽、Amplivax、AS15、BCG、CP-870，893、CpG7909、CyaA、dSL頂、GM-CSF、IC30、IC31、Imiquimod、ImuFact頂P321、ISPatch、ISCOMATRIX、Juvlmmune、LipoVac、MF59、單磷酰脂A、Montanide頂S1312、MontanideISA206、MontanideISA50V、MontanideISA_51、0K_432、0M_174、0M-197-MP-EC、0NTAK、PepTel⑧載體系統、PLG微粒、resiquimod、SRL172、病毒顆粒和其他病毒樣顆粒、YF-17DBCG、Aquila公司的QS21剌激子、Ribi，sDetox。Quil、Superfos、Freund's、GM-CSF、霍亂毒素、免疫佐劑、MF59和細胞因子。8.根據權利要求7中所述的藥物組合物，其中佐劑系由集落剌激因子組成的群組中選出，如粒細胞巨噬細胞集落剌激因子(GM-CSF)。9.根據權利要求l-8任何一項中所述的藥物組合物，另外含有至少有一種抗原提呈細胞。10.根據權利要求7中所述的藥物組合物，其中抗原提呈細胞為樹突狀細胞。11.根據權利要求9或10中所述的藥物組合物，其中，至少有一種抗原提呈細胞為a.有肽沖擊或加載，或b.包括一種編碼肽的表達載體。12.根據上述任一權利要求所述的藥物組合物，該組合物的給藥方式為靜脈注射、動脈注射、腹腔注射、肌肉注射、皮內注射、瘤內注射、口服、經皮、經鼻腔、經口腔、經直腸、經陰道、吸入、或外用。13.—種治療或預防患者癌癥的方法，其包括給予患者以上任一權利要求中所述藥物組合物的有效治療量。14.根據權利要求13中所述的方法，其中藥物組合物為一種抗癌疫苗。15.根據權利14中所述的方法，其中癌種系指口腔癌、咽癌，消化道癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、呼吸道癌、乳腺癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、子宮體癌、卵巢癌、男性生殖道癌、尿道癌、骨癌、軟組織癌、卡波西肉瘤、皮膚黑色素瘤、眼黑色素瘤、非黑色素瘤眼癌、腦癌、中樞神經系統癌、甲狀腺癌、其他內分泌腺癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤，優選為腎癌、結直腸癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、腦癌、胃腸道間質瘤或膠質母細胞瘤。16.根據權利要求15中所述的方法，其中癌癥系指結直腸癌。全文摘要本發明涉及免疫治療肽及其在免疫療法，特別是癌癥免疫療法中的用途。本發明披露了單獨形式的或與其他腫瘤相關肽(刺激抗腫瘤免疫反應疫苗化合物的活性藥物成分)組合形式的腫瘤相關T輔助細胞肽表位。特別是本發明的肽組合物可用于引發結直腸癌抗腫瘤免疫反應的疫苗化合物。文檔編號A61K38/16GK101765434SQ200880100807公開日2010年6月30日申請日期2008年7月25日優先權日2007年7月27日發明者克勞迪婭·特勞特溫,哈普利特·辛格,奧利弗·斯庫爾,彼得·萊溫德洛斯基,托尼·溫斯切尼克,斯特芬·沃爾特,諾伯特·希勒夫申請人:伊瑪提克斯生物技術有限公司