二聯滅活疫苗的制備方法步驟1中本發明保藏 編號為CGMCC No. 11988、CGMCC No. 11990和CGMCC No. 11989的銅綠假單胞菌株W及水貂銅 綠假單胞菌G型化15株、B型化08株分別經培養基培養后，所述混合的比例為1:1:1:1:1 (v/ V)，混合后每株菌的菌數至少為40億CRJ/mL。
[0027] 在本發明的一些具體實施方案中，二聯滅活疫苗的制備方法步驟2細小病毒半成 品中細小病毒的含量化06'?TCID50。
[0028] 在本發明的一些具體實施方案中，二聯滅活疫苗的制備方法步驟3所述步驟1制得 的滅活后銅綠假單胞菌五價苗半成品菌液與步驟2制得的細小病毒半成品混合的比例為2: Io
[0029] 在本發明的一些具體實施方案中，二聯滅活疫苗的制備方法步驟1所述的培養基 為PYG培養基，優選在PYG培養基中添加 MgS〇4、尿素、構祿酸鋼、維生素、NasHP化緩沖鹽或 K出K)4緩沖鹽中的一種或多種；
[0030] 作為優選，培養基配方：蛋白腺3%，葡萄糖2%，酵母粉0.3%，氯化鋼0.5%， Na2冊〇4 2.5g/L，KH2P〇4 0.83g/L，MgS〇4 0.3g/L，構祿酸鋼0.3g/L，尿素2g/L，維生素液 IOmL/!;
[0031] 步驟1中所述接種為按照PYG培養基體積的3%接種菌株;步驟2所述接種為按照 CRFK細胞懸液體積的2 %接種病毒。
[0032] 在本發明的一些具體實施方案中，二聯滅活疫苗的制備方法步驟I或步驟2所述滅 活采用甲醒滅活;所述甲醒的用量為菌液總量的0.2%。
[0033] 作為優選，步驟1或步驟2所述滅活為按菌液總量的0.2%緩慢加入甲醒溶液，邊加 邊攬拌，36~37 °C攬拌滅活24小時。
[0034] 在本發明的一些具體實施方案中，二聯滅活疫苗的制備方法步驟4所述佐劑為 40%(w/v，Wg/mL計)氨氧化侶膠，步驟3制得的混合液與所述佐劑的混合比例為6:1。
[0035] 在本發明的一些具體實施方案中，二聯滅活疫苗的制備方法步驟1中培養具體包 括如下步驟：
[0036] 步驟1: 一級種子繁殖:取化15株、JL08株、WDOl株、WF05株、DL03株菌株凍干菌種各 1支啟封，用滅菌生理鹽水稀釋，分別接種PYG瓊脂培養基(所述的培養基配方:蛋白腺3%， 葡萄糖2%，酵母粉0.3%，氯化鋼0.5%，化2HP04 2.5g/L，KH2P〇4 0.83g/L，MgS〇4 0.3g/L， 構祿酸鋼〇.3g/L，尿素 2g/L，維生素液lOmL/L，瓊脂粉2g/L)，36~37°C培養18~24小時，分 別挑選5個W上典型菌落混合于少量PYG液體培養基中，再分別接種PYG瓊脂斜面培養基(所 述的培養基配方：蛋白腺3%，葡萄糖2%，酵母粉0.3%，氯化鋼0.5%，Na2HP〇4 2.5g/L， K出P〇4 0.83g/L，MgS〇4 0.3g/L，構祿酸鋼0.3g/L，尿素 2g/L，維生素液lOmL/L，瓊脂粉2g/L) 若干，36~37°C培養18~24小時，作為一級種子。2~8°C保存，使用期不超過15日，傳代不超 過5代；
[0037] 步驟2:二級種子繁殖:取一級種子分別接種若干支5mL PYG液體培養基(所述的培 養基配方：蛋白腺3 %，葡萄糖2 %，酵母粉0.3 %，氯化鋼0.5 %，Na2HP〇4 2.5g/L，KH2PO4 0.83旨/1，1旨5〇4〇.3旨/1，構祿酸鋼0.3旨/1，尿素 2旨/1，維生素液1〇111171)中，36~37°(：振搖12 小時，再按3%比例分別接種較大量的PYG液體培養基中，36~37°C振搖12小時，經純粹檢驗 合格后，作為二級種子，置2~8°C保存，應不超過4日；
[0038] 步驟3:發酵種子液制備:將所述二級種子接種于發酵培養基，在溫度37~37.5 °C、 攬拌速度100~12化/min、進氣流量70~90L/min、壓力30~70Kpa條件下發酵培養化，獲得 發酵種子液；
[0039] 步驟4: 一級發酵:將發酵種子液按3 %比例接種于裝有250~30化PYG培養基(所 述的培養基配方：蛋白腺3%，葡萄糖2%，酵母粉0.3%，氯化鋼0.5%，Na2HP〇4 2.5g/L， K此PO4 0.83g/L，MgS〇4 0.3g/L，構祿酸鋼0.3g/L，尿素2g/L，維生素液lOmL/L)的500L發酵 罐，加入消泡劑泡敵，培養6~化后分別加入葡萄糖至終濃度為1%和尿素至終濃度2g/L作 為補充碳源，發酵期間主要控制參數如下：：罐溫37~37.5°C，攬拌速度80~11化/min,進氣 流量80~12化/min，罐壓30~70化a，1化收獲，經純粹檢驗合格后，即為半成品菌液，菌數穩 定在250億CFU/mL
[0040] 步驟5:二級發酵:將發酵種子液按4%比例接種于裝有50化~60化PYG培養基(所 述的培養基配方：蛋白腺3%，葡萄糖2%，酵母粉0.3%，氯化鋼0.5%，Na2HP〇4 2.5g/L， K出PO4 0.83g/L，MgS〇4 0.3g/L，構祿酸鋼0.3g/L，尿素2g/L，維生素液lOmL/L)的1000 L發酵 罐，培養6~化后分別加入葡萄糖至終濃度為1%和尿素至終濃度2g/L作為補充碳源，加入 消泡劑泡敵，發酵期間主要控制參數如下：：罐溫37~37.5°C，攬拌速度80~l(K)r/min，進氣 流量90~13化/min,罐壓30~70化a，l化收獲，經純粹檢驗合格后，即為半成品菌液，菌數可 穩定在250億CFU/ml。
[0041] 在本發明的一些具體實施方案中，二聯滅活疫苗的制備方法步驟2中培養具體為： 將基礎毒種用細胞維持液進行稀釋，按2%的比例同步接種于CRH(細胞懸液中，置37°C培養 3~4日，80% W上細胞出現典型CPE時，即可收獲，-20°C保存。
[0042] 在本發明的一些具體實施方案中，本發明提供的銅綠假單胞菌的培養基及發酵罐 培養工藝原有PYG培養基(葡萄糖-蛋白腺-酵母粉)的基礎上對培養基進行改良，通過添加 菌體代謝所需要的MgS〇4、構祿酸鋼、維生素液滿足高速發酵的營養需求，并通過添加 化抽P04，K此P化緩沖鹽類維持PH值及菌體滲透壓的穩定，另外，在發酵培養6~化補充葡萄 糖和尿素，通過1(K)L、500L、1000L發酵罐逐級發酵方法的建立，確定了種子液的菌數、接種 比例，種子液保存時間，傳代次數，發酵收獲時間，使菌數可穩定達到250億CFU，比原有方法 菌數提高了5~10倍。
[0043] 本發明在水貂出血性肺炎二價滅活疫苗研制的基礎上，在疫苗株種新加入了近幾 年出現的流行株I型、C型和F型，制備為水貂出血性肺炎五價滅活疫苗，能夠對水貂出血性 肺炎新的血清型菌株的流行起到很好的預防作用，可解決國內原有疫苗的對該病只能提供 部分保護的問題，從而可有效預防水貂出血性肺炎的發生。該疫苗免疫期為6個月，免疫保 護率80% W上，可同時用于預防水貂細小病毒性腸炎和水貂出血性肺炎的，減少了養殖戶 的免疫工作量和水貂應激反應，市場應用前景較好。
[0044] 生物保藏說明
[0045] 菌株WDOl，分類命名：銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa.于2016年Ol月11日 保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，地址為北京市朝陽區北辰西路1 號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 11988;
[0046] 菌株WF05,分類命名：銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa.于2016年Ol月11日 保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，地址為北京市朝陽區北辰西路1 號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 11990;
[0047] 菌株DL03,分類命名：銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa.于2016年Ol月11日 保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，地址為北京市朝陽區北辰西路1 號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 11989。
【附圖說明】
[0048] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0049] 圖1示水貂免疫二聯苗后銅綠假單胞菌抗體酶聯免疫吸附試驗測定結果；
[0050] 圖2示水貂免疫二聯苗后細小病毒血凝抑制抗體測定結果；
[0051] 圖3示水貂免疫二聯苗后細小病毒中和抗體測定結果。
【具體實施方式】
[0052] 本發明公開了菌株及其應用，W及疫苗及其制備方法，本領域技術人員可W借鑒 本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技 術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較 佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文所述的 方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0053] 本發明提供的菌株及其應用，W及疫苗及其制備方法中所用菌株、原料及試劑均 可由市場購得。其中，菌株化15的保藏編號為CGMCC No.