本發(fa)明涉及4n雜環化(hua)合(he)物的(de)(de)衍(yan)生(sheng)物的(de)(de)新用途，尤其涉及4n雜環化(hua)合(he)物的(de)(de)衍(yan)生(sheng)物在制備用于治療自(zi)身(shen)免疫疾病(bing)的(de)(de)藥物中的(de)(de)應用。

背景技術：

約5％人口(kou)患有自(zi)身免(mian)(mian)疫(yi)疾病(bing)(bing)，大約70多種人類(lei)疾病(bing)(bing)都和(he)自(zi)免(mian)(mian)疫(yi)失調有關(goodnowetal.,2005)。目前自(zi)身免(mian)(mian)疫(yi)疾病(bing)(bing)的(de)治(zhi)療主(zhu)要依賴(lai)于一些非選擇(ze)性的(de)免(mian)(mian)疫(yi)抑(yi)制劑(ji)，其(qi)療效(xiao)有限且(qie)(qie)副(fu)作用大，臨(lin)(lin)床中還沒有非常(chang)特效(xiao)的(de)治(zhi)療自(zi)身免(mian)(mian)疫(yi)疾病(bing)(bing)的(de)藥(yao)物。因此，臨(lin)(lin)床上急需開發一種新型的(de)高療效(xiao)且(qie)(qie)低副(fu)作用的(de)自(zi)免(mian)(mian)疫(yi)藥(yao)物。

最新研(yan)究表明一種(zhong)新的(de)(de)t細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)亞(ya)群th17細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)和人類自(zi)(zi)身免(mian)(mian)疫(yi)疾(ji)病和相關動物(wu)模(mo)型的(de)(de)發生(sheng)密切(qie)相關(；kiklyetal.,2006)。在風(feng)濕性關節炎、牛皮癬、哮喘、系統性紅斑狼瘡、特征(zheng)性皮炎、炎癥性腸(chang)炎等自(zi)(zi)身免(mian)(mian)疫(yi)疾(ji)病中，th17細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)特征(zheng)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)因(yin)子il17a、il17f表達上(shang)調，而(er)(er)抑制il17a、il17f表達和th17細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)分(fen)化可(ke)以減輕自(zi)(zi)身免(mian)(mian)疫(yi)疾(ji)病的(de)(de)發生(sheng)或臨(lin)(lin)床嚴重(zhong)程度(bowmanetal.,2006；kiklyetal.,2006)。現有(you)研(yan)究表明th17細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)分(fen)化形成受到轉錄因(yin)子rorγt的(de)(de)控制，而(er)(er)在rorγt基因(yin)敲除(chu)的(de)(de)小鼠中，th17細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)分(fen)化能力下降，數量減少，同時誘(you)導(dao)發生(sheng)的(de)(de)小鼠eae自(zi)(zi)身免(mian)(mian)疫(yi)疾(ji)病概率和臨(lin)(lin)床打分(fen)指(zhi)標(biao)均有(you)顯著的(de)(de)降低(ivanovetal.,2006)。這意(yi)味(wei)著rorγt的(de)(de)功能抑制劑可(ke)以作為(wei)開發th17介導(dao)的(de)(de)自(zi)(zi)身免(mian)(mian)疫(yi)疾(ji)病治療藥(yao)物(wu)的(de)(de)定向靶標(biao)。

rorγt是(shi)類固(gu)醇類核受體(ti)(ti)家(jia)族成(cheng)員，蛋白分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)中包括一個保守的(de)(de)dna結合(he)(he)域(yu)(yu)和(he)有(you)12個螺旋構成(cheng)的(de)(de)配(pei)體(ti)(ti)結合(he)(he)域(yu)(yu)，而(er)配(pei)體(ti)(ti)結合(he)(he)域(yu)(yu)是(shi)結合(he)(he)配(pei)體(ti)(ti)、核定位和(he)二聚(ju)體(ti)(ti)形成(cheng)的(de)(de)重要(yao)區域(yu)(yu)。類固(gu)醇類受體(ti)(ti)共(gong)激(ji)活分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)srcs能(neng)夠(gou)通過結合(he)(he)配(pei)體(ti)(ti)結構域(yu)(yu)的(de)(de)af2區域(yu)(yu)來解聚(ju)轉錄抑(yi)制(zhi)復合(he)(he)物(wu)，招募轉錄激(ji)活分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)，啟動相關(guan)基因轉錄(glassandrosenfeld,2000)。目前(qian)，rorγt的(de)(de)天然配(pei)體(ti)(ti)還沒有(you)找到，但最近兩個研究(jiu)發現人(ren)工合(he)(he)成(cheng)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)地高辛及其(qi)衍生物(wu)(huhetal.,20011；fujita-satoetal.,2011)和(he)sr1001(soltetal.,2011)能(neng)夠(gou)特異性地結合(he)(he)到rorγt的(de)(de)配(pei)體(ti)(ti)結構域(yu)(yu)，抑(yi)制(zhi)rorγt的(de)(de)功能(neng)并(bing)降低(di)th17細胞的(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)化能(neng)力，減(jian)弱小(xiao)鼠(shu)自(zi)(zi)身免(mian)疫疾(ji)(ji)病(bing)eae的(de)(de)臨床(chuang)癥(zheng)(zheng)狀。然而(er)，地高辛及其(qi)衍生物(wu)具有(you)很強的(de)(de)毒性(paulaetal.,2005)；sr1001分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)盡管在體(ti)(ti)外能(neng)夠(gou)有(you)效抑(yi)制(zhi)th17細胞的(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)化，但在體(ti)(ti)內(nei)實驗中高濃(nong)度給藥(yao)(yao)下(xia)(40mg/kg)，也(ye)只能(neng)略微減(jian)輕eae的(de)(de)臨床(chuang)癥(zheng)(zheng)狀。此外，sr1001能(neng)夠(gou)同(tong)其(qi)他的(de)(de)rors作用(yong)，選擇性較(jiao)差(soltetal.,2011)。這些研究(jiu)一方(fang)面表明抑(yi)制(zhi)rorγt的(de)(de)功能(neng)來治療自(zi)(zi)身免(mian)疫疾(ji)(ji)病(bing)是(shi)一個可(ke)行(xing)的(de)(de)方(fang)案，但目前(qian)還沒有(you)找到一個理想的(de)(de)靶標藥(yao)(yao)物(wu)。因此尋找高效低(di)毒且具有(you)較(jiao)強特異性的(de)(de)rorγt功能(neng)抑(yi)制(zhi)劑將是(shi)開發th17介導的(de)(de)自(zi)(zi)身免(mian)疫疾(ji)(ji)病(bing)藥(yao)(yao)物(wu)的(de)(de)一個重要(yao)方(fang)向。

技術實現要素：

本發明目的(de)(de)在(zai)(zai)于(yu)克服(fu)現有技術(shu)存在(zai)(zai)的(de)(de)不足，而提供4n雜環化合物(wu)的(de)(de)衍生物(wu)在(zai)(zai)制備用于(yu)治療自身免(mian)疫疾病的(de)(de)藥物(wu)中的(de)(de)應用。

為(wei)實現上述目的(de)，本發明采取的(de)技術方案為(wei)：4n雜環化(hua)合(he)物(wu)的(de)衍生物(wu)在制備用于(yu)治療自身免疫疾病的(de)藥物(wu)中的(de)應用，所述4n雜環化(hua)合(he)物(wu)的(de)衍生物(wu)的(de)結構(gou)式為(wei)：

作為上述技術(shu)方案的(de)改進，所(suo)述自身(shen)免(mian)疫(yi)疾病為th17細胞介導的(de)自身(shen)免(mian)疫(yi)疾病。

作為(wei)上述技術方案的(de)改進(jin)，所述自身免疫疾病包括牛皮(pi)癬、多發性硬(ying)發癥、風濕性關節炎(yan)、系(xi)統性紅斑狼瘡、特征性皮(pi)炎(yan)、哮喘和炎(yan)癥性腸(chang)道病。

另(ling)外，本發明還提供一種藥物(wu)(wu)組合(he)物(wu)(wu)，所述藥物(wu)(wu)組合(he)物(wu)(wu)包括4n雜環化合(he)物(wu)(wu)的(de)衍生物(wu)(wu)和藥學上可接(jie)受的(de)載體(ti)，所述4n雜環化合(he)物(wu)(wu)的(de)衍生物(wu)(wu)的(de)結構式(shi)為：

在上(shang)(shang)述(shu)技術(shu)方案中(zhong)(zhong)，“藥學上(shang)(shang)可接受(shou)的(de)載(zai)體”包(bao)括任(ren)何和所(suo)有(you)(you)生(sheng)理上(shang)(shang)相容的(de)溶劑(ji)、分散介(jie)質、包(bao)衣料、抗細菌和抗真菌劑(ji)、等(deng)滲(shen)和吸收(shou)延緩(huan)劑(ji)等(deng)。藥學上(shang)(shang)可接受(shou)的(de)載(zai)體的(de)實(shi)例(li)包(bao)括水、鹽(yan)水、磷酸緩(huan)沖鹽(yan)水、右旋糖酐、甘油(you)、乙醇等(deng)中(zhong)(zhong)的(de)一(yi)個或(huo)多個以及(ji)它們的(de)組合。在很(hen)多情況下，優選的(de)是將等(deng)滲(shen)劑(ji)例(li)如糖、多元醇或(huo)氯化(hua)鈉(na)包(bao)括在組合物中(zhong)(zhong)。藥學上(shang)(shang)可接受(shou)的(de)載(zai)體還(huan)可包(bao)含少量(liang)的(de)能(neng)提高(gao)抗體或(huo)抗體部分的(de)貨架期或(huo)有(you)(you)效(xiao)性的(de)輔助物質，如濕潤(run)劑(ji)或(huo)乳化(hua)劑(ji)、防腐(fu)劑(ji)或(huo)緩(huan)沖液。

作為(wei)上述技術方案的改進，所述藥物(wu)組合物(wu)的劑型是注射液或凍干制劑。

在(zai)(zai)上述(shu)技(ji)術方(fang)案中(zhong)，本(ben)發明(ming)的(de)藥(yao)(yao)(yao)(yao)物組合(he)物可(ke)(ke)以(yi)為(wei)多種形(xing)式(shi)(shi)。這些形(xing)式(shi)(shi)包括(kuo)例如(ru)液(ye)(ye)體(ti)(ti)、半固(gu)體(ti)(ti)和(he)(he)固(gu)體(ti)(ti)劑(ji)(ji)(ji)(ji)型，如(ru)液(ye)(ye)體(ti)(ti)溶液(ye)(ye)劑(ji)(ji)(ji)(ji)(例如(ru)可(ke)(ke)注(zhu)射和(he)(he)可(ke)(ke)輸(shu)注(zhu)溶液(ye)(ye)劑(ji)(ji)(ji)(ji))、分散劑(ji)(ji)(ji)(ji)或(huo)混(hun)懸劑(ji)(ji)(ji)(ji)、片劑(ji)(ji)(ji)(ji)、丸(wan)劑(ji)(ji)(ji)(ji)、散劑(ji)(ji)(ji)(ji)、脂質體(ti)(ti)和(he)(he)栓劑(ji)(ji)(ji)(ji)。優選的(de)形(xing)式(shi)(shi)取決(jue)于預(yu)定的(de)給藥(yao)(yao)(yao)(yao)方(fang)式(shi)(shi)和(he)(he)治療應(ying)用(yong)。典型的(de)優選組合(he)物為(wei)可(ke)(ke)注(zhu)射或(huo)可(ke)(ke)輸(shu)注(zhu)溶液(ye)(ye)劑(ji)(ji)(ji)(ji)形(xing)式(shi)(shi)。優選的(de)給藥(yao)(yao)(yao)(yao)方(fang)式(shi)(shi)是(shi)胃(wei)腸外(wai)(例如(ru)靜脈內、皮下(xia)、腹膜(mo)內、肌肉內)給藥(yao)(yao)(yao)(yao)。在(zai)(zai)一個優選的(de)實施方(fang)案中(zhong)，藥(yao)(yao)(yao)(yao)物組合(he)物通(tong)過(guo)腹膜(mo)注(zhu)射給予。還(huan)可(ke)(ke)將輔(fu)助性(xing)活(huo)性(xing)化合(he)物摻入(ru)到組合(he)物中(zhong)。

另(ling)外，本發明還提(ti)供所(suo)述藥(yao)物(wu)組合物(wu)在制備用于治療自身免疫疾病的(de)(de)藥(yao)物(wu)中(zhong)的(de)(de)應用。

作為(wei)上述技(ji)術方(fang)案的改進，所(suo)述自(zi)身(shen)免疫疾病為(wei)th17細胞介導的自(zi)身(shen)免疫疾病。

作為上述(shu)技術(shu)方案的改進，所述(shu)自身免疫疾病包括牛皮癬、多發性硬(ying)發癥(zheng)、風濕性關節炎(yan)、系統性紅斑狼瘡、特(te)征性皮炎(yan)、哮喘和炎(yan)癥(zheng)性腸道病。

本(ben)發(fa)(fa)(fa)明(ming)的(de)(de)(de)(de)有益效果在于(yu)：本(ben)發(fa)(fa)(fa)明(ming)提(ti)供4n雜(za)(za)環(huan)化(hua)合物(wu)的(de)(de)(de)(de)衍生物(wu)在制(zhi)備用于(yu)治(zhi)療自(zi)身免(mian)疫疾病的(de)(de)(de)(de)藥物(wu)中的(de)(de)(de)(de)應用，本(ben)發(fa)(fa)(fa)明(ming)利用基(ji)(ji)于(yu)轉錄因子(zi)活性的(de)(de)(de)(de)熒光素酶活性篩選系統，通(tong)過(guo)篩選獲得活性分子(zi)4n雜(za)(za)環(huan)化(hua)合物(wu)的(de)(de)(de)(de)衍生物(wu)，4n雜(za)(za)環(huan)化(hua)合物(wu)的(de)(de)(de)(de)衍生物(wu)具(ju)(ju)有抑(yi)(yi)制(zhi)th17細(xi)(xi)(xi)胞分化(hua)的(de)(de)(de)(de)關鍵轉錄因子(zi)rorγt的(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)；體外th17細(xi)(xi)(xi)胞分化(hua)實驗(yan)(yan)驗(yan)(yan)證這些化(hua)合物(wu)具(ju)(ju)有抑(yi)(yi)制(zhi)th17分化(hua)的(de)(de)(de)(de)功能，能夠抑(yi)(yi)制(zhi)rorγt的(de)(de)(de)(de)靶基(ji)(ji)因il17a和il17f分子(zi)的(de)(de)(de)(de)轉錄表(biao)達(da)；用流式細(xi)(xi)(xi)胞儀檢測細(xi)(xi)(xi)胞內的(de)(de)(de)(de)il17a表(biao)達(da)也得到明(ming)顯抑(yi)(yi)制(zhi)；證實4n雜(za)(za)環(huan)化(hua)合物(wu)的(de)(de)(de)(de)衍生物(wu)具(ju)(ju)有明(ming)顯抑(yi)(yi)制(zhi)th17細(xi)(xi)(xi)胞活性的(de)(de)(de)(de)功能；4n雜(za)(za)環(huan)化(hua)合物(wu)的(de)(de)(de)(de)衍生物(wu)作為th17細(xi)(xi)(xi)胞活性的(de)(de)(de)(de)抑(yi)(yi)制(zhi)劑，可(ke)以用于(yu)自(zi)身免(mian)疫疾病的(de)(de)(de)(de)治(zhi)療中。

附圖說明

圖(tu)1為4n雜環(huan)(huan)化合物(wu)的(de)衍(yan)生(sheng)物(wu)對rorγt表達的(de)抑制率的(de)曲線圖(tu)；其中(zhong)，4n雜環(huan)(huan)化合物(wu)的(de)衍(yan)生(sheng)物(wu)縮寫(xie)為jhm11，以下相同；

圖(tu)(tu)2為(wei)4n雜環(huan)化(hua)(hua)(hua)(hua)合物(wu)的(de)(de)(de)衍生物(wu)抑(yi)制th17細(xi)胞(bao)體外(wai)誘(you)導分(fen)化(hua)(hua)(hua)(hua)過程(cheng)中(zhong)il17a和(he)il17f的(de)(de)(de)mrna轉(zhuan)錄的(de)(de)(de)柱狀(zhuang)圖(tu)(tu)；其中(zhong)，圖(tu)(tu)2a為(wei)4n雜環(huan)化(hua)(hua)(hua)(hua)合物(wu)的(de)(de)(de)衍生物(wu)抑(yi)制th17細(xi)胞(bao)體外(wai)誘(you)導分(fen)化(hua)(hua)(hua)(hua)過程(cheng)中(zhong)il17a的(de)(de)(de)mrna轉(zhuan)錄的(de)(de)(de)柱狀(zhuang)圖(tu)(tu)，圖(tu)(tu)2b為(wei)4n雜環(huan)化(hua)(hua)(hua)(hua)合物(wu)的(de)(de)(de)衍生物(wu)抑(yi)制th17細(xi)胞(bao)體外(wai)誘(you)導分(fen)化(hua)(hua)(hua)(hua)過程(cheng)中(zhong)il17f的(de)(de)(de)mrna轉(zhuan)錄的(de)(de)(de)柱狀(zhuang)圖(tu)(tu)；

圖3顯示4n雜環(huan)化合物的衍生(sheng)物抑制(zhi)il-17a蛋白表達(da)。

具體實施方式

為更好地說明(ming)本發明(ming)的(de)目的(de)、技術方(fang)案(an)和(he)優點，下面將結合具體(ti)實施(shi)例、和(he)附圖對本發明(ming)作進一步(bu)說明(ming)。

試劑來源

細胞系jurkat為(wei)本實驗室保存；dh5α細菌(jun)菌(jun)株由北京中科院遺傳(chuan)所馬潤林教授饋贈；限(xian)制性內切酶購(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)自(zi)(zi)(zi)(zi)美(mei)(mei)(mei)國(guo)fermentas公(gong)(gong)(gong)司(si)(si)(si)(si)；dna連接酶購(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)自(zi)(zi)(zi)(zi)美(mei)(mei)(mei)國(guo)neb公(gong)(gong)(gong)司(si)(si)(si)(si)；報告(gao)基因序(xu)列(lie)ires-gfp為(wei)發明(ming)人(ren)自(zi)(zi)(zi)(zi)有(you)保存(也可(ke)以(yi)采用(yong)其他現有(you)的(de)報告(gao)基因序(xu)列(lie))；報告(gao)質粒pgl4.31[luc2p/gal4uas/hygro]和pbind質粒購(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)自(zi)(zi)(zi)(zi)美(mei)(mei)(mei)國(guo)promega公(gong)(gong)(gong)司(si)(si)(si)(si)；dmem培(pei)養(yang)基和rpmi1640培(pei)養(yang)基以(yi)及(ji)培(pei)養(yang)細胞用(yong)的(de)丙(bing)酮酸鈉(na)、谷氨(an)酰胺、β巰(qiu)基乙醇、非必須(xu)氨(an)基酸、雙抗(kang)是購(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)自(zi)(zi)(zi)(zi)美(mei)(mei)(mei)國(guo)life公(gong)(gong)(gong)司(si)(si)(si)(si)；胎牛(niu)血(xue)清(fbs)購(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)自(zi)(zi)(zi)(zi)美(mei)(mei)(mei)國(guo)hyclone公(gong)(gong)(gong)司(si)(si)(si)(si)；熒光(guang)素酶報告(gao)基因檢測試(shi)劑(ji)盒購(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)自(zi)(zi)(zi)(zi)美(mei)(mei)(mei)國(guo)promega公(gong)(gong)(gong)司(si)(si)(si)(si)；lipo2000購(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)自(zi)(zi)(zi)(zi)美(mei)(mei)(mei)國(guo)life公(gong)(gong)(gong)司(si)(si)(si)(si)；無內毒素質粒提取試(shi)劑(ji)盒購(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)自(zi)(zi)(zi)(zi)sigma公(gong)(gong)(gong)司(si)(si)(si)(si)；8～12周齡的(de)c57小鼠(shu)購(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)自(zi)(zi)(zi)(zi)中山大(da)學實驗動物中心(spf級(ji))；t細胞電轉試(shi)劑(ji)盒和電穿孔儀購(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)自(zi)(zi)(zi)(zi)瑞士lonza公(gong)(gong)(gong)司(si)(si)(si)(si)；潮(chao)霉素b購(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)自(zi)(zi)(zi)(zi)瑞士roche公(gong)(gong)(gong)司(si)(si)(si)(si)；逆轉錄試(shi)劑(ji)盒購(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)自(zi)(zi)(zi)(zi)大(da)連takara公(gong)(gong)(gong)司(si)(si)(si)(si)；realtime檢測試(shi)劑(ji)盒購(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)自(zi)(zi)(zi)(zi)美(mei)(mei)(mei)國(guo)promega公(gong)(gong)(gong)司(si)(si)(si)(si)；細胞因子(zi)htgf-β和mil-6購(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)自(zi)(zi)(zi)(zi)美(mei)(mei)(mei)國(guo)rd公(gong)(gong)(gong)司(si)(si)(si)(si)；小鼠(shu)cd3、cd4、il17a和cd28抗(kang)體購(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)自(zi)(zi)(zi)(zi)美(mei)(mei)(mei)國(guo)ebioscience公(gong)(gong)(gong)司(si)(si)(si)(si)；其他常用(yong)化(hua)學試(shi)劑(ji)購(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)自(zi)(zi)(zi)(zi)sigma公(gong)(gong)(gong)司(si)(si)(si)(si)和上海生工公(gong)(gong)(gong)司(si)(si)(si)(si)。

質粒構建

將熒光蛋白基(ji)因ires-gfp目的(de)(de)片段(duan)通過not1單酶(mei)切位點插入到pbind載體(ti)中(zhong)完成pbind-ires-gfp的(de)(de)質(zhi)粒構建(jian)(jian)；用pcr法從pbmc(外周血單個核細胞)的(de)(de)cdna中(zhong)調取人的(de)(de)rorγt基(ji)因(hrorγt)，hrorγt調取時兩(liang)端加上bamh1的(de)(de)單酶(mei)切位點；再將hrorγt基(ji)因克(ke)隆到pbind-ires-gfp質(zhi)粒中(zhong)，完成pbind-gal4dbd-hrorγt-ires-gfp重組(zu)質(zhi)粒的(de)(de)構建(jian)(jian)(gal4dbd的(de)(de)序列是pbind質(zhi)粒自帶的(de)(de))。

細胞培養

jurkat細胞培(pei)養在含10％fbs(胎牛血清)，1％雙抗，2mm谷氨酰(xian)胺，1mm丙酮酸鈉，50μm的β巰(qiu)基(ji)乙醇的rpmi1640完全培(pei)養基(ji)中。細胞置于(yu)5％co2，37℃培(pei)養箱中恒溫(wen)培(pei)養，約每兩天傳代一(yi)次。

pgl4.31⁺hrorγt⁺jurkat穩定(ding)細胞系的構建(jian)

將20μg經not1單酶切的質粒pgl4.31[luc2p/gal4uas/hygro]電轉入jurkat細胞(1×10⁷)中，再用200μg/ml的潮霉素b進行抗性篩選；篩選進行2～3周后，再將20μg用限制性內切酶eam1105酶切的pbind-gal4dbd-hrorγt-ires-gfp重組質粒電轉至經潮霉素b篩選后的jurkat細胞中，再次轉染后的細胞繼續培養2～3周，之后用gfp熒光蛋白標記進行流式分選，并收集gfp⁺陽性(xing)jurkat細胞(bao)。

ec50的測定

ec50的測定基于構建的gal4/hrorγt的報告體系：將pgl4.31⁺hrorγt⁺jurkat細胞鋪板至96孔圓底板中，每孔2×10⁴個細胞，5％co2，37℃培(pei)(pei)養箱(xiang)中恒溫培(pei)(pei)養過夜，然后按濃(nong)度(du)梯(ti)度(du)設置不(bu)同濃(nong)度(du)值，在不(bu)同濃(nong)度(du)的(de)(de)4n雜(za)環(huan)化合物(wu)(wu)的(de)(de)衍(yan)生物(wu)(wu)下作用6h，之后收集細胞，進行luciferase活性(xing)檢(jian)測(ce)以得到4n雜(za)環(huan)化合物(wu)(wu)的(de)(de)衍(yan)生物(wu)(wu)的(de)(de)ec50的(de)(de)值；結果如(ru)圖1所示(shi)。

如圖1所示，4n雜環化合(he)物(wu)(wu)的(de)衍生物(wu)(wu)具有(you)抑(yi)制th17細胞分化的(de)關鍵轉錄(lu)因(yin)子(zi)rorγt的(de)表達，根據計算公式測得4n雜環化合(he)物(wu)(wu)的(de)衍生物(wu)(wu)抑(yi)制rorγt轉錄(lu)因(yin)子(zi)表達的(de)ec50為3.892μm。

4n雜環化合物(wu)的(de)衍(yan)生物(wu)對(dui)th17細胞的(de)體(ti)外(wai)分(fen)化的(de)影(ying)響

實驗前一天晚上用含有5μg/mlcd3抗體、1μg/mlcd28抗體的pbs溶液包被六孔板，每孔1ml，4℃包被過夜。第二天開展實驗，首先用miltenyi磁珠分選小鼠脾臟的cd4⁺t細胞，分選后的細胞按1×10⁶個/ml的細胞密度重懸細胞，向包被后的六孔板的每個孔加2ml的細胞懸液，即每孔細胞數為2×10⁶個，激活24h。24h后，收集六孔板中的細胞至50ml離心管中，再向溶液中加入終濃度為5ng/ml的htgf-β和30ng/ml的mil-6的細胞因子，混勻，體外誘導cd4⁺t細胞向th17細胞分化。混勻后的細胞懸液，按每孔100μl分配至96孔板中，再向每孔加1μl的終濃度為1μm4n雜環化合物的衍生物(并設置3個孔的dmso對照組)，37℃、5％二氧化碳培養48h。48h后，每孔補加100μlrpmi1640完全培養基以及終濃度為5ng/ml的htgf-β、30ng/ml的mil-6的細胞因子和1μl的終濃度為5μm4n雜環化合物的衍生物，補加完成后再培養48h。至此，cd4⁺t細胞體外誘(you)導(dao)th17分化(hua)培養了約(yue)5天(tian)，5天(tian)后收集(ji)細胞，用于抽提(ti)rna和細胞染(ran)色后的流式細胞儀檢測。

1)cdna的合成及熒光定量pcr的檢(jian)測

trizol法提取細(xi)胞的(de)總rna，并按(an)逆轉錄試劑(ji)盒的(de)操作說明(ming)反轉總rna合(he)成(cheng)cdna。然后用(yong)合(he)成(cheng)的(de)cdna按(an)promega公(gong)司(si)的(de)使用(yong)說明(ming)進行il17a、il17f基因的(de)熒光(guang)定量(liang)pcr檢測(ce)(以(yi)gapdh基因為內參)，結果如圖2所示。

如圖2a、2b所示，體外th17細胞(bao)分化實驗驗證4n雜環化合(he)物的衍(yan)生物能夠抑制rorγt的靶基因il17a和il17f分子的轉錄表達。

2)流式細胞儀檢測

用(yong)il17a和cd4的(de)抗體(ti)進行(xing)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)內(nei)染色，elisa試(shi)劑(ji)盒檢(jian)測凍存的(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)上(shang)清(qing)中il17a的(de)含量。實(shi)驗操作嚴格按(an)照ebioscience細(xi)(xi)(xi)胞(bao)內(nei)染色試(shi)劑(ji)盒和流式細(xi)(xi)(xi)胞(bao)儀操作說明進行(xing)，結果(guo)如圖(tu)3所(suo)示。

如圖3所(suo)示，細(xi)胞內的il17a表達受到4n雜環化合物的衍生物明顯的抑制。

最(zui)后所應當說明(ming)(ming)的(de)(de)(de)是(shi)，以上(shang)實施例用以說明(ming)(ming)本發(fa)明(ming)(ming)的(de)(de)(de)技(ji)術(shu)方案(an)而非(fei)對(dui)本發(fa)明(ming)(ming)保護范圍的(de)(de)(de)限制，盡管參照(zhao)較佳實施例對(dui)本發(fa)明(ming)(ming)作了(le)詳細說明(ming)(ming)，本領域的(de)(de)(de)普通(tong)技(ji)術(shu)人員應當理解，可(ke)以對(dui)本發(fa)明(ming)(ming)的(de)(de)(de)技(ji)術(shu)方案(an)進行修改(gai)或者同等替換，而不脫離本發(fa)明(ming)(ming)技(ji)術(shu)方案(an)的(de)(de)(de)實質(zhi)和(he)范圍。

參考文獻

bowmanep,chackerianaa,cuadj.rationaleandsafetyofanti-interleukin-23andanti-interleukin-17atherapy.curropininfectdis2006；19:245-52.

fujita-satos,itos,isobet,ohyamat,wakabayashik,morishitak,andoo,isonof.structuralbasisofdigoxinthatantagonizesrorγtreceptoractivityandsuppressesth17celldifferentiationandinterleukin(il)-17production.jbiolchem2011；286:31409-17.

glassck,androsenfeldmg.thecoregulatorexchangeintranscriptionalfunctionsofnuclearreceptors.genesdev2000；14:121-141.

goodnowcc,sprentj,fazekasdestgrothb,vinuesacg.cellularandgeneticmechanismsofselftoleranceandautoimmunity.nature2005；435:590-597.

huhjr,leungmwl,huangpx,ryanda,kroutmr,malapakarrv,chowj,maneln,ciofanim,kimsv,cuestaa,santorifr,lafaillejj,xuhe,gindy,rastinejadf,littmandr.digoxinanditsderivativessuppressth17celldifferentiationbyantagonizingrorγtactivity.nature2011；472:486-490.

ivanovii,mckenziebs,zhoul,tadokoroce,lepelleya,lafaillejj,cuadj,littmandr.theorphannuclearreceptorrorgammatdirectsthedifferentiationprogramofproinflammatoryil-17⁺thelpercells.cell2006；126:1121-1133.

kidlyk,liul,nas,sedgwickjd.theil-23/th(17)axis:therapeutictargetsforautoimmuneinflammation.curropinimmunol2006；18:670-675.

paulas,tabetmr,ballwjj.interactionsbetweencardiacglycosidesandsodium/potassium-atpase:three-dimentionalstructure-activityrelationshipmodelsforligandbindingtothee2-piformoftheenzymeversusactivityinhibition.biochemistry2005；44:498-510.

soltla,kumarn,nuhantp,wangyj,lauerjl,liuj,istratema,kameneckam,roushwr,r,sc,xujh,wagonerg,drewpd,griffinpr,burristp.suppressionofth17differentiationandautoimmunitybyasyntheticrorligand.nature2011；472:491-494。