一種提高胰島素口服結腸吸收的殼聚糖納米粒及制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明所涉及可用于生物醫藥技術領域的納米粒及其制備方法，特別涉及一種提 高胰島素口服結腸吸收的殼聚糖納米粒及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 胰島素在臨床上被廣泛的用于治療I型糖尿病，目前其主要給藥方式為皮下注 射。糖尿病患者為了控制自己的血糖水平需要每天多次的注射胰島素（Ins)，給患者的身心 帶來了極大的痛苦和日常生活的諸多不便。口服給藥系統被認為是患者順應性最好、最自 然、最安全的一種給藥方式，但胰島素口服生物利用度非常低，基本沒有藥理效應。其主要 原因：一是胰島素在消化道中容易被酸及酶降解失活；二是胰島素的分子量較大，跨越消 化道粘膜上皮細胞的能力差，無法被有效的吸收。
[0003] 為了解決胰島素口服生物利用度低的問題，研究者們提出了許多方案，如：對胰島 素分子進行修飾，加入吸收促進劑，在處方中加入酶抑制劑，發展新的藥物傳遞系統來包裹 胰島素，像微球、脂質體、納米粒給藥系統。
[0004] 細胞穿透肽是一類能夠通過生物膜進入細胞的短肽，它們在較低的溶度條件下， 就可以在不對細胞膜造成明顯損傷的條件下透過細胞膜進入到各種細胞中；它們還能夠高 效促進各種物質包括蛋白質，納米粒進入細胞。有文獻報道一種提高胰島素生物利用度的 策略（Journal Controlled Release, 2007，118: 177-184)，是將膜島素與一種細胞穿透 肽(寡聚精氨酸)混合后注射到大鼠的回腸部位。然而由于胰島素和細胞穿透肽口服后在胃 腸道中不穩定，易被胃酸、胃蛋白酶和胰蛋白酶降解，這種沒有經過任何處理的胰島素與細 胞穿透肽的混合液只有通過直接注射到小腸段的手段才能起作用，通過口服給藥無法有效 提高胰島素的生物利用度。
[0005]與消化道的其他部位相比較，結腸擁有有利于胰島素吸收的生理條件，如蛋白酶 的密度及活性相對較低、相對較溫和的pH條件、粘液的更新速度較慢，內容物的滯留時間 較長，這些條件使結腸成為蛋白質藥物吸收較為理想的部位。
[0006] 文獻（]〇111'的1〇1!'八卩卩116(1?〇15〇11613(^611〇6，1997，63(1):125-132. International Journal of Pharmaceutics, 2002，249(1-2): 139-147)報道用離子交聯 法制備了包裹著胰島素的殼聚糖納米粒，此方法制備的納米粒在胃酸環境下不穩定，不能 夠保護其所包裹的物質。文獻(沈陽藥科大學學報，2006，23(2): 65-69)報道用羥丙基 甲基纖維素酞酸酯（HP55)對用離子交聯法制備的裝載著Ins的殼聚糖納米粒進行腸溶包 衣以提高胰島素的口服結腸吸收，但胰島素的口服生物利用度有待提高。
[0007] 本發明采用殼聚糖納米粒包裹胰島素及細胞穿透肽Tat，再對制備好的納米粒用 尤特奇S100進行包衣。一方面解決了殼聚糖納米粒同時包裹胰島素和細胞穿透肽兩種物 質的技術難題，從而實現用細胞穿透肽Tat增加胰島素的跨腸道細胞轉運，提高胰島素的 口服吸收生物利用度。另一方面，解決了胰島素和細胞穿透肽Tat 口服后在胃腸道中的穩 定性問題，使得細胞穿透肽Tat能夠發揮提高藥物跨膜轉運吸收的活性，使胰島素能夠順 利到達人體最佳吸收部位，起到良好的治療效果。本發明比現有技術方法制備出的殼聚糖 納米粒具有更好的穩定性。

【發明內容】

[0008] 本發明的一個目的是使用簡單方便可控的制備方法--離子交聯法來制備一種 包裹胰島素與細胞穿透肽Tat的殼聚糖納米粒，并且通過腸溶材料尤特奇S100對該納米粒 進行包衣，獲得一種提高胰島素口服結腸吸收的納米載體。用尤特奇S100包衣的殼聚糖納 米粒在胃及小腸低pH值的環境下不會有明顯的內容物釋放，當尤特奇S100包衣的殼聚糖 納米粒運動到小腸底部pH值較高環境中時尤特奇S100開始溶解，包裹在尤特奇S100里面 的殼聚糖納米粒暴露在腸腔中。殼聚糖納米粒在腸腔中緩慢釋放所包裹的細胞穿透肽Tat 及胰島素。當殼聚糖納米粒進入結腸時，發生去質子化，殼聚糖納米粒被破壞，胰島素和Tat 被完全釋放到結腸中，Tat促進結腸上皮細胞對胰島素的吸收。因而提高了胰島素的口服 生物利用度。
[0009] 本發明在制備包裹胰島素和細胞穿透肽Tat的殼聚糖納米粒時，采用殼聚糖與胰 島素先混合的辦法，這可使胰島素與殼聚糖的分子間相互作用增加，從而提高胰島素的包 封率，包封率高達80%。本發明采用殼聚糖與三聚磷酸鈉離子交聯的方法制備殼聚糖納米 粒，納米粒的整個制備過程不加入任何有機溶劑，制備條件溫和簡便。與現有的殼聚糖納米 粒的制備方法相比，本發明操作簡便，可以較好保護胰島素及肽Tat的活性。
[0010] 本發明所使用的肽Tat是常用的細胞穿透肽中的一種。當包裹胰島素和肽Tat 口 服到達結腸后，殼聚糖納米粒在該環境中不穩定，納米粒被破壞，胰島素及肽Tat釋放進入 結腸腸腔，肽Tat促進結腸上皮細胞對胰島素的吸收，從而起到增加胰島素口服的生物利 用度。
[0011] 本發明的殼聚糖納米粒制備方法比現有技術方法制備出的殼聚糖納米粒具有更 好的物理化學穩定性。所用的腸溶材料尤特奇S100為甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯（1:2) 共聚物，具有成膜性好，溶于乙醇、丙酮，在pH小于6. 8的水溶液中不溶，可以保護其包裹的 納米粒，在消化道下段當pH大于6. 8的環境中開始溶解并對其包衣的納米粒失去保護作 用。通過上述方法把無水乙醇揮發完全后，尤特奇S100析出并沉降在殼聚糖納米粒的表面 形成腸溶包衣膜，使得用本發明制備的殼聚糖納米粒在消化道上部不會被破壞具有良好的 穩定性，從而使結腸成為本發明藥物的主要釋放及吸收部位。
[0012] 本發明所述的一種提高胰島素口服結腸吸收的殼聚糖納米粒，其組成成分為 殼聚糖、尤特奇S100、細胞穿透肽Tat和胰島素，其中細胞穿透肽Tat的氨基酸序列為 GRKKRRQRRRP，細胞穿透肽Tat與殼聚糖的質量比為1. 0: (3. 5~4. 5)，細胞穿透肽Tat與殼 聚糖的質量比為1. 〇: (3. 5~4. 0)，胰島素與殼聚糖的質量比為1. 0: (1. 5~2. 5)。該納米粒的 制備步驟如下： (a) 將殼聚糖粉末溶解于醋酸溶液中，制備成殼聚糖溶液，用lmol/L的氫氧化鈉溶液 調節pH值至5. 5~6. 0后，加入細胞穿透肽Tat使溶解； (b) 在室溫攪拌的條件下，將胰島素溶液緩慢加到（a)中的殼聚糖與細胞穿透肽Tat 的混合液中，繼續攪拌1小時； (c) 在室溫攪拌的條件下，將三聚磷酸鈉水溶液緩慢加到（b)所得的溶液中，繼續攪 拌0. 5小時，形成納米粒懸浮液； (d)在室溫攪拌的條件下，將尤特奇S100的無水乙醇溶液緩慢加到（c)所得的納米粒 懸浮液中，繼續攪拌12小時，即得一種提高胰島素口服結腸吸收的殼聚糖納米粒。
[0013] 本發明所述的一種提高胰島素口服結腸吸收的殼聚糖納米粒優選的制備過程如 下： (1)稱取分子量5-10萬道爾頓、脫乙酰度大于85%的殼聚糖粉末7-9mg，溶于0. 2%的 醋酸溶液中，用lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值至5. 5~6. 0,將殼聚糖溶液置于恒溫磁 力攪拌器上室溫勻速攪拌；稱取肽Tat粉末1. 75-2. 57mg (使Tat與殼聚糖的質量比為 1: (3. 5~4. 0))，置于殼聚糖溶液中溶解。
[0014] (2)稱取胰島素粉末2. 8-6mg (使胰島素與殼聚糖的質量比為1: (1. 5~2. 5))，溶于 0? Olmol/L的鹽酸溶液2ml中，用lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值至7. 5~8. 5,在室溫攪 拌的條件下，將胰島素溶液加到（1)所得的殼聚糖溶液中攪拌混合1小時。
[0015] (3)稱取三聚磷酸鈉粉末1. 56-2. 57mg (使三聚磷酸鈉與殼聚糖的質量比為 1: (3. 5~4. 5))，溶于水形成lmg/mL的三聚磷酸鈉的溶液，在室溫攪拌的條件下，將三聚磷 酸鈉溶液加到（2)所得的溶液中攪拌混合0. 5小時，使其形成納米粒懸浮液。
[0016] (4)稱取包衣材料尤特奇S100粉末2mg溶于無水乙醇溶液，形成濃度為2mg/mL的 尤特奇S100無水乙醇溶液，在室溫攪拌的條件下，將尤特奇S100無水乙醇溶液加到（3)所 得的納米粒懸浮液中