一種細菌i型拓撲異構酶的抑制劑及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種細菌I型拓撲異構酶的抑制劑及其應用，屬于分子生物學領域。本發明利用bTopo I識別反應底物的特點，提出將具有不配對堿基結構的雙鏈核苷酸作用于bTopo I，從而達到靶向性的抑菌效果。另外，由于bTopo I與哺乳類動物的topoisomerase I有不同的作用機制，因此以具有不配對堿基結構的雙鏈核苷酸為基礎的新型抗菌分子，具有干擾細菌的重要功能而不影響宿主細胞的特性，為抗菌藥物的研發提供理論依據和全新發展方向。
【專利說明】
一種細菌I型拓撲異構酶的抑制劑及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及一種細菌I型拓撲異構酶的抑制劑及其應用，屬于分子生物學領域。
【背景技術】
[0002] 細菌I型拓撲異構酶(Bacterial Toposomerase I，bTopo I)是存在于原核細菌生 物中的一種關鍵核酶，由590個氨基酸組成，分子量為67kD，N-端被發現具有舒緩DNA負超螺 旋的關鍵結構，bTopo I通過舒緩細菌DNA負超螺旋結構，改變細菌DNA拓撲結構，維持細菌 核酸正常的復制、轉錄，保證細菌的正常生長、繁殖。
[0003] 當前，對核酸功能的研究結果表明，除了存在編碼蛋白質功能外，核酸還在其他生 命活動中發揮著關鍵作用。目前存在各種功能性的非編碼RNA分子、非編碼DNA、引起RNA干 擾作用的RNA分子等。
[0004] 目前，細菌的耐藥性問題已經成為全球面臨的最大的公共衛生問題之一。因為耐 藥性問題的嚴重性，新型抗菌藥物的研發迫在眉睫。理想的抗菌藥應該提高藥物對病原體 的選擇性，降低對宿主的毒性。bTopo I正是抗菌藥物研發的一個重要祀點。雖然以bTopo I 為靶標的小分子抑制劑已經有相應研究和應用，但多數小分子化學藥物選擇性差，容易作 用于哺乳動物的topoisomeras I，產生毒副作用。

【發明內容】

[0005] 本發明的一個目的是提供一種細菌I型拓撲異構酶的抑制劑。
[0006] 所述抑制劑是具有錯配堿基的雙鏈核苷酸。
[0007] 所述抑制劑可以包括一段或者多段錯配堿基，每一段至少含有一個錯配堿基。
[0008] 所述抑制劑的雙鏈核苷酸中兩條鏈的長度可以相同，也可以不同。
[0009] 所述錯配堿基，可以位于雙鏈核苷酸的任意位置，包括兩端和/或中部。
[0010]所述錯配堿基的組成，可以是A、T、C、G中的任一一種或幾種的組合。
[0011] 所述雙鏈核苷酸的長度沒有特別的要求。
[0012] 在本發明的一種實施方式中，所述抑制劑的5'至3'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，3'至5'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013] 在本發明的一種實施方式中，所述抑制劑的5'至3'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，3'至5'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0014] 在本發明的一種實施方式中，所述抑制劑的5'至3'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，3'至5'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0015] 在本發明的一種實施方式中，所述抑制劑的5'至3'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，3'至5'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0016] 本發明的另一個目的是提供一種可以用于食品儲藏、保鮮中的防腐劑類產品，或 者是用于醫療殺菌方面的抑菌劑，主要活性成分就是上述細菌I型拓撲異構酶的抑制劑。
[0017] bTopo I是通過識別雙鏈DNA中任意一段打開的DNA單鏈而且發揮作用，而具有不 配對堿基結構的雙鏈核苷酸正好有一段打開的DNA單鏈的特殊結構。本發明利用bTopo I識 別反應底物的特點，提出將具有不配對堿基結構的雙鏈核苷酸作用于bTopo I，從而達到靶 向性的抑菌效果。另外，由于bTopo I與哺乳類動物的topoisomerase I有不同的作用機制， 因此以具有不配對堿基結構的雙鏈核苷酸為基礎的新型抗菌分子，具有干擾細菌的重要功 能而不影響宿主細胞的特性，為抗菌藥物的研發提供理論依據和全新發展方向。
【附圖說明】
[0018] 圖1(A)瓊脂糖凝膠電泳測定特殊結構核酸Mismatch DNA 3-mis對bTopo I的抑制 作用；（B)不同濃度3-mis對bTopo I的抑制效果。
[0019] 圖2(A)瓊脂糖凝膠電泳測定特殊結構核酸Mismatch DNA 5-mis對bTopo I的抑制 作用；（B)不同濃度5-mis對bTopo I的抑制效果。
[0020] 圖3(A)瓊脂糖凝膠電泳測定特殊結構核酸Mismatch DNA 7-mis對bTopo I的抑制 作用；（B)不同濃度7-mis對bTopo I的抑制效果。
[0021] 圖4(A)瓊脂糖凝膠電泳測定特殊結構核酸Mismatch DNA 11-mis對bTopo I的抑 制作用；（B)不同濃度11-mis對bTopo I的抑制效果。
[0022] 圖5瓊脂糖凝膠電泳方法分析各Mismatch DNA與真核生物toposomerase I的抑制 作用。
【具體實施方式】
[0023] 下列實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規方法
[0024] 下列實施例中所用的材料、試劑、設備耗材如無特殊說明，均可從商業途徑獲取。
[0025] 表1為本發明實施例涉及的具有特殊結構的寡居核苷酸單鏈序列。
[0026]
[0028]注:加粗處為各核苷酸序列中突出的錯配單鏈區域。
[0029] 實施例1驗證3-mis對bTopo I的抑制效果并得出IC50
[0030] 實驗材料
[0031] E.coli Toposomerase I(購于NEB，產品貨號#103015)41](： 19(購于NEB，產品貨 號#N3041S)、Mismatch單鏈(序列見表1，由上海捷瑞公司負責合成）、瓊脂糖、TAE緩沖液、水 平電泳槽、移液槍、干式恒溫儀、微型離心機、伯樂凝膠成像儀、1M氯化鈉溶液、loading dying、50mM KAc、20mM Tris-Ac、10mM Mg(Ac)2、100μg/ml BSA(pH 7·9@25Γ)ΕΒ染液等。
[0032] 實驗步驟
[0033] (1)制備Mismatch DNA
[0034] 單鏈序列（表1)由上海捷瑞公司協助合成，公司提供的單鏈DNA均為20D稀釋至25μ 1最終配置為100μΜ，取表中相應3-mis兩條單鏈DNA稀釋50倍，加入1Μ氯化鈉溶液使混合溶 液中NaCl濃度為50mM。將混合單鏈DNA溶液置入干式恒溫儀溫控90°C，5min，后隨環境降至 室溫，得到2μΜ Mismatch DNA，標記為3-mis〇
[0035] (2)3-mis對bTopo I的抑制
[0036] 首先取1.5ml離心管分別編號0-6,配置添加相應試劑，使0至6各管最終包含5mM KAc、2mM Tris-Ac、lmM Mg(Ac)2、10μg/ml BSA(pH 7.925°C)、250ng pUC 19,其中 1-6管均 包含2U bTopo I，2-6管3-mis濃度最終依次為 12.5nM、25nM、50nM、110nM、300nM。最后將各 管在震蕩器震蕩數秒并用離心機混勻處理。將各管在干式恒溫器中37°C溫浴30min。
[0037] (3)凝膠電泳實驗
[0038]精確稱取瓊脂糖1.5g加入錐形瓶，隨后用量筒量取150ml TAE緩沖液倒入錐形瓶， 加熱混合溶液至溶液澄清透明，之后將溶液倒入水平電泳槽至冷卻成膠。
[0039]將（2)中0-6管各加入4μ1 loading dying，震蕩離心混勻，后將其注膠上樣。電泳 在100V條件下運行lh，結束后取出將凝膠在EB溶液(EB溶液濃度為0.15mg/ml)中浸泡染色 40min后使用伯樂凝膠成像儀成像并使用軟件計算得出其IC 5Q(見圖1)。從圖1中可以看出伴 隨3-mis濃度的增加 ，Mismatch DNA對bTopo I的抑制效果亦成正相關，3-mis對bTopo I制 的 IC5Q為0·2450μΜ。
[0040] 實施例2驗證5-mis對bTopo I的抑制效果并得出IC50 [0041 ] 實驗材料
[0042] E.coli Toposomerase I(購于NEB，產品貨號#103015)41](： 19(購于NEB，產品貨 號#N3041S)、Mismatch單鏈(序列見表1，由上海捷瑞公司負責合成）、瓊脂糖、TAE緩沖液、水 平電泳槽、移液槍、干式恒溫儀、微型離心機、伯樂凝膠成像儀、1M氯化鈉溶液、loading dying、50mM KAc、20mM Tris-Ac、10mM Mg(Ac)2、100μg/ml BSA(pH 7·9@25Γ)ΕΒ染液等。
[0043] 實驗步驟
[0044] (1)制備Mismatch DNA
[0045] 單鏈序列（表1)由上海捷瑞公司協助合成，公司提供的單鏈DNA均為20D稀釋至25μ 1最終配置為1〇〇μΜ，取表中相應5-mis兩條單鏈DNA稀釋50倍，加入1Μ氯化鈉溶液使混合溶 液中NaCl濃度為50mM。將混合單鏈DNA溶液置入干式恒溫儀溫控90°C5min，后隨環境降至室 溫，得到2μΜ Mismatch DNA，標記為5-mis〇
[0046] (2)5-mis對bTopo I的抑制
[0047] 首先取1.5ml離心管分別編號0-6,配置添加相應試劑，使0至6各管最終包含 5mMKAc、2mM Tris-Ac、lmM Mg(Ac)2、10μg/ml BSA(pH 7.9@25。〇、250即 pUC 19,其中 1-6 管均包含2U bTopo I，2-6管5-mis濃度最終依次為20nM、90nM、160nM、230nM、300nM。最后將 各管在震蕩器震蕩數秒并用離心機混勻處理。將各管在干式恒溫器中37°C溫浴30min。
[0048] (3)凝膠電泳實驗
[0049] 精確稱取瓊脂糖1.5g加入錐形瓶，隨后用量筒量取150ml TAE緩沖液倒入錐形瓶， 加熱混合溶液至溶液澄清透明，之后將溶液倒入水平電泳槽至冷卻成膠。
[0050] 將(2)中0-6管各加入4ylloading dying，震蕩離心混勻，后將其注膠上樣。電泳在 100V條件下運行lh，結束后取出將凝膠在EB溶液(EB溶液濃度為0.15mg/ml)中浸泡染色 40min后使用伯樂凝膠成像儀成像并使用軟件計算得出其IC 5Q(見圖2)，從圖2可以看出，伴 隨5-mis濃度的增加 ，Mismatch DNA對bTopo I的抑制效果亦成正相關，5-mis對bTopo I抑 制的 IC5Q 為0.1890μΜ.
[0051 ] 實施例3驗證7-mis對bTopo I的抑制效果并得出IC50
[0052] 實驗材料
[0053] E.coli Toposomerase I(購于NEB，產品貨號#103015)41](： 19(購于NEB，產品貨 號#N3041S)、Mismatch單鏈(序列見表1，由上海捷瑞公司負責合成）、瓊脂糖、TAE緩沖液、水 平電泳槽、移液槍、干式恒溫儀、微型離心機、伯樂凝膠成像儀、1M氯化鈉溶液、loading dying、50mM KAc、20mM Tris-Ac、10mM Mg(Ac)2、100μg/ml BSA(pH 7·9@25Γ)ΕΒ染液等。
[0054] 實驗步驟
[0055] (1)制備Mismatch DNA
[0056] 單鏈序列（表1)由上海捷瑞公司協助合成，公司提供的單鏈DNA均為20D稀釋至25μ 1最終配置為1〇〇μΜ，取表中相應7-mis兩條單鏈DNA稀釋50倍，加入1Μ氯化鈉溶液使混合溶 液中NaCl濃度為50mM。將混合單鏈DNA溶液置入干式恒溫儀溫控90°C5min，后隨環境降至室 溫，得到2μΜ Mismatch DNA，標記為7_mis〇
[0057] (2)7-mis對bTopo I的抑制
[0058] 首先取1.5ml離心管分別編號0-6,配置添加相應試劑，使0至6各管最終包含 5mMKAc、2mM Tris-Ac、lmM Mg(Ac)2、10μg/ml BSA(pH 7.9@25。〇、250即 pUC 19,其中 1-6 管均包含2U bTopo I，2-6管7-mis濃度最終依次為 12.511]\1、2511]\1、5〇11]\1、10〇11]\1、20〇11]\1。最后 將各管在震蕩器震蕩數秒并用離心機混勻處理。將各管在干式恒溫器中37°C溫浴30min。
[0059] (3)凝膠電泳實驗
[0060]精確稱取瓊脂糖1.5g加入錐形瓶，隨后用量筒量取150ml TAE緩沖液倒入錐形瓶， 加熱混合溶液至溶液澄清透明，之后將溶液倒入水平電泳槽至冷卻成膠。
[0061]將（2)中0-6管各加入4μ1 loading dying，震蕩離心混勾，后將其注膠上樣。電泳 在100V條件下運行lh，結束后取出將凝膠在EB溶液(EB溶液濃度為0.15mg/ml)中浸泡染色 40min后使用伯樂凝膠成像儀成像并使用軟件計算得出其IC 5Q(見圖3)，從圖3可以看出，伴 隨7-mis濃度的增加 ，Mismatch DNA對bTopo I的抑制效果亦成正相關，7-mis對bTopo I抑 制的 IC5Q 為0.04647μΜ.
[0062] 實施例4驗證11-mis對bTopo I的抑制效果并得出IC50
[0063] 實驗材料
[0064] E.coli Toposomerase I(購于NEB，產品貨號#103015)41](： 19(購于NEB，產品貨 號#N3041S)、Mismatch單鏈(序列見表1，由上海捷瑞公司負責合成）、瓊脂糖、TAE緩沖液、水 平電泳槽、移液槍、干式恒溫儀、微型離心機、伯樂凝膠成像儀、1M氯化鈉溶液、loading dying、50mM KAc、20mM Tris-Ac、10mM Mg(Ac)2、100μg/ml BSA(pH 7·9@25Γ)ΕΒ染液等。
[0065] 實驗步驟
[0066] (1)制備Mismatch DNA
[0067] 單鏈序列（表1)由上海捷瑞公司協助合成，公司提供的單鏈DNA均為20D稀釋至25μ 1最終配置為100μΜ，取表中相應11-mis兩條單鏈DNA稀釋50倍，加入1Μ氯化鈉溶液使混合溶 液中NaCl濃度為50mM。將混合單鏈DNA溶液置入干式恒溫儀溫控90°C5min，后隨環境降至室 溫，得到2μΜ Mismatch DNA，標記為 11-mis〇
[0068] (2)ll-mis對bTopo I的抑制
[0069] 首先取1.5ml離心管分別編號0-6,配置添加相應試劑，使0至6各管最終包含 5mMKac、2mM Tris-Ac、lmM Mg(Ac)2、10μg/ml BSA(pH 7.9@25。〇、250即 pUC 19,其中 1-6 管均包含2U bTopo I，2-6管3-mis濃度最終依次為 1.562nM、3.125nM、6.25nM、12.5nM、 25nM。最后將各管在震蕩器震蕩數秒并用離心機混勻處理。將各管在干式恒溫器中37°C溫 浴30min。
[0070] (3)凝膠電泳實驗
[0071]精確稱取瓊脂糖1.5g加入錐形瓶，隨后用量筒量取150ml TAE緩沖液倒入錐形瓶， 加熱混合溶液至溶液澄清透明，之后將溶液倒入水平電泳槽至冷卻成膠。
[0072]將(2)中0-6管各加入4ylloading dying，震蕩離心混勻，后將其注膠上樣。電泳在 100V條件下運行lh，結束后取出將凝膠在EB溶液(EB溶液濃度為0.15mg/ml)中浸泡染色 40min后使用伯樂凝膠成像儀成像并使用軟件計算得出其IC 5Q(見圖4)，從圖4可以看出伴隨 11-mis濃度的增加，Mismatch DNA對bTopo I的抑制效果亦成正相關，11-mis對bTopol抑制 的 IC5Q為0·01630μΜ.
[0073] 實施例5驗證Mismatch DNA對真核生物Toposomerase I的抑制作用 [0074] 實驗材料
[0075] CalfToposomerase I(Calftopo I)(購與Takara，產品貨號2240A)、pUC 19(購于 NEB，產品貨號#似0415)^觀&丨^1單鏈(序列見表1，由上海捷瑞公司負責合成）、瓊脂糖、 TAE緩沖液、水平電泳槽、干式恒溫儀、微型離心機、移液槍、伯樂凝膠成像儀、1M氯化鈉溶 液、loading dying、35〇mM Tris-HCl，（pH8·0)、72〇mM KCl、5〇mM MgCl2、5〇mM DTT、5〇mM spermidine、。· 1 %BSA、EB染液
[0076] 實驗步驟
[0077] (1)單鏈序列（表1)由上海捷瑞公司協助合成，各管單鏈DNA均為20D稀釋至25μ1最 終濃度1〇〇μΜ，取表中相應兩條單鏈DNA稀釋50倍，加入1Μ氯化鈉溶液使混合溶液中NaCl濃 度為50mM。將混合單鏈DNA溶液置入干式恒溫儀溫控90°C5min，后隨環境降至室溫，得到2μΜ Mismatch DNA，標記為X-mis(X為1、3、5、7、11)〇
[0078] (2)首先取1.5ml離心管分別編號0-7,配置添加相應試劑，使0至7各管最終包含 35mM Tris-HCl，（pH8.0)、72mM KCl、5mM MgCl2、5mM DTT、5mM spermidine、0.01%BSA、 250ng pUC 19,其中 1-7管均包含 1U Calftopo I，2-7管分別包含0·2μΜ的Control、l-mis、 3-111&、5-1114、7-111&、11-111&。將各管在震蕩器震蕩數秒并用離心機混勻處理。將各管在干 式十旦溫器中37 C溫洛30min。
[0079] (3)凝膠電泳實驗
[0080]精確稱取瓊脂糖1.5g加入錐形瓶，隨后用量筒量取150mlTAE緩沖液倒入錐形瓶， 加熱混合溶液至溶液澄清透明，之后將溶液倒入水平電泳槽至冷卻成膠。
[0081 ]將（2)中0-7管各加入4μ1 loading dying，震蕩離心混勻，后將其注膠上樣。電泳 在100V條件下運行lh，結束后取出將凝膠在EB溶液(EB溶液濃度為0.15mg/ml)中浸泡染色 40min后使用伯樂凝膠成像儀成像，見圖5,圖中，X-mis為不同種類核酸適配體，各特殊結構 寡居核苷酸濃度均為0.2μΜ。通過使用不同種類特殊結構寡居核苷酸研究對Calftopo I的 作用效果發現:通過設計的具有Mismatch結構的寡居核苷酸對Calftopo I沒有抑制作用。 [0082]雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種細菌I型拓撲異構酶的抑制劑，其特征在于，是具有錯配堿基的雙鏈核苷酸。2. 根據權利要求1所述的一種細菌I型拓撲異構酶的抑制劑，其特征在于，包括一段或 者多段錯配堿基，每一段至少含有一個錯配堿基。3. 根據權利要求1或2所述的一種細菌I型拓撲異構酶的抑制劑，其特征在于，所述抑制 劑的雙鏈核苷酸中的兩條鏈的長度相同或者不同。4. 根據權利要求1所述的一種細菌I型拓撲異構酶的抑制劑，其特征在于，所述錯配堿 基，位于雙鏈核苷酸的任意位置，包括兩端和/或中部。5. 根據權利要求1或2或4任一所述的一種細菌I型拓撲異構酶的抑制劑，其特征在于， 所述錯配堿基的組成，可以是A、T、C、G中的任一一種或幾種的組合。6. 根據權利要求1所述的一種細菌I型拓撲異構酶的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑 的5'至3'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，3'至5'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示；或者，所述抑制劑的5 '至3 '方向的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，3 '至5 '方向的核 苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；或者，所述抑制劑的5'至3'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，3 '至5 '方向的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示;或者，所述抑制劑的5 '至3 '方向 的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，3'至5'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。7. -種細菌殺菌劑，其特征在于，活性成分包括權利要求1所述的細菌I型拓撲異構酶 的抑制劑。8. -種防腐劑，其特征在于，活性成分包括權利要求1所述的細菌I型拓撲異構酶的抑 制劑。9. 一種醫用殺菌劑，其特征在于，活性成分包括權利要求1所述的細菌I型拓撲異構酶 的抑制劑。10. 權利要求1所述的細菌I型拓撲異構酶的抑制劑在食品儲藏、保鮮，或者醫療殺菌中 的應用。
【文檔編號】A61P31/04GK106086023SQ201610421602
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月13日 公開號201610421602.3, CN 106086023 A, CN 106086023A, CN 201610421602, CN-A-106086023, CN106086023 A, CN106086023A, CN201610421602, CN201610421602.3
【發明人】楊兆琪, 姜拓昱, 仲晗實, 劉元法
【申請人】江南大學