一種雞新城疫和h9亞型禽流感二聯疫苗的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物獸藥技術領域，具體涉及一種雞新城疫和H9亞型禽流感二聯疫 苗。
【背景技術】
[0002] H9亞型禽流感屬于低致病性疫病，但與其他病原特別是新城疫、大腸桿菌混合感 染能夠提高其致病力，引起產蛋量嚴重下降和死亡率顯著提高，給養禽業帶來嚴重的危害。 [0003] 低致病H9亞型禽流感的發生是潛在性的，分布極為廣泛，危害持久和難以控制， 給養禽業帶來滅頂之災，對人類的威脅同樣嚴重。目前已有的禽流感（H9亞型）疫苗已在 臨床廣泛使用，但存在抗體水平較低和抗體整齊度方面的問題，影響到疫苗的防治效果。而 且，疫苗制造用的毒株為多年前的流行毒株，隨著時間推移和環境變化，禽流感（H9亞型） 臨床流行毒株已經發生抗原變異，使用原有毒株制造的疫苗免疫產生的抗體，無法針對流 行毒株提供完全的免疫保護，臨床應用效果不佳。因此，H9N2禽流感的研宄工作非常重要， 迫切需要從臨床上分離到免疫原性好、與現在流行毒株抗原性接近的毒株來制造疫苗，為 禽流感（H9亞型）的防治奠定基礎。
[0004] 新城疫是新城疫病毒引起的禽類一種以呼吸道、消化道黏膜出血為特征的高度接 觸性、急性敗血性傳染病。同時感染其他病原如H9亞型禽流感，可引起的內源性感染，將會 使產蛋雞產蛋量下降，育成雞死亡率增加，是危害我國養禽業的主要疫病之一。
[0005] 本發明從全國各地臨床發生H9亞型禽流感的養殖場分離H9N2禽流感，并對其臨 床流行病學和遺傳變異進行分析，篩選到一株免疫原性好、與現有流行毒株同源性高的H9 亞型禽流感病毒（QDY株）。本發明應用篩選到的新型H9亞型禽流感病毒與新城疫Lasota 毒株制備二聯滅活疫苗。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種雞新城疫和H9亞型禽流感二聯疫苗，從而彌補現有技 術的不足。
[0007] 本發明的二聯疫苗，包含有抗原和佐劑，所述的抗原為滅活的H9亞型禽流感病毒 和新城疫病毒；所述的H9亞型禽流感病毒為QDY株（Avian influenza virus)，已于2015 年4月29日保藏于中國.武漢.武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:V201517 ；
[0008] 作為優選，新城疫病毒為Lasota株，
[0009] 所述的疫苗佐劑為白油佐劑。
[0010] 上述的疫苗中H9亞型禽流感病毒的含量不低于107_°EID5Q/0. 3ml，新城疫病毒的 含量不低于 l〇8_°EID5Q/0· 3ml。
[0011] 本發明將H9亞型禽流感病毒（QDY株）、新城疫病毒Lasota株，分別接種雞胚后收 取病毒液，經甲醛溶液滅活后加油佐劑混合乳化制成疫苗。
[0012] 本發明的雞新城疫、禽流感（H9亞型）二聯滅活疫苗免疫原性好，免疫后抗體產生 快，產生的抗體滴度高且維持時間長，保存期長，免疫劑量小，選用的佐劑易于注射，可一針 防治兩種疾病，此疫苗具有高效、安全性好的優點。
【具體實施方式】
[0013] 本發明篩選出效價高、免疫原性好的H9亞型禽流感毒株（QDY株），接種于10日齡 的雞胚中進行培養，收獲含病毒的尿囊液滅活；采用新城疫病毒Lasota株（中國獸醫微生 物菌種保藏管理中心CVCC AV1615)接種于雞胚培養，收獲尿囊液滅活，將兩種滅活抗原按 一定比例混合，加入油佐劑，制備了新型的雞新城疫、禽流感（H9亞型）二聯滅活疫苗。
[0014] 下面結合具體實施例對本發明進行詳細的描述。
[0015] 實施例1、制苗用抗原毒株（H9亞型禽流感病毒QDY株）的篩選
[0016] 2013年從山東城陽地區已接種了 H9亞型禽流感病毒疫苗的發病雞群中，無菌采 集發病雞的心、脾等臟器和喉頭、泄殖腔拭子，滅菌平皿中無菌條件下進行研碎，按1:5的 比例加入含4000單位/ml雙抗的生理鹽水，于-20°C反復凍融3次。棉拭子直接放入含1 萬單位雙抗的生理鹽水中，2~8°C作用4h，臟器及棉拭子均3500rpm離心10min，取上清， 混合后接種10日齡的SPF雞胚5枚，0. 2ml/枚。雞胚置37°C孵育，每天早晚各照檢一次， 及時取出死胚置4°C冰箱中保存，棄去24h內的死亡胚，至96h時取出全部雞胚。逐胚收集 雞胚尿囊液，血凝試驗檢測病毒效價，連續傳代3次。收獲的病毒液經純化后進行了病毒含 量、免疫原性、特異性及純凈性等方面的病毒特性的分析檢測，結果表明該毒株病毒含量為 10 8_9EID5tlA). Iml，該病毒僅與H9亞型禽流感病毒發生特異性反應，無細菌、支原體及外源病 毒污染，適合作為制苗用毒株。
[0017] 將篩選QDY株保藏于北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研宄所 的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO !M201517。
[0018] 對篩選的QDY株的基因 HA進行測序，結果HA全長為1683bp，編碼560個氨基酸； NCBI的blast序列分析表明，QDY株的結構基因 HA與已公開的禽流感病毒的HA存在差異 位點，同源性為97. 5%~98. 8%;表明本發明所篩選的QDY株為一新型的H9亞型禽流感病 毒株。
[0019] 上述的結果證明篩選的QDY株符合制備疫苗的標準，用篩選的QDY株與新城疫病 毒Lasota株（中國獸醫微生物菌種保藏管理中心CVCC AV1615)制備二聯疫苗。
[0020] 實施例2 :雞新城疫、禽流感（H9亞型）二聯滅活疫苗的制備及檢驗
[0021] 1.制苗用抗原液的制備
[0022] I. 1禽流感（H9亞型）抗原液的制備
[0023] I. I. 1禽流感（H9亞型）病毒的繁殖將毒種（QDY株）用滅菌生理鹽水作20000 倍稀釋，經尿囊腔接種10~11日齡SPF雞胚，每胚0. 2ml，接種后密封針孔，置36~37°C 繼續孵育，不必翻胚。每日照胚1次，將48小時前死亡的雞胚棄去。此后，每4~6小時照 胚1次，死亡雞胚隨時取出，直至72小時，無論死亡與否，全部取出，照胚將已死亡的雞胚和 仍健活的雞胚分開，氣室向上直立，置于2~8°C冷卻4~24小時。
[0024] I. 1. 2收獲將冷卻的雞胚取出，按《全自動收獲機使用說明》要求，收獲雞胚尿囊 液（先收活胚后收死胚）。吸取胚液放于50000ml滅菌容器內，抽樣測定紅細胞凝集價，紅 細胞凝集價低于1:256(微量法）者應棄去。同時按現行《中國獸藥典》進行無菌檢驗。收 獲的胚液滅活前在2~8°C保存。
[0025] I. 1. 3滅活將H9亞型禽流感病毒液導入滅活罐內，計量加入10%甲醛溶液，開啟 攪拌機攪拌，使其充分混合，甲醛的最終濃度為〇. 1 %。加甲醛溶液后導入另一滅活罐中，以 避免罐口附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°C滅活16小時（以罐內溫度達到37°C開始 計時，開啟攪拌機連續攪拌）后取出，放2~8°C保存。
[0026] 1.1. 4半成品檢驗
[0027] (1)無菌檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行無菌檢驗。
[0028] (2)病毒含量測定將收獲的病毒液（滅活前取樣）用滅菌生理鹽水作10倍系列 稀釋，取1〇_ 5、1〇_6、1〇_7、1〇_8、1〇_95個稀釋度，分別尿囊腔接種10~11日齡SPF雞胚，每胚 0. lml，同時設接種生理鹽水對照5枚，每胚0. lml。置36~37°C繼續孵育，每日照胚2次， 觀察96小時。測定每個雞胚尿囊液的血凝效價，血凝效價不小于24,判為感染并計算EID 5tl, 病毒含量應不低于IO8 5EID5tlA). lml。
[0029] (3)滅活檢驗取10日齡SPF雞胚6個，每個尿囊腔內接種滅活