活性尿激酶受體的檢測的制作方法
【專利摘要】活性尿激酶受體的檢測。本發明公開了利用AUCA或其融合蛋白檢測活性uPAR的方法和AUCA或其融合蛋白在制備用于檢測活性uPAR的試劑盒中的應用，以及包含AUCA或其融合蛋白的試劑盒。所述檢測方法包括：1)使捕獲試劑與待測樣品在適合于所述捕獲試劑捕獲待測樣品中活性uPAR的條件下接觸，形成捕獲試劑與活性uPAR的復合物，所述捕獲試劑包括可特異性捕獲活性uPAR的AUCA或其融合蛋白；2)檢測被捕獲的活性uPAR。本發明的方法具有較好的準確度和重現性，其檢測下限達15ng/L。
【專利說明】
活性尿激酶受體的檢測
技術領域
[0001] 本發明設及生物醫學檢測領域，具體設及對活性尿激酶受體的檢測。
【背景技術】
[0002] 尿激酶受體（urokinase type plasminogen acitivator rec邱tor,uPAR)是一種 細胞表面受體。該受體由Stoppelli等于1985年發現，1989年Roldan等克隆了該cDNA，1990 年Behremlt等用親和層析法從人淋己瘤細胞U937的細胞膜抽提液中純化出該蛋白。在第五 次國際白細胞分化抗原會議上，uPAR被命名為分化抗原簇87(cluste;r of differentiation 87,CD87)euPAR是一種高度糖基化的表面膜蛋白，廣泛表達于免疫細胞 表面，例如激活的嗜中性粒細胞、單核細胞、激活的T淋己細胞、巨隧細胞，W及多種惡性腫 瘤細胞表面，但是在絕大多數正常細胞表面表達量較低[1-5]。
[0003] UPAR是一種柔性分子，可與多種配體或受體相互作用。如玻連蛋白 (vitronectin)、尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator， uPA)、低密度脂蛋白受體相關蛋白 l(low density lipoprotein receptor-related protein 1，LRP1)、整聯蛋白（integrinKG蛋白偶聯受體（G protein coupled receptor, GPCR)等。運些不同的相互作用在人體多種生理及病理過程中發揮著廣泛的重要作用，包括 纖溶酶原的激活、細胞黏附和遷移、細胞分化、化學增活現象、趨化因子受體調節、免疫應 答、炎癥反應等[4,6]。證43由^個富含半脫氨酸、大小為81-87個氨基酸的1^76/證4賠吉構域 組成（Dl，D2，D3 )，分子量約為55kDaDuPAR通過其C端的糖基化憐脂酷肌醇 (glycosylphosphatidylinositol，GPI)錯定在細胞膜表面[4,6]。
[0004] 尿激酶受體存在著多種的形式，包括全長的膜受體、不含穿膜區的可溶性尿激酶 受體(soluble uPAR，suPAR)、W及各種的降解片段。全長的UPAR膜受體易受憐脂酷酶C的水 解，使UPAR從細胞膜表面脫落，形成不含糖基化憐脂酷肌醇的可溶性尿激酶受體(soluble uPAR，suPAR)。另夕hPAR也對多種水解酶敏感，能夠被進一步水解成Dl和D2-D3片段[3]。
[0005] 我們的前期晶體結構研究表明，UPAR通過它的S個結構域形成一個碗狀結構，而 正是運個碗狀結構能高效結合它的配體uPA[7]，將UPA富集在細胞表面，而將纖溶酶原激活 為纖溶酶，進而對胞外基質進行降解，在細胞遷移在發揮重要作用。同時我們的結構也證明 uPA與uPAR的結合可大大提高uPAR與玻連蛋白的結合[8]，而大量的文獻也證明了uPA與 UPAR的結合對其與整合素相互作用的重要性[6,7]。運些蛋白與其他蛋白如〇曰乂6〇1111等在 病灶局部黏附、積聚，整合素受體啟動細胞內信號，從而將信號從細胞外傳入細胞內，激活 細胞內蛋白激酶，促進細胞分裂及細胞遷移。運種UPAR被定義為活性UPA即7]。只有有活性 的UPAR可進行信號的傳導，而與腫瘤的侵襲和轉移密切相關，而其他UPAR片段沒有活性。目 前尚沒有測定活性UPAR的方法。
[0006] 由于UPAR含量與疾病密切相關，目前市場上有很多針對UPAR的診斷方法，它們主 要是通過雙抗體夾屯、法來進行檢測，一般測定的是血液中有活性和非活性的總量suPAR。如 丹麥ViroGates公司推出的檢測suPAR的酶聯免疫吸附（enzyme-1 inked immuno sorbent assay ,ELISA)試劑盒-suPA民nostic愈尼通過了歐洲的CE-IVD(體外診斷試劑)認證，用于指 導臨床。運種方法是基于總SUPAR在血液中的濃度增高預示著病人免疫系統被持續激活 [3]，總SUPAR在血液中的濃度水平也可作為病情進展的評定指標W及用于病人風險狀態的 臨床決策[9-11]。另外，SUPAR也可用于重癥監護病房病人病情嚴重程度的篩選W及病人治 療效果的評價[12，13]。具體的，SUPAR的濃度范圍在0.1-4.化g/L表示受檢者為正常，沒有 感染或炎癥反應;4-6yg/L表明受檢者可能有感染，或免疫系統非正常激活需要進一步檢 查；〉6yg/L表明疾病在快速進展中，需要嚴密監測W及跟進治療。然而目前類似于 SiiPARnosUc皆運些抗體雙夾屯、法檢測到的都是血液內多種形式suPAR的總值，無法直接地 檢測血液中活性uPAR的含量。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是提供一種活性UPAR的檢測方法。
[000引本
【發明內容】
如下：使用活性uPAR捕獲試劑(active uPAR capture agent,AUCA)或 含有它的融合蛋白捕獲活性uPAR，從而實現對uPAR的檢測。AUCA為尿激酶N末端片段的截斷 體，通過結構分析保留其與UPAR結合相關及保持結構穩定性的片段，其序列如SEQ ID NO: 1 所示。與ATF-樣，它能夠特異性結合活性UPAR的活性口袋，而對無活性UPAR(如Dl和D2D3) 只有相對很弱的結合。
[0009] 所述活性UPAR捕獲劑AUCA的氨基酸序列如下所示：
[0010] PSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLPWNSATVLQQTY HAHRSDALQLGLGKHNYCRNPDNRRRPWCYVQVGLKPLV犯CMVHDCA(SEQ ID N0.1)。
[001。 本發明中所使用的術語"uPA"指尿激酶型纖溶酶原激活物。
[0012]本發明中所使用的術語"uPAR"指尿激酶型纖溶酶原激活物受體，也可稱為尿激酶 受體。
[OOU]本發明中所使用的術語"suPAR"指尿激酶型纖溶酶原激活物受體(UPAR)的可溶形 式。
[0014] 本發明中所使用的術語"AUCA"指能夠特異性捕獲活性UPAR的一段蛋白序列，其氨 基酸順序為沈Q ID NO. 1所定義的。AUCA為active uPAR cap 1:ure agent的縮寫。
[0015] 本發明中所使用的術語"活性uPAR"是指結構上含S個完整結構域Dl和D2D3、功能 上能夠結合天然配體UPA和玻連蛋白的uPAR。本文所述的"活性uPAR"包含全長的UPAR膜受 體、不含穿膜區的可溶性尿激酶受體(SO1 Ub 1 e uPAR，suPAR)，但不包含suPAR的各種降解片 段。
[0016] 根據本發明的一個方面，提供活性UPAR的檢測方法，該方法包括：
[0017] 1)使捕獲試劑與待測樣品在適合于所述捕獲試劑捕獲待測樣品中活性UPAR的條 件下接觸，形成捕獲試劑與活性UPAR的復合物；
[001引2)檢測被捕獲的活性uPAR;
[0019] 其中所述捕獲試劑包含AUCA或含有AUCA的融合蛋白。
[0020] 在優選的實施方案中，本發明的檢測方法是非診斷目的的，并且是在體外進行的。 在優選的實施方案中，含有AUCA的融合蛋白是AUCA-HSA融合蛋白。"適合于所述捕獲試劑捕 獲待測樣品中活性uPAR的條件"包括合適的溫度、反應時間和溶液等，W避免蛋白質變性， 并使捕獲試劑與活性UPAR特異性結合。合適的條件取決于選擇的具體檢測系統和/或具體 檢測方法，本領域技術人員基于其所掌握的一般知識能夠選擇適合于不同檢測系統和/或 具體檢測方法的條件。
[0021] 可W通過本領域技術人員熟知的具體檢測系統和/或具體檢測方法對被捕獲的活 性UPAR進行檢測。所選擇的具體檢測方法可W是異質或同質測定法。異質測定法是包括一 次或多次清洗步驟的測定法，而在同質測定法中，此類清洗步驟不是必需的，僅將檢測試劑 和待檢測樣品混合并測量。所述測定方法包括但不限于基于化ISA(酶聯免疫吸附測定法） 的測定法、DELFIA(解離增強銅系元素巧光免疫測定法）、SPA(閃爍鄰近測定法）、 Flashplate測定法、FRET(巧光共振能量轉移)測定法、TR-FRET(時間分辨巧光共振能量轉 移)測定法、FP (巧光偏振)測定法、ALPHA(放大化學發光親合均相檢測）、EFC (酶片段互補） 測定法、雙雜交測定法或共免疫沉淀測定法。
[0022] 在進一步的實施方案中，在上述活性UPAR的檢測方法中，步驟2)可W包括使所形 成的復合物與特異性結合被捕獲的活性UPAR的試劑結合，并通過檢測所述特異性結合被捕 獲的活性UPAR的試劑來檢測被捕獲的活性uPAR。
[0023] 在上述測定過程中，可W通過對反應體系中所包含的檢測成分的測定來實現對被 捕獲的活性UPAR進行檢測。所述檢測成分包括捕獲試劑(例如捕獲試劑中所含有的AUCA或 其融合蛋白）和/或與被捕獲的活性UPAR特異性結合的試劑。對檢測成分的測定可W通過使 用可檢測的標記成分進行標記并檢測標記成分來進行。可檢測的標記成分根據具體使用的 測定方法而有所不同。本發明中，可W W多種方式，例如但不限于用生物素、酶、巧光染料 (如FITC、巧光素、羅丹明、切染料或Alexa fluor)，來標記檢測成分，也可W使用放射性標 記物(如化、32P、35S、i25I或I4C)及常見的酶標記物如辣根過氧化物酶和堿性憐酸酶來進行 標記。例如，可W將標記成分標記在與被捕獲的活性uPAR特異性結合的試劑上，通過檢測標 記成分實現對被捕獲的活性UPAR的檢測;也可W將成對的標記成分中的一個標記在捕獲試 劑上，另一個標記在與被捕獲的活性UPAR特異性結合的試劑上，通過成對的標記成分之間 的相互作用的檢測實現對被捕獲的活性UPAR的檢測；還可W將標記成分標記在捕獲試劑 上，捕獲試劑與活性UPAR的結合會導致捕獲試劑上的標記成分發生變化，通過檢測標記成 分的變化實現對被捕獲的活性UPAR的檢測;運些標記成分及其檢測方法都是本領域技術人 員熟知的。
[0024] 在一些優選的實施方案中，特異性結合被捕獲的活性UPAR的試劑是結合于活性 UPAR外側的單克隆抗體。運類抗體可W通過利用活性UPAR蛋白免疫動物得到多克隆抗體， 而后經uPAR-AUCA親合柱捕獲而得。
[0025] 在更優選的實施方案中，所述結合于活性UPAR外側的單克隆抗體是用UPAR D2D3 (氨基酸88-283)免疫小鼠，經雜交瘤技術篩選而得到的單克隆抗UPAR抗體。
[0026] 在更加優選的實施方案中，所述結合于活性UPAR外側的單克隆抗體是抗體ATN- 658。
[0027] 本文使用的術語"單克隆抗體"指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中 包含的單個抗體是相同的，除了少數可能存在的天然發生的突變之外，單克隆抗體高特異 性地針對單個抗原表位。制備特定抗原的單克隆抗體的方法是本領域公知的，例如通過雜 交瘤方法獲得。本發明所述"結合于活性uPAR外側的單克隆抗體"是指所針對的抗原表位位 于活性UPAR外側的單克隆抗體。所述"活性UPAR外側"是活性UPAR上相對于AUCA所插入的活 性疏水性口袋的內側而言的外側上的位點。活性UPAR與AUCA結合情況下，與其外側位點結 合的單克隆抗體可W與所形成的復合物相結合，從而可W實現對被捕獲的活性UPAR的檢 。鑒定單克隆抗體所針對的抗原表位的方法是本領域公知的，因此本領域技術人員可W 通過其所熟知的方法確定單克隆抗體是否與活性UPAR外側相結合。
[0028] 對該單克隆抗體的測定可W通過使用可檢測的標記成分對檢測成分進行標記并 檢測標記成分來進行。檢測成分包括捕獲試劑(含有AUCA或含有AUCA的融合蛋白）、結合于 活性UPAR外側的單克隆抗體和/或與該單克隆抗體結合的二抗。例如，可W將標記成分標記 在單克隆抗體上，通過檢測標記成分實現對被捕獲的活性UPAR的檢測；也可W使單克隆抗 體與二抗結合，將標記成分標記在二抗上，通過檢測標記成分實現對被捕獲的活性UPAR的 檢測;還可W將成對的標記成分中的一個標記在捕獲試劑上，另一個標記在該單克隆抗體 或與該單克隆抗體結合的二抗上，通過成對的標記成分之間的相互作用的檢測實現對被捕 獲的活性UPAR的檢測;還可W將標記成分標記在捕獲試劑上，捕獲試劑與活性UPAR的結合 會導致捕獲試劑上的標記成分發生變化，通過檢測標記成分的變化實現對被捕獲的活性 UPAR的檢測;運些標記成分及其檢測方法都是本領域技術人員熟知的。可檢測的標記成分 包括但不限于生物素、酶、巧光染料(如FITC、巧光素、羅丹明、切染料或Alexa f Iuor)、放射 性標記物(如3h、32p、35s、i25i或及常見的酶標記物如辣根過氧化物酶和堿性憐酸酶。
[0029] 在更加優選的實施方案中，本發明的檢測方法的具體步驟如下：
[0030] (1)向多孔板的孔內加入IOOyl經包被液稀釋的AUCA-HSA蛋白溶液（140iig/ml)進 行包被，4 °C過夜，洗涂并干燥；
[0031] (2)向孔中加入10化1封閉液進行封閉，室溫80轉/分，解育1小時，洗涂并干燥；
[0032] (3)向一些孔中加入不同濃度的活性UPAR標準品10化1，所述不同濃度分別為化g/ L、0.扣g/L、0.25iig/L、0.125iig/L、0.062扣g/L、0.0312扣g/l;向另一些孔中加入 100山的樣 品稀釋液作為空白對照，空白對照中不含有uPAR;向其它孔中加入待檢樣品的用樣品稀釋 液稀釋10倍的稀釋液;室溫80轉/分，解育1小時，洗涂并干燥；
[0033] (4)向所有孔內加入I(K)山9μg/ml經樣品稀釋液稀釋的鼠抗人源UPAR的單克隆抗 體，室溫80轉/分，解育1小時，洗涂并干燥，其中所述單克隆抗體是用UPAR D2D3(氨基酸 88-283)免疫小鼠，經雜交瘤技術篩選而得到的單克隆抗UPAR抗體；
[0034] (5)向所有孔內加入10化1經樣品稀釋液500倍稀釋的堿性憐酸酶標記的抗鼠 IgG, 室溫80轉/分，解育1小時，洗涂并干燥；
[0035] (6)向每孔內加入10化1顯色液，接著將酶標板置于酶標儀上于405皿讀取吸光度， 共讀取60min，每Imin讀取一次吸光度值；
[0036] (7)制作標準曲線，計算樣品中活性UPAR的濃度。
[0037] 根據本發明的另一個方面，提供AUCA或含有AUCA的融合蛋白在制備用于檢測樣品 中活性UPAR的試劑中的應用。
[0038] 在本發明中，"待測樣品"包括但不限于來自于受試者的血液、血清、血漿細胞培養 液、唾液和尿液。
[0039] 本發明中所使用的術語"融合蛋白"指包含兩種或更多種不同蛋白質的氨基酸序 列的嵌合蛋白。制備融合蛋白的方法是本領域公知的，通常融合蛋白由本領域熟知的體外 重組技術產生。本發明的"含有AUCA的融合蛋白"是AUCA與另一種蛋白質或多膚或其片段的 嵌合蛋白。所述另一種蛋白質或多膚或其片段可W是血清白蛋白，例如人血清白蛋白 化SA)、牛血清白蛋白（BSA)，也可W是卵清蛋白（OVA)。在優選的實施方案中，含有AUCA的融 合蛋白是AUCA-服A融合蛋白。
[0040] 本發明中，可W通過本領域已知的各種方法制備AUCA、或含有AUCA的融合蛋白，例 如可W通過化學合成或重組方法制備。在優選的實施方案中，本發明的AUCA或含有AUCA的 融合蛋白是重組蛋白。
[0041] 所述AUCA或含有AUCA的融合蛋白可W被固定在固體基質上。所述固體基質包括但 不限于多孔板(如96孔板）、蛋白質忍片底膜(例如硝酸纖維素膜、尼龍膜等）、磁珠等。
[0042] 根據本發明的另一個方面，提供AUCA或含有AUCA的融合蛋白在制備用于檢測樣品 中活性UPAR的試劑盒中的應用。在優選的實施方案中，所述試劑盒包含捕獲試劑，所述捕獲 試劑包括可特異性捕獲活性UPAR的AUCA或含有AUCA的融合蛋白。
[0043] 根據本發明的一個方面，提供用于檢測活性UPAR的試劑盒，所述試劑盒包含捕獲 試劑，所述捕獲試劑包括可特異性捕獲活性UPAR的AUCA或其融合蛋白。
[0044] 在一些實施方案中，所述捕獲試劑被可檢測的標記成分標記。捕獲試劑與活性 UPAR的結合會導致捕獲試劑上的標記成分發生變化，通過檢測捕獲試劑上的標記成分的 變化可W實現對被捕獲的活性UPAR的檢測。
[0045] 在另一些實施方案中，所述試劑盒還包含用于檢測被捕獲的活性UPAR的一種或多 種試劑。在優選的實施方案中，所述用于檢測被捕獲的活性UPAR的一種或多種試劑包括結 合于活性UPAR外側的單克隆抗體和/或與該單克隆抗體結合的二抗。在一些實施方案中，所 述單克隆抗體被可檢測的標記成分標記。在另一些實施方案中，所述單克隆抗體未被可檢 測的標記成分標記。在一些實施方案中，所述二抗被可檢測的標記成分標記。在另一些實施 方案中，所述二抗未被可檢測的標記成分標記。
[0046] 在優選的實施方案中，所述結合于活性UPAR外側的單克隆抗體是UPAR D2D3(氨基 酸88-283)免疫小鼠，經雜交瘤技術篩選而得到的單克隆抗UPAR抗體。
[0047] 在另一些實施方案中，所述試劑盒還包含用于檢測被捕獲的活性UPAR的一種或多 種試劑，其中所述捕獲試劑被可檢測的成對標記成分中的一個成分標記，并且用于檢測被 捕獲的活性uPAR的一種或多種試劑被成對標記成分中的另一個標記。通過檢測成對標記成 分之間的相互作用可W實現對被捕獲的活性UPAR的檢測。在優選的實施方案中，所述用于 檢測被捕獲的活性UPAR的一種或多種試劑包括結合于活性UPAR外側的單克隆抗體和/或與 該單克隆抗體結合的二抗。
[0048] 在另一些實施方案中，所述試劑盒還包含任何適用于檢測被捕獲試劑捕獲的活性 UPAR的可檢測的標記成分。
[0049] W上所述的可檢測的標記成分包括但不限于生物素、酶、巧光染料(如FITC、巧光 素、羅丹明、切染料或416義3門11〇')、放射性標記物(如化、3申、355、1251或1 4〇^及常見的酶 標記物如辣根過氧化物酶和堿性憐酸酶。
[0050] 在一些實施方案中，在本發明的試劑盒中，捕獲試劑可W被固定在固相基質上，例 如被固定在多孔板(如96孔板）、蛋白質忍片底膜(例如硝酸纖維素膜、尼龍膜等）、磁珠上。 試劑盒中還可W包含包被液、封閉液、洗涂液、樣品稀釋液、W及用于檢測標記成分的試劑 中的一種或多種。
[0051] 上述試劑盒還可W包括使用說明書。
[0052] 在優選的實施方案中，本發明的試劑盒包含：酶標板;AUCA-HSA蛋白溶液；活性 UPA財示準品；用人UPAR D2D3 (氨基酸88-283)免疫小鼠，經雜交瘤技術篩選而得到的單克隆 抗UPAR抗體;堿性憐酸酶標記的抗鼠 IgG;包被液;洗涂液/樣品稀釋液;封閉液和顯色液。
[0053] 在更優選的實施方案中，本發明的試劑盒包含:酶標板；Iml 1.4mg/ml的AUCA-HSA 蛋白溶液；Iml活性UPAR標準品（Img/ml); IOOiil用UPAR D2D3(氨基酸88-283)免疫小鼠，經 雜交瘤技術篩選而得到的單克隆抗uPAR抗體(0.9mg/ml); 2扣1 500 X堿性憐酸酶標記的抗 鼠 IgG;包被液IOml; 30 X洗涂液/樣品稀釋液20ml;BSA封閉液IOml;PNPP顯色液IOml。
[0054] 本發明中，包被液優選為含40mMNaHC03，10mM化2C03，pH9.6的水溶液。
[0055] 本發明中，封閉液優選為用包被液配制的5%BSA溶液。
[0056] 本發明中，洗涂液/樣品稀釋液優選為含0.5%oTween-20pH7.4的PBS溶液，其中 ?85配方為船(：18邑/1，1((：10.2邑/1，船2冊〇4*12出0 3.58邑/1，1(出口〇4〇.27邑/1。
[0化7]本發明中，顯色液優選含有0.ImM Tris ? HCKpH 9.5),0.ImM 化Cl,5mM MgCl2， 2mg/ml PNPPo
[0058] 使用本發明的檢測方法和檢測試劑盒，可特異地檢測各種樣本中的活性uPAR。
[0059] 本發明中所使用的"包含"、"包括"或"含有"可W指"包括但不限于"、"基本由…… 組成"或"主要由……組成"。
[0060] 在本發明中使用"包含"、"包括"或"含有"的技術方案還可W是由所列成分組成的 技術方案。
【附圖說明】
[006。 圖1是實施例1的活性UPAR的ELISA檢巧巧法的設計原理示意圖。
[0062] 圖2是實施例1中所使用的96孔化ISA檢測板典型示例。
[0063] 圖3是不同濃度活性UPAR標準品的吸光度隨時間變化的動力學過程圖。
[0064] 圖4是活性UPAR濃度對應酶反應速度的標準曲線。
[0065] 圖5是本發明活性UPAR的化ISA檢測方法的回收率計算結果。
【具體實施方式】
[0066] 下面結合具體實施例對本發明作進一步闡述，但提供運些實施例是為了幫助理解 本發明，本發明不限于運些實施例。
[0067] W下為實施例中設及使用的試劑及實驗材料：
[006引 AUCA-HSA:使用與專利201410034942.1類似的方法制備AUCA-HSA融合蛋白，經 SDS-PAGE電泳驗證純度大于90%。也可W通過本領域技術人員熟知的其它方法制備AUCA和 HSA的融合蛋白，例如在己斯德畢赤酵母X-33中表達并經儀-次氮基S乙酸(Ni-NTA)柱純 化。
[0069] 活性UPAR標準品：在S2果蛹胚胎細胞中表達的重組suPAR，經親合柱結合離子柱純 化。
[0070] 抗體ATN-658:由Attenuon，LLC(SanDiego，Calif)提供，是uPARD2D3(氨基酸88- 283)免疫小鼠，經雜交瘤技術篩選而得到的單克隆抗uPAR抗體。
[0071 ]堿性憐酸酶標記二抗（AP-antimouse-IgG):選購于Cell Si即aling Technology 公司，是專用于Western blotting和ElLISA中的酶標二抗。
[0072] 96孔酶標板:選購于化ermo scientific公司，是透明的Maxiso巧類型酶標板。
[0073] 包被液:含40mMNa肥03，10mM化2C03，pH9.6的水溶液。
[0074] 封閉液:用包被液配置的5%BSA溶液，其中BSA選購于生工生物工程有限公司。
[0075] 洗涂液/樣品稀釋液：含0.5%〇Tween-20pH 7.4的PBS溶液，其中PBS配方為化Cl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na2HP〇4? 12出0 3.58g/L，K出P〇4 0.27g/L。
[0076] 顯色液：0.1mM Tris ?肥 1(抑 9.5)，0.1mM NaCl，5mM MgCl2,2mg/ml PNPP。
[0077] 實施例一:利用AUCA-HSA來檢測人血樣中的活性uPAR
[0078] 本實施例中活性UPAR的化ISA檢測方法的原理如圖1所示。
[0079] 血漿樣品的收集和保存:收集人的全血于含抓TA抗凝劑的真空采血管中，在1200* g離屯、30min。將不同病人的血漿編號并用樣品稀釋液稀釋10倍，分裝于1.5ml離屯、管中，保 存在-80°C待用。
[0080] 具體的操作步驟如下：
[0081 ] 1包被：向酶標板的1A-12H所有孔（參見圖2)內加入10化1經包被液稀釋的AUCA- 服A蛋白溶液(140iig/ml)，用密封膠帶將96孔板密封好W防止液體蒸發，并于4°C過夜。掲開 密封膠帶，甩干酶標板孔內的液體，并用排槍吸取洗涂液，洗涂每孔6次，在最后一次洗涂 后，將酶標板在吸水紙上輕輕拍干并保證孔內沒有氣泡存留。
[0082] 2封閉：向酶標板內1A-12H所有孔中加入10化1封閉液，并用密封膠帶將96孔板密 封好W防止液體蒸發，于室溫80轉/分的搖床上解育1小時。掲開密封膠帶，甩干酶標板孔內 的液體，并用排槍吸取洗涂液洗涂每孔6次，在最后一次洗涂后，將酶標板在吸水紙上輕輕 拍干并保證孔內沒有氣泡存留。
[0083] 3加樣:分別向酶標板1A-1F加入不同濃度的活性UPAR標準品10化1，每一濃度有兩 個復孔(Al、A2: liig/L;Bl、B2:0.5iig/L;Cl、C2:0.2扣g/l;Dl、D2:0.12扣g/l;El、E2:0.0625y g/レFl、F2:0.03125iig/L)。向Gl、G2分別加入10化l的樣品稀釋液作為空白對照。然后向酶 標板內其它孔加入待檢測病人的稀釋血清樣品（用樣品稀釋液稀釋10倍），每個血清樣品2 個重復，然后用密封膠帶將96孔板密封好，并于室溫80轉/分鐘的搖床上解育1小時。掲開密 封膠帶，甩干酶標板孔內的液體，并用排槍吸取洗涂液，洗涂每孔6次，在最后一次洗涂后， 將酶標板在吸水紙上輕輕拍干并保證孔內沒有氣泡存留。
[0084] 4加一抗：向酶標板1A-12H所有孔內加入10化1 9iig/ml經樣品稀釋液稀釋的鼠抗 人源UPAR的ATN-658抗體，并用密封膠帶將96孔板密封好，并于室溫80轉/分鐘的搖床上解 育1小時。掲開密封膠帶，甩干酶標板孔內的液體，并用排槍吸取洗涂液，洗涂每孔6次，在最 后一次洗涂后，將酶標板在吸水紙上輕輕拍干并保證孔內沒有氣泡存留。
[0085] 5加酶標二抗：向酶標板1A-12H所有孔內加入10化1經樣品稀釋液500倍稀釋的堿 性憐酸酶標記的抗鼠 IgG(antimouse-AP con化gate IgG)，并用密封膠帶將96孔板密封好， 并于室溫80轉/分鐘的搖床上解育1小時。掲開密封膠帶，甩干酶標板孔內的液體，并用排槍 吸取洗涂液，洗涂每孔6次，然后在用排槍吸取去離子水洗涂每孔3次。將酶標板在吸水紙上 輕輕拍干并保證孔內沒有氣泡存留。
[0086] 6加顯色液:然后用排槍向每孔內快速加入10化1顯色液，接著將酶標板置于酶標 儀上于405nm讀取吸光度，共讀取60min，每Imin讀取一次吸光度值。
[0087] 7制作標準曲線，計算血液樣品中活性UPAR的濃度。
[008引首先，通過線性回歸分析的方法建立一系列活性UPAR濃度(X軸）與對應的酶反應 速度-Rate(Y軸）的標準曲線。圖3就是酶標儀于405nm讀取不同濃度活性UPAR標準品的吸光 度隨時間變化的動力學過程，其中橫坐標為時間（監測60分鐘），縱坐標為405nm處的吸光 值，動力學曲線由上至下對應的活性UPAR濃度依次為：liig/L，0.5iig/L，0.2扣g/L，0.12扣g/ L，0.062化g/L，0.0312扣g/L，0yg/L。通過不同活性uPAR濃度對應的第60分鐘OD 405nm處 吸光值減去第1分鐘0 D 4 0 5 n m處的吸光值，得到6 0分鐘時間內的0 D 4 0 5 n m的變化值X (miIliAbsorbance ,milIiAbs)。用邱余W60分鐘即得到不同活性uPAR濃度對應的酶反應速 度(milliAbs/min)。圖4即為一系列活性UPAR濃度對酶反應速度所做標準曲線。通過換算將 病人血漿樣本對應的酶反應速度帶入標準曲線即可測定對應血漿樣品中的活性uPAR含量。
[0089] 實施例二:活性UPAR檢測方法的性能表征
[0090] 本實施例是對本發明的活性UPAR的化ISA檢測方法的考核，如未作特殊說明，具體 的實驗方法和所用試劑同實施例1所述方法。
[0091] (1)精密度實驗
[0092] 精密度通常用批內和批間變異系數(CV% )來表示，應用實施例一的化ISA方法對 于同一個血漿樣品中的活性UPAR含量在同一天同一塊板中重復測量16次得到相應的平均 值(AVE)和標準差(SD)，通過公式100%*(SD/AVE)即得到相應的批內變異系數（％)，結果如 表一所示。另外在連續4天內每天重復測量同一個血漿樣品中的活性UPAR含量，得到相應4 天的平均值(AVE'）和標準差（SD'），通過公式100%*(SD'/AVE'）即得到相應的批間變異系 數（％ )，結果如表二所示。由表一和表二可看到批內變異系數為8.27%，小于10%，批間變 異系數為9.52%，小于15%，說明了所建立的ELISA新方法重現性良好。
[0093] 表一批內精密度測定結果： rn〇94i Luuy/j 凹H乂頭避
[0098]回收實驗的回收效果一般用回收率（％ )來表示。將IOiil -系列已知濃度的活性 UPA財示準樣品分別加入到10化1樣品稀釋液或者稀釋10倍的血漿中，并分別計算出11化1體 系中最終添加的活性UPAR濃度(此濃度記為活性UPAR添加濃度）。然后應用本化ISA方法分 別檢測加入活性UPAR的樣品稀釋液和稀釋的血漿中活性UPAR濃度(此濃度記為活性UPAR檢 測濃度））。分別繪制針對樣品稀釋液的活性UPAR添加濃度和活性UPAR檢測濃度W及針對 稀釋血漿的活性UPAR添加濃度和活性UPAR檢測濃度的線性關系圖，結果如圖5所示。通過對 比兩曲線的斜率值來計算標準樣品在血漿中的回收率R，其中針對樣品稀釋液的活性uPAR 添加濃度和活性UPAR檢測濃度的線性方程的斜率被認為是100%的回收率。因此活性UPAR 在血漿中的回收率R二1.0102/1.0165二99.4%，也表明了此化ISA方法具有較好的準確度。
[0099] (3)檢測限^及標準曲線的線性范圍
[0100] 為了確認本化ISA方法檢測活性UPAR含量的檢測下限，通過測量4組空白對照（加 入樣品為樣品稀釋液，活性UPAR濃度為Otig/L)中相應的酶反應速度，然后帶入到活性UPAR 濃度和酶反應速度的標準曲線中，得到相應活性UPAR的含量。計算出四組空白對照中活性 UPAR含量的平均值(AVE" ) W及相應的標準差(SD")。此方法的檢測下限可通過公式AVE"+3* SD"得到，由此獲得本ELISA方法的活性UPAR含量的檢測下限約為15ng/L。另外通過繪制0- 12如g/L活性UPAR濃度對應酶反應速度的線性關系圖，我們發現本方法的線性范圍為0-如 g/U線性方程中1?2〉〇.99被認為線性關系較好）。
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【主權項】
1. 活性uPAR的檢測方法，該方法包括： 1) 使捕獲試劑與待測樣品在適合于所述捕獲試劑捕獲待測樣品中活性uPAR的條件下 接觸，形成捕獲試劑與活性uPAR的復合物； 2) 檢測被捕獲的活性uPAR; 其中所述捕獲試劑包含AUCA或含有AUCA的融合蛋白，優選包含AUCA-HSA融合蛋白。2. 權利要求1的檢測方法，其中步驟2)包括使所形成的復合物與結合于活性uPAR外側 的單克隆抗體結合，并通過檢測所述單克隆抗體來檢測被捕獲的活性uPAR，優選所述結合 于活性uPAR外側的單克隆抗體是用uPAR D2D3免疫小鼠，經雜交瘤技術篩選而得到的單克 隆抗uPAR抗體。3. 根據權利要求1的檢測方法，其中具體步驟如下： (1)向多孔板的孔內加入1〇〇μ1經包被液稀釋的140μg/ml的AUCA-HSA蛋白溶液進行包 被，4°C過夜，洗滌并干燥； ⑵向孔中加入?〇〇μ1封閉液進行封閉，室溫80轉/分，孵育1小時，洗滌并干燥； (3) 向一些孔中加入不同濃度的活性uPAR標準品100μΙ，所述不同濃度分別為lyg/L、 0.5yg/L、0.25yg/L、0.125yg/L、0.0625yg/L、0.03125yg/L;向另一些孔中加入100μΙ的樣品 稀釋液作為空白對照，空白對照中不含uPAR;向其它孔中加入待檢樣品的用樣品稀釋液稀 釋10倍的稀釋液;室溫80轉/分，孵育1小時，洗滌并干燥； (4) 向所有孔內加入100μΙ 9μg/ml經樣品稀釋液稀釋的鼠抗人源uPAR的單克隆抗體， 室溫80轉/分，孵育1小時，洗滌并干燥，其中所述單克隆抗體是用uPAR D2D3免疫小鼠，經雜 交瘤技術篩選而得到的單克隆抗uPAR抗體； (5) 向所有孔內加入IOOyl經樣品稀釋液500倍稀釋的堿性磷酸酶標記的抗鼠 IgG，室溫 80轉/分，孵育1小時，洗滌并干燥； (6) 向每孔內加入IOOyl顯色液，接著將酶標板置于酶標儀上于405nm讀取吸光度，共讀 取60min，每Imin讀取一次吸光度值； (7) 制作標準曲線，計算樣品中活性uPAR的濃度。4. 權利要求1-3任一項的檢測方法，其中待測樣品可以但不僅限于血液、血清、血漿、細 胞培養液、唾液和尿液。 5 .AUCA或含有AUCA的融合蛋白在制備用于檢測樣品中活性uPAR的試劑中的應用。 6. AUCA或含有AUCA的融合蛋白在制備用于檢測樣品中活性uPAR的試劑盒中的應用。7. 根據權利要求5或6的應用，其中含有AUCA的融合蛋白是AUCA-HSA融合蛋白。8. 用于檢測活性uPAR的試劑盒，所述試劑盒包含捕獲試劑，所述捕獲試劑包含可特異 性捕獲活性uPAR的AUCA或含有AUCA的融合蛋白，優選包含AUCA-HSA融合蛋白。9. 權利要求6的應用或權利要求8的試劑盒，其中所述試劑盒還包含結合于活性uPAR外 側的單克隆抗體和/或與該單克隆抗體結合的二抗，優選所述結合于活性uPAR外側的單克 隆抗體是uPAR D2D3免疫小鼠，經雜交瘤技術篩選而得到的單克隆抗uPAR抗體。10. 權利要求6的應用或權利要求8的試劑盒，其中所述試劑盒包含:酶標板;AUCA-HSA 蛋白溶液;活性uPAR標準品；用人uPAR D2D3免疫小鼠，經雜交瘤技術篩選而得到的單克隆 抗uPAR抗體;堿性磷酸酶標記的抗鼠 IgG;包被液;洗滌液/樣品稀釋液;封閉液和顯色液； 優選所述試劑盒包含：酶標板；Iml 1.4mg/ml的AUCA-HSA蛋白溶液；Iml活性uPAR標準 品（lmg/ml);100yl 0.9mg/ml的用uPAR D2D3免疫小鼠，經雜交瘤技術篩選而得到的單克隆 抗uPAR抗體;25μ1 500 X堿性磷酸酶標記的抗鼠 IgG;包被液IOml; 30 X洗滌液/樣品稀釋液 20ml ;BSA封閉液IOml，ΡΝΡΡ顯色液IOml。
【文檔編號】G01N33/68GK105954522SQ201610541379
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月11日
【發明人】黃明東, 周曉雷, 許明明, 袁彩
【申請人】中國科學院福建物質結構研究所