[0050] 表2本文中使用的互補突變核苷酸
[0051]
[0053] 1 · 4Rv0888 蛋白純化
[0054] 收集4L含有pET-22b-Rv0888的Rosetta2(DE3)E.coli細菌培養物，菌體沉淀用 200mLbufferA(20mMTris-HCl, 150mMNaCl, 10%glycerol,pH8. 0)重懸，用高壓破碎機 (ConstantsystemUSA, 30kpsi)在 4°C條件進行壓力破碎，4°C1500rpm離心 30min收集沉 淀。沉淀用bufferA重懸超聲（350W, 3s/3s, 4°C) 10min，4°C1500rpm離心 30min收集沉 淀。沉淀再用80mL2M尿素重懸，于4°C攪拌4h，4°C1500rpm離心30min在收集沉淀。沉 淀用 80mLbufferB(20mMTris-HCl, 150mMNaCl，6Murea, 20%glycerol,pH8.0)重懸， 于4°C條件下溶解過夜，4°C1500rpm離心30min，棄沉淀留上清。
[0055]上清用 2LbufferC(20mMTris-HCl，150mMNaCl，5Murea, 20%glycerol,ρΗ8· 0) 透析，每隔12h換一次透析液，尿素下降1M，其他成分不變，直到無尿素。透析后的蛋 白于 4°C條件下 15000rpm離心 30min。上清過NiSepharose6FastFlowresin(GE Healthcare)純化柱，用 60mLbufferE(20mMTris-HCl, 500mMNaCl, 10%glycerol, 20mM imidazole,pH8. 0), 60mLbufferF(20mMTris-HCl, 500mMNaCl, 10 %glycerol, 40mM imidazole,pH8.0)和lOOmLbufferG(20mMTris-HCl, 1MNaCl,pH8.0)洗去未結合的 蛋白。用 5mLbufferH(20mMTris-HCl, 150mMNaCl, 10%glycerol300mMimidazole,pH 8.0)和 5mLbufferI(20mMTris-HCl，150mMNaCl，10%glycerol，500mMimidazole,pH 8. 0)洗脫目的蛋白。收集的蛋白用SDS-PAGE驗證純化效果。
[0056] 親和層析純化的蛋白的用30kDa的超濾管（Millipore)濃縮至2mL，濃縮的蛋白過 預先用bufferJ(20mMTris-HCl,pH8.0)平衡的HiLoad16/600Superdex200pg柱（GE Healthcare)，收集所有峰下的蛋白，用SDS-PAGE進行分析驗證。驗證的蛋白在濃縮至2mL 過預先用bufferJ平衡的ResourceS5mL柱（GEHealthcare)。目標蛋白用0M-2M的 NaCl線性洗脫。收集的蛋白用SDS-PAGE進行分析驗證。
[0057] 1. 5Rv0888蛋白的質譜分析
[0058] 純化的蛋白跑SDS-PAGE，將含有目的蛋白的膠塊切下，切成1mm3左右的小塊，裝 入離心管中，水洗一次；然后用50% (V/v)ACN/25mM碳酸氫銨（100yL，pH8. 0)脫色15分 鐘。反復3次，直至將顏色脫盡；在用蒸餾水洗滌1次；將膠塊浸入30μL100%ACN中5 分鐘，脫水，膠塊變白，然后室溫抽干；加8μLTrypsin酶液（0.lmg/ml)，37°C過夜16h左 右；將 0· 3uL已酶解的樣品加 0· 3uL的基質（5mg/mLa-cyan〇-4-hydroxycinnamic-acid(F luka)in50% (v/v)acetonitrile(Fisher)andO. 1% (w/v)trifluoroaceticacid(DIMA)) 點到樣品板上，室溫晾干，用基質輔助的激光解析離子飛行時間質譜分析。選用正離子反射 模式進行質譜分析，結果用4000Series軟件分析。利用以下參數：肽片段分子質量容許誤 差（Precursortol.) :±0.2Da;二級片段容許誤差（MS/MStol) :±0.8Da;酶解片段不完 全（missedcleavages) :1，搜索SwissProt同源數據庫驗證目的蛋白。
[0059] 1. 6Rv0888核酸酶底物
[0060] 為了檢測重組核酸酶Rv0888對底物的特異性。10μL的反應體系，反應buffer 為：20mMTris-HCl, 5mMMgCl2,pH7. 5,分別加入 0· 2μg的線性dsDNA(PCR產物），環狀質 粒DNA(pGEX-6p-l質粒），染色體DNA(大腸桿菌DNA)或者面包酵母RNA(Sigma-Aldrich) 與3yg純化的Rv0888蛋白于37°C水浴鍋中反應。Buffer(20mMTris-HClpH7. 5)代替 Rv0888蛋白作為陰性對照。60min之后，10yL的反應溶液加入1yL的10xloadingbuffer 跑1%的核酸膠電泳進行分析。所有的試驗重復三次。
[0061] 1. 7二價離子和金屬螯合劑對Rv0888活性的影響
[0062] 二價離子通常是脫氧核糖核酸酶或者是核酸酶所必須的。二價離 子對核酸酶活性的影響測定方法如下：Rv0888蛋白與5mM的不同二價離子鹽 (CaCl2,MgCl2,MnCl2,BaCl2,NiCl2)和不同的二價離子鹽組合（CaCl2+MgCl2,CaCl2+MnCl2,Mg Cl2+MnCl2)在37°C條件下反應lh。結果通過1%的核酸凝膠電泳進行分析。所有試驗重復 三次。
[0063] 1· 8溫度和pH對Rv0888活性的影響
[0064] 使用最佳的二價離子和20mMTris-HCl緩沖液（pH6.Ο-pH8. 0,間隔0. 5)，37°C 條件下反應lh檢測不同pH對Rv0888活性的影響。使用最佳的二價離子和最佳的pH在 33°C-51°C(間隔2°C)的溫度范圍內檢測不同溫度對Rv0888活性的影響。所有的結果都 通過1%核酸凝膠電泳分析驗證。Rv〇888的活性用之前報道的分光光度的方法進行定量。 200 以1^的反應體系：2(^1^(^反應131^€61(10〇11111^8-!1(：1，5〇1111〇3(：12,5〇1111111(：1 2，口!1 7.5) ;20yL環狀質粒DNA(100ng/yLpGEX-6p-l) ;10yLRv0888 蛋白（lmg/mL) ;150yL 滅菌水。于37°C反應lh，加入8yL0. 5MEDTA以終止反應。反應混合物用滅菌水稀釋至 2mL，用Nanophotometer?PealUltramicroUV-Visspectrophotometer測定 260nm〇 在 41°C條件下，每分鐘降解底物的產物使260nm處吸光值增加0. 001所需要的酶量定義為一 個酶活力單位（U)。
[0065] 1. 9Rv0888核酸酶活性的動力學研究
[0066] 以小牛胸腺DNA和面包酵母RNA為底物，使用分光光度法測定Rv0888核酸酶米氏 動力學的參數。在41°C和pH6. 5條件下，10μg純化的Rv0888蛋白與不同濃度的小牛胸 腺DNA(0. 00625mg/mL, 0· 0125mg/mL, 0· 025mg/mL, 0· 05mg/mL, 0·lmg/mL, 0· 2mg/mL, 0· 4mg/ mL, 0. 6mg/mL, 0. 8mg/mL；RNA:0. 00625mg/mL, 0. 0125mg/mL, 0. 025mg/mL, 0. 05mg/mL, 0.lmg/ mL)共同孵育。20mMTris-HCl(pH6. 5)代替Rv0888蛋白作為陰性對照。反應lh后，加 入終濃度5%冰的高氯乙酸，然后用滅菌水稀釋至2mL。稀釋后的溶液用Nanophotometer? PealUltramicroUV-Visspectrophotometer測定 260nm。所有試驗重復三次。
[0067] 1. 10Rv0888抑制劑篩選
[0068] 使用以下中藥單體篩選Rv0888的抑制劑：丹參素鈉，天麻素，鹽酸益母草堿，紅景 天苷溶于水；橄欖苦苷，綠原酸，刺五加苷，6-姜酚，西紅花苷，姜黃素，白藜蘆醇，類葉升麻 苷，虎杖苷，松果菊苷，香葉木素，蘆丁，根皮苷，黃芩苷，柚皮苷，楊梅素，水飛薊素，蛇床子 素，藤黃素，新藤黃酸，大黃酸，葛根素溶于50 %乙醇；野漆樹苷，補骨脂乙素，劍葉龍血素 C，甲氧醉椒素，格列喹酮，紫檀芪，姜黃醇，菊苣酸，龍血素B，鹽酸羅格列酮，左旋紫草溶于 50%DMS0 ;α-倒捻子素，哈巴俄苷，阿魏酸松柏酯溶于50%甲醇。3μg純化Rv0888蛋白 預先37°C條件下與0. 3mM不同中藥單體孵育。對照用滅菌水，50%DMS0, 50%甲醇，或者 50%乙醇。活性參照以上所使用的測定方法。
[0069] 1.11肺部感染
[0070] 肺部感染試驗使用5-6周齡SPF雌性BALB/c